Name: Obrazowanie odpowiedzi Ca2+ podczas zakażenia komórek nabłonkowych Shigella (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Poznaj metodę mikroskopii fluorescencyjnej do wizualizacji sygnałów wapniowych w komórkach HeLa zakażonych Shigella. Technika ta pozwala charakteryzować lokalne i globalne odpowiedzi Ca²⁺ podczas infekcji bakteryjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Jenny-Lee Thomassin za pomoc w edycji rękopisu. Prace były wspierane przez granty ANR MITOPATHO i PATHIMMUN, granty z Labex Memolife oraz PSL IDEX Shigaforce. Chunhui Sun jest laureatką stypendium doktoranckiego Chińskiej Rady Stypendialnej. Laurent Combettes i Guy Tran Van Nhieu są stypendystami programu Tournesol N°31268YG (Wallonie-Bruxelles International, Fonds de la Recherche Scientifique, Ministère Français des Affaires étrangères et européennes, Ministère de l'Enseignement supérieur et de la Recherche dans le cadre des Partenariats Hubert Curien).

1. Przygotowania
<ol>
	<li>Przygotowanie bakterii
	<ol>
		<li>Bakterie - szczep Shigella typu dzikiego wyrażający adhezynę AfaE (M90T-AfaE) - należy umieścić na płytce agarowej z tryptykazą sojową (TCS) zawierającej 0,01% czerwieni Kongo (CR) i inkubować je przez 18 godzin w temperaturze 37 °C. 
		Uwaga: Aby zwiększyć ich odtwarzalność, płytki Shigella otrzymane w kroku 1.1.1 są przechowywane w temperaturze 4 °C i powinny być zużyte w ciągu tygodnia, ponieważ wszystkie kolonie na pożywce CR z czasem zmienią kolor na czerwony.</li>
		<li>Zaszczep wstępną kulturę bulionu TCS, wybierając 3 czerwone kolonie z płytek smugowych. 
		Uwaga: Inokulację z 3 koloniami przeprowadza się w celu ograniczenia prawdopodobieństwa wybrania pojedynczego klonu, którego plazmid wirulencji został poddany rekombinacji genetycznej.</li>
		<li>Hodować płynne kultury bakterii w inkubatorze z wytrząsaniem przez 16 godzin w temperaturze 37 °C przy 200 obr./min. Dodać ampicylinę w końcowym stężeniu 75 mg/ml. Stężenie antybiotyku nie powinno przekraczać 3-krotności minimalnego stężenia hamującego, ponieważ nadmiar antybiotyku może prowadzić do utraty dużego plazmidu wirulencji. 
		Uwaga: Utrzymanie plazmidu zjadliwości Shigella powinno być zweryfikowane poprzez posiew kultur bakterii na płytkach CR uzupełnionych odpowiednimi stężeniami antybiotyków. Obecność białych kolonii wskazuje na utratę plazmidu.</li>
		<li>Zaszczepić kulturę TCS wstępną kulturą bakteryjną w rozcieńczeniu 1:100. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przez 2 godziny przy 200 obr./min. Upewnij się, że gęstość optyczna przy 600 nm (OD600 nm) wynosi 0,2 - 0,4.</li>
		<li>Odwirować kulturę bakteryjną przez 2 minuty przy 13 000 x g w temperaturze 21 °C i ponownie zawiesić osad w równoważnej objętości pożywki EM (120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 0,8 mM MgCl2, 5 mM glukozy i 25 mM HEPES, pH = 7,3).</li>
		<li>Rozcieńczyć zawiesinę bakteryjną w buforze EM przy końcowej średnicy zewnętrznej600 nm wynoszącej 0,1 i zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze 21 °C i zużyć w ciągu następnych 60 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie komórek
	<ol>
		<li>Hoduj komórki HeLa w DMEM z 1 g / L glukozy uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą (FCS) i hoduj je w temperaturze 37 °C z 10% CO2 . Hoduj TC-7 uprawiany w DMEM z 4,5 g/L glukozy, zawierającej 10% FCS i endogennych aminokwasów w inkubatorze o temperaturze 37 °C zawierającym 10% CO2 .</li>
		<li>W celu utrzymania komórek, należy regularnie dzielić komórki, aby uniknąć zahamowania wzrostu związanego ze stanami konfluencji; ma to kluczowe znaczenie dla wysokiej wydajności ładowania/transfekcji sondy Ca2+.</li>
		<li>Płytki komórek HeLa na sterylnych okrągłych szkiełkach nakrywkowych o średnicy 25 mm na płytkach 6-dołkowych o gęstości 3 x 105 komórek/basenik dzień przed eksperymentem dla komórek HeLa.</li>
		<li>W przypadku komórek TC-7 trypsynizuj i policz komórki. Wysiewaj je w 4 x 105 komórek/dołku i inkubuj przez 5 - 7 dni w temperaturze 37 °C w 10% inkubatorze CO2 przed eksperymentami, aby umożliwić polaryzację.
		<ol>
			<li>Pożywkę do hodowli komórkowych należy odświeżać codziennie aż do dnia eksperymentu. 
			Uwaga: Jednorazowe studzienki ze szklanym dnem o średnicy 35 mm mogą być również stosowane jako alternatywa dla studni zawierających szkiełka nakrywkowe. W przypadku stosowania tych ostatnich kontrola temperatury za pomocą podgrzewanego stolika lub obiektywu nie jest wystarczająca i wymagana jest komora inkubacyjna z termostatem zamontowana na stoliku mikroskopowym.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W dniu eksperymentu usunąć pożywkę i przemyć komórki 3x 1 ml pożywki EM w temperaturze 21 °C.</li>
	<li>Załaduj ogniwa 3 mM Fluo-4-AM14 do bufora EM na 30 minut w temperaturze 21 °C. 
