Name: Produkcja elastynopodobnych hydrożeli białkowych do enkapsulacji i barwienia immunologicznego komórek w 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Poznaj metodę ekspresji i oczyszczania białek elastynopodobnych do tworzenia regulowanych hydrożeli 3D do enkapsulacji komórek. Technika umożliwia badanie interakcji komórka-macierz pozakomórkowa w biologii komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują T. Palmerowi i H. Babu (Stanford Neurosurgery) za dostarczenie mysich NPC. Grafika wektorowa w <silnej klasie="xfig">Rysunek 4 został użyty i zaadaptowany z Servier Medical Art na licencji Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/legalcode). Część tych prac została wykonana w Stanford Nano Shared Facilities (SNSF), wspieranym przez National Science Foundation w ramach nagrody ECCS-1542152. N.A.S. potwierdza wsparcie ze strony Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych Narodowych Instytutów Zdrowia (32GM008412). C.M.M. dziękuje za wsparcie ze strony stypendium przeddoktoranckiego NIH NRSA (F31 EB020502) oraz programu Siebel Scholars Program. S.C.H. dziękuje za wsparcie ze strony National Institutes of Health (U19 AI116484 i R21 EB018407), National Science Foundation (DMR 1508006) oraz California Institute for Regenerative Medicine (RT3-07948). Badania te otrzymały finansowanie od Alliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training (AR3T), który jest wspierany przez Narodowy Instytut Zdrowia Dziecka i Rozwoju Człowieka im. Eunice Kennedy Shriver (NICHD), Narodowy Instytut Zaburzeń Neurologicznych i Udaru Mózgu (NINDS) oraz Narodowy Instytut Obrazowania Biomedycznego i Bioinżynierii (NIBIB) Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach nagrody numer P2CHD086843. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one poglądy National Institutes of Health.

<ol><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+Cell-Matrix+Adhesions+to+the+Third+Dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li>
<li>Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+perturbation+in+vitro-A+growing+case+for+three-dimensional+%283D%29+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene expression perturbation in vitro-A growing case for three-dimensional (3D) culture systems.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).</li>
<li>Gómez-Lechón, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expression+of+differentiated+functions+in+hepatocytes+cultured+in+three-dimensional+collagen+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Long-term expression of differentiated functions in hepatocytes cultured in three-dimensional collagen matrix.</a> Journal of Cellular Physiology. 177 (4), 553-562 (1998).</li>
<li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+the+third+dimension+-+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Justice, B. A., Badr, N. A., Felder, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture+opens+new+dimensions+in+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">3D cell culture opens new dimensions in cell-based assays.</a> Drug Discovery Today. 14 (1-2), 102-107 (2009).</li>
<li>Caliari, S. R., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+hydrogels+for+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide to hydrogels for cell culture.</a> Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).</li>
<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).</li>
<li>Madl, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+neural+progenitor+cell+stemness+in+3D+hydrogels+requires+matrix+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Maintenance of neural progenitor cell stemness in 3D hydrogels requires matrix remodelling.</a> Nature Materials. 16 (12), 1233-1242 (2017).</li>
<li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Cells+Feel+and+Respond+to+the+Stiffness+of+Their+Substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate.</a> Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).</li>
<li>Sun, Y., Villa-Diaz, L. G., Lam, R. H. W., Chen, W., Krebsbach, P. H., Fu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+Regulates+Fate+Decisions+of+Human+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mechanics Regulates Fate Decisions of Human Embryonic Stem Cells.</a> PLoS ONE. 7 (5), e37178(2012).</li>
<li>Ehrbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+Role+of+Matrix+Stiffness+in+3D+Cell+Migration+and+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Elucidating the Role of Matrix Stiffness in 3D Cell Migration and Remodeling.</a> Biophysical Journal. 100 (2), 284-293 (2011).</li>
<li>Rowlands, A. S., George, P. A., Cooper-White, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+osteogenic+and+myogenic+differentiation+of+MSCs%3A+interplay+of+stiffness+and+adhesive+ligand+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Directing osteogenic and myogenic differentiation of MSCs: interplay of stiffness and adhesive ligand presentation.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 295 (4), 1037-1044 (2008).</li>
<li>Lampe, K. J., Antaris, A. L., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+three-dimensional+engineered+protein+hydrogels+for+tailored+control+of+neurite+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Design of three-dimensional engineered protein hydrogels for tailored control of neurite growth.</a> Acta Biomaterialia. 9 (3), 5590-5599 (2013).</li>
<li>Kilian, K. A., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+Stem+Cell+Fate+by+Controlling+the+Affinity+and+Density+of+Ligand-Receptor+Interactions+at+the+Biomaterials+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Directing Stem Cell Fate by Controlling the Affinity and Density of Ligand-Receptor Interactions at the Biomaterials Interface.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (20), 4891-4895 (2012).</li>
<li>Tse, J. R., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Hydrogel+Substrates+with+Tunable+Mechanical+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 10.16.1-10.16.16 (2010).</li>
<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+A+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li>
<li>DiMarco, R. L., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+Materials+through+Modular+Protein+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Multifunctional Materials through Modular Protein Engineering.</a> Advanced Materials. 24 (29), 3923-3940 (2012).</li>
<li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).</li>
<li>Aladini, F., Araman, C., Becker, C. F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+and+characterization+of+elastin-like+polypeptides+%28ELPs%29+with+variable+guest+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis and characterization of elastin-like polypeptides (ELPs) with variable guest residues.</a> Journal of Peptide Science. 22 (5), 334-342 (2016).</li>
<li>McMillan, R. A., Caran, K. L., Apkarian, R. P., Conticello, V. P. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ma991119z">High-Resolution Topographic Imaging of Environmentally Responsive, Elastin-Mimetic Hydrogels.</a> Macromolecules. 32 (26), 9067-9070 (1999).</li>
<li>McMillan, R. A., Conticello, V. P. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ma9921091">Synthesis and Characterization of Elastin-Mimetic Protein Gels Derived from a Well-Defined Polypeptide Precursor.</a> Macromolecules. 33 (13), 4809-4821 (2000).</li>
<li>Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrakis%28hydroxymethyl%29+Phosphonium+Chloride+as+a+Covalent+Cross-Linking+Agent+for+Cell+Encapsulation+within+Protein-Based+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Tetrakis(hydroxymethyl) Phosphonium Chloride as a Covalent Cross-Linking Agent for Cell Encapsulation within Protein-Based Hydrogels.</a> Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2012).</li>
<li>Romano, N. H., Madl, C. M., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+RGD+ligand+density+and+L1CAM-mediated+Schwann+cell+interactions+synergistically+enhance+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Matrix RGD ligand density and L1CAM-mediated Schwann cell interactions synergistically enhance neurite outgrowth.</a> Acta Biomaterialia. 11, 48-57 (2015).</li>
<li>Shah, M., Hsueh, P. Y., Sun, G., Chang, H. Y., Janib, S. M., MacKay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradation+of+elastin-like+polypeptide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Biodegradation of elastin-like polypeptide nanoparticles.</a> Protein Science. 21 (6), 743-750 (2012).</li>
<li>Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+elastin-like+polypeptides+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (15), 1479-1485 (2010).</li>
<li>Madl, C. M., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine-Selective+Functionalization+for+Bio-Orthogonal+Cross-Linking+of+Engineered+Protein+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tyrosine-Selective Functionalization for Bio-Orthogonal Cross-Linking of Engineered Protein Hydrogels.</a> Bioconjugate Chemistry. 28 (3), 724-730 (2017).</li>
<li>Zhu, D., Wang, H., Trinh, P., Heilshorn, S. C., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin-like+protein-hyaluronic+acid+%28ELP-HA%29+hydrogels+with+decoupled+mechanical+and+biochemical+cues+for+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Elastin-like protein-hyaluronic acid (ELP-HA) hydrogels with decoupled mechanical and biochemical cues for cartilage regeneration.</a> Biomaterials. , 132-140 (2017).</li>
<li>Madl, C. M., Katz, L. M., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-Orthogonally+Crosslinked%2C+Engineered+Protein+Hydrogels+with+Tunable+Mechanics+and+Biochemistry+for+Cell+Encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Bio-Orthogonally Crosslinked, Engineered Protein Hydrogels with Tunable Mechanics and Biochemistry for Cell Encapsulation.</a> Advanced Functional Materials. 26 (21), 3612-3620 (2016).</li>
<li>Cai, L., Dinh, C. B., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-pot+synthesis+of+elastin-like+polypeptide+hydrogels+with+grafted+VEGF-mimetic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">One-pot synthesis of elastin-like polypeptide hydrogels with grafted VEGF-mimetic peptides.</a> Biomater Sci. 2 (5), 757-765 (2014).</li>
<li>Straley, K. S., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2009/sm/b808504h#!divAbstract">Independent tuning of multiple biomaterial properties using protein engineering.</a> Soft Matter. 5 (1), 114-124 (2009).</li>
<li>Baneyx, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10508629">Recombinant protein expression in Escherichia coli.</a> Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).</li>
<li>Graumann, K., Premstaller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manufacturing+of+recombinant+therapeutic+proteins+in+microbial+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Manufacturing of recombinant therapeutic proteins in microbial systems.</a> Biotechnology Journal. 1 (2), 164-186 (2006).</li>
<li>Tashiro, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Synthetic+Peptide+Containing+the+IKVAV+Sequence+from+the+A+Chain+of+Laminin+Mediates+Cell+Attachment%2C+Migration%2C+and+Neurite+Outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Synthetic Peptide Containing the IKVAV Sequence from the A Chain of Laminin Mediates Cell Attachment, Migration, and Neurite Outgrowth.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16174-16182 (1989).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Rekombinowana ekspresja i oczyszczanie białek jest potężnym narzędziem do syntezy biomateriałów o wysokiej odtwarzalności. W dużej mierze ze względu na pojawienie się skomercjalizowanego klonowania molekularnego, niestandardowe rekombinowane plazmidy można kupić od kilku dostawców, co znacznie skraca czas pracy z materiałami takimi jak ELP. Podobnie, plazmidy można zamówić bezpośrednio w laboratorium, z którego pochodzą, gdy oryginalna praca była wspierana przez umowę federalną, a przyszłe prace będą przeznaczone do użyt...

