Name: Kriowycinki siatkówki, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowane preparaty naczyniowe do immunohistochemicznej wizualizacji perycytów mikronaczyniowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Poznaj trzy techniki przygotowania tkanek siatkówki szczura do immunohistochemicznej wizualizacji perycytów mikronaczyniowych: kriowycinki, całe wierzchowania i hipotoniczna izolacja naczyń.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badania zostały sfinansowane przez Fundację Lundbeck, Dania.

Protokół został zoptymalizowany i zademonstrowany na dorosłych samcach szczurów albinosów. We wszystkich procedurach eksperymentalnych zwierzęta były traktowane zgodnie z przepisami zawartymi w Oświadczeniu ARVO dotyczącym wykorzystywania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych. Zwierzęta zostały poddane eutanazji przez dwutlenek węgla, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
1. Preparaty tkanki siatkówki szczura
<ol>
	<li>Kriosekcja
	<ol>
		<li>Wykonaj skalpelem tylne i przednie ~0,5 cm szczeliny w powiece szczura.
		<ol>
			<li>Opcjonalnie: Za pomocą palnika do diatermii oznacz oko pod kątem wewnętrznym, aby ustawić oko w jednolity sposób podczas osadzania i umożliwić pionowe przecięcie kriostatu przez nerw wzrokowy.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Chwyć oko kleszczami i ostrożnie przechyl na bok, aby odsłonić otaczającą tkankę. Wyłuszczyć oko, wykonując nacięcia nożyczkami preparacyjnymi w tkance łącznej i mięśniowej. 
		UWAGA: Nie ciągnij oka zbyt mocno, ponieważ nadmierny nacisk na nerw wzrokowy może spowodować odwarstwienie siatkówki.</li>
		<li>Umieść oko na krótko w 4% formaldehydzie w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), aby ustabilizować się przed wykonaniem początkowego otworu w rąbku rogówki, wywierając lekki nacisk końcówką skalpela.</li>
		<li>Pod mikroskopem przeciąć wzdłuż rąbka rogówki nożyczkami preparacyjnymi w celu usunięcia rogówki i usunąć soczewkę kleszczami, a następnie zanurzyć w 4% formaldehydzie w PBS na 2-4 godziny.</li>
		<li>Przepłukać kolejno w buforze fosforanowym Sörensena z 10% sacharozą i 25% sacharozą.</li>
		<li>Zanurz w pożywce Yazulla przygotowanej z 3% żelatyny ze skóry świni i 30% albuminy z białka jaja kurzego. 
		UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu przy przechowywaniu tkanek w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Całe mocowanie
	<ol>
		<li>Wykonaj skalpelem tylne i przednie szczeliny ~0,5 cm w powiece szczura.</li>
		<li>Chwyć oko kleszczami i ostrożnie przechyl na bok, aby odsłonić otaczającą tkankę. Wyłuszczyć oko, wykonując nacięcia nożyczkami preparacyjnymi w tkance łącznej i mięśniowej. 
		UWAGA: Nie ciągnij oka zbyt mocno, ponieważ nadmierny nacisk na nerw wzrokowy może spowodować odwarstwienie siatkówki.</li>
		<li>Umieść oko na krótko w 4% formaldehydzie w PBS, aby ustabilizować się przed wykonaniem początkowego otworu w rąbku rogówki, wywierając lekki nacisk końcówką skalpela.</li>
		<li>Pod mikroskopem przeciąć wzdłuż rąbka rogówki nożyczkami preparacyjnymi, aby usunąć rogówkę i usunąć soczewkę za pomocą kleszczy.</li>
		<li>Oddziel siatkówkę od nabłonka barwnikowego siatkówki w kierunku nerwu wzrokowego za pomocą kleszczy, wykonując małe ruchy otwierające, aby uniknąć poważnego rozdarcia.</li>
		<li>Uwolnij siatkówkę na nerwie wzrokowym za pomocą nożyczek preparacyjnych i wykonaj cztery szczeliny o długości kilku milimetrów od obwodu siatkówki w kierunku głowy nerwu wzrokowego.</li>
		<li>Rozłóż siatkówkę na szkiełku podstawowym i pozostaw do wyschnięcia na 5–10 minut.</li>
		<li>Utrwal 4% formaldehydu przez 20–30 minut, kapiąc formaldehyd na siatkówkę. 
		UWAGA: Nie nakładaj bezpośrednio na siatkówkę, ponieważ może ona oderwać się od szkła.</li>
		<li>Spłucz PBS. Aby uzyskać optymalne rezultaty, barwnik immunologiczny bezpośrednio po spłukaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja hipotoniczna
	<ol>
		<li>Wykonaj skalpelem tylne i przednie szczeliny ~0,5 cm w powiece szczura.</li>
		<li>Chwyć oko kleszczami i ostrożnie przechyl na bok, aby odsłonić otaczającą tkankę. Wyłuszczyć oko, wykonując nacięcia nożyczkami preparacyjnymi w tkance łącznej i mięśniowej. 
		UWAGA: Nie ciągnij oka zbyt mocno, ponieważ nadmierny nacisk na nerw wzrokowy może spowodować odwarstwienie siatkówki.</li>
		<li>Wykonaj początkowy otwór w rąbku rogówki, lekko uciskając końcówką skalpela.</li>
		<li>Pod mikroskopem przeciąć wzdłuż rąbka rogówki nożyczkami preparacyjnymi, aby usunąć rogówkę i usunąć soczewkę za pomocą kleszczy.</li>
		<li>Oddziel siatkówkę od nabłonka barwnikowego siatkówki w kierunku głowy nerwu wzrokowego za pomocą kleszczy, wykonując małe ruchy otwierające, aby uniknąć poważnego rozdarcia.</li>
		<li>Uwolnij siatkówkę na nerwie wzrokowym za pomocą nożyczek preparacyjnych, umieść siatkówkę w 1 ml dejonizowanej wody na 24-dołkowej płytce i potrząsaj z prędkością 200 obr./min z orbitą wibracyjną 1,5 mm przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: W dalszej części siatkówki siatkówka będzie wydawała się mniej wyraźna na krawędziach.</li>
		<li>Dodać 200 U DNAzy 1, aby oddzielić zlizowane resztki komórkowe od układu naczyniowego siatkówki i wstrząsać przez kolejne 30 minut w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: W studniach mogą zacząć tworzyć się zanieczyszczenia.</li>
		<li>Płukać co najmniej 3 razy w wodzie dejonizowanej przez 5 minut, wstrząsając z prędkością 150–300 obr./min, aby usunąć resztki komórek nerwowych. Siatkówka powinna stawać się bardziej przezroczysta z każdym płukaniem, co wskazuje na usuwanie resztek komórek neuronalnych.
		<ol>
			<li>Użyj ciemnego tła, aby spojrzeć w 24-dołkową płytkę, aby wyraźnie zobaczyć przeźroczyste, izolowane unaczynienie siatkówki.</li>
			<li>(Opcjonalnie): Jeśli w tym momencie układ naczyniowy nie wydaje się wolny od warstw neuronalnych (półprzezroczysty), dodaj więcej etapów płukania, zwiększ prędkość wytrząsania lub użyj pipety do zasysania płynu do układu krwionośnego. 
			UWAGA: Każdy z opcjonalnych kroków może uszkodzić naczynia krwionośne.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Utrwalić 10 minut w 1 ml 4% paraformaldehydu w PBS w temperaturze pokojowej i spłukać 3 razy w PBS. 
		UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu z przechowywaniem tkanek w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Immunohistochemia
<ol>
	<li>Barwienie kriosekcji
	<ol>
		<li>Wyciąć krioskrawki siatkówki zanurzonej w żelatynie o grubości 10 μm jako pionowe przecięcie przez nerw wzrokowy i umieścić krioskruchy na szkiełku podstawowym i pozostawić do wyschnięcia (minimum 1 h).</li>
		<li>Zanurz szkiełko w PBS z 0,25 % Triton X-100 (PBS-T) na 15 minut.</li>
		<li>Kroplówkę 1:100 PDGFRβ i 1:500 NG2 przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczone w PBS-T + 1% BSA na kriosekcję i inkubować w komorach inkubacyjnych w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Zanurz szklane szkiełko 2 razy w PBS-T na 15 minut i wlej 1:100 anty-mysich przeciwciał drugorzędowych połączonych z Alexa Fluor 594 i 1:100 anty-króliczych FITC rozcieńczonych w PBS-T z 3% BSA na kriosekcje.</li>
		<li>Inkubować szkiełko szkiełkowe przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
		<li>Wypłukać szkiełko podstawowe w PBS-T 2x 15 min. 
		UWAGA: Opcjonalnie: W przypadku podwójnego i potrójnego barwienia immunofluorescencyjnego barwienie sekwencyjne można przeprowadzić, powtarzając procedurę od 2.1.3 do 2.1.6 odpowiednio dwa i trzy razy.</li>
		<li>Zamontuj poplamione kriosekcje za pomocą zapobiegającego blaknięciu medium montażowego zawierającego DAPI i szkiełko nakrywkowe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie całego mocowania
	<ol>
		<li>Wlać PBS-T na całą matrycę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
		<li>Odlać i ociekać 1:100 PDGFRβ i 1:500 NG2 przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w PBS-T + 1% BSA i inkubować w wilgotnych komorach w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Odlewać i wlać na PBS-T, aby przepłukać szkiełko w czasie 2x 15 min.</li>
		<li>Odlewać i wlać 1:100 anty-królikowe przeciwciało drugorzędowe Cy2 i 1:100 anty-mysie przeciwciało wtórne sprzężone z Cy3 rozcieńczone w PBS-T z 3% BSA do inkubacji przez 1 godzinę w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
		<li>Odlewać i wlać na PBS-T do spłukania w 2x 15 min w ciemności. 
		UWAGA: Opcjonalnie: W przypadku podwójnego i potrójnego barwienia immunofluorescencyjnego barwienie sekwencyjne można przeprowadzić, powtarzając procedurę od 2.2.2 do 2.2.5 odpowiednio dwa i trzy razy.</li>
		<li>Zamontuj poplamioną całość za pomocą zapobiegającego blaknięciu medium montażowego zawierającego DAPI i szkiełko nakrywkowe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie hipotonicznego izolowanego naczynia krwionośnego
	<ol>
		<li>Zablokować hipotoniczny izolowany układ krwionośny przez 1 godzinę wytrząsaniem przy prędkości 100 obr./min i temperaturze pokojowej za pomocą 500 μl/basenik 10 % surowicy osła rozcieńczonej w PBS.</li>
		<li>Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej i wstrząsać z prędkością 100 obr./min z 600 μl/basenik 1:100 PDGFRβ i 1:500 NG2 przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w 10% surowicy osła w PBS.</li>
		<li>Przepłukać sieć siatkówki 3x w PBS przez 5 minut i inkubować w 1:100 przeciwciałach drugorzędowych anty-mysich Alexa Fluor 594 i 1:100 anty-króliczych FITC, rozcieńczonych w 10% surowicy osła w PBS, wytrząsając z prędkością 100 obr./min i temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w ciemności.</li>
		<li>Płukać w PBS-T przez 5 minut i inkubować w 0,2 ng/ml DAPI w PBS-T przez 15 minut, a następnie płukać 3 x 5 minut w PBS-T w ciemności.</li>