	Uwaga: Podczas gdy ładowanie sub-konfluentnych komórek HeLa nie stwarza większych problemów, ładowanie spolaryzowanych komórek TC-7 jest często niejednorodne i słabo wydajne. W przypadku tych ogniw stwierdziliśmy, że wydajność ładowania jest zwiększona przez dodanie środka dyspergującego - kwasu pluronowego - o końcowym stężeniu 0,1% oraz inhibitora transportera anionów bromosulfoftaleiny o końcowym stężeniu 20 μM do EM zawierającego Fluo-4-AM. Stosowanie ratiometrycznych sond chemicznych lub genetycznie kodowanych sond FRET wymagających podwójnej akwizycji nie jest zgodne z szybkością akwizycji wymaganą do obrazowania lokalnych odpowiedzi Ca2+.</li>
	<li>Przemyć próbki 3x buforem EM i dalej inkubować je w 1 ml buforu EM w temperaturze 21 °C, aby umożliwić hydrolizę grupy AM. Zużyte ogniwa obciążone Fluo-4 należy zużyć natychmiast lub w ciągu następnych 90 minut (utrzymywanych w temperaturze 21 °C).</li>
</ol>
2. Infekcja i pozyskiwanie obrazów lokalnych odpowiedzi Ca2+
<ol>
	<li>Umieścić szkiełko nakrywkowe zawierające komórki obciążone Fluo-4 w komorze obrazowania lub komorze ze szklanym dnem. Umyj próbki w komorze obrazowania lub jednorazowej komorze ze szklanym dnem 3x buforem EM w celu usunięcia związków potencjalnie powstałych w wyniku lizy komórek. Dodać 1 ml buforu EM.</li>
	<li>Umieścić komorę na stoliku mikroskopu z odwróconą fluorescencją podgrzanym do temperatury 33 °C. 
	Uwaga: Ta temperatura jest wybierana jako kompromis między optymalnymi temperaturami zgodnymi z procesem inwazji Shigella a spowolnieniem reakcji Ca2+ w celu wizualizacji lokalnych reakcji. Używamy obiektywu z olejkiem immersyjnym 63X (NA = 1,25) wyposażonego w pierścienie kontrastu fazowego.</li>
	<li>Wybierz pole mikroskopowe i ustaw parametry akwizycji, w tym czas ekspozycji i kategoryzację, jeśli to konieczne, aby zoptymalizować sygnał fluorescencyjny Fluo-4. 
	Uwaga: Głównymi wyzwaniami związanymi z lokalnym obrazowaniem Ca2+ są niska amplituda i krótki czas trwania odpowiedzi, wymagający akwizycji co najmniej co 30 ms. Kilka dostępnych na rynku kamer EM-CCD lub C-MOS w technologii BSI ma wymaganą czułość do wykrywania lokalnych odpowiedzi Ca2+ za pomocą Fluo-4. Czułość wykrywania jest również ważną kwestią w celu ograniczenia fotouszkodzeń lub artefaktów, takich jak spontaniczne reakcje związane ze wzbudzeniem fluorescencyjnym Fluo-4 o wysokiej częstotliwości. W tym przypadku zastosowano oświetlenie oparte na diodach LED o długości fali 470 nm, z filtrem wzbudzenia pasmowo-przepustowym 480 ± 40 nm, filtrem dichroicznym 505 nm oraz emisją pasmowo-przepustową 527 ± 30 nm używaną przy 5% jego maksymalnej intensywności w połączeniu z filtrem o neutralnej gęstości 1,0, aby zminimalizować te problemy w strumieniu akwizycji o ograniczonym czasie trwania. Rutynowo przeprowadzano analizę lokalnych sygnałów Ca2+ za pomocą partii strumieni 120 s. W tych warunkach słabego oświetlenia nie zaobserwowano fotowybielania fluoroforu podczas akwizycji 2 min strumienia. Kolejne akwizycje mogą być wykonywane na tej samej próbie, pod warunkiem, że używane są różne pola. Zgodnie z ogólną zasadą, pierwszy strumień akwizycji jest wykonywany na polu kontrolnym przy braku stymulacji bakteryjnej, aby zapewnić brak spontanicznych reakcji. W przypadku zaobserwowania spontanicznych reakcji, próbki przemuje się buforem EM do momentu, gdy nie zaobserwuje się żadnych reakcji.</li>
	<li>Aby dodać bakterie do próbki, należy usunąć 500 μl buforu EM z komory i dodać 500 μl zawiesiny bakteryjnej przygotowanej w kroku 1.1.6 w celu uzyskania końcowego OD600 nm wynoszącego 0,05, z odpowiednią ostrożnością, aby uniknąć przesuwania wybranego pola mikroskopowego; objętości zapewniają właściwe wymieszanie bakterii i jednorodne rozmieszczenie bakterii na próbkach komórkowych.</li>
	<li>Wykonaj akwizycję po dodaniu bakterii. Alternatywnie, należy wykonać akwizycję 10 minut po dodaniu bakterii, co odpowiada czasowi potrzebnemu do osadzania się bakterii na komórkach w zastosowanych warunkach. Na końcu strumienia akwizycji uzyskaj obraz wybranego pola z kontrastem fazowym, aby uwidocznić bakterie stykające się z komórkami i zmarszczki błony związane z miejscami inwazji bakterii.</li>
	<li>Powtórz procedurę akwizycji, jak w kroku 2.5, w odstępach czasu zależnych od czasu trwania akwizycji obrazu, zapisywania plików i wyboru nowego pola, które obejmuje cały proces. 
	Uwaga: W przypadku Shigelli odkryliśmy, że strumienie akwizycji co 5 minut przez 20 minut, po 10-minutowej sedymentacji bakteryjnej, pozwoliły pokryć większość wydarzeń inwazji.</li>
	<li>Na zakończenie procedury akwizycji dodać końcowe stężenie 2 μM próbek jonoforu jonomycynyCa2+ w celu określenia maksymalnej amplitudy sygnałówCa2+. Rejestruj obrazy co 3 - 5 s do momentu ustabilizowania sygnału, zwykle przez mniej niż 10 minut.</li>
	<li>Następnie dodaj chelator Ca2+ EGTA o końcowym stężeniu 10 mM w celu określenia sygnału fluorescencji pod nieobecność Ca2+. Rejestruj obrazy co 3 - 5 s do momentu ustabilizowania sygnału, zwykle przez mniej niż 10 minut. 
	Uwaga: Ze względu na stosunkowo powolną dynamikę globalnych zmian Ca2+, akwizycje te wykonuj co 3 - 5 s (nie w trybie strumieniowym), co pozwala na obrazowanie Ca2+ w tym samym polu mikroskopowym podczas kolejnych zabiegów.</li>
</ol>
3. Analiza
<ol>
	<li>Wyraż cytozolowe zmiany Ca2+ w czasie jako procent ΔF/F0, gdzie ΔF reprezentuje zmianę średniej intensywności fluorescencji obszaru zainteresowania (ROI), a F0 wyjściową fluorescencję w tym samym ROI, do którego odejmuje się nieistotny obszar pola pozbawionego komórek.
	<ol>
		<li>Usuń podstawowe poziomy fluorescencji dla każdej komórki w różnych polach, odpowiadające poziomom wyjściowym; poziomy te można jednoznacznie określić ze względu na niską częstotliwość i stosunkowo krótki czas trwania lokalnych odpowiedzi Ca2+ w danym strumieniu akwizycji. 
		Uwaga: Określ ilościowo uderzające cechy odpowiedzi związanych z zadanymi pytaniami i badanym modelem patogennym. Klasycznie do analizy sygnałów Ca2 + brane są pod uwagę różne parametry, w tym częstotliwość komórek wykazujących lokalne lub globalne odpowiedzi Ca2+, a także czas trwania, amplituda i częstotliwość tych odpowiedzi. W przypadku Shigella i reakcji lokalnych kolejnym ważnym aspektem analizy jest przestrzenne powiązanie odpowiedzi z miejscami inwazji bakteryjnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby określić ilościowo odsetek reagujących komórek wykazujących odpowiedzi globalne lub lokalne, narysuj ROI w komórkach, w szeregach czasowych odpowiadających zmianom intensywności Fluo-4.
	<ol>
		<li>Ustaw ścisłe parametry, aby zidentyfikować lokalne odpowiedzi Ca2+, takie jak amplituda trzykrotnie wyższa od zmian tła średniej intensywności fluorescencji komórki lub czas trwania co najmniej 200 ms, aby uniknąć uzyskania wyniku fałszywie dodatniego. 
		Uwaga: Z reguły nawet małe lokalne odpowiedzi Ca2+ można odróżnić od dowolnego szumu tła na podstawie ich profilu. Zwroty akcji powinny być wystarczająco duże, aby zintegrować wystarczającą ilość sygnałów fluorescencyjnych, aby umożliwić wykrycie lokalnych zmian. W zależności od intensywności detekcji Fluo-4, te ROI mogą odpowiadać okręgom o średnicach w zakresie od 2 do 5 mM.</li>
		<li>Zmierz zmiany średniej intensywności fluorescencji Fluo-4 w 2 regionach w odrębnym obszarze tej samej komórki, aby określić, czy odpowiedzi są lokalne czy globalne. 
		Uwaga: Analiza dużej liczby komórek jest ułatwiona dzięki zastosowaniu oprogramowania do obrazowania, które umożliwia wyświetlanie na ekranie on-line zmian średniej intensywności fluorescencji w czasie dla wybranych regionów. Dostępne na rynku oprogramowanie do obrazowania ma taką opcję, ale można to również wykonać za pomocą darmowego oprogramowania Ice, za pomocą wtyczki ROI Intensity Evolution.</li>
		<li>Określ odsetek komórek wykazujących odpowiedzi lokalne. 
		Uwaga: Odsetek ten jest obliczany na podstawie całkowitej liczby komórek analizowanych w polu mikroskopowym, która powinna być w liczbie wystarczającej do potwierdzenia istotności statystycznej za pomocą testu nieparametrycznego.</li>
		<li>Określ czas trwania odpowiedzi lokalnych. 
		Uwaga: Lokalne odpowiedzi Ca2+ można dalej rozróżnić w zależności od ich zakresów czasu trwania (tj. mniej niż 500 ms, od 5 do 10 s lub powyżej 10 s) i ich związku z miejscami inwazji Shigella.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ ilościowo amplitudę odpowiedzi. Najpierw skalibruj maksymalne poziomy Ca2+ i tła komórek określone jak w kroku 2.1.7. Ponieważ obciążenie Fluo-4 może się różnić dla każdej komórki, należy wykonać te oznaczenia dla poszczególnych komórek w terenie.
	<ol>
		<li>Wyraź amplitudę odpowiedzi jako względny procent maksymalnej odpowiedzi.</li>
		<li>Wykonaj testy statystyczne za pomocą testu normalności, a następnie testu parametrycznego w celu analizy potencjalnych różnic w amplitudzie odpowiedzi między próbkami.</li>
		<li>Określ związek tych odpowiedzi w stosunku do miejsc inwazji bakteryjnej przez ich odpowiednią lokalizację w wywołanych przez bakterie zmarszczkach błony, które są wizualizowane na odpowiednich obrazach kontrastu fazowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ashida, H., Ogawa, M., Kim, M., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+and+host+interactions+in+the+gut+epithelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Bacteria and host interactions in the gut epithelial barrier.</a> Nature Chemical Biology. 8 (1), 36-45 (2012).</li>
<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11413485">The versatility and universality of calcium signaling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Strehler, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+calcium+ATPases%3A+from+generic+Ca%282%2B%29+sump+pumps+to+versatile+systems+for+fine-tuning+cellular+Ca%282%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane calcium ATPases: from generic Ca(2+) sump pumps to versatile systems for fine-tuning cellular Ca(2).</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (1), 26-33 (2015).</li>
<li>Muallem, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+Ca2%2B+signals%3A+a+question+of+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Decoding Ca2+ signals: a question of timing.</a> Journal of Cell Biology. 170 (2), 173-175 (2005).</li>
<li>Uhlen, P., Fritz, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20494106">Biochemistry of calcium oscillations.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (1), 28-32 (2010).</li>
<li>Carneiro, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+induces+mitochondrial+dysfunction+and+cell+death+in+nonmyleoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Shigella induces mitochondrial dysfunction and cell death in nonmyleoid cells.</a> Cell Host & Microbe. 5 (2), 123-136 (2009).</li>
<li>Horng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+and+mitochondrial+destabilization+in+the+triggering+of+the+NLRP3+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling and mitochondrial destabilization in the triggering of the NLRP3 inflammasome.</a> Trends in Immunology. 35 (6), 253-261 (2014).</li>
<li>Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+type+III+secretion+systems%3A+specialized+nanomachines+for+protein+delivery+into+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial type III secretion systems: specialized nanomachines for protein delivery into target cells.</a> Annual Review of Microbiology. 68, 415-438 (2014).</li>
<li>Ashida, H., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+manipulates+host+immune+responses+by+delivering+effector+proteins+with+specific+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Shigella manipulates host immune responses by delivering effector proteins with specific roles.</a> Frontiers in Immunology. 6, 219(2015).</li>
<li>Tran Van Nhieu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-based+confinement+of+calcium+responses+during+Shigella+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Actin-based confinement of calcium responses during Shigella invasion.</a> Nature Communications. 4, 1567(2013).</li>
<li>Niebuhr, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+PtdIns%284%2C5%29P%282%29+into+PtdIns%285%29P+by+the+S.+flexneri+effector+IpgD+reorganizes+host+cell+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Conversion of PtdIns(4,5)P(2) into PtdIns(5)P by the S. flexneri effector IpgD reorganizes host cell morphology.</a> The EMBO Journal. 21 (19), 5069-5078 (2002).</li>
<li>Konradt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Shigella+flexneri+type+three+secretion+system+effector+IpgD+inhibits+T+cell+migration+by+manipulating+host+phosphoinositide+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">The Shigella flexneri type three secretion system effector IpgD inhibits T cell migration by manipulating host phosphoinositide metabolism.</a> Cell Host & Microbe. 9 (4), 263-272 (2011).</li>
<li>Friedrich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intriguing+Ca2%2B+requirement+of+calpain+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">The intriguing Ca2+ requirement of calpain activation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 323 (4), 1131-1133 (2004).</li>
<li>Thomas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+fluorescent+Ca2%2B+indicator+properties+and+their+use+in+measuring+elementary+and+global+Ca2%2B+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals.</a> Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).</li>
<li>Sun, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Shigella+type+III+effector+IpgD+recodes+Ca2%2B+signals+during+invasion+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The Shigella type III effector IpgD recodes Ca2+ signals during invasion of epithelial cells.</a> The EMBO Journal. 36 (17), 2567-2580 (2017).</li>
<li>Allaoui, A., Menard, R., Sansonetti, P. J., Parsot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Shigella+flexneri+IpgD+and+IpgF+genes%2C+which+are+located+in+the+proximal+part+of+the+mxi+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Shigella flexneri IpgD and IpgF genes, which are located in the proximal part of the mxi locus.</a> Infection and Immunity. 61 (5), 1707-1714 (1993).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do zadeklarowania.

