Kriowycinki siatkówki, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowane preparaty naczyniowe do immunohistochemicznej wizualizacji perycytów mikronaczyniowych

Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie okulistyki, takie jak proliferacja lub migracja perycytów. Główną zaletą tych procedur jest to, że zapewniają one różnorodne opcje wizualizacji. Procedury zademonstrują Karin Dreisig i Frank W. Blixt, dwoje post-doców w naszym laboratorium.

Aby wyłuszczyć oko, najpierw użyj skalpela, aby zrobić tylne i przednie szczeliny o długości około 0,5 centymetra w powiece szczura. Chwyć oko kleszczami i ostrożnie przechyl na bok, aby odsłonić otaczającą tkankę. Wyłuszczyć oko, wykonując nacięcia nożyczkami preparacyjnymi w tkance łącznej i mięśniowej.

Na krótko umieść oko w 4% formaldehydzie i soli fizjologicznej buforowanej fosforanami na jedną do dwóch minut. Spłucz krótko w buforze sodowym przed wykonaniem otworu w rąbku rogówki, lekko uciskając końcówką skalpela. Przeciąć wzdłuż rąbka rogówki nożyczkami preparacyjnymi, aby usunąć rogówkę i soczewkę za pomocą kleszczy.

Zanurz pozostałą tkankę z siatkówką w 4% formaldehydzie w PBS na dwie do czterech godzin. Krio-ochrona tkanki poprzez zanurzenie w buforze fosforanowym Sorensona zawierającym 10% sacharozy, a następnie 25% sacharozy. Przenieś chusteczkę, gdy opadnie na dno pojemnika.

Zanurz w podłożu Yazulla przygotowanym z 3% żelatyny ze skóry świni i 30% albuminy z białka jaja kurzego. Następnie przetnij 10-mikronowe pionowe kriosekcje siatkówki osadzonej w żelatynie do nerwu wzrokowego. Umieść kriosekcje na szklanym szkiełku i pozostaw do wyschnięcia na co najmniej godzinę.

Po wyschnięciu zanurz szkiełko w PBS z 0,25%Triton-X 100 na 15 minut. Następnie wlej mieszaninę przeciwciał pierwszorzędowych 1:100 receptora beta PDGF i 1:500 NG2 w PBST i 1% BSA na kriosekcję i umieść w wilgotnej komorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza na noc. Następnego dnia umyj sekcje, zanurzając szkiełko w PBST dwa razy na 15 minut za każdym razem.

Następnie wlej mieszaninę przeciwciał drugorzędowych 1:100 Anti-Mouse Alexa Fluor 594 i 1:100 Anti-Rabbit FITC połączonych rozcieńczonych w PBST z 3% BSA na kriosekcje i inkubuj przez godzinę w ciemności. Po inkubacji przepłukać szkiełko podstawowe w PBST dwa razy przez 15 minut za każdym razem. Zamontuj poplamione kriosekcje za pomocą zapobiegającego blaknięciu podłoża montażowego zawierającego DAPI i szkiełko nakrywkowe.

Drugą techniką preparacji tkanki siatkówki jest całościowy montaż. Po usunięciu rogówki użyj niewielkich ruchów kleszczy, aby oddzielić siatkówkę od nabłonka barwnikowego siatkówki w kierunku nerwu wzrokowego. Uwolnij siatkówkę na nerwie wzrokowym za pomocą nożyczek preparacyjnych i wykonaj trzy do czterech nacięć o długości kilku milimetrów od obwodu siatkówki w kierunku głowy nerwu wzrokowego.

Rozłóż siatkówkę na szklanym szkiełku i pozostaw do wyschnięcia na pięć do 10 minut. Wlej 4% formaldehydu na siatkówkę i utrwalaj przez 20 do 30 minut. Po utrwaleniu spłukać PBS.

Aby uzyskać optymalne rezultaty, barwnik immunologiczny bezpośrednio po spłukaniu. Najpierw wlej PBST na całą matrycę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Odlej PBST, a następnie dodaj roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i inkubuj w wilgotnej komorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia odlej przeciwciało pierwotne i wlej PBST, aby przepłukać siatkówkę dwa razy przez 15 minut za każdym razem. Po wylaniu drugiego płukania wlej roztwór przeciwciał wtórnych na siatkówkę i inkubuj przez godzinę w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej w ciemności. Po wtórnej inkubacji przeciwciał przemyć dwukrotnie PBST, tak jak poprzednio.

Zamontuj poplamioną całość za pomocą antyblakującego medium montażowego zawierającego DAPI i szkiełko nakrywkowe. Alternatywą dla całego montażu siatkówki, unaczynienie siatkówki można wyizolować za pomocą izolacji hipotonicznej. Najpierw umieść siatkówkę w jednym mililitrze dejonizowanej wody na 24-dołkowej płytce i potrząsaj z prędkością 200 obr./min z 1,5-milimetrową orbitą wibracyjną przez godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie dodaj 200 jednostek DNAzy 1, aby oddzielić zlizowane resztki komórek od układu naczyniowego siatkówki i wstrząsaj przez kolejne 30 minut w temperaturze pokojowej.

Opłucz siatkówkę w dejonizowanej wodzie trzy razy przez pięć minut, z potrząsaniem z prędkością od 150 do 300 obr./min, aby usunąć resztki komórek nerwowych. Siatkówka powinna stawać się bardziej przezroczysta z każdym płukaniem, co wskazuje na usuwanie resztek komórek neuronalnych. Po spłukaniu utrwalić siatkówkę w jednym mililitrze 4% paraformaldehydu i PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Spłucz PBS trzy razy. Jeśli przystępujesz do barwienia immunologicznego, zablokuj izolowane hipotonicznie naczynia krwionośne 500 mikrolitrami 10% surowicy osła rozcieńczonej w PBS na jedną godzinę z wytrząsaniem przy 100 obr./min. Po zablokowaniu inkubować siatkówkę przez noc w 600 mikrolitrach roztworu przeciwciała pierwszorzędowego składającego się z przeciwciał pierwszorzędowych 1:100 beta receptora PDGF i 1:500 NG2 rozcieńczonych w 10% surowicy osła i PBS.

Następnego dnia przepłucz sieć siatkówki trzy razy w PBS przez pięć minut za każdym razem, a następnie inkubuj w 1:100 przeciwciałach drugorzędowych połączonych z anty-myszem Alexa Fluor 594th i 1:100 Anti-Rabbit FITC, rozcieńczonych w 10% surowicy osła i PBS z wytrząsaniem przy 100 obr./min w temperaturze pokojowej przez godzinę w ciemności. Po pięciominutowym myciu w PBST inkubować w DAPI i PBST o stężeniu 0,2 nanograma na mililitr przez 15 minut. Umyć trzy razy przez pięć minut PBST, chroniąc przed światłem.

Następnie odetnij końcówkę plastikowej pipety Pasteura. Usuń ostre krawędzie za pomocą końcówki pipety i zwilż pipetę Pasteura PBST, a następnie odessaj naczynia krwionośne siatkówki do pipety i dozuj do szkiełka z czterema dołkami. Etap nawilżania jest ważny, aby uniknąć przywierania układu naczyniowego siatkówki do wnętrza pipety Pasteura.

Ustaw układ naczyniowy siatkówki, przechylając suwak komory do przodu i do tyłu. Usunąć pożywkę z dołków szkiełka komorowego. Napięcie powierzchniowe cieczy spłaszczy naczynia krwionośne na dnie szkiełka.

W razie potrzeby wlej krople płynu na naczynia krwionośne siatkówki, aby się rozłożyły. Upewnij się, że rozkładasz się prawidłowo pod mikroskopem przed wyjęciem plastikowych studzienek ze szkiełka komory. Zamontuj poplamione naczynia krwionośne za pomocą środka montażowego zapobiegającego blaknięciu i szkiełka nakrywkowego.

Immunohistochemia NG2 ujawnia dodatnie naczynia w wewnętrznej części siatkówki. Strzałki wskazują okrągłą i podkowiastą immunoreaktywność w naczyniach. Grot strzały wskazuje na wzdłużnie przecięte naczynie.

Immunohistochemia receptora beta PDGF wykazuje podobną immunoreaktywność do NG2. Ponownie strzałki i grot strzałki wskazują na immunoreaktywność w naczyniach. To zdjęcie pokazuje połączenie NG2 na zielono, PDGF-receptor beta na czerwono i DAPI na niebiesko.

Nakładając na siebie trzy różne filtry, okazuje się, że NG2 i receptor beta PDGF są kolokowane. To zdjęcie przedstawia immunologicznie wybarwiony preparat w całości z barwieniem NG2 na czerwono. Immunoreaktywność jest widoczna wzdłuż powierzchownej sieci naczyniowej z intensywnym barwieniem w perycytach abluminalnych.

Komórki neuronalne są widoczne jako niebieskie jądra DAPI pomiędzy mikrokrążeniem barwionym NG2. Ten obraz przedstawia hipotoniczną izolowaną sieć naczyniową siatkówki szczura zabarwioną NG2 na zielono i receptorem PDGF beta na czerwono. Cała sieć wykazała immunoreaktywność NG2.

Immunoreaktywność receptora beta PDGF stwierdzono w somiach komórkowych. Przy większym powiększeniu jasne jest, że barwienie receptora beta PDGF jest widoczne tylko w soma komórkowym w sieci naczyniowej, co wskazuje na immunoreaktywność perycytów. Łącznie z barwieniem DAPI wraz z NG2 i receptorem PDGF beta ujawnia trzy perycyty w dwóch niezdefiniowanych komórkach ściany naczynia na tym obrazie w dużym powiększeniu.

Po tych procedurach można zastosować inne barwienia immunologiczne, takie jak barwienie komórek mięśni gładkich lub śródbłonka, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania. Na przykład, jak wyglądają komórki w unaczynieniu siatkówki po niedokrwieniu?