W ciągu ostatniego stulecia, dwuwymiarowa (2D) hodowla tkanek stała się integralnym zestawem narzędzi do badania podstawowej biologii komórki in vitro. Ponadto stosunkowo tanie i proste protokoły hodowli komórek 2D doprowadziły do jej przyjęcia w wielu dyscyplinach biologicznych i medycznych. Jednak wcześniejsze badania wykazały, że tradycyjne platformy 2D mogą prowadzić do wyników, które znacznie odbiegają od tych zebranych in vivo, powodując marnowanie cennego czasu i funduszy na badania kliniczne1,2,3. My i inni stawiamy hipotezę, że ta rozbieżność może być przypisana brakowi natywnych sygnałów biochemicznych i biofizycznych dostarczanych komórkom hodowanym na powierzchniach 2D, które mogą być niezbędne do optymalnej proliferacji i dojrzewania różnych typów komórek.
Aby rozwiązać te problemy i pomóc wypełnić lukę między badaniami 2D in vitro i in vivo, naukowcy opracowali trójwymiarowe (3D) platformy hydrożelowe do enkapsulacji komórek1,4,5,6. Hydrożele są idealnymi materiałami do rekapitulacji endogennego mikrośrodowiska macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) in vivo ze względu na ich tkankowe właściwości mechaniczne i spuchniętą od wody strukturę, która umożliwia szybki transport składników odżywczych i czynników sygnałowych7,8. Co więcej, hydrożele 3D mogą być zaprojektowane tak, aby miały niezależną kontrolę nad właściwościami mechanicznymi i biochemicznymi rusztowania. Zarówno mechanika macierzy9,10,11,12 oraz ligandy adhezyjne komórek13,14,15 są dobrze znane z wpływania na zachowanie komórek in vitro i in vivo. W ten sposób hydrożele 3D o przestrajalnych właściwościach stanowią platformę do badania związków przyczynowo-skutkowych między komórkami a ich mikrośrodowiskiem. Kryteria idealnej matrycy hydrożelowej 3D obejmują prostą, niecytotoksyczną enkapsulację komórek, a także niezależną możliwość dostrajania fizjologicznie istotnych właściwości mechanicznych i naśladowanie natywnych motywów adhezyjnych komórek.
Zarówno syntetyczne (np. glikol polietylenowy, kwas polimlekowy, poli(kwas glikolowy)) jak i pochodzenia naturalnego (np. alginian, kolagen, Matrigel) hydrożele mają przewagę nad platformami do hodowli 2D in vitro; jednak mają również istotne wady, które ograniczają ich zastosowanie. Po pierwsze, wiele platform syntetycznych i pochodzenia naturalnego wymaga trudnych warunków sieciowania, które mogą być potencjalnie toksyczne dla komórek ssaków, prowadząc do zmniejszenia żywotności komórek7. Ponadto wiele platform syntetycznych nie ma natywnej bioaktywności i musi być funkcjonalizowanych poprzez wtórne reakcje chemiczne, co może zwiększyć koszty i złożoność16. Wreszcie, podczas gdy materiały pochodzenia naturalnego zazwyczaj zawierają wewnętrzne domeny bioaktywne, często są one nękane dużą zmiennością między partiami i często ograniczają się do tworzenia stosunkowo słabych żeli7,17.
Inżynieria białek rekombinowanych prezentuje unikalny zestaw narzędzi do projektowania materiałów, umożliwiając wyraźną kontrolę nad sekwencją białek, a co za tym idzie, potencjalnymi właściwościami mechanicznymi i biochemicznymi końcowego rusztowania hydrożelowego18. Ponadto, dzięki wykorzystaniu dobrze znanej maszynerii biologicznej Escherichia coli (E. coli) do ekspresji białek, materiały mogą być produkowane w sposób ekonomiczny i spójny przy ograniczonej zmienności między i wewnątrz partii. Przedstawione tutaj białko podobne do elastyny (ELP) ma trzy zmodyfikowane domeny: (1) znacznik T7 i His6, który umożliwia znakowanie za pomocą fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał, (2) region "podobny do elastyny", który nadaje elastyczne właściwości mechaniczne i umożliwia chemiczne sieciowanie, oraz (3) region "bioaktywny", który koduje motywy adhezyjne komórek.
Nasz region podobny do elastyny jest oparty na kanonicznej sekwencji elastyny (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)5, gdzie cztery z miejsc aminokwasowych 'Xaa' to izoleucyna (Ile), ale mogą być zaprojektowane tak, aby były dowolnymi aminokwasami z wyjątkiem proliny. Ta sekwencja nadaje rekombinowanym ELP zachowanie niższej temperatury roztworu krytycznego (LCST), które można wykorzystać do prostego oczyszczania po ekspresji za pomocą cykli termicznych19,20. Tę właściwość LCST można dostroić tak, aby agregowała termicznie w różnych temperaturach, modyfikując pozostałość gościa 'Xaa' class21,22.
Tutaj pozycja 'Xaa' na jednym z pięciu powtórzeń podobnych do elastyny została zastąpiona aminokwasem lizyny (Lys), który jest używany do sieciowania hydrożelowego. Nasze poprzednie prace wykazały niecytotoksyczne i odporne sieciowanie poprzez reakcję z aminowo-reaktywnym środkiem sieciującym tetrakis(hydroksymetylo)fosfonium chlorek (THPC)23. Różnicując ogólną zawartość białka i stężenie środka sieciującego, jesteśmy w stanie wyprodukować hydrożele, które można dostroić tak, aby obejmowały fizjologicznie istotny zakres sztywności (~0,5-50 kPa)9,23,24. Oprócz dostrajania właściwości mechanicznych, adhezja komórek w hydrożelu wynika z integracji kanonicznych domen adhezyjnych komórek w szkielecie białka ELP. Na przykład włączenie rozszerzonej sekwencji aminokwasowej "RGDS" pochodzącej z fibronektyny pozwala na adhezję komórek i elastyczność konformacyjną, podczas gdy zaszyfrowany, niewiążący wariant "RDGS" ogranicza adhezję macierzy komórkowej24. Modulując stosunek białek adhezyjnych do nieadhezyjnych, a także całkowite stężenie białka, jesteśmy w stanie skutecznie wytwarzać hydrożele, które obejmują szeroki zakres stężeń ligandów. W rezultacie opracowaliśmy platformę hydrożelową o rozłącznych właściwościach biochemicznych i biofizycznych, którą można niezależnie dostroić w celu uzyskania optymalnej hodowli 3D różnych typów komórek.
Oprócz sztywności matrycy i możliwości przestrajania ligandów adhezyjnych, rekombinowane hydrożele oferują możliwość projektowania określonych profili degradacji materiału, co jest niezbędne do rozprzestrzeniania się komórek, proliferacji i migracji w kontekście 3D4,9. Degradacja ta jest spowodowana wydzielaniem przez komórki proteaz, które są specyficznie ukierunkowane na rozszerzony 'RGDS'9 lub sekwencję podobną do elastyny25. Wykazano również, że hydrożele ELP wspierają późniejsze testy biochemiczne, które są niezbędne do badania żywotności i funkcji komórek, w tym immunocytochemii, a także ekstrakcji DNA/RNA/białka w ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR) i Western blot9. Warianty ELP były również stosowane w wielu modelach in vivo i wiadomo, że są dobrze tolerowane przez układ odpornościowy26.