		<li>Odetnij końcówkę plastikowej pipety Pasteura, zwilż ją PBS-T i użyj do przeniesienia sieci siatkówki do 4-dołkowego szkiełka podstawowego. 
		UWAGA: Etap nawilżania jest ważny, aby uniknąć przywierania naczyń krwionośnych siatkówki do wnętrza pipety Pasteura.</li>
		<li>Rozłóż naczynia krwionośne siatkówki. Unikaj dotykania unaczynienia siatkówki kleszczami, ponieważ może to spowodować splątanie się układu krwionośnego. 
		UWAGA: Rozkładanie można wykonać poprzez przechylanie suwaka komory do przodu i do tyłu lub zasysanie kropli płynu na naczynia krwionośne siatkówki.</li>
		<li>Usuń pożywkę z dołków. Napięcie powierzchniowe cieczy spłaszczy naczynia krwionośne na dnie szkiełka.</li>
		<li>Upewnij się, że rozkładasz się prawidłowo pod mikroskopem przed wyjęciem plastikowych studzienek ze szkiełka komory.</li>
		<li>Zamontuj poplamione naczynia krwionośne za pomocą środka montażowego zapobiegającego blaknięciu i szkiełka nakrywkowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Eshaq, R. S., Aldalati, A. M. Z., Alexander, J. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+retinopathy%3A+Breaking+the+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Pathophysiology%22%5BJournal%5D)">Diabetic retinopathy: Breaking the barrier.</a> Pathophysiology. , (2017).</li>
<li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+in+Brain+Injury+and+Repair+After+Ischemic+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Stroke+Research%22%5BJournal%5D)">Pericytes in Brain Injury and Repair After Ischemic Stroke.</a> Translational Stroke Research. , (2016).</li>
<li>Trost, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+and+Retinal+Pericytes%3A+Origin%2C+Function+and+Role%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Brain and Retinal Pericytes: Origin, Function and Role.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 20(2016).</li>
<li>Ramos, D., et al. The Use of Confocal Laser Microscopy to Analyze Mouse Retinal Blood Vessels. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRamos%2C+D+%22Confocal+Laser+Microscopy+-+Principles+and+Applications+in+Medicine%2C+Biology%2C+and+the+Food+Sciences%22">Confocal Laser Microscopy - Principles and Applications in Medicine, Biology, and the Food Sciences</a>. Lagali, N. , InTech. (2013).</li>
<li>Moran, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+cross+talk+in+diabetic+retinopathy%3A+Pathophysiological+roles+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiolog%22%5BJournal%5D)">Neurovascular cross talk in diabetic retinopathy: Pathophysiological roles and therapeutic implications.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiolog. 311, H738-H749 (2016).</li>
<li>Henkind, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/5357346">Microcirculation of the peripapillary retina.</a> Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 73, 890-897 (1969).</li>
<li>Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+a+pericyte%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">What is a pericyte?</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36, 451-455 (2016).</li>
<li>Fernandez-Bueno, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+Characterization+of+Retina+Neuroglia+Modifications+in+Diabetic+Zucker+Diabetic+Fatty+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Histologic Characterization of Retina Neuroglia Modifications in Diabetic Zucker Diabetic Fatty Rats.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58, 4925-4933 (2017).</li>
<li>Yu, D. -Y., Yu, P. K., Cringle, S. J., Kang, M. H., Su, E. -N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+morphological+characteristics+of+the+retinal+and+choroidal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Functional and morphological characteristics of the retinal and choroidal vasculature.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 40, 53-93 (2014).</li>
<li>Allen, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severity+of+middle+cerebral+artery+occlusion+determines+retinal+deficits+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats.</a> Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).</li>
<li>Kyhn, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+retinal+ischemia+caused+by+controlled+low+ocular+perfusion+pressure+in+a+porcine+model.+Electrophysiological+and+histological+characterisation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Acute retinal ischemia caused by controlled low ocular perfusion pressure in a porcine model. Electrophysiological and histological characterisation.</a> Experimental Eye Research. 88, 1100-1106 (2009).</li>
<li>Blixt, F. W., Radziwon-Balicka, A., Edvinsson, L., Warfvinge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+CGRP+and+its+receptor+components+CLR+and+RAMP1+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Distribution of CGRP and its receptor components CLR and RAMP1 in the rat retina.</a> Experimental Eye Research. 161, 124-131 (2017).</li>