Ten manuskrypt opisuje protokół, który opracowaliśmy, aby śledzić lokalne sygnały Ca2+ podczas stosunkowo krótkiej kinetyki inwazji Shigella , a także globalne reakcje Ca2+ podczas rozszerzonej kinetyki Shigella. Poniżej znajdują się kluczowe kwestie, które należy rozwiązać, aby zoptymalizować wykrywanie sygnałów Ca2+ przy jednoczesnej minimalizacji wszelkich zakłóceń w procesach biologicznych.
Chemiczne a genetycznie kodowane sondy Ca<s...

Ca2+ reguluje wszystkie znane procesy komórkowe, w tym reorganizację cytoszkieletu, reakcje zapalne i szlaki śmierci komórki związane z interakcjami gospodarz-patogen1,2,3. W warunkach fizjologicznych podstawowe stężenia cytozolowego Ca2+ są niskie, w zakresie setek nM, ale mogą być poddawane przejściowemu wzrostowi po stymulacji agonistycznej. Zmiany te często wykazują zachowanie oscylacyjne poprzez działanie pomp i kanałów na błonach plazmy i retikulum endoplazmatycznego. Wzorzec tych oscylacji charakteryzuje się okresem, czasem trwania i amplitudą wzrostu Ca2+ i jest odszyfrowywany przez komórki, które z kolei wywołują określone odpowiedzi w tak zwanym kodzie Ca2+4,5. Utrzymujący się wzrost stężenia cytozolowego Ca2+ w warunkach patologicznych może prowadzić do śmierci komórki związanej z przenikaniem błon mitochondrialnych i uwalnianiem czynników proapoptotycznych lub nekrotycznych6,7.
Shigella, czynnik wywołujący czerwonkę bakteryjną, atakuje komórki nabłonkowe poprzez wstrzykiwanie efektorów do komórek gospodarza za pomocą systemu wydzielania typu III (T3SS)8,9. Inwazja Shigella na komórki gospodarza jest związana z lokalnymi i globalnymi sygnałami Ca2 + wywoływanymi przez T3SS. Jeśli chodzi o toksyny tworzące pory, translokon T3SS, który wstawia się do błon komórkowych gospodarza i jest wymagany do wstrzykiwania efektorów T3SS, jest prawdopodobnie odpowiedzialny za aktywację PLC i uwalnianie Ca2 + zależne od trifosforanu inozytolu (1, 4, 5) (InsP3). Połączenie zlokalizowanej stymulacji PLC i akumulacji spolimeryzowanej aktyny w miejscach inwazji Shigella skutkuje nietypowo długotrwałym, zależnym od InsP3 uwalnianiem Ca2+10. Efektor IpgD typu III, fosfatydylo-4,5-bisfosforan (PIP2)-4-fosfataza, ogranicza lokalną ilość PIP2, kontrolując w ten sposób ilość dostępnego substratu dla PLC do generowania InsP3, co przyczynia się do uwięzienia lokalnych odpowiedzi Ca2+ w miejscach inwazji bakteryjnej11,12. Te lokalne odpowiedzi Ca2+ prawdopodobnie przyczyniają się do polimeryzacji aktyny w miejscach inwazji Shigella10. Globalne odpowiedzi Ca2 +, które są również wywoływane przez Shigella, są jednak zbędne w procesie inwazji bakteryjnej, ale powodują otwarcie półkanałów koneksyny w błonie plazmatycznej i uwolnienie ATP w przedziale zewnątrzkomórkowym. Uwolniony ATP działając w sposób parakrynny, z kolei stymuluje odpowiedzi oscylacyjne Ca2+ w komórkach obok zakażonej komórki. IpgD jest również odpowiedzialny za kształtowanie globalnych odpowiedzi Ca2+ w niekonsekwentne izolowane odpowiedzi o powolnej dynamice. Ostatecznie, przy długotrwałej infekcji bakteryjnej, IpgD prowadzi do zahamowania sygnałów Ca2 + za pośrednictwem InsP3. Poprzez interferencję z sygnalizacją Ca2+, IpgD opóźnia zależną od Ca2+ aktywację kalpainy, co prowadzi do demontażu ogniskowych struktur adhezyjnych i przedwczesnego oderwania zainfekowanych komórek13.
Podczas gdy sygnały Ca2+ są zaangażowane w krytyczne aspekty patogenezy, użycie mikroorganizmu rodzi szereg wyzwań technicznych, które nie są spotykane w klasycznych badaniach agonistycznych. Opisane tutaj protokoły wykorzystują powszechnie stosowany fluorescencyjny wskaźnik chemiczny Ca2 + Fluo-4, który opracowaliśmy w celu scharakteryzowania lokalnych sygnałów Ca2 + podczas infekcji Shigella. Omówiono etapy kluczowe dla detekcji tych sygnałów, a także procedury wdrożone do ich analizy ilościowej, która jest wymagana do scharakteryzowania roli efektorów bakteryjnych w sygnalizacjiCa2+.

<table><tbody><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph wersja 7.7</td><td>Uniwersalny system oświetlenia</td> CoolLED do obrazowania <td></td><td></td></tr><tr><td>pE-2</td><td>Roper Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikroczasza 35 mm, wysoka&nbsp;</td><td>IBIDI</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>Rosół sojowy z tryptikazy (TCS)</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>B11768</td></tr><tr><td>Agar TCS</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>B11043</td></tr><tr><td>Kongo czerwony</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>75768</td></tr><tr><td>M90T-AfaE</td><td>Sun et al. 2017</td><td>Shigella flexneri serotyp V. wyrażający adhezynę</td><td></td> AfaE</tr><tr><td>ipgD-AfaE</td><td>Sun i wsp. 2017</td><td>izogeniczny zmutowany szczep ipgD wyrażający adhezynę</td><td></td> AfaE</tr></tbody></table>

obrazowanie odpowiedzi ca2+ podczas zakażenia komórek nabłonkowych shigella

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Ca2+ to wszechobecny jon biorący udział we wszystkich znanych procesach komórkowych. Podczas gdy globalne odpowiedzi Ca2 + mogą wpływać na los komórki, lokalne zmiany w stężeniach cytozolu Ca2 +, związane z uwalnianiem z wewnętrznych zapasów lub napływem przez kanały błony plazmatycznej, regulują procesy komórek korowych. Patogeny, które przylegają do komórek gospodarza lub atakują je, wywołują reorganizację cytoszkieletu aktynowego leżącego pod błoną plazmatyczną gospodarza, co prawdopodobnie wpływa zarówno na globalną, jak i lokalną sygnalizację Ca2 +. Ponieważ zdarzenia te mogą zachodzić przy niskich częstotliwościach w sposób pseudostochastyczny w rozszerzonej kinetyce, analiza sygnałów Ca2+ indukowanych przez patogeny rodzi poważne wyzwania techniczne, którymi należy się zająć.
Tutaj raportujemy protokoły wykrywania globalnych i lokalnych sygnałów Ca2+ po zakażeniu Shigella komórek nabłonkowych. W tych protokołach artefakty związane z długotrwałą ekspozycją i fotouszkodzeniami związanymi ze wzbudzeniem sond fluorescencyjnych Ca2 + są rozwiązywane poprzez ścisłą kontrolę parametrów akwizycji w określonych okresach czasu podczas inwazji Shigella. Wdrożono procedury rygorystycznej analizy amplitudy i częstotliwości globalnych cytozolowych sygnałów Ca2 + podczas rozszerzonej kinetyki infekcji przy użyciu sondy chemicznej Fluo-4.

Shigella wywołuje inwazję związaną z nietypowymi, długotrwałymi lokalnymi odpowiedziami Ca2+ :
Zgodnie z powyższym protokołem, komórki HeLa obciążone Fluo-4 zostały poddane działaniu WT Shigella, a następnie przeprowadzono akwizycję strumieniową w celu analizy sygnałów Ca2+ . Reprezentatywny eksperyment przedstawiono na Rysunku 1, obejmującym serię obrazów time-l...

Tutaj prezentujemy protokoły wizualizacji odpowiedzi wapnia (Ca2+) wywołanych przez komórki HeLa zakażone przez Shigella. Optymalizując parametry infekcji bakteryjnej i obrazując za pomocą sond fluorescencyjnychCa2+, scharakteryzowano nietypowe globalne i lokalne sygnały Ca2+ indukowane przez bakterie w szerokim zakresie kinetyki infekcji.

Obrazowanie odpowiedzi Ca2+ podczas zakażenia komórek nabłonkowych Shigella

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

Ogólnym celem tej analizy mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu sond chemicznych jest analiza lokalnych i globalnych odpowiedzi wapnia wywołanych przez komórki gospodarza podczas infekcji patogenną Shigella. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu mikrobiologii komórkowej, takie jak sygnalizacja indukowana przez patogeny prowadząca do reorganizacji cytoszkieletu lub śmierci komórki. Główną zaletą tej techniki jest to, że za pomocą sond chemicznych można śledzić lokalne sygnały wapniowe związane z lokalnymi procesami przekierowanymi przez patogen.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z ustawieniem parametrów, które umożliwiają śledzenie lokalnych sygnałów wapnia przy jednoczesnym zachowaniu integralności próbek biologicznych. Na początek umieść Shigella typu dzikiego wyrażającą adhezję AfaE na płytce agarowej z tryptykazą sojową lub TCS zawierającą 0,01% czerwieni Kongo i inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 godzin. Przygotuj kultury wstępne z prążkowanych płytek, wybierając trzy czerwone kolonie i zaszczepiając bulion TCS 75 mikrogramami na mililitr ampicyliny.Hoduj płynne kultury w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min przez 16 godzin. Następnie zaszczepić TCS wstępną kulturą bakteryjną w rozcieńczeniu 1:100. Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z wytrząsaniem przy 200 obr./min przez dwie godziny.Upewnij się, że gęstość optyczna przy 600 nanometrach wynosi od 0,2 do 0,4. Odwirować kulturę w temperaturze 13 000 g i temperaturze 21 stopni Celsjusza przez dwie minuty i ponownie zawiesić osad w równoważnej objętości pożywki EM. Rozcieńczyć zawiesinę bakteryjną w buforze EM przy końcowej średnicy zewnętrznej 600 wynoszącej 0,1 i użyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze 21 stopni Celsjusza i zużyć w ciągu następnych 60 minut.Hoduj komórki HeLa w DMEM z jednym gramem na litr glukozy uzupełnionej 10% FCS i hoduj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 10% CO2. Hoduj komórki TC7 w DMEM z 4,5 gramami na litr glukozy, 10% FCS i aminokwasami endogennymi i hoduj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 10% CO2. W celu utrzymania komórek należy regularnie dzielić komórki, aby uniknąć zahamowania kontaktu wzrostu związanego ze stanami zlewania się.Ma to kluczowe znaczenie dla wysokiego obciążenia sondy wapniowej i wydajności transfekcji. Trypsynizuj i policz komórki TC7. Dzień przed eksperymentem z komórkami HeLa, umieść komórki na sterylnych okrągłych szkiełkach przykrywkowych o średnicy 25 milimetrów w sześciodołkowych płytkach o gęstości trzy razy 10 do pięciu komórek na dołek.Następnie, aby umożliwić polaryzację przed eksperymentami, wysiewaj komórki cztery razy 10 do pięciu komórek na studzienkę i inkubuj je przez pięć do siedmiu dni, wymieniając pożywkę każdego dnia. W dniu eksperymentu usuń pożywkę i użyj jednego mililitra pożywki EM do trzykrotnego umycia komórek. Załaduj komórki trzema mikromolowymi Fluo-4 AM i EM i inkubuj płytki w temperaturze 21 stopni Celsjusza przez 30 minut.Za pomocą buforu EM umyj próbki trzy razy, a następnie dodaj jeden mililitr buforu EM i inkubuj komórki w temperaturze 21 stopni Celsjusza, aby umożliwić hydrolizę ugrupowania AM. Umieścić szkiełko nakrywkowe zawierające komórki obciążone Fluo-4 w komorze obrazowania lub komorze ze szklanym dnem. Użyj buforu EM, aby trzykrotnie przepłukać próbkę w celu usunięcia związków potencjalnie powstałych w wyniku lizy komórek.Następnie dodaj jeden mililitr buforu EM. Umieść komorę na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego z odwróconą wodą podgrzanym do 33 stopni Celsjusza. Wybierz pole mikroskopowe i ustaw parametry akwizycji, w tym czas ekspozycji i kategoryzację, jeśli to konieczne, aby zoptymalizować sygnał fluorescencyjny Fluo-4.Aby dodać bakterie do próbki, ostrożnie usuń 500 mikrolitrów buforu EM z komory i dodaj 500 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej, aby uzyskać końcowy OD 600 0,05. Natychmiast wykonaj akwizycję lub odczekaj 10 minut, aby bakterie mogły osiąść na komórkach. Na końcu strumienia akwizycji uzyskaj obraz wybranego pola z kontrastem fazowym, aby uwidocznić bakterie stykające się z komórkami oraz zmarszczki błony związane z miejscami inwazji bakterii.Powtarzaj procedurę akwizycji w odstępach czasu, które są zależne od czasu trwania akwizycji obrazu, zapisania plików i wyboru nowego pola, które obejmuje cały proces. Pod koniec procedury pobierania dodać do próbki dwa mikromole jonoforu wapnia jonomycyny w celu określenia maksymalnej amplitudy sygnałów wapniowych. Rejestruj obrazy co trzy do pięciu sekund, aż sygnał się ustabilizuje, zwykle na mniej niż 10 minut.Następnie dodaj chelator wapnia EGTA do końcowego stężenia 10 milimolów, aby określić sygnał fluorescencyjny przy braku wapnia. Rejestruj obrazy co trzy do pięciu sekund, aż do ustabilizowania sygnału, zwykle przez mniej niż 10 minut. Przeprowadź analizę obrazu zgodnie z protokołem tekstowym.W tym eksperymencie komórki HeLa załadowane Fluo-4 poddano prowokacji Shigelli typu dzikiego i przeprowadzono akwizycje strumienia w celu analizy sygnałów wapniowych. Seria zdjęć poklatkowych intensywności fluorescencji sondy Fluo-4 jest uśredniana w obszarze zainteresowania pojedynczej komórki i pokazywany jest odpowiedni obraz z kontrastem fazowym. W miejscu inwazji Shigella obserwuje się nietypowy miejscowy wzrost wolnego wapnia cytozolowego o różnej amplitudzie i czasie trwania od 2,5 do pięciu sekund, po którym następuje globalny wzrost zakażonej komórki.W tym przykładzie izogeniczny zmutowany szczep, z niedoborem efektora IpgD typu III, fosfatazy fosfatydylo-4, 5-bisfosforanowej, wywołał bardziej globalne i mniej nietypowe reakcje miejscowe o długim czasie trwania w porównaniu ze szczepem Shigella typu dzikiego. Jak widać w tym eksperymencie, obrazowanie globalnych odpowiedzi wapnia w rozszerzonej kinetyce infekcji wykazało spadek częstości odpowiedzi 30 minut po prowokacji Shigella typu dzikiego. Wreszcie, kwantyfikacja zależnych od dawki odpowiedzi komórek na histaminę agonistyczną wapnia ilustruje hamowanie zależnego od trifosforanu inozytolu uwalniania wapnia w późnych stadiach infekcji Shigella.Zgodnie z tą procedurą, wszystkie metody jednocześnie łączą kompatybilne płyny i obrazują w celu uwzględnienia roli sygnałów wapniowych w danym procesie. Nie zapominaj, że praca z patogenami może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak usuwanie odpadów, czyszczenie zanieczyszczonych powierzchni lub sprzętu.

imaging-ca2-responses-during-shigella-infection-of-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Vonaesch, P. i in., Analiza immunofluorescencji powstawania ziaren stresowych po bakteryjnym wyzwaniu komórek ssaków. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje zakażenie komórek nabłonkowych patogenną bakterią Shigella flexneri oraz powstałą w wyniku tego odpowiedź komórkową gospodarza. Bakteryjne białka efektorowe zakłócają translację gospodarza, wywołując powstawanie organelli bez błony zwanej granulami stresowymi, które odzwierciedlają adaptacyjną odpowiedź komórki na infekcję.

Tworzenie ziaren stresowych podczas infekcji komórek nabłonka nowotworowego Shigella

Source: Poore, K., et al. Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates an in vitro assay to assess Shigella invasion and intracellular replication in human colonic epithelial monolayers. It highlights steps for infection, antibiotic selection, host cell lysis, and recovery of intracellular bacteria for downstream analysis.

Intracellular Replication Assay for Shigella in Human Colonic Epithelial Cells

Ten film demonstruje technikę wykrywania lokalnej i globalnej reakcji jonów wapnia na zakażenie Shigella ludzkimi komórkami nabłonkowymi. Shigella atakuje komórki gospodarza i uwalnia efektory inwazji, wpływając na wewnątrzkomórkowy poziom wapnia. Amplitudę i częstość lokalnego i globalnego cytozolowego wapnia bada się za pomocą wskaźnika fluorescencyjnego.

Technika obrazowania do badania odpowiedzi wapnia w komórkach zakażonych bakteriami

Opisujemy metodę śledzenia pęknięcia błony wewnętrznej wywołanego przez wewnątrzkomórkowe bakterie Shigella flexneri i Mycobacterium tuberculosis po inwazji komórek gospodarza. Nasz test wykorzystuje CCF4, cytoplazmatyczną sondę FRET gospodarza w żywych lub utrwalonych komórkach. Ten reporter jest degradowany przez aktywność enzymatyczną obecną na powierzchni bakterii.

Pomiary pojedynczych komórek pęknięcia wakuolarnego spowodowanego przez patogeny wewnątrzkomórkowe

Aby przeciwdziałać rozprzestrzenianiu się patogenów, komórki gospodarza reorganizują swój cytoszkielet, aby podzielić bakterie na grupy i wywołać autofagię. Za pomocą zakażenia Shigella komórek hodowli tkankowej identyfikowane i charakteryzowane są determinanty gospodarza i patogenu leżące u podstaw tego procesu. Korzystając z modeli zakażenia Shigella danio pręgowanego, bada się rolę odkrytych cząsteczek i mechanizmów in vivo.

Zastosowanie Shigella flexneri do badania interakcji autofagia-cytoszkielet

Obecny protokół opisuje testy infekcji do badania przestrzegania Shigella, inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej przy użyciu linii komórkowych nabłonka in vitro.

Analizy zakażeń komórek nabłonkowych preparatem Shigella

Komórki M w wyspecjalizowanym nabłonku związanym z mieszykami, pokrywającym kępki Peyera, odgrywają istotną rolę w nadzorze immunologicznym błony śluzowej w tkance limfatycznej związanej z jelitami. W niniejszej pracy opisaliśmy metodę oceny transcytozy bakteryjnej przez komórki M in vivo. Metoda ta pozwala na zrozumienie funkcji komórek M w układzie odpornościowym.

Zastosowanie testu pętli jelitowej z podwiązaną plamką Peyer’a u myszy do oceny wychwytu bakterii przez komórki M

Opisujemy metodę szybkiej izolacji pierwotnych pęcherzykowych komórek nabłonkowych typu II (AECII) myszy za pomocą negatywnej selekcji cytometrycznej. Uzyskane komórki AECII wykazują wysoką żywotność oraz czystość i nadają się do szerokiego zakresu badań funkcjonalnych i molekularnych dotyczących ich roli w schorzeniach układu oddechowego, takich jak choroby autoimmunologiczne lub zakaźne.

Izolacja pierwotnych komórek nabłonkowych pęcherzyków płucnych typu II myszy metodą cytometrii przepływowej do badań funkcjonalnych i molekularnych

Opisano kolonizację mysiego nosogardzieli Streptococcus pneumoniae i późniejszą ekstrakcję przylegających lub zrekrutowanych komórek. Technika ta polega na przepłukiwaniu nosogardzieli i zbieraniu płynu przez nozdrza i można ją dostosować do różnych odczytów, w tym różnicowej kwantyfikacji komórek i analizy ekspresji mRNA in situ.

Charakterystyka reakcji zapalnych podczas kolonizacji donosowej Streptococcus pneumoniae

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę izolowania komórek prezentujących antygen z ludzkiej grasicy poprzez różne etapy enzymatycznego trawienia tkanki, następnie gęstości odwirowania zawiesiny pojedynczej komórki i na końcu magnetycznego i/lub FACS sortowania interesujących populacji komórek.

Izolacja mieloidalnych komórek dendrytycznych i komórek nabłonkowych z ludzkiej grasicy

Poznaj metodę mikroskopii fluorescencyjnej do wizualizacji sygnałów wapniowych w komórkach HeLa zakażonych Shigella. Technika ta pozwala charakteryzować lokalne i globalne odpowiedzi Ca²⁺ podczas infekcji bakteryjnej.

Obrazowanie odpowiedzi Ca²⁺ podczas zakażenia komórek nabłonkowych Shigella

Przeglądaj więcej filmów