Ocena roli funkcji mitochondriów w zmęczeniu związanym z rakiem

Ogólnym celem tej procedury jest ocena dysfunkcji mitochondriów związanej ze zmęczeniem u pacjentów z rakiem. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie wspomagającej opieki onkologicznej, takie jak to, czy dysfunkcja mitochondriów jest związana ze zmęczeniem u pacjentów z rakiem po otrzymaniu radioterapii. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest mniej inwazyjna i może być łatwo stosowana w klinice do identyfikacji pacjentów zagrożonych toksycznością terapii przeciwnowotworowej.

Technika ta nie tylko pogłębia naszą wiedzę na temat roli dysfunkcji mitochondriów w zmęczeniu związanym z rakiem, ale może również poprawić ocenę i zoptymalizować jej zarządzanie. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat mechanizmów leżących u podstaw zmęczenia związanego z rakiem, można ją również zastosować do innych męczących stanów chorobowych, takich jak stany metaboliczne i zapalne dróg moczowych. Ogólnie rzecz biorąc, dla osób, które dopiero zaczynają tę metodę, prawidłowe wstrzykiwanie inhibitorów oddechowych do każdego portu wkładu czujnika bez wcześniejszej demonstracji wizualnej może być trudne.

Tę procedurę zademonstruje pan Quang Nguyen, doktorant z naszego laboratorium. Aby nawodnić wkład czujnika, najpierw wyjmij go z opakowania. Następnie dodaj 200 mikrolitrów roztworu kalibru do każdej studzienki płytki użytkowej.

Napełnij również każdą fosę 400 mikrolitrami roztworu kalibru. Następnie umieść płytkę czujnika z powrotem na tabliczce użytkowej i zacznij nawilżać wkład w inkubatorze bez dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Zmierz poziom zmęczenia na podstawie 13-punktowej oceny funkcjonalnej terapii chorób przewlekłych.

Zmęczenie na początku badania, w połowie leczenia, po zakończeniu EBRT i rok po EBRT. Najpierw przygotuj pożywkę testową do pomiaru funkcji mitochondriów. Po przygotowaniu podłoża podgrzej je do 37 stopni Celsjusza i dostosuj pH do 7,4.

Ważne jest, aby upewnić się, że pożywka testowa została przygotowana w dniu doświadczenia i została podgrzana do 37 stopni przed dostosowaniem pH do 7,4. Następnie zasiej PBMC w każdym dołku, aby osiągnąć 80 do 90 procent zbieżności. Następnie obracaj płytkę 200 razy g przez 2 minuty, aby komórki przylgnęły do dna studzienek.

Po wirowaniu usuń pożywkę z każdej studzienki i przepłucz studzienki raz pożywką do oznaczania. Dodaj 180 mikrolitrów pożywki testowej do każdej studzienki, w tym studzienek tła. Następnie inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze bez dwutlenku węgla przez 45 do 60 minut.

Aby rozpuścić leki, dodaj 252 mikrolitry pożywki testowej do leku, aby wytworzyć 50-mikromolowy roztwór podstawowy oligomycyny. Dodaj 288 mikrolitrów pożywki testowej do leku, aby wytworzyć 50-mikromolowy roztwór podstawowy FCCP. Na koniec dodaj 216 mikrolitrów pożywki testowej, aby wytworzyć 25-mikromolowy roztwór podstawowy antymycyny a/rotenonu.

Po rozpuszczeniu wszystkich trzech leków należy wirować zawiesinę leku przez jedną minutę, a następnie rozcieńczyć roztwory robocze. Następnie odpipetować 20 mikrolitrów 10 mikromolowych oligomycyny w porcie A do końcowego stężenia jednego mikromola w każdym dołku. Następnie odpipetować 22 mikrolitry 10 mikromolowych FCCP w porcie B do końcowego stężenia jednego mikromola w każdym dołku.

Na koniec odpipetować 25 mikrolitrów 5 mikromolowych antymycyny a/rotenonu w porcie C do końcowego stężenia 0,5 mikromola w każdym dołku. Następnie wybierz test wysiłkowy Mito na instrumencie do pomiaru strumienia zewnątrzkomórkowego. Następnie włóż wkład czujnika, postępując zgodnie z instrukcją przyrządu.

Przyrząd automatycznie przeprowadzi kalibrację czujnika. Po zakończeniu kalibracji włóż płytkę celi dla instrumentu, aby zakończyć resztę testu. Aby przygotować roztwór do oznaczania proliferacji komórek, dodaj 5,76 mikrolitra barwienia kwasem nukleinowym i 28,8 mikrolitra supresora tła do 1,405 mililitra soli fizjologicznej buforowanej fosforanem.

Po zakończeniu testu warunków skrajnych Mito dodaj 180 mikrolitrów 2x roztworu roboczego bezpośrednio do pożywki w każdym dołku. Następnie inkubuj komórki z roztworem do testu proliferacji komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45 do 60 minut. Określ ilościowo liczbę żywych komórek na czytniku płytek przy wzbudzeniu 508 nanometrów i emisji 527 nanometrach, a następnie znormalizuj dane OCR.

Podczas miareczkowania FCCP jeden mikromol jest optymalnym stężeniem leku, które służy do oceny funkcji mitochondriów PBMC. Badanie oddychania mitochondrialnego i świeżo wyizolowanych PBMC pokazuje, że OCR zaczyna spadać po trzech godzinach i trwa do ośmiu godzin. Jednak maksymalny oddech wywołany wstrzyknięciem FCCP również nie przekracza podstawowego poziomu OCR.

Tutaj pokazano normalizację funkcji mitochondriów, w której komórki są izolowane od dwóch zdrowych osób. W rzeczywistości OCR znormalizowany do żywych komórek reprezentowanych przez barwnik wiążący DNA z zieloną fluorescencją jest podobny u obu zdrowych osób. W rzeczywistości nie obserwuje się znaczącej różnicy w podstawowym OCR między osobą zdrową a zmęczoną.

Jednak zmęczony pacjent wykazuje zmniejszone maksymalne zużycie tlenu i zapasową wydolność oddechową w porównaniu z grupą kontrolną. Nie stwierdzono różnic w zużyciu tlenu niezwiązanym z mitochondriami i ATP ani w efektywności sprzężenia między osobami zdrowymi i zmęczonymi. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby najpierw określić optymalną gęstość komórek i stężenia FCCP. Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak izolowanie różnych populacji komórek, w celu kierowania przyszłymi badaniami mechanistycznymi skoncentrowanymi na określonych typach komórek. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się opieką wspomagającą do zbadania roli dysfunkcji mitochondriów u zmęczonych pacjentów z rakiem.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć funkcję mitochondriów i próbki kliniczne, które można również wykorzystać do proaktywnej identyfikacji pacjentów zagrożonych rozwojem toksyczności związanej z leczeniem raka, w tym zmęczenia. Nie zapominaj, że praca z inhibitorami układu oddechowego, takimi jak oligomycyna i rotenon, może być bardzo niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej.