Name: Ocena roli funkcji mitochondriów w zmęczeniu związanym z rakiem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Poznaj metodę oceny dysfunkcji mitochondriów w zmęczeniu związanym z rakiem u pacjentów onkologicznych. Protokół wykorzystuje standardową flebotomię i podstawowe procedury laboratoryjne do identyfikacji ryzyka toksyczności terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie jest w pełni wspierane przez Wydział Badań Wewnętrznych Narodowego Instytutu Badań Pielęgniarskich NIH, Bethesda, Maryland.

Obecne badanie (NCT00852111) zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board (IRB) of the National Institutes of Health (NIH), Bethesda, Maryland. Uczestnikami włączonymi do tego badania byli mężczyźni eutymiczni w wieku 18 lat lub starsi, u których zdiagnozowano raka gruczołu krokowego bez przerzutów z lub bez wcześniejszej prostatektomii i u których zaplanowano radioterapię wiązką zewnętrzną (EBRT). Potencjalni uczestnicy zostali wykluczeni, jeśli mieli postępującą chorobę, która mogła powodować znaczne zmęczenie, mieli chorobę psychiczną w ciągu ostatnich pięciu lat, mieli nieskorygowaną niedoczynność tarczycy lub niedokrwistość lub mieli drugi nowotwór złośliwy. Wykluczono również osoby, które stosowały środki uspokajające, sterydy lub niesteroidowe środki przeciwzapalne. Zdrowe próbki krwi kontrolnej zostały pobrane na Wydziale Medycyny Transfuzjologicznej NIH od zdrowych dawców zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IRB (NCT00001846). Wszyscy uczestnicy są rekrutowani w Centrum Badań Klinicznych Magnuson w NIH. Podpisane pisemne świadome zgody uzyskano przed udziałem w badaniu.
1. Przygotowanie do pomiaru funkcji mitochondriów (pierwszy dzień eksperymentu)
<ol>
	<li>Wkład z czujnikiem hydratu (patrz tabela materiałów; przybliżony czas trwania: 5 min).
	<ol>
		<li>Wyjmij wkład czujnika z opakowania. Dodaj 200 μl roztworu Calibrant do każdej studzienki płytki użytkowej, a następnie napełnij każdą fosę 400 μl roztworu Calibrant.</li>
		<li>Zwróć płytkę czujnika na tabliczkę narzędziową, w której teraz znajduje się roztwór kalibru. Uwodnić wkład w inkubatorze bez emisji CO2 w temperaturze 37 °C przez noc. 
		UWAGA: Wkład czujnika musi być nawodniony przez co najmniej 4 godziny, a maksymalnie 72 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki klinicznej (dzień 2 eksperymentu)
<ol>
	<li>Zmierz zmęczenie za pomocą 13-punktowej Oceny Funkcjonalnej Terapii Chorób Przewlekłych - Zmęczenie (FACIT-F)2,23,24 na początku badania (przed rozpoczęciem EBRT), punkt środkowy i zakończenie EBRT oraz 1 rok po EBRT.
	<ol>
		<li>Użyj skali od 0 do 4 dla każdej odpowiedzi na pytanie, gdzie 0 oznacza "wcale", a 4 oznacza, że respondent odnosi się do odpowiedniego stwierdzenia "bardzo". Łączne wyniki powinny mieścić się w zakresie od 16 do 53, przy czym niższe wyniki powinny odzwierciedlać wysoką intensywność zmęczenia.</li>
		<li>Zdefiniuj zmęczenie jako wynik FACIT-F niższy niż 43, przy czym wynik FACIT-F ≥43 wskazuje na brak lub brak klinicznie istotnego zmęczenia2. 
		UWAGA: Wynik FACIT-F wynoszący 43 najlepiej dzieli wyniki zmęczenia pacjentów z rakiem i populacji ogólnej2.</li>
		<li>Uwzględnij następujące 13 pozycji w Skali Zmęczenia FACIT: 1) Czuję się zmęczony; 2) Czuję się słaby na całym ciele; 3) Czuję się apatyczny ("wyprany"); 4) Czuję się zmęczony; 5) Mam problem z uruchomieniem rzeczy, ponieważ jestem zmęczony; 6) Mam problem z kończeniem rzeczy, ponieważ jestem zmęczony; 7) Mam energię; 8) Jestem w stanie wykonywać swoje zwykłe czynności; 9) Muszę spać w ciągu dnia; 10) Jestem zbyt zmęczony, aby jeść; 11) Potrzebuję pomocy w wykonywaniu moich zwykłych czynności; 12) Jestem sfrustrowany tym, że jestem zbyt zmęczony, aby robić rzeczy, które chcę robić; oraz 13) Muszę ograniczyć swoją aktywność społeczną, ponieważ jestem zmęczony.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyizolować PBMC ze świeżo pobranych próbek krwi (przybliżony czas trwania: 1 godzina).
	<ol>
		<li>Zebrać 8 ml krwi do probówki do przygotowania komórek jednojądrzastych (patrz tabela materiałów). 
		UWAGA: Próbki krwi należy przetworzyć w ciągu 2 godzin od pobrania. Jakość PBMC może być zagrożona, jeśli próbki krwi są przetwarzane dłużej niż 2 godziny po pobraniu próbki.</li>
		<li>Wirować przy 1 750 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej (18 - 25 °C). Przenieść mętną warstwę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj do 15 ml PBS i odwróć 5 razy.</li>
		<li>Wirować przy 300 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant bez naruszania osadu. Ponownie zawiesić osad, dodając do 10 ml PBS i odwrócić 5 razy.</li>
		<li>Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić ciekły supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS. Przenieś PBMC do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Wirować przy 610 x g przez 10 minut. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w kompletnym RPMI-1640 (RPMI-1640 uzupełniony o 10% FBS, 10 mM penicyliny/streptomycyny).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pokryj płytki komórkowe dla komórek nieprzylegających (przybliżony czas trwania: 30 min).
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór klejący do komórek i tkanek (patrz tabela materiałów), rozcieńczając roztwór podstawowy w 0,1 M wodorowęglanie sodu o pH 8,0. Roztwór roboczy powinien mieć powierzchnię 3,5 μg/cm2. 
		UWAGA: Ten roztwór zawiera białka polifenolowe ekstrahowane z omułka morskiego Mytilus edulis. Białka te są kluczowymi składnikami kleju wydzielanego przez małże, który zakotwicza się na powierzchni. Uważamy, że Cell-Tak działa najlepiej z PBMC.</li>
		<li>Dodać 100 μl rozcieńczonego roztworu kleju do każdego dołka i inkubować przez co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej. Umyj trzy razy wodą DI i wysusz na powietrzu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Pomiar funkcji mitochondriów
<ol>
	<li>Przygotowanie pożywki do oznaczania (przybliżony czas trwania: 10 min). 
	UWAGA: Pożywka do oznaczania musi być świeżo przygotowana w dniu doświadczenia.
	<ol>
		<li>Dodaj L-glutaminę, pirogronian i glukozę do pożywki bazowej (te same składniki, co zmodyfikowana pożywka Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco, ale bez wodorowęglanu sodu, glukozy, glutaminy lub pirogronianu sodu), aby uzyskać pożywkę do oznaczania. Podgrzej podłoże do temperatury 37 °C, a następnie dostosuj pH do 7,4, 
		UWAGA: Stężenia L-glutaminy, pirogronianu i glukozy są zwykle takie same jak stężenia w normalnych pożywkach wzrostowych, ale można je dostosować w zależności od testu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj PBMC do testu Mito Stress (przybliżony czas trwania: 2 godziny).
	<ol>
		<li>Umieść wystarczającą ilość PBMC z kroku 2 w każdym dołku, aby osiągnąć 80-90% zbieżności. Z naszego doświadczenia wynika, że 1,5 x 105 komórek/studnię dało najbardziej spójne wyniki. 
		UWAGA: Studzienki A i H są studzienkami tła i powinny zawierać wyłącznie pożywki testowe bez komórek. W studzienkach od B do G zalecamy posiew co najmniej 3-6 dołków na próbkę pacjenta w celu uwzględnienia wartości odstających.</li>
		<li>Obracaj płytki w dół o masie 200 x g przez 2 minuty, aby komórki przylgnęły do dna studzienek. Umyj komórki raz pożywką do oznaczania. Ten etap usuwa surowicę i wodorowęglan sodu z pożywki wzrostowej. 
		UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że etap mycia zazwyczaj usuwa 20-30% komórek.</li>
		<li>Dodać 180 μl pożywki do oznaczania do każdej studzienki, w tym studzienek tła A i H. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C bez emisji CO2 przez 45 - 60 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzanie testu warunków skrajnych Mito
	<ol>
		<li>Rozpuść leki w zestawie Mito Stress Kit za pomocą pożywki do oznaczania w następujący sposób:
		<ol>
			<li>Oligomycyna: Dodać 252 μl pożywki do oznaczania do fiolki, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 50 μM.</li>
			<li>FCCP: Dodać 288 μl pożywki do oznaczania do fiolki, aby wytworzyć roztwór podstawowy o stężeniu 50 μM.</li>
			<li>Antymycyna A/Rotenon: Dodać 216 μl pożywki testowej do fiolki, aby wytworzyć roztwór podstawowy o stężeniu 25 μM.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Vortex rozpuszczony lek przez około 1 minutę. Rozcieńczyć do roztworów roboczych. 
		UWAGA: Stężenia roztworów roboczych powinny być miareczkowane i wstępnie określone przed eksperymentem w zależności od typu komórki. W przypadku PBMC okazuje się, że 1 μM oligomycyny, 1 μM FCCP i 0,5 μM antymycyny A / Rotenonu działają najlepiej.</li>
		<li>Pipetować leki do każdego portu we wkładzie czujnika po kolei:
		<ol>
			<li>Port A: Odpipetować 20 μl 10 μM oligomycyny, aby uzyskać końcowe stężenie w każdym dołku 1 μM.</li>
			<li>Port B: Odpipetować 22 μL 10 μM FCCP, aby uzyskać końcowe stężenie w każdym studzience 1 μM.</li>
			<li>Port C: Odpipetować 25 μl 5 μM antymycyny A/rotenonu, aby uzyskać końcowe stężenie w każdym dołku 0,5 μM.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz "Test stresu Mito" na instrumencie do pomiaru strumienia zewnątrzkomórkowego. Postępuj zgodnie z instrukcjami przyrządu i włóż wkład czujnika. Przyrząd automatycznie przeprowadzi kalibrację czujnika. Włóż płytkę ogniwa po kalibracji czujnika, a przyrząd zakończy resztę testu. Dynamika tlenu jest mierzona przy 530 nm (wzbudzenie)/650 nm (emisja), a stężenie protonów jest mierzone przy 470 nm (wzbudzenie)/ 530 nm (emisja).</li>
</ol>
4. Normalizacja danych o funkcjach mitochondriów
<ol>
	<li>Przygotować roztwór do testu proliferacji komórek (przybliżony czas trwania: 5 min).
	<ol>
		<li>Dodaj 48 μl barwnika kwasem nukleinowym (500x) i 240 μl supresora tła do 11,7 ml PBS (2x). Barwienie kwasem nukleinowym jest barwnikiem wiążącym DNA przenikającym komórkę, a supresor tła jest barwnikiem maskującym, który blokuje martwe komórki lub komórki z naruszoną integralnością błony komórkowej przed zabarwieniem. Połączenie barwnika wiążącego DNA i supresora tła zapewnia, że barwione są tylko żywe komórki.</li>
		<li>Dodać równą objętość 2x roztworu roboczego (180 μl) bezpośrednio do pożywki w każdym dołku po zakończeniu testu warunków skrajnych Mito.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować komórki w obecności roztworu do oznaczania proliferacji komórek w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 45 - 60 minut. Określić ilościowo liczbę żywych komórek (fluorescencyjnych) na czytniku płytek przy 508 nm (wzbudzenie)/527 nm (emisja) i znormalizować dane OCR (przybliżony czas trwania: 10 min). 
	UWAGA: oprócz liczby żywych komórek, użytkownicy mogą również znormalizować swoje dane za pomocą całkowitej liczby komórek, ilości kwasu nukleinowego, stężeń białek itp.</li>
</ol>

<ol><li>Berger, A. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26285247">Cancer-Related Fatigue, Version 2.2015.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 13 (8), 1012-1039 (2015).</li>
<li>Feng, L. R., Dickinson, K., Kline, N., Saligan, L. N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27521284">Different phenotyping approaches lead to dissimilar biologic profiles in men with chronic fatigue following radiation therapy.</a> Journal of Pain and Symptom Management. 52 (6), 832-840 (2016).</li>
<li>Feng, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Predictors+of+Fatigue+in+Men+With+Non-Metastatic+Prostate+Cancer+Receiving+External+Beam+Radiation+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Journal+of+Oncology+Nursing%22%5BJournal%5D)">Clinical Predictors of Fatigue in Men With Non-Metastatic Prostate Cancer Receiving External Beam Radiation Therapy.</a> Clinical Journal of Oncology Nursing. 19 (6), 744-750 (2015).</li>
<li>Feng, L. R., Wolff, B. S., Lukkahatai, N., Espina, A., Saligan, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploratory+Investigation+of+Early+Biomarkers+for+Chronic+Fatigue+in+Prostate+Cancer+Patients+Following+Radiation+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Nursing%22%5BJournal%5D)">Exploratory Investigation of Early Biomarkers for Chronic Fatigue in Prostate Cancer Patients Following Radiation Therapy.</a> Cancer Nursing. 40 (3), 184-193 (2017).</li>
<li>Myhill, S., Booth, N. E., McLaren-Howard, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19436827">Chronic fatigue syndrome and mitochondrial dysfunction.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 2 (1), 1-16 (2009).</li>
<li>Pernas, L., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mito-Morphosis%3A+Mitochondrial+Fusion%2C+Fission%2C+and+Cristae+Remodeling+as+Key+Mediators+of+Cellular+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function.</a> Annual Review of Physiology. 78 (1), 505-531 (2016).</li>
<li>Vecchiet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+characterization+of+somatic+parietal+tissues+in+humans+with+chronic+fatigue+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Sensory characterization of somatic parietal tissues in humans with chronic fatigue syndrome.</a> Neuroscience Letters. 208 (2), 117-120 (1996).</li>
<li>Jones, D. E. J., Hollingsworth, K. G., Taylor, R., Blamire, A. M., Newton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormalities+in+pH+handling+by+peripheral+muscle+and+potential+regulation+by+the+autonomic+nervous+system+in+chronic+fatigue+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Abnormalities in pH handling by peripheral muscle and potential regulation by the autonomic nervous system in chronic fatigue syndrome.</a> Journal of Internal Medicine. 267 (4), 394-401 (2010).</li>
<li>Feng, L. R., Suy, S., Collins, S. P., Saligan, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+TRAIL+in+fatigue+induced+by+repeated+stress+from+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Psychiatric+Research%22%5BJournal%5D)">The role of TRAIL in fatigue induced by repeated stress from radiotherapy.</a> Journal of Psychiatric Research. 91, 130-138 (2017).</li>
<li>Karamercan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+peripheral+blood+mononuclear+cells+be+used+as+a+proxy+for+mitochondrial+dysfunction+in+vital+organs+during+hemorrhagic+shock+and+resuscitation%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Can peripheral blood mononuclear cells be used as a proxy for mitochondrial dysfunction in vital organs during hemorrhagic shock and resuscitation.</a> Shock. 40 (6), (2013).</li>
<li>Ijsselmuiden, A. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+white+blood+cells+and+platelets+amplify+oxidative+stress+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Clinical+Practice+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Circulating white blood cells and platelets amplify oxidative stress in heart failure.</a> Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 5, 811(2008).</li>
<li>Kong, C. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+mitochondrial+alterations+after+cardiac+surgery+involving+cardiopulmonary+bypass%3A+Clinical+correlations%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Leukocyte mitochondrial alterations after cardiac surgery involving cardiopulmonary bypass: Clinical correlations.</a> Shock. 21 (4), 315-319 (2004).</li>
<li>Straub, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+and+immune+system+prompt+energy+shortage+in+chronic+inflammation+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">The brain and immune system prompt energy shortage in chronic inflammation and ageing.</a> Nature Reviews Rheumatology. 13, 743(2017).</li>
<li>Kuhnke, A., Burmester, G., Krauss, S., Buttgereit, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetics+of+immune+cells+to+assess+rheumatic+disease+activity+and+efficacy+of+glucocorticoid+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Bioenergetics of immune cells to assess rheumatic disease activity and efficacy of glucocorticoid treatment.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 62 (2), 133-139 (2003).</li>
<li>Kramer, P. A., Ravi, S., Chacko, B., Johnson, M. S., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+mitochondrial+and+glycolytic+metabolism+in+human+platelets+and+leukocytes%3A+Implications+for+their+use+as+bioenergetic+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">A review of the mitochondrial and glycolytic metabolism in human platelets and leukocytes: Implications for their use as bioenergetic biomarkers.</a> Redox Biology. 2, Supplement C 206-210 (2014).</li>
<li>Garrabou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effects+of+Sepsis+on+Mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">The Effects of Sepsis on Mitochondria.</a> The Journal of Infectious Diseases. 205 (3), 392-400 (2012).</li>
<li>Mittal, M., Siddiqui, M. R., Tran, K., Reddy, S. P., Malik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+in+inflammation+and+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species in inflammation and tissue injury.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 20 (7), 1126-1167 (2014).</li>
<li>Adrie, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Membrane+Potential+and+Apoptosis+Peripheral+Blood+Monocytes+in+Severe+Human+Sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Membrane Potential and Apoptosis Peripheral Blood Monocytes in Severe Human Sepsis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164 (3), 389-395 (2001).</li>
<li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+protocol+to+analyze+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+in+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54918(2016).</li>
<li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e2511(2010).</li>
<li>Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+characterization+of+polarized+M1+and+M2+bone+marrow-derived+macrophages+using+real-time+extracellular+flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Metabolic characterization of polarized M1 and M2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53424(2015).</li>
<li>Boutagy, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+isolated+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments. (104), e53216(2015).</li>
<li>Yellen, S. B., Cella, D. F., Webster, K., Blendowski, C., Kaplan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+fatigue+and+other+anemia-related+symptoms+with+the+Functional+Assessment+of+Cancer+Therapy+%28FACT%29+measurement+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pain+and+Symptom+Management%22%5BJournal%5D)">Measuring fatigue and other anemia-related symptoms with the Functional Assessment of Cancer Therapy (FACT) measurement system.</a> Journal of Pain and Symptom Management. 13 (2), 63-74 (1997).</li>
<li>Yost, K. J., Eton, D. T., Garcia, S. F., Cella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimally+important+differences+were+estimated+for+six+Patient-Reported+Outcomes+Measurement+Information+System-Cancer+scales+in+advanced-stage+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Epidemiology%22%5BJournal%5D)">Minimally important differences were estimated for six Patient-Reported Outcomes Measurement Information System-Cancer scales in advanced-stage cancer patients.</a> Journal of Clinical Epidemiology. 64 (5), 507-516 (2011).</li>
<li>Kang, J. -G., Wang, P. -y, Hwang, P. M. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/journal/00766879/542">Methods in Enzymology</a>. Galluzzi, L., Kroemer, G. 542, Academic Press. 209-221 (2014).</li>
<li>Chacko, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+defining+distinct+bioenergetic+profiles+in+platelets%2C+lymphocytes%2C+monocytes%2C+and+neutrophils%2C+and+the+oxidative+burst+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood.</a> Laboratory Investigation. 93 (6), 690-700 (2013).</li>
<li>Jones, L. J., Gray, M., Yue, S. T., Haugland, R. P., Singer, V. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11406155">Sensitive determination of cell number using the CyQUANT® cell proliferation assay.</a> Journal of Immunological Methods. 254 (1), 85-98 (2001).</li>
<li>Hartman, M. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relation+of+mitochondrial+oxygen+consumption+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+to+vascular+function+in+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Relation of mitochondrial oxygen consumption in peripheral blood mononuclear cells to vascular function in type 2 diabetes mellitus.</a> Vascular Medicine. 19 (1), London, England. 67-74 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zmęczenie u pacjentów z rakiem jest wyniszczającym stanem, który nie jest dobrze zdefiniowany ani scharakteryzowany1. Diagnoza zmęczenia całkowicie opiera się na subiektywnym zgłoszeniu i nie ma aktualnego standardu diagnostycznego ani leczenia tego schorzenia, głównie z powodu braku zrozumienia jego patobiologii2. Spośród proponowanych mechanizmów leżących u podstaw zmęczenia u pacjentów z rakiem, upośledzenie funkcji mitochondriów jest jednym z najbardziej terapeutycznie ...

Zmęczenie jest powszechnym i stresującym stanem, który ma negatywny wpływ na jakość życia pacjentów z rakiem1. Do tej pory zmęczenie nowotworem pozostaje słabo zdefiniowane i opiera się wyłącznie na subiektywnych raportach pacjentów2. W związku z tym istnieje pilna potrzeba zidentyfikowania łatwego do dostosowania diagnostycznego testu laboratoryjnego, który obiektywnie scharakteryzuje zmęczenie w warunkach klinicznych3,4.
Zaproponowano, że wiele podstawowych mechanizmów, w tym dysfunkcja mitochondriów, powoduje zmęczenie5. Mitochondria są potężnymi organellami, zapewniającymi 95% zapotrzebowania na energię komórkową poprzez fosforylację oksydacyjną i odgrywają ważną rolę w sygnalizacji wapniowej, apoptozie, sygnalizacji immunologicznej i regulacji innych wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych<klasa sup = "xref">6. W związku z tym upośledzona bioenergetyka mitochondriów i defekty w produkcji energii mogą przyczyniać się do zmęczenia. Potwierdzając tę hipotezę, wcześniejsze badania zaobserwowały mutacje w mitochondrialnym DNA u pacjentów z zespołem chronicznego zmęczenia7. Chociaż nie jest jasne, czy patofizjologiczne źródło zmęczenia leży w ośrodkowym układzie nerwowym, czy w tkankach obwodowych, takich jak mięśnie szkieletowe8,9, obecnie nie ma bezpośredniej metody dokładnej oceny dysfunkcji mitochondriów związanej ze zmęczeniem w żywych, oddychających komórkach.
Wykorzystanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) do badania funkcji mitochondriów oferuje kilka korzyści. Po pierwsze, PBMC są łatwo dostępne w warunkach klinicznych przy użyciu standardowej flebotomii i można je szybko wyizolować przy użyciu podstawowych technik laboratoryjnych. Po drugie, pobieranie krwi jest mniej inwazyjne niż pobieranie innych tkanek, takich jak biopsja mięśni. Dzięki temu próbki krwi mogą być pobierane od tego samego pacjenta wielokrotnie w czasie, co ułatwia długotrwałą ocenę efektów leczenia. Co ciekawe, funkcja mitochondriów w PBMC wydawała się być dobrze skorelowana ze statusem mitochondriów nerek w modelu zwierzęcym10. Co więcej, mitochondria komórek odpornościowych były używane jako wskaźnik zastępczy do wykrywania zmian ogólnoustrojowych w różnych stanach chorobowych11,12. Mitochondria w krążących komórkach odpornościowych są szczególnie wrażliwe na zmiany w funkcjach immunologicznych i cząsteczkach sygnalizacji immunologicznej, takich jak cytokiny13,14,15. Na przykład zaobserwowano, że PBMC od pacjentów z ostrymi reumatycznymi chorobami zapalnymi wykazują wysokie wyjściowe zużycie tlenu14. Natomiast zużycie tlenu było zmniejszone w PBMC izolowanych od pacjentów z ogólnoustrojowymi stanami zapalnymi, w tym sepsą16. W stanach zapalnych wolne rodniki wytwarzane przez dysfunkcyjne mitochondria mogą dodatkowo przyczyniać się do podwyższonego stresu oksydacyjnego i przedłużającego się stanu zapalnego17. Centralna rola mitochondriów w produkcji energii, jak również w stresie oksydacyjnym, sugeruje potencjalną użyteczność wykorzystania funkcji mitochondriów jako wskaźnika zastępczego do badania zmęczenia u pacjentów z rakiem 13.
Poprzednie badania badające funkcję mitochondriów wykorzystywały techniki biochemiczne, pomiar potencjału błony mitochondrialnej lub izolację określonych populacji komórek, które mogą nie być łatwo przystosowane w warunkach klinicznych5,14,18. W ostatnich latach rozwój testów przepływu zewnątrzkomórkowego pozwolił naukowcom łatwo i dokładnie zbadać zmiany wskaźnika zużycia tlenu (OCR) w odpowiedzi na automatyczne wstrzyknięcia inhibitorów układu oddechowego19,20,21,22. Jednak większość z tych badań jest przeznaczona dla określonych typów komórek, a duży format o wysokiej przepustowości może nie mieć zastosowania w warunkach klinicznych. W tym manuskrypcie opisujemy zoptymalizowany protokół badania funkcji mitochondriów do użytku klinicznego.

<table><tbody><tr><td>Probówka do przygotowania komórek jednojądrzastych CPT&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>362761</td><td>Do izolacji PBMC po flebotomii</td></tr><tr><td>RPMI-1640&nbsp;</td><td>Corning</td><td>10-040</td><td>Do wytwarzania pożywek wzrostowych dla PBMC</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td>Do wytwarzania pożywek wzrostowych dla PBMC</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td>Do wytwarzania pożywek wzrostowych dla PBMC</td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>Roztwór adhezyjny do komórek i tkanek; umożliwia przyleganie komórek zawiesiny do powierzchni</td></tr><tr><td>Seahorse XF Calibrant Solution</td><td>Agilent</td><td>103059-000</td><td>Do wkładów nawilżających</td></tr><tr><td>XFp Fluxpak (minipłytki i wkłady czujników)</td><td>Agilent</td><td>103022-100</td><td>Zawiera minipłytki do hodowli komórkowych XFp i wkłady z czujnikami</td></tr><tr><td>Pożywka bazowa XF</td><td>Agilent</td><td>103335-100</td><td>Do wytwarzania pożywki testowej XF</td></tr><tr><td>45% hodowla komórkowa D-(+)-Roztwór glukozy</td><td>Corning</td><td>25-037-CI</td><td>Do wytwarzania XF pożywka do oznaczania</td></tr><tr><td>Roztwór pirogronianu sodu</td><td>Corning&nbsp;</td><td>25-000-CI</td><td>Do wytwarzania pożywki testowej XF</td></tr><tr><td>Roztwór L-glutaminy</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td>Do wytwarzania pożywki testowej</td></tr><tr><td>XF Seahorse XFp Mito Stress Test</td><td>Kit Agilent</td><td>103010-100</td><td>Zawiera oligomycynę, FCCP, antymycynę A/rotenon</td></tr><tr><td>CyQUANT Bezpośredni test proliferacji komórek</td><td>ThermoFisher</td><td>C35011</td><td>Do oznaczania ilościowego żywych komórek i normalizacji danych</td></tr><tr><td>Seahorse XFp Analyzer</td><td>Agilent</td><td>S7802AEA</td><td>Do pomiaru funkcji mitochondriów w żywych komórkach</td></tr><tr><td>Cytacja 5 Obrazowanie komórek Multi-Mode Reader (lub dowolny instrument, który może określić ilościowo komórki fluorescencyjne na płytce)</td><td>BioTek</td><td>BTCYT5PV</td><td>Do ilościowego oznaczania żywych komórek i normalizacji danych</td></tr></tbody></table>

ocena roli funkcji mitochondriów w zmęczeniu związanym z rakiem

Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

Zmęczenie jest powszechnym i wyniszczającym stanem, który dotyka większość pacjentów z rakiem. Do tej pory zmęczenie pozostaje słabo scharakteryzowane i nie ma testu diagnostycznego, który obiektywnie mierzyłby nasilenie tego stanu. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną metodę oceny funkcji mitochondriów PBMC pobranych od zmęczonych pacjentów z rakiem. Korzystając ze zwartego systemu strumienia zewnątrzkomórkowego i sekwencyjnego wstrzykiwania inhibitorów oddechowych, zbadaliśmy stan funkcjonalny mitochondriów PBMC, mierząc podstawowe oddychanie mitochondrialne, wolną wydolność oddechową i fenotyp energetyczny, który opisuje preferowany szlak energetyczny w odpowiedzi na stres. Świeże PBMC są łatwo dostępne w warunkach klinicznych przy użyciu standardowej flebotomii. Cały test opisany w tym protokole można wykonać w czasie krótszym niż 4 godziny bez udziału skomplikowanych technik biochemicznych. Dodatkowo opisujemy metodę normalizacji, która jest niezbędna do uzyskania powtarzalnych danych. Przedstawiona prosta procedura i metody normalizacji pozwalają na wielokrotne pobieranie próbek od tego samego pacjenta i generowanie powtarzalnych danych, które można porównywać między punktami czasowymi w celu oceny potencjalnych efektów leczenia.

Test stresu mitochondrialnego (Mito Stress Test) opiera się na pomiarze szybkości zużycia tlenu (OCR) po sekwencyjnym wstrzykiwaniu różnych inhibitorów oddychania w celu sporządzenia pełnego profilu mitochondrialnego. Pomiary OCR po każdym wstrzyknięciu leku mogą być wykorzystane do obliczenia następujących parametrów związanych ze zdrowiem mitochondriów: Bazowy OCR jest mierzony w pierwszej kolejności, przed wstrzyknięciem jakiegokolwiek leku, aby ocenić zużycie tlenu ni...

Naszym celem było opracowanie praktycznego protokołu do oceny dysfunkcji mitochondriów związanych ze zmęczeniem u pacjentów z rakiem. Ten innowacyjny protokół jest zoptymalizowany do użytku klinicznego, obejmującego tylko standardową flebotomię i podstawowe procedury laboratoryjne.

Ocena roli funkcji mitochondriów w zmęczeniu związanym z rakiem

Fatigue is a common and debilitating condition that affects most cancer patients. To date, fatigue remains poorly characterized with no diagnostic test to ...

Ogólnym celem tej procedury jest ocena dysfunkcji mitochondriów związanej ze zmęczeniem u pacjentów z rakiem. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie wspomagającej opieki onkologicznej, takie jak to, czy dysfunkcja mitochondriów jest związana ze zmęczeniem u pacjentów z rakiem po otrzymaniu radioterapii. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest mniej inwazyjna i może być łatwo stosowana w klinice do identyfikacji pacjentów zagrożonych toksycznością terapii przeciwnowotworowej.Technika ta nie tylko pogłębia naszą wiedzę na temat roli dysfunkcji mitochondriów w zmęczeniu związanym z rakiem, ale może również poprawić ocenę i zoptymalizować jej zarządzanie. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat mechanizmów leżących u podstaw zmęczenia związanego z rakiem, można ją również zastosować do innych męczących stanów chorobowych, takich jak stany metaboliczne i zapalne dróg moczowych. Ogólnie rzecz biorąc, dla osób, które dopiero zaczynają tę metodę, prawidłowe wstrzykiwanie inhibitorów oddechowych do każdego portu wkładu czujnika bez wcześniejszej demonstracji wizualnej może być trudne.Tę procedurę zademonstruje pan Quang Nguyen, doktorant z nasze

evaluating-role-mitochondrial-function-cancer-related

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Zmęczenie jest powszechnym, niedostatecznie leczonym i często słabo rozumianym objawem wielu chorób i zaburzeń. Nowe przedkliniczne testy zmęczenia mogą pomóc w lepszym zrozumieniu i przyszłym leczeniu zmęczenia. W tym celu obecny protokół zapewnia nowatorski sposób pomiaru zachowania podobnego do zmęczenia u myszy.

Test zmęczenia bieżni: prosty, wysokowydajny test zachowania podobnego do zmęczenia myszy

Tutaj prezentujemy protokół izolacji komórek białaczkowych od szpiku kostnego chorych na białaczkę i analizy ich stanu metabolicznego. Ocena profilu metabolicznego komórek białaczki pierwotnej może pomóc w lepszym scharakteryzowaniu zapotrzebowania na komórki pierwotne i może prowadzić do bardziej spersonalizowanej medycyny.

Ocena profilu metabolicznego komórek białaczki pierwotnej

Opracowaliśmy praktyczny protokół i analityczne podejście do oceny mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej i zdolności przenoszenia elektronów w świeżych homogenatach guza. Protokół ten można łatwo dostosować do badania różnych funkcji mitochondriów, które przyczyniają się do inicjacji, progresji i odpowiedzi na leczenie.

Analityczne oznaczanie funkcji mitochondrialnej wyciętych homogenatów guzów litych

Wysokorozdzielcza respirometria sprzężona z czujnikami fluorescencyjnymi określa zużycie tlenu w mitochondriach i generowanie reaktywnych form tlenu (ROS). Niniejszy protokół opisuje technikę oceny częstości oddechów mitochondriów i produkcji ROS w przepuszczalnym nerwie kulszowym.

Ocena funkcji mitochondriów w nerwie kulszowym za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Opisujemy stopniowe protokoły mierzące oddychanie mitochondrialne mysich i ludzkich neutrofili oraz komórek HL60 za pomocą analizatora metabolicznego przepływu zewnątrzkomórkowego.

Pomiar w czasie rzeczywistym mitochondrialnego profilu bioenergetycznego neutrofili

Ten protokół opisuje technikę generowania cybrydów z komórek nowotworowych rosnących w zawiesinie jako narzędzie do badania roli mitochondriów w procesie nowotworowym.

Wytwarzanie cybridów transmiscyjnych przy użyciu linii komórek rakowych

Bioenergetyka limfocytów T CD8 może być badana za pomocą testu stresu Mito. Metodologia ta może być wykorzystana do badania ostrego i przewlekłego programowania metabolicznego. Protokół ten opisuje podejścia do badania relacji między biologią receptora komórek T a analizą bioenergetyczną.

Pomiar funkcji mitochondrialnej naiwnych i efektorowych limfocytów T CD8

Tutaj prezentujemy protokół respirometrii o wysokiej rozdzielczości do analizy bioenergetyki u zmutowanych muszek owocowych PINK1B9-null. W metodzie wykorzystuje się protokół SUIT (Substrate-Uncouplingr-Inhibitor-Titration).

Analiza funkcji mitochondriów u Drosophila melanogaster PINK1B9-Null mutant przy użyciu respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Tutaj opisujemy kompleksową metodę pomiaru mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej w świeżych, przepuszczalnych włóknach mięśni szkieletowych z mięśni ludzkich lub myszy. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie oddychania mitochondriów w czasie rzeczywistym oraz ocenę preferencji paliwowych i elastyczności metabolicznej przy jednoczesnym zachowaniu istniejących sieci mitochondrialnych i integralności błony.

Pomiar oddychania mitochondrialnego we włóknach mięśni szkieletowych ludzi i myszy za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

To badanie wykorzystywało ultrasonografię do diagnozy i badań kontrolnych, aby potwierdzić skuteczność leczenia Progresywnym Oporem (PRE) w obrzęku limfatycznym związanym z rakiem piersi (BCRL). Ultrasonografia może być skutecznie stosowana w celu zapewnienia diagnozy i leczenia obrzęku limfatycznego.

Ocena ultrasonograficzna obrzęku limfatycznego związanego z rakiem piersi

Poznaj metodę oceny dysfunkcji mitochondriów w zmęczeniu związanym z rakiem u pacjentów onkologicznych. Protokół wykorzystuje standardową flebotomię i podstawowe procedury laboratoryjne do identyfikacji ryzyka toksyczności terapii.

Ocena roli funkcji mitochondriów w zmęczeniu związanym z rakiem

Przeglądaj więcej filmów