Podsumowując, ELP jako platforma materiałowa do badań nad enkapsulacją komórek oferuje szeroki wachlarz korzyści w porównaniu do platform materiałów syntetycznych lub pochodzenia naturalnego, które często nie mają tego samego stopnia biochemicznej i biofizycznej przestrajania i odtwarzalności. Dodatkowo, proste i niecytotoksyczne zastosowanie ELP z szeroką gamą typów komórek (np. zwoje korzenia grzbietowego piskląt14,24, mysie neuronalne komórki progenitorowe9, ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste27, chondrocyty noworodków bydła28, ludzkie komórki śródbłonka29,30) pozwala na opracowanie bardziej fizjologicznie istotnego modelu endogennego ECM 3D w porównaniu z hodowlą komórkową 2D. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół ekspresji rekombinowanych ELP do stosowania jako przestrajalna platforma hydrożelowa do enkapsulacji komórek 3D. W dalszej części przedstawiamy metodologię znakowania fluorescencyjnego i mikroskopii konfokalnej komórek otorbionych.

<table><tbody><tr><td><silna>elastynopodobna ekspresja i oczyszczanie białek</mocna></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm Szalki Petriego</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td>RICCA Chemical</td><td>2546.70-1</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3920-500G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1760-25G</td><td></td></tr><tr><td>Agar Bacto</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9002-18-0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3)pLysS Kompetentne komórki</td><td>Invitrogen</td><td>C606003</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Amresco</td><td>0230-100G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>EDTA sól disodowa, dwuwodna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>O2793-500</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A451-4</td><td></td></tr><tr><td>Izopropyl &beta;-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1755-10G</td><td></td></tr><tr><td>Bulion Luria</td><td>EMD Millipore</td><td>1.10285.5007</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF)</td><td>MP Biomedicals</td><td>195381</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S 8045-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy (0,22 &mu; m)</td> <td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>Terrific Bulion</td><td>Millipore</td><td>71754-4</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrożele</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mu; m filtry strzykawkowe</td><td>Millipore</td><td>SLGV004SL</td><td></td></tr><tr><td>arkusz silikonowy o grubości 0,5 mm</td><td>Mikroskopia elektronowa Science</td><td>70338-05</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych&nbsp;</td><td>Jednorazowy</td><td></td> dziurkacz do biopsji Corning 353047 <td></td></tr><tr><td>(2 mm)</td>Jednorazowy dziurkacz do biopsji <td>Integra Miltex</td><td>33-31</td><td></td></tr><tr><td>(4 mm)</td>Jednorazowy dziurkacz do biopsji <td>Integra Miltex</td><td>33-34</td><td></td></tr><tr><td>(5 mm)</td><td>Integra Miltex</td><td>33-35</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>No. 1 Szkiełka nakrywkowe szklane 12 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek tetrakis(hydroksymetylo)fosfoniowy (THPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>404861-100ML</td><td></td></tr><tr><td>0,5% Tryspin/EDTA</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Immunocytochemia komórek w hydrożelach 3D ELP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% (w/v) Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>15701</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Roche</td><td>3116956001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek)</td><td>Sondy molekularne</td><td>D1306&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Surowica osła</td><td>Lampire Biological Labs</td><td>7332100</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne przeciwko myszom kozi (AF488)</td> <td>Sondy molekularne</td><td>A-11017</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne kozy przeciwko królikowi (AF546)</td> <td>Sondy molekularne</td><td>A-11071</td><td></td></tr><tr><td>Surowica kozia</td><td>Gibco</td><td>16210-072</td><td></td></tr><tr><td>Gniazdo myszy Pierwotne przeciwciało</td><td>BD Pharmingen</td><td>556309</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Sox2 Primary</td><td>Antibody Cell Signaling Technology</td><td>23064S</td><td></td></tr><tr><td>Lakier do paznokci</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Hardset Mounting Medium&nbsp;</td><td>Vector Labs</td><td>H-1400&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

produkcja elastynopodobnych hydrożeli białkowych do enkapsulacji i barwienia immunologicznego komórek w 3d

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Techniki dwuwymiarowej (2D) hodowli tkankowej były niezbędne dla naszego zrozumienia podstawowej biologii komórki. Jednak tradycyjne systemy hodowli tkankowych 2D nie mają trójwymiarowej (3D) matrycy, co powoduje znaczną rozbieżność między wynikami zebranymi in vitro i in vivo. Aby rozwiązać ten problem, naukowcy zaprojektowali platformy do hodowli tkanek hydrożelowych 3D, które mogą naśladować biochemiczne i biofizyczne właściwości mikrośrodowiska komórkowego in vivo. Badania te zmotywowały potrzebę opracowania platform materiałowych, które wspierają enkapsulację komórek 3D i dalsze testy biochemiczne. Inżynieria białek rekombinowanych oferuje unikalny zestaw narzędzi do projektowania i opracowywania materiałów hydrożelowych 3D, umożliwiając specyficzną kontrolę sekