Name: Egzosomy płukania oskrzelowo-pęcherzykowego w septycznym uszkodzeniu płuc wywołanym lipopolisacharydem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Poznaj izolację egzosomów z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego w uszkodzeniu płuc wywołanym LPS u myszy. Ta metoda pozwala badać komunikację międzykomórkową i odpowiedź zapalną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie zadeklarowali konfliktu interesów.

Ogólny protokół wymaga 2 dni, w tym pierwszego dnia indukcji sepsy i izolacji płynu BAL od zwierzęcia, a drugiego dnia izolacji egzosomów od mysiego BALF. Wszystkie procedury zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w centrum medycznym Atlanta VA.
1. Model ostrego septycznego uszkodzenia płuc u myszy
<ol>
	<li>Użyj 6-8 tygodniowych samców myszy C57BL/6J typu dzikiego (waga 20 - 22 g) jako modelu zwierzęcego i wykonuj wszystkie procedury przy użyciu technik i narzędzi aseptycznych. Wszystkie narzędzia chirurgiczne, w tym kleszcze i nożyczki, należy sterylizować w autoklawie przez 20 minut w temperaturze 121 °C. </li>
	<li>Losowo rozmieść myszy na grupę eksperymentalną i kontrolną. Unieruchamiaj myszy na desce chirurgicznej. Leczyć myszy lipopolisacharydem Escherichia coli (LPS, 15 mg/kg) drogą dootrzewnową. W zależności od indywidualnej masy ciała rozcieńczyć odpowiednie dawki LPS do 0,1 ml PBS na mysz, a następnie wstrzyknąć roztwór LPS za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 27 G i wstrzyknąć równoważną objętość PBS do kontroli zwierząt.   </li>
	<li>Trzymaj myszy w obiekcie BSL2 dla zwierząt, który składa się z czystych klatek w odpowiedniej temperaturze pokojowej.</li>
	<li>24 godziny później poddać myszy eutanazji za pomocą wdychania CO2 . </li>
	<li>Wybierz obszar chirurgiczny na środku szyi myszy. Wykonaj małe nacięcie (około 5 mm) i delikatnie oddziel mięśnie dostępu do tchawicy za pomocą kleszczy, aż tchawica zostanie odsłonięta.</li>
	<li>Pobrać płyn BAL myszy za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 10 ml z igłą 27 G. Najpierw delikatnie włóż igłę do tchawicy i powoli wstrzyknij 1 ml sterylnego PBS do tchawicy, a następnie wciągnij BALF do jednorazowej strzykawki o pojemności 3 ml z igłą 27 G. Po zakończeniu zabiegu strzykawki i igły należy wyrzucić do pojemnika na ostre przedmioty stanowiące zagrożenie biologiczne.</li>
	<li>Narzędzia chirurgiczne należy traktować dwutlenkiem chloru, jak opisano wcześniej przez Chauret i wsp.27, a następnie wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w autoklawie przez 20 minut w temperaturze 121 °C.</li>
</ol>
2. Izolacja egzosomów - seryjne ultra-wirowanie i charakterystyka
<ol>
	<li>Zbierz mysi płyn BAL w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml. W celu pobrania komórek pęcherzyków płucnych należy odwirowywać próbki przez 10 minut w temperaturze 1 000 g, w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowych stożkowych probówek o pojemności 15 ml, a następnie odwirować próbki przez 30 minut w temperaturze 4 000 x g w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórek.</li>
	<li>Zebrać supernatant do probówek ultrawirówek i odwirowywać próbki przez 60 minut w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C w celu usunięcia większych cząstek komórkowych.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowych stożkowych probówek, a następnie przefiltrować próbki przez filtr strzykawkowy 0,2 μm, aby usunąć pozostałe większe cząstki.</li>
	<li>Próbki należy zbierać w probówkach ultrawirówkowych i probówkach równoważących. Odwiruj próbki przez 2 godziny w temperaturze 140 000 x g w temperaturze 4°C w celu osadzenia egzosomów. 
	Uwaga: Wielkość egzosomów waha się od 20 do 200 nm. Filtr 0,2 μm służy do usuwania większych cząstek o wielkości powyżej 200 nm.</li>
	<li>Delikatnie odrzucić supernatanty. Rozpuścić osad w 100 μl PBS lub roztworze do lizy i przenieść próbki egzosomów do probówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia. 
	Uwaga: Transmisyjny mikroskop elektronowy jest zalecany do weryfikacji izolowanych egzosomów.</li>
	<li>Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem przetwarzania próbek TEM28. Analizuj próbki egzosomów za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej i rób obrazy, skala 200 nm.</li>
</ol>
3. Przygotowanie miRNA i przeprowadzenie miRNA-q-RT-PCR
Uwaga: miRNA-q-RT-PCR jest zalecany do analizy poziomu ekspresji miRNA.
<ol>
	<li>Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem izolacji miRNA i upewnij się, że używasz równej ilości oczyszczonych RNA w jednoniciowej odwrotnej transkrypcji24.</li>
	<li>Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem PCR w czasie rzeczywistym, aby wykryć poziom egzosomalnego mikroRNA w płynie BAL. Użyj specyficznych starterów PCR w czasie rzeczywistym przeciwko miR-155, miR-146a i U6 SnRNA. Przeprowadź reakcję PCR z ilościowym aparatem PCR i znormalizuj wartości ekspresji do kontroli wewnętrznej U6 snRNA. 
	Uwaga: Każda grupa składa się z trzech próbek24.</li>
</ol>
4. Znakowanie i oczyszczanie egzosomów
<ol>
	<li>Zawiesić osad egzosomów ze 100 μl roztworu zawiesiny w probówce polipropylenowej o pojemności 1,5 ml, a następnie dodać 0,4 μl barwnika egzosomów do drugiej probówki ze 100 μl roztworu zawiesiny.</li>
	<li>Szybko dodaj egzosomy w roztworze do roztworu barwnika i dokładnie wymieszaj, pipetując. Próbki należy przechowywać przez 5 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem.</li>
	<li>Umieść jedną kolumnę wirową egzosomu w probówce elucyjnej o pojemności 1,5 ml. Przenieś mieszaninę roztworu do środka kolumny wirowej egzosomu.</li>
	<li>Obracać kolumnę przez 2 minuty w temperaturze 800 x g w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wyrzucić kolumnę i przechowywać eluowaną próbkę w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
5. Walidacja egzosomów pobranych przez komórki biorcze
<ol>
	<li>Nasiona 1 x 104 MLE 12 / komórkę w 8-dołkowym szkiełku podstawowym i komórki hodowlane w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Dodaj 10 μl znakowanych fluorescencyjnie egzosomów do komórek. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Usuń pożywkę hodowlaną i umyj komórki PBS, a następnie utrwal komórki 1% paraformaldehydem przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zamontuj suwak w medium montażowym za pomocą DAPI.</li>
	<li>Analizuj próbki przez mikroskop fluorescencyjny i rób zdjęcia w powiększeniu 40x.</li>
</ol>
6. Weryfikacja interakcji między egzosomami a komórkami biorcy
<ol>
	<li>Wysiew 2 x 105 MLE12/basenik na 12-dołkowej płytce hodowlanej zawierającej odpowiednią pożywkę i komórki hodowlane w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Dodaj 20 μg egzosomów z mysiego płynu BAL do komórek MLE12 i ustaw kontrpróby na grupę eksperymentalną.</li>
	<li>24 godziny później przemyć komórki PBS i dodać 600 μl buforu do lizy do studzienki. Delikatnie potrząśnij płytką i zbierz próbki do lizy w probówce o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety.</li>
	<li>Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem izolacji całkowitego RNA i protokołem odwrotnej transkrypcji cDNA, uzupełnij jednoniciową odwrotną transkrypcję cDNA29.</li>
	<li>Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem PCR w czasie rzeczywistym, aby wykryć poziom ekspresji mRNA w komórkach biorcy29. Użyj specyficznych starterów PCR w czasie rzeczywistym przeciwko TNF-α, IL-6 i ZO-1. Przeprowadź reakcje PCR z ilościowym aparatem PCR i znormalizuj wartości ekspresji do kontroli wewnętrznej GAPDH. 
	Uwaga: Każda grupa składa się z trzech próbek.</li>
</ol>

<ol><li>Rubenfeld, G. D., Herridge, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+outcomes+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and outcomes of acute lung injury.</a> Chest. 131, 554-562 (2007).</li>
<li>Baron, R. M., Choi, A. J., Owen, C. A., Choi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+manipulated+mouse+models+of+lung+disease%3A+potential+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">Genetically manipulated mouse models of lung disease: potential and pitfalls.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L485-L497 (2012).</li>
<li>Han, S., Mallampalli, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+respiratory+distress+syndrome%3A+from+mechanism+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">The acute respiratory distress syndrome: from mechanism to translation.</a> Journal of immunology. , Baltimore, Md. 855-860 (1950).</li>
<li>Aeffner, F., Bolon, B., Davis, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Models+of+Acute+Respiratory+Distress+Syndrome%3A+A+Review+of+Analytical+Approaches%2C+Pathologic+Features%2C+and+Common+Measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+pathology%22%5BJournal%5D)">Mouse Models of Acute Respiratory Distress Syndrome: A Review of Analytical Approaches, Pathologic Features, and Common Measurements.</a> Toxicologic pathology. 43, 1074-1092 (2015).</li>
<li>Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">Animal models of acute lung injury.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L379-L399 (2008).</li>
<li>Terrasini, N., Lionetti, V. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28328650">Exosomes in Critical Illness.</a> Critical care medicine. , (2017).</li>
<li>Fujita, Y., Kadota, T., Araya, J., Ochiya, T., Kuwano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles%3A+New+Players+in+Lung+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles: New Players in Lung Immunity.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. , (2017).</li>
<li>Kubo, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28684288">Extracellular Vesicles in Lung Disease.</a> Chest. 153, 210-216 (2018).</li>
<li>Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+widespread+regulation+of+microRNA+biogenesis%2C+function+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay.</a> Nature reviews. Genetics. 11, 597-610 (2010).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+target+recognition+and+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136, 215-233 (2009).</li>
<li>Fanini, F., Fabbri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CANCER-DERIVED+EXOSOMIC+microRNAs+SHAPE+THE+IMMUNE+SYSTEM+WITHIN+THE+TUMOR+MICROENVIRONMENT%3A+STATE+OF+THE+ART%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">CANCER-DERIVED EXOSOMIC microRNAs SHAPE THE IMMUNE SYSTEM WITHIN THE TUMOR MICROENVIRONMENT: STATE OF THE ART.</a> Seminars in cell & developmental biology. , (2016).</li>
<li>Agarwal, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental%2C+Systems%2C+and+Computational+Approaches+to+Understanding+the+MicroRNA-Mediated+Reparative+Potential+of+Cardiac+Progenitor+Cell-Derived+Exosomes+From+Pediatric+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Experimental, Systems, and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients.</a> Circulation research. 120, 701-712 (2017).</li>
<li>Prattichizzo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+microRNAs+and+endothelial+hyperglycaemic+memory%3A+a+therapeutic+opportunity%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%2C+obesity+%26+metabolism%22%5BJournal%5D)">Extracellular microRNAs and endothelial hyperglycaemic memory: a therapeutic opportunity?</a> Diabetes, obesity & metabolism. 18, 855-867 (2016).</li>
<li>Huang-Doran, I., Zhang, C. Y., Vidal-Puig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles%3A+Novel+Mediators+of+Cell+Communication+In+Metabolic+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+endocrinology+and+metabolism%3A+TEM%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles: Novel Mediators of Cell Communication In Metabolic Disease.</a> Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 28, 3-18 (2017).</li>
<li>Khalyfa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Plasma+Extracellular+Microvesicle+MicroRNA+Cargo+and+Endothelial+Dysfunction+in+Children+with+Obstructive+Sleep+Apnea%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+and+critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Circulating Plasma Extracellular Microvesicle MicroRNA Cargo and Endothelial Dysfunction in Children with Obstructive Sleep Apnea.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 194, 1116-1126 (2016).</li>
<li>Thomou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+circulating+miRNAs+regulate+gene+expression+in+other+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived circulating miRNAs regulate gene expression in other tissues.</a> Nature. 542, 450-455 (2017).</li>
<li>Gregson, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Exosomal+RNA+Profiles+in+Bronchoalveolar+Lavage+from+Lung+Transplants+with+Acute+Rejection%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+and+critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Altered Exosomal RNA Profiles in Bronchoalveolar Lavage from Lung Transplants with Acute Rejection.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 192, 1490-1503 (2015).</li>
<li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nature cell biology. 9, 654-659 (2007).</li>
<li>Doxaki, C., Kampranis, S. C., Eliopoulos, A. G., Spilianakis, C., Tsatsanis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+Regulation+of+miR-155+and+miR-146a+Genes+during+Induction+of+Endotoxin+Tolerance+in+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Coordinated Regulation of miR-155 and miR-146a Genes during Induction of Endotoxin Tolerance in Macrophages.</a> Journal of immunology. , Baltimore, Md. 5750-5761 (2015).</li>
<li>Schulte, L. N., Westermann, A. J., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+activation+and+functional+specialization+of+miR-146+and+miR-155+in+innate+immune+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Differential activation and functional specialization of miR-146 and miR-155 in innate immune sensing.</a> Nucleic acids research. 41, 542-553 (2013).</li>
<li>Alexander, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-delivered+microRNAs+modulate+the+inflammatory+response+to+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Exosome-delivered microRNAs modulate the inflammatory response to endotoxin.</a> Nature communications. 6, 7321(2015).</li>
<li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-1+is+induced+in+tumor+associated+macrophages+by+cyclo-oxygenase+pathway+in+human+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">TREM-1 is induced in tumor associated macrophages by cyclo-oxygenase pathway in human non-small cell lung cancer.</a> PloS one. 9, e94241(2014).</li>
<li>Xu, R., Richards, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+In+Vitro+Co-Culture+Model+in+Anti-Cancer+Drug+Development+Cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Combinatorial+chemistry+%26+high+throughput+screening%22%5BJournal%5D)">Development of In Vitro Co-Culture Model in Anti-Cancer Drug Development Cascade.</a> Combinatorial chemistry & high throughput screening. 20, 451-457 (2017).</li>
<li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-1-accentuated+lung+injury+via+miR-155+is+inhibited+by+LP17+nanomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">TREM-1-accentuated lung injury via miR-155 is inhibited by LP17 nanomedicine.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L426-L438 (2016).</li>
<li>Sadikot, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dose+dexamethasone+accentuates+nuclear+factor-kappa+b+activation+in+endotoxin-treated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+and+critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">High-dose dexamethasone accentuates nuclear factor-kappa b activation in endotoxin-treated mice.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 164, 873-878 (2001).</li>
<li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+mediated+epigenetic+modulation+inhibits+TREM-1+expression+in+response+to+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Curcumin mediated epigenetic modulation inhibits TREM-1 expression in response to lipopolysaccharide.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 44, 2032-2043 (2012).</li>
<li>Chauret, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorine+dioxide+inactivation+of+Cryptosporidium+parvum+oocysts+and+bacterial+spore+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Chlorine dioxide inactivation of Cryptosporidium parvum oocysts and bacterial spore indicators.</a> Applied and environmental microbiology. 67, 2993-3001 (2001).</li>
<li>Cizmar, P., Yuana, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+Characterization+of+Extracellular+Vesicles+by+Transmission+and+Cryo-Transmission+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Detection and Characterization of Extracellular Vesicles by Transmission and Cryo-Transmission Electron Microscopy.</a> Methods in molecular biology. , Clifton, N.J. 221-232 (2017).</li>
<li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-related+proteins+prolong+macrophage+survival+through+induction+of+Triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-1%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">HIV-related proteins prolong macrophage survival through induction of Triggering receptor expressed on myeloid cells-1.</a> Scientific reports. 7, 42028(2017).</li>
<li>Jackson, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Mitochondrial+Transfer+in+Direct+Co-cultures+of+Human+Monocyte-derived+Macrophages+%28MDM%29+and+Mesenchymal+Stem+Cells+%28MSC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Mitochondrial Transfer in Direct Co-cultures of Human Monocyte-derived Macrophages (MDM) and Mesenchymal Stem Cells (MSC).</a> Bio-protocol. 7, (2017).</li>
<li>Fujita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles%3A+New+Players+in+Lung+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles: New Players in Lung Immunity.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. 17, 474-484 (2017).</li>
<li>Gunasekaran, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-Derived+Exosomes+With+Lung+Self-Antigens+in+Human+Lung+Allograft+Rejection%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+transplantation+%3A+official+journal+of+the+American+Society+of+Transplantation+and+the+American+Society+of+Transplant+Surgeons%22%5BJournal%5D)">Donor-Derived Exosomes With Lung Self-Antigens in Human Lung Allograft Rejection.</a> American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 17, 474-484 (2017).</li>
<li>Kalra, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+evaluation+of+plasma+exosome+isolation+techniques+and+assessment+of+the+stability+of+exosomes+in+normal+human+blood+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics evaluation of plasma exosome isolation techniques and assessment of the stability of exosomes in normal human blood plasma.</a> Proteomics. 13, 3354-3364 (2013).</li>
<li>Baranyai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Exosomes+from+Blood+Plasma%3A+Qualitative+and+Quantitative+Comparison+of+Ultracentrifugation+and+Size+Exclusion+Chromatography+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods.</a> PloS one. 10, e0145686(2015).</li>
<li>Nordin, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafiltration+with+size-exclusion+liquid+chromatography+for+high+yield+isolation+of+extracellular+vesicles+preserving+intact+biophysical+and+functional+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%3A+nanotechnology%2C+biology%2C+and+medicine%22%5BJournal%5D)">Ultrafiltration with size-exclusion liquid chromatography for high yield isolation of extracellular vesicles preserving intact biophysical and functional properties.</a> Nanomedicine : nanotechnology, biology, and medicine. 11, 879-883 (2015).</li>
</ol>

Praca ta była wspierana przez VA Merit Review 2I01BX001786-06A1 finansowanie dla RS.

Mysie modele chorób są powszechnie stosowane do oceny fizjologicznej funkcji określonych genów i zmniejszania kosztów eksperymentów2. Opisane tutaj ostre septyczne uszkodzenie płuc naśladuje reakcję zapalną obserwowaną u ludzi z ARDS. Model ten jest istotny dla badania patogenezy molekularnej, rozwoju biomarkerów oraz testowania potencjalnych nowych terapii5.
Systemy kohodowli są istotne dla badań in vivo w kontekście badania potencjalny...

ALI i ARDS to zagrażające życiu formy niewydolności oddechowej z ciężką hipoksemią spowodowaną niekardiogennym obrzękiem płuc, który dotyka około 1 miliona ludzi na całym świecie rocznie1. Etiologia ARDS obejmuje bezpośrednie uszkodzenie płuc w wyniku infekcji lub zachłyśnięcia oraz różne pośrednie zniewagi. W ciągu ostatniej dekady pogłębiono wiedzę na temat molekularnej patogenezy ARDS, jednak specyficzne ukierunkowane metody leczenia ARDS nie zostały jeszcze opracowane2,3.
Opracowano kilka zwierzęcych modeli ostrego uszkodzenia płuc, które stanowią pomost do przełożenia eksperymentalnych terapii na badania na ludziach4,5. Powszechnie stosowane modele obejmują lokalną instalację kwasu oleinowego, bakterii, LPS i bleomycyny. Inne podejścia obejmują niedokrwienie-reperfuzję, nakłucie podwiązania jelita ślepego, rozciągnięcie wywołane wentylacją mechaniczną, hiperoksję lub ogólnoustrojowe podawanie bakterii i LPS5. Modele te stanowią użyteczny system biologiczny do testowania hipotez klinicznych i opracowywania potencjalnych terapii. Aby symulować ludzkie ARDS, modele zwierzęce powinny odtworzyć stan zapalny i ostre uszkodzenie komórek nabłonka i śródbłonka z defektami funkcji bariery w płucach.
Egzosomy to pęcherzyki błonowe o średnicy 20 - 200 nm, których zawartość molekularna zawiera białka, DNA, RNA i lipidy, i ułatwiają komunikację międzykomórkową w mikrośrodowisku tkankowym poprzez transfer składu molekularnego. Egzosomy są wydzielane przez wiele typów komórek, takich jak komórki śródbłonka, komórki nabłonkowe, komórki mięśni gładkich i komórki nowotworowe i występują w płynie ustrojowym człowieka. Badania wskazują, że egzosomy regulują wzajemne oddziaływanie między komórkami odpornościowymi a komórkami zrębu podczas zakaźnych i sterylnych chorób zapalnych, a ich nieprawidłowe uwalnianie wydaje się być regulowane przez różne naturalne i eksperymentalne bodźce podczas procesów fizjologicznych i patologicznych6. Taka sieć komunikacyjna może odgrywać ważną rolę w patogenezie chorób płuc i wpływać na postęp patofizjologiczny7,8. Jako 18 - 22 nukleotydowe niekodujące RNA, miRNA istnieją zarówno w tkankach, jak i płynach ustrojowych, osoczu, surowicach i modulują ekspresję mRNA na poziomie potranslacyjnym9,10.
Upakowane miRNA w egzosomach wpływają na różnicowanie i funkcjonowanie wielu typów komórek, a ich nadmierne poziomy są związane z różnymi chorobami, w tym rakiem, chorobami płuc, otyłością, cukrzycą i chorobami układu krążenia11,12,13,14,15,16. Wejście do komórek biorcy i transport egzosomalnych miRNA ułatwia komunikację międzykomórkową, modyfikując hemostazę mikrośrodowiska17,18. Ostre uszkodzenie płuc jest złożonym procesem, obejmującym wiele typów komórek z rozległą komunikacją międzykomórkową za pośrednictwem egzosomów8. miR-155 i miR-146a mają wspólny mechanizm regulacji transkrypcji i przyczyniają się do odpowiedzi zapalnej i tolerancji immunologicznej19,20. Ostatnie badania wskazują, że oba modulują odpowiedź zapalną poprzez egzosomalne miRNA przemieszczające się między komórkami odpornościowymi21. Jednak mechanizmy molekularne leżące u podstaw modulacyjnego wpływu egzosomalnych miRNA na odpowiedź pęcherzyków płucnych na endotoksynę pozostają niejasne, niewątpliwie potencjalne znaczenie kliniczne i implikacje translacyjne zasługują na dalsze badania.
Modele współhodowli są wykorzystywane do definiowania interakcji między określonymi typami komórek w złożonym środowisku, takim jak stany zapalne i nowotwory22,23. Platformy te zapewniają alternatywną strategię badania wzajemnych oddziaływań między typami komórek, szczególnie w przypadku komórek immunologicznych i strukturalnych.
Dotchawicze, aerozolowe, dootrzewnowe lub ogólnoustrojowe podawanie LPS jest powszechnie stosowane do wywoływania eksperymentalnego uszkodzenia płuc24,25,26, i wykazały, że wywołują defekty przepuszczalności nabłonka i śródbłonka. Tutaj używamy dootrzewnowego LPS do wywołania septycznego modelu ostrego uszkodzenia płuc u myszy. W ciągu 24 godzin od podania dootrzewnowego LPS dochodzi do powstania zaburzeń przepuszczalności w płucach z rekrutacją komórek zapalnych. Ponadto pokazujemy, że egzosomy z BAL zawierają miRNA-155 i miR-146a, a egzosomy z płynu BAL indukują ekspresję cytokin prozapalnych w komórkach nabłonka biorcy, w tym IL-6 i TNF-α. Dane te są pierwszymi, które pokazują, że egzosomalne miRNA są wydzielane w BAL w tym modelu ostrego septycznego uszkodzenia płuc.

<table><tbody><tr><td>lipopolisacharyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Escherichia coli 055:B5</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH7.2(1X)</td><td>Life technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji miRNA mirVana</td><td>Thermo Fisher</td><td>449774</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Thermo Fisher</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>mmu-miR-155 (002571) podkład</td><td>Thermo Fisher</td><td>4427975</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-146a (000468) starter</td><td>Thermo Fisher</td><td>4427975</td><td></td></tr><tr><td>starter U6snRNA</td><td>Thermo Fisher</td><td>4427975</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alpha;( Mm00443258_m1 ) podkład</td><td>Thermo Fisher</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 (Mm00446190_m1&nbsp; &nbsp; ) grunt</td><td>Thermo Fisher</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 (Mm00493699_m1&nbsp; )podkład</td><td>Thermo Fisher</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>minimalnym niezbędnym podłożem (MEM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11095-072</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trysin-EDTA(0,05%)</td><td>Termo Fisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Egzosomy zostały oznaczone PKH67 przez PKH67 Łącznik zielonych komórek fluorescencyjnych Mini Kit&nbsp;</td><td>Kolumny wirujące egzosomu Sigma-Aldrich</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>(MW3000)</td><td></td><td>Ultrawirówka Thermo Fisher</td> 4484449 <td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Optima L-100XP&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>L-100XP</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-przezroczyste probówki wirówkowe</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems 7500 Szybki system PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Transmisyjne</td> mikroskopy elektronowe Thermo Fisher <td></td><td></td></tr><tr><td>(TEM)</td><td>JEOL Ltd</td><td>120 kV TEM</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Olympus BX41</td><td>Olympus</td><td>BX41</td><td></td></tr></tbody></table>

egzosomy płukania oskrzelowo-pęcherzykowego w septycznym uszkodzeniu płuc wywołanym lipopolisacharydem

Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

Ostre uszkodzenie płuc (ALI) i zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) reprezentują niejednorodną grupę chorób płuc, które nadal charakteryzują się wysoką zachorowalnością i śmiertelnością. Patogeneza molekularna ALI jest coraz lepiej definiowana; Jednak ze względu na złożony charakter choroby terapie molekularne nie zostały jeszcze opracowane. Tutaj używamy mysiego modelu ostrego septycznego uszkodzenia płuc indukowanego lipopolisacharydem (LPS), aby określić rolę egzosomów w odpowiedzi zapalnej. Korzystając z tego modelu, byliśmy w stanie wykazać, że myszy, które są narażone na dootrzewnowy LPS, wydzielają egzosomy w płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) z płuc, które są upakowane w miRNA i cytokiny regulujące odpowiedź zapalną. Ponadto, wykorzystując system modelu kohodowli, pokazujemy, że egzosomy uwalniane z makrofagów zaburzają ekspresję białek połączeń ścisłych w komórkach nabłonka oskrzeli. Wyniki te sugerują, że 1) wzajemne oddziaływanie między wrodzonymi komórkami odpornościowymi i strukturalnymi poprzez transport egzosomalny przyczynia się do odpowiedzi zapalnej i zakłócenia bariery strukturalnej oraz 2) celowanie w te miRNA może zapewnić nową platformę do leczenia ALI i ARDS.

W celu wywołania septycznego uszkodzenia płuc myszy poddano działaniu LPS w drodze podania dosytronicznego (15 mg/kg). W ciągu 24 h od podania LPS w płucach zaobserwowano napływ neutrofilów, co przedstawiono na Rysunku 1A. Pobrano płyn BAL myszy, a następnie przeprowadzono izolację i oczyszczanie egzosomów. Morfologię egzosomów z BALF potwierdzono za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (Rysunek 1B).
<p class="jove_c...

Myszy wystawione na działanie dootrzewnowego LPS wydzielają egzosomy w płynie płukania oskrzelowo-pęcherzykowym (BAL), które są wypełnione miRNA. Korzystając z systemu kohodowli, pokazujemy, że egzosomy uwalniane w płynie BAL zaburzają ekspresję białek połączeń ścisłych w komórkach nabłonka oskrzeli i zwiększają ekspresję cytokin prozapalnych, które uwydatniają uszkodzenie płuc.

Egzosomy płukania oskrzelowo-pęcherzykowego w septycznym uszkodzeniu płuc wywołanym lipopolisacharydem

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent a heterogeneous group of lung diseases which continues to have a high ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest określenie roli egzosomów w reakcjach zapalnych w mysim modelu ostrego septycznego uszkodzenia płuc wywołanego LPS. Tak więc ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania związane z przesłuchem komórkowym w ostrym uszkodzeniu płuc i zespole ostrej niewydolności oddechowej. Zwłaszcza komunikacja międzykomórkowa w środowisku pęcherzykowo-mikro poprzez transport egzosomów.Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona izolację i charakterystykę wysoce oczyszczonych egzosomów popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych pochodzących od myszy septycznych leczonych endotoksyną z ostrym uszkodzeniem płuc. Demonstracją procedury są dr Zhihong Yuan i dr Chetna Bedi. Na początek załaduj strzykawkę o pojemności jednego mililitra wyposażoną w igłę o rozmiarze 27 z 0,1 mililitra LPS i PBS na mysz i ręcznie przytrzymuj pierwszą sześcio- do ośmiotygodniową męską czarną mysz C57 6J.Dostarczyć LPS dotrzewnowo i przywrócić zwierzę do klatki. 24 godziny później wykonaj pięciomilimetrowe nacięcie na środku szyi pierwszego zwierzęcia i użyj kleszczy, aby delikatnie oddzielić mięśnie, aby odsłonić tchawicę. Następnie delikatnie włóż igłę o rozmiarze 27 dołączoną do sterylnej strzykawki o pojemności 10 mililitrów do tchawicy i wstrzyknij jeden mililitr sterylnego PBS.Następnie natychmiast wymień 10-mililitrową strzykawkę na trzymililitrową strzykawkę wyposażoną w nową igłę o rozmiarze 27. Zassać płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego lub BOLF i dodać BOLF do odpowiednio oznakowanej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów na lodzie. Aby wyizolować egzosomy, odwiruj próbki BOLF i przenieś supernatanty do nowych 15-mililitrowych probówek.Ponownie odwirować próbki i przenieść supernatanty do probówek ultrawirówek w celu usunięcia większych, komórkowych cząstek. Przenieść supernatanty do nowych stożkowych probówek i załadować próbki do filtrów strzykawkowych o wielkości 0,2 mikrona, aby usunąć wszelkie pozostałe większe cząstki. Dodaj przefiltrowane próbki do nowych probówek ultrawirówek, aby osadzać egzosomy.Ostrożnie wyrzucić supernatanty i ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach PBS na probówkę. Następnie przenieś próbki egzosomów do pojedynczych 1,5 mililitrowych probówek do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby oczyścić egzosomy, dodaj 0,4 mikrolitra odpowiedniego barwnika egzosomowego do jednej probówki zawierającej 100 mikrolitrów roztworu zawiesiny na próbkę i szybko dodaj jedną rozmrożoną próbkę egzosomu do każdej probówki barwnika.Dokładnie wymieszaj egzosomy z barwnikiem i inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez pięć minut, chroniąc przed światłem. Pod koniec inkubacji umieść jedną kolumnę wirową egzosomu na próbkę w 1,5-mililitrowej probówce iluzji i przenieś roztwory egzosomów do środka każdej kolumny wirowej. Następnie odwirować próbki, wyrzucić kolumny i przechowywać wyznaczone próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Aby zmierzyć wychwyt egzosomu przez komórki biorcy, najpierw wysiewaj 12 komórek nabłonka płuc myszy razy 10 do czwartego nabłonka płuc myszy w 0,5 mililitra pożywki do każdej studzienki szkiełka z ośmioma dołkami na 16-godzinną hodowlę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Po rozmrożeniu dodaj 10 mikrolitrów oczyszczonych egzosomów znakowanych fluorescencyjnie do każdej studzienki i zwróć kultury komórkowe do inkubatora na jedną godzinę. Pod koniec inkubacji przemyć komórki PBS i utrwalić każdą kokulturę 1% paraformaldehydem przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Usunąć pożywkę, a następnie zamontować szkiełko z pożywką uzupełnioną DAPI i zobrazować próbki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w 40-krotnym powiększeniu. Aby zweryfikować interakcję egzosomu z komórkami biorcy, wysiewaj dwa razy 10 do piątych komórek nabłonka płuc myszy w dwóch mililitrach pożywki na basenie na 12-dołkowej płytce hodowlanej zawierającej odpowiednią pożywkę hodowlaną na dwugodzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Pod koniec inkubacji dodaj 20 mikrogramów egzosomów do trzech studzienek komórek nabłonkowych na grupę eksperymentalną i zwróć komórki do inkubatora.Po 24 godzinach usuń pożywkę, umyj komórki PBS i dodaj 600 mikrolitrów buforu do lizy do każdej studzienki, delikatnie wstrząsając. Następnie przenieś całą zawartość każdej studzienki do pojedynczych 1,5 mililitrowych probówek i przeanalizuj próbki zgodnie ze standardowymi protokołami PCR w czasie rzeczywistym. W ciągu 24 godzin od podania LPS obserwuje się napływ neutrofilów do płuc zwierząt leczonych LPS.Po ich wyizolowaniu i oczyszczeniu, jak właśnie wykazano, obecność egzosomów w BOLF ze zwierząt z septycznym uszkodzeniem płuc można potwierdzić za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Ekspresja wybranego prozapalnego mikro RNA jest znacznie zwiększona w egzosomach płynu oskrzelowo-pęcherzykowego od zwierząt leczonych LPS w porównaniu z kontrolowanymi myszami leczonymi PBS. Egzosomy traktowane LPS są wychwytywane przez mysie komórki nabłonka oskrzelików, o czym świadczy kolokalizacja egzosomów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym z komórkami znakowanymi DAPI po godzinie kohodowli.Ekspresja mediatora prozapalnego jest znacznie zwiększona w komórkach nabłonka hodowanych wspólnie z egzosomami od zwierząt leczonych LPS w porównaniu z kohodowlą z egzosomami od myszy kontrolnych leczonych PBS. Co więcej, komórki traktowane egzosomami od myszy leczonych LPS wykazują znacznie osłabioną ekspresję zonula occludens one w porównaniu z kontrolami, co wskazuje na mniej nienaruszoną integralność komórek po kohodowli egzosomów traktowanych LPS. Dootrzewnowe wstrzyknięcie LPS, ekstrakcja płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i delegacja egzosomu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego wszystkie etapy można wykonać w stosunkowo krótkim czasie.Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak kohodowla egzosomów i komórek nabłonkowych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące wzajemnego oddziaływania między komórkami wrodzonymi i strukturalnymi w mikrośrodowisku pęcherzyków płucnych. Wzajemne oddziaływanie między wrodzonymi komórkami odpornościowymi i strukturalnymi poprzez transport egzosomów przyczynia się do odpowiedzi zapalnej i przerwania bariery strukturalnej, co sugeruje, że egzosomalne celowanie w mikro-RNA może stanowić normalną platformę do leczenia ostrego uszkodzenia płuc i zespołu ostrej niewydolności oddechowej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wywołać septyczne uszkodzenie płuc u myszy, wyizolować płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego od myszy, wyizolować egzosomy z płynu z płukania i użyć modelu kokultury do badania wewnątrzkomórkowego przesłuchu.Nie zapominaj, że praca z LPS może być niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej.

bronchoalveolar-lavage-exosomes-lipopolysaccharide-induced-septic

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Source: Yuan, Z., et al. Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates an in vivo mouse model for inducing and analyzing acute lung injury (ALI) using intraperitoneal administration of bacterial lipopolysaccharide. The inflammatory cascade triggered by alveolar macrophages and neutrophils leads to epithelial and endothelial barrier disruption, allowing fluid and immune cells to accumulate in the alveoli. Alveolar...

Lipopolysaccharide-Induced Acute Lung Injury in Mice for Exosome and Immune Analysis

Odpowiedź immunologiczna gospodarza na infekcję patogenem jest ściśle regulowanym procesem. Wykorzystując model ekspozycji płuc na lipopolisacharydy u myszy, możliwe jest przeprowadzenie oceny w wysokiej rozdzielczości złożonych mechanizmów związanych z patogenezą choroby.

Wykorzystanie dotchawczego podawania PAMP w jamie ustnej i gardłowej oraz płukania oskrzeli i pęcherzyków płucnych w celu oceny odpowiedzi immunologicznej gospodarza u myszy

Opisujemy metodę wywoływania neutrofilowego zapalenia płuc poprzez prowokację do aerozolowanego lipopolisacharydu za pomocą nebulizacji, do modelowania ostrego uszkodzenia płuc. Ponadto opisano podstawowe techniki operacyjne izolacji płuc, intubacji tchawicy i płukania oskrzelowo-pęcherzykowego.

Metoda wytwarzania neutrofilii płucnej przy użyciu lipopolisacharydu w aerozolu

Powtarzające się płukanie płuc u znieczulonych świń powoduje uszkodzenie płuc przypominające główne aspekty zespołu ostrej niewydolności oddechowej u ludzi (ARDS). W tym celu płuca są wielokrotnie przepłukiwane 0,9% solą fizjologiczną w temperaturze 37 °C. Celem protokołu jest powtarzalne łagodzenie wymiany gazowej i hemodynamiki do badań w ARDS.

Niedobór środków powierzchniowo czynnych wywołany płukaniem u świń jako model zespołu ostrej niewydolności oddechowej (ARDS)

Stan zdrowia płuc jest odzwierciedlony przez typ i liczbę komórek odpornościowych, które są obecne w oskrzelikach płuc. Opisujemy technikę płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, która umożliwia izolację i badanie nieprzylegających komórek i rozpuszczalnych czynników z dolnych dróg oddechowych myszy.

Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe płuc myszy w celu analizy nacieku komórek zapalnych

Tutaj opisujemy dwa protokoły izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, wirowanie ultrafiltracji i ultrawirowanie z wirowaniem gradientu gęstości, aby wyizolować pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z próbek płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego myszy. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące z mysiego płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego za pomocą obu metod są określane ilościowo i charakteryzowane.

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z mysiego płynu płucnego z oskrzelowo-pęcherzykowego przy użyciu techniki wirowania ultrafiltracji

Przedstawiona tutaj jest procedura krok po kroku do wywołania ostrego uszkodzenia płuc u myszy poprzez bezpośrednie wkroplenie lipopolisacharydu dotchawiczego i przeprowadzenie analizy FACS próbek krwi, płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i tkanki płucnej. Minimalna inwazyjność, prosta obsługa, dobra odtwarzalność i miareczkowanie ciężkości choroby to zalety tego podejścia.

Wywoływanie ostrego uszkodzenia płuc u myszy przez bezpośrednie wkroplenie lipopolisacharydów dotchawiczych

Myszy narażone na działanie ozonu i endotoksyn bakteryjnych wykazują rozległą śmierć komórek, w tym neutrofili. Zaobserwowaliśmy adaptacje komórkowe, takie jak zakłócenie blaszek cytoszkieletu, zwiększona ekspresja komórkowa podjednostki syntazy ATP kompleksu V β i angiostatyny w płukaniu oskrzelowo-pęcherzykowym, supresja odpowiedzi immunologicznej płuc i opóźniona rekrutacja neutrofili.

Wizualizacja adaptacji komórek płuc podczas połączonego ozonu i ostrego mysiego uszkodzenia płuc wywołanego ozonem i LPS

W tym badaniu wykazano, że nieinwazyjna technika instylacji tchawicy pozwala na rozwój ALI u szczurów za pomocą podstawowego laryngoskopu, aby zapewnić precyzyjne dostarczanie LPS do płuc. LPS jest wprowadzany za pomocą rurki tchawicowej za pomocą laryngoskopu. Skala uszkodzenia płuc jest oceniana w wielu punktach czasowych.

Nieinwazyjne podanie lipopolisacharydu przez endotchawicę w celu wywołania ostrego uszkodzenia płuc u gryzoni

Ten protokół opisuje metodę efektywnej transfekcji siRNA w świeżo wyizolowanych ludzkich cytotrofoblastach kosmkowych za pomocą mikroporacji i identyfikacji kompleksów DNA-białko w tych komórkach. Transfekowane komórki mogą być monitorowane za pomocą analiz Western blot i EMSA podczas 4-dniowego czasu hodowli.

Transfekcja siRNA i analizy EMSA na świeżo wyizolowanych ludzkich cytotrofoblastach kosmkowych

Poznaj izolację egzosomów z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego w uszkodzeniu płuc wywołanym LPS u myszy. Ta metoda pozwala badać komunikację międzykomórkową i odpowiedź zapalną.

Egzosomy płukania oskrzelowo-pęcherzykowego w septycznym uszkodzeniu płuc wywołanym lipopolisacharydem

Przeglądaj więcej filmów