<li>Sarlos, S., Wilkinson-Berka, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+renin-angiotensin+system+and+the+developing+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The renin-angiotensin system and the developing retinal vasculature.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46, 1069-1077 (2005).</li>
<li>Wittig, D., Jaszai, J., Corbeil, D., Funk, R. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+localization+and+characterization+of+putative+mesenchymal+stem+cell+markers+in+the+retinal+capillary+network+of+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical localization and characterization of putative mesenchymal stem cell markers in the retinal capillary network of rodents.</a> Cells Tissues Organs. 197, 344-359 (2013).</li>
<li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50546(2013).</li>
<li>Park, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastic+roles+of+pericytes+in+the+blood-retinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier.</a> Nature Communications. 8, 15296(2017).</li>
<li>Hughes, S., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+smooth+muscle+cell+and+pericyte+differentiation+in+the+rat+retina+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 2795-2806 (2004).</li>
<li>Lange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreal+injection+of+the+heparin+analog+5-amino-2-naphthalenesulfonate+reduces+retinal+neovascularization+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Intravitreal injection of the heparin analog 5-amino-2-naphthalenesulfonate reduces retinal neovascularization in mice.</a> Experimental Eye Research. 85, 323-327 (2007).</li>
<li>Higgins, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diltiazem+reduces+retinal+neovascularization+in+a+mouse+model+of+oxygen+induced+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Diltiazem reduces retinal neovascularization in a mouse model of oxygen induced retinopathy.</a> Current Eye Research. 18, 20-27 (1999).</li>
<li>Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin+digest+protocol+to+analyze+the+retinal+vasculature+of+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50489(2013).</li>
<li>Hazra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+X+receptor+modulates+diabetic+retinopathy+outcome+in+a+mouse+model+of+streptozotocin-induced+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Liver X receptor modulates diabetic retinopathy outcome in a mouse model of streptozotocin-induced diabetes.</a> Diabetes. 61, 3270-3279 (2012).</li>
<li>Zhang, L., Xia, H., Han, Q., Chen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+antioxidant+gene+therapy+on+the+development+of+diabetic+retinopathy+and+the+metabolic+memory+phenomenon%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Effects of antioxidant gene therapy on the development of diabetic retinopathy and the metabolic memory phenomenon.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253, 249-259 (2015).</li>
<li>Dagher, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+rat+and+human+retinas+predict+a+role+for+the+polyol+pathway+in+human+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).</li>
<li>Navaratna, D., McGuire, P. G., Menicucci, G., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+degradation+of+VE-cadherin+alters+the+blood-retinal+barrier+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Proteolytic degradation of VE-cadherin alters the blood-retinal barrier in diabetes.</a> Diabetes. 56, 2380-2387 (2007).</li>
<li>Gustavsson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+cellular+adhesion+molecule-1+%28VCAM-1%29+expression+in+mice+retinal+vessels+is+affected+by+both+hyperglycemia+and+hyperlipidemia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Vascular cellular adhesion molecule-1 (VCAM-1) expression in mice retinal vessels is affected by both hyperglycemia and hyperlipidemia.</a> PLoS One. 5, e12699(2010).</li>
<li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+blood+flow+in+the+retinal+trilaminar+vascular+network%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network.</a> Journal of Neuroscience. 34, 11504-11513 (2014).</li>
<li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinovascular+physiology+and+pathophysiology%3A+new+experimental+approach%2Fnew+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31, 258-270 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiamy trzy techniki preparacji siatkówki, które można zastosować w badaniu mikronaczyniowych perycytów siatkówki. Poniżej przedstawiamy porównanie każdej z metod i podkreślamy krytyczne kroki w protokołach.
W przypadku kriosekcji siatkówka jest cięta w odcinkach strzałkowych, dzięki czemu możliwe jest uzyskanie wielu próbek z tej samej siatkówki. Sekcje cyfrowe wynikające z tej metody sprawiają, że jest to idealny wybór do badania swoistości przeciwciał i miareczkowania, ponieważ zapob...

Perycyty siatkówki są przedmiotem zainteresowania wielu laboratoriów badawczych, ponieważ te komórki odgrywają główną rolę w integralności układu krwionośnego. Stany patologiczne, takie jak retinopatia cukrzycowa1, niedokrwienie2 i jaskra3 mają cechy naczyniowe, które obejmują funkcję perycytów. Perycyty znajdują się w wewnętrznych splotach naczyń włosowatych siatkówki. Centralna tętnica siatkówkowa, która zaopatruje wewnętrzną siatkówkę, rozgałęzia się na dwie warstwy splotów naczyń włosowatych. Wewnętrzne łożysko naczyniowe znajduje się między komórką zwojową a wewnętrznymi warstwami jądrowymi. Głębsza warstwa jest bardziej gęsta i złożona i jest zlokalizowana między wewnętrzną i zewnętrzną warstwą jądrową4,5. Ponadto niektóre części siatkówki zawierają również trzecią sieć zwaną promieniowymi naczyniami włosowatymi przybrodawkowatymi. Są to długie, proste naczynia włosowate, które leżą wśród włókien nerwowych i rzadko łączą się ze sobą lub z pozostałymi dwoma splotami6. W ścianie naczyń włosowatych perycyty są osadzone w błonie podstawnej i wyściełają abluminalną stronę komórek śródbłonka naczyń krwionośnych.
Do dnia dzisiejszego nie ma unikalnego markera biologicznego tych perycytów, który mógłby je odróżnić od innych komórek naczyniowych. Receptor β płytkowego czynnika wzrostu (PDGFRβ) i antygen nerwowy/glejowy 2 (NG2) są powszechnie stosowanymi markerami, które występują zarówno na perycytach, jak i na innych komórkach naczyniowych. Identyfikacja perycytów jest dodatkowo skomplikowana przez istnienie podzbiorów perycytów, które różnią się morfologią i ekspresją białka7. Obecnie najlepsza identyfikacja opiera się na połączeniu markerów białkowych i charakterystycznym umiejscowieniu perycytów w ścianie naczynia krwionośnego. Przedstawiono tutaj trzy różne techniki przygotowania tkanek do immunohistochemicznego barwienia PDGFRβ/NG2 mikrokrążycieli siatkówki szczura, tj. kriosekcji, całych gór i hipotonicznej izolacji sieci naczyniowej.
W przypadku kriosekcji, siatkówka i twardówka są przecinane przez nerw wzrokowy. Pozwala to na wizualizację wszystkich warstwowych struktur neuronów. Wyraźne dziesięć warstw siatkówki jest widocznych jako zamieniające się struktury jądrowe i aksonalne / dendrytyczne, które można uwidocznić za pomocą barwników, takich jak hematoksylina / eozyna lub fluorescencyjny jądrowy 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) <klasa sup = 'xref'>8. Wymagania metaboliczne różnią się między warstwami9 i zapewnia metodę określania grubości lub całkowitego braku określonej warstwy (np. utrata komórek zwojowych siatkówki jest jedną z cech charakterystycznych niedokrwienia siatkówki10,11). Układ naczyniowy jest widoczny jako poprzeczne nacięcia przez siatkówkę, co umożliwia oddzielne badanie splotów naczyń włosowatych w odpowiednich warstwach siatkówki12,13.
Tradycyjnie, badania sieci naczyniowej siatkówki są wykonywane w całych wierzchowcach siatkówki. Dzięki temu preparatowi tkankowemu siatkówka jest cięta i spłaszczana jako struktura w kształcie kwiatu. Metoda ta jest stosunkowo szybką techniką przygotowania tkanek, która może podkreślić ogólną architekturę unaczynienia siatkówki i dlatego jest często stosowana w badaniu neowaskularyzacji w siatkówce myszy. Pomyślna wizualizacja mikrokrążenia w całych siatkówkach jest również zgłaszana w rozwijającej się siatkówce noworodków myszy i szczurów14,15,16,17,18,19. Badania te ujawniają bardziej zdefiniowaną aktywność perycytarną z większymi obszarami wolnymi od naczyń włosowatych u osoby dorosłej w porównaniu z siatkówką noworodka14.
Innym sposobem wizualizacji jest mikrokrążenie siatkówki po izolacji hipotonicznej. Ta technika przygotowania tkanek powoduje uwolnienie naczyń krwionośnych i naczyń włosowatych siatkówki od komórek nerwowych. Ten rodzaj dwuwymiarowego obrazowania izolowanej sieci naczyniowej siatkówki jest zwykle wykonywany po trawieniu trypsyny siatkówki20 i służy do oceny nieprawidłowości naczyniowych retinopatii cukrzycowej, w tym utraty perycytów i zwyrodnienia naczyń włosowatych20,21,22. Metoda izolacji hipotonicznej umożliwia badanie odpowiedzi regulatorowych genów naczyniowych siatkówki i białek, tak jak miało to miejsce w przypadku RT-PCR i western blotting23,24,25. Przedstawiamy tutaj protokół barwienia immunohistochemicznego hipotonicznego izolowanego naczynia siatkówki jako alternatywy dla trawienia trypsyny w celu zbadania perycytów mikronaczyniowych.

<table><tbody><tr><td>Żeletyna ze skóry świni</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2625-500G</td><td></td></tr><tr><td>Albumina z białka jaja kurzego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5253-500G</td><td></td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza (DNAzy) I z trzustki bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-15KU</td><td>Rozpuszczona w 0,15 M NaCl</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>VWR</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica osła</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121, partia 129348</td><td></td></tr><tr><td>Królik anty-PDGFR&beta;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-432</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Mysz anty-NG2</td><td>Abcam</td><td>ab50009</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-585-152</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Fluoresceina (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-151</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-225-152</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-165-150</td><td>1:100</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>Rozpuszczony w DMSO</td></tr><tr><td>Anty-blaknięcie podłoża montażowego</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Anty-blaknięcie medium montażowe z wektorem DAPI</td><td> Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II 4-dołkowy szkiełko komorowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>154526</td><td></td></tr></tbody></table>

kriowycinki siatkówki, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowane preparaty naczyniowe do immunohistochemicznej wizualizacji perycytów mikronaczyniowych

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Perycyty siatkówki odgrywają ważną rolę w wielu chorobach oczu. Techniki barwienia immunohistochemicznego naczyń siatkówki i perycytów mikronaczyniowych mają kluczowe znaczenie dla badań okulistycznych. Bardzo ważne jest, aby wybrać odpowiednią metodę wizualizacji perycytów mikronaczyniowych. Opisujemy barwienie immunohistochemiczne mikronaczyniowe pericytów siatkówki w kriosekcjach, całych wierzchowcach i hipotonicznym izolowanym układzie naczyniowym przy użyciu przeciwciał dla β receptora płytkowego czynnika wzrostu (PDGFRβ) i antygenu nerwowego / glejowego 2 (NG2). Pozwala to na podkreślenie zalet i wad każdego z trzech preparatów tkankowych do wizualizacji perycytów mikronaczyniowych siatkówki. Kriosekcje zapewniają transsekcyjną wizualizację wszystkich warstw siatkówki, ale zawierają tylko kilka sporadycznych poprzecznych nacięć mikrokrążenia. Całościowe mocowanie zapewnia przegląd całego unaczynienia siatkówki, ale wizualizacja mikrokrążenia może być kłopotliwa. Izolacja hipotoniczna zapewnia metodę wizualizacji całego unaczynienia siatkówki poprzez usunięcie komórek neuronalnych, ale to sprawia, że tkanka jest bardzo delikatna.

Skuteczne protokoły zapewniają trzy różne preparaty siatkówki do wizualizacji perycytów mikro naczyniowych. Każda z tych metod wykorzystuje ko-lokalizację immunoreaktywności PDGFRβ i NG2 oraz unikalne położenie perycytów oplatających śródbłonek kapilar w celu ich identyfikacji.
W przypadku skrawków kriotomicznych warstwy neuronów można zidentyfikować według fluorescencyjnej gęstości jąder znakowanych DAPI, a wewnętrzne i głęboki...

Pokazujemy trzy różne techniki przygotowania tkanek do immunohistochemicznej wizualizacji mikrokrążeń siatkówki szczura, tj. kriosekcje, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowanie sieci naczyniowej.

Kriowycinki siatkówki, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowane preparaty naczyniowe do immunohistochemicznej wizualizacji perycytów mikronaczyniowych

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie okulistyki, takie jak proliferacja lub migracja perycytów. Główną zaletą tych procedur jest to, że zapewniają one różnorodne opcje wizualizacji. Procedury zademonstrują Karin Dreisig i Frank W. Blixt, dwoje post-doców w naszym laboratorium.Aby wyłuszczyć oko, najpierw użyj skalpela, aby zrobić tylne i przednie szczeliny o długości około 0,5 centymetra w powiece szczura. Chwyć oko kleszczami i ostrożnie przechyl na bok, aby odsłonić otaczającą tkankę. Wyłuszczyć oko, wykonując nacięcia nożyczkami preparacyjnymi w tkance łącznej i mięśniowej.Na krótko umieść oko w 4% formaldehydzie i soli fizjologicznej buforowanej fosforanami na jedną do dwóch minut. Spłucz krótko w buforze sodowym przed wykonaniem otworu w rąbku rogówki, lekko uciskając końcówką skalpela. Przeciąć wzdłuż rąbka rogówki nożyczkami preparacyjnymi, aby usunąć rogówkę i soczewkę za pomocą kleszczy.Zanurz pozostałą tkankę z siatkówką w 4% formaldehydzie w PBS na dwie do czterech godzin. Krio-ochrona tkanki poprzez zanurzenie w buforze fosforanowym Sorensona zawierającym 10% sacharozy, a następnie 25% sacharozy. Przenieś chusteczkę, gdy opadnie na dno poje

retinal-cryo-sections-whole-mounts-hypotonic-isolated-vasculature

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy artykuł opisuje metodę znakowania naczyń krwionośnych w skórze zarodkowej i grasicy.

Metoda znakowania naczyń krwionośnych u embrionów myszy

Źródło: Vacca, O., et al. Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease. J. Vis. Exp. (2015)W tym filmie zaprezentowano szczegółową procedurę przygotowywania kriosiekcji siatkówki myszy w celu wizualizacji przepuszczalności wirusa towarzyszącego adenowirusom przez uszkodzone bariery siatkówkowe.

Przygotowanie kriosiekcji siatkówki myszy w celu oceny przepuszczalności siatkówki dla wirusa towarzyszącego adenowirusom

Mysia siatkówka noworodka dostarcza dobrze scharakteryzowanego fizjologicznego modelu angiogenezy, który pozwala na badanie ról różnych genów lub leków modulujących angiogenezę w kontekście in vivo. Barwienie immunofluorescencyjne w celu dokładnej wizualizacji splotu naczyniowego ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego typu badań.

Barwienie immunofluorescencyjne siatkówki noworodka myszy w celu zbadania angiogenezy in vivo

Opisany tutaj protokół służy do oceny strukturalnej preparatu całego siatkówki. Obejmuje to opisy rozwarstwiania tkanek, montażu na hydrofilizowanej wkładce membranowej z politetrafluoroetylenu (PTFE), ładowania bolusa markerami fluorescencyjnymi oraz porównanie utrwalania z karbodiimidem i paraformaldehydem do analizy immunohistochemicznej składników komórkowych i synaptycznych.

Zoptymalizowany protokół przygotowania całej siatkówki do obrazowania i immunohistochemii

Ten raport opisuje kompleksowe metody przygotowania zamrożonych wycinków siatkówki myszy do immunohistochemii (IHC).  Opisane metody obejmują rozwarstwienie tylnej części gałki ocznej, utrwalanie paraformaldehydu, osadzanie w pożywkach o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i orientację tkanki, cięcie i barwienie immunologiczne.

Przygotowanie kriosekcji siatkówki myszy do immunohistochemii

Ten artykuł opisuje dobrze sprawdzony i powtarzalny test barwienia lektyny dla całego preparatu siatkówki Mount oraz protokoły wymagane do ilościowego pomiaru parametrów naczyniowych często zmienianych w retinopatiach proliferacyjnych i nieproliferacyjnych.

Kwantyfikacja parametrów naczyniowych w całych siatkówkach górskich myszy z retinopatiami nieproliferacyjnymi i proliferacyjnymi

Ten protokół opisuje niezawodną metodę uzyskiwania wysokiej jakości kriosekcji całych oczu królika. Szczegółowo opisuje procedury sekcji, fiksacji, osadzania i cięcia oczu królika, które można łatwo dostosować do użycia w dowolnym badaniu wykorzystującym immunohistochemię w większych oczach.

Uzyskanie wysokiej jakości kriosekcji całego oka królika

Perycyty w unaczynieniu siatkówki zostały zbadane za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego z receptorem czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego β po retro-orbitalnym wstrzyknięciu fluorescencyjnej lektyny pomidorowej. Znakowaną siatkówkę poddano dalszej obróbce metodą oczyszczania tkanek i zamontowano w całości w celu wizualizacji trójwymiarowych widoków perycytów otaczających naczynia krwionośne siatkówki pod mikroskopem konfokalnym.

Wizualizacja 3D perycytów naczyniowych siatkówki myszy za pomocą immunostainingu

Opisano protokół przygotowania kriosekcji siatkówki myszy i przeprowadzania barwienia immunologicznego na fotoreceptorach. Artykuł ten umożliwia naukowcom konsekwentne wytwarzanie zamrożonych skrawków siatkówki myszy z dobrze zachowaną morfologią i wysokiej jakości wynikami barwienia immunologicznego.

Kriosekcja i barwienie immunologiczne siatkówki myszy

Przedstawiona metoda umożliwia powtarzalne wykonywanie seryjnych cięć w kriosztacie z małych, trudnych w obsłudze fragmentów tkanek, takich jak biopsjaty i skrawki mózgu. Wykorzystujemy prosty aluminiowy blok mrożący, aby ułatwić manipulację tkanką, oraz standardowy kriosztat do rutynowego przygotowywania seryjnych przekrojów o grubości 5-10 micron z fragmentów mózgu o grubości 400 micron.

Przygotowywanie cienkich przekrojów z preparatów slice do immunohistochemii

Poznaj trzy techniki przygotowania tkanek siatkówki szczura do immunohistochemicznej wizualizacji perycytów mikronaczyniowych: kriowycinki, całe wierzchowania i hipotoniczna izolacja naczyń.

Kriowycinki siatkówki, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowane preparaty naczyniowe do immunohistochemicznej wizualizacji perycytów mikronaczyniowych (Wideo) | JoVE Journal

Kriowycinki siatkówki, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowane preparaty naczyniowe do immunohistochemicznej wizualizacji perycytów mikronaczyniowych

Przeglądaj więcej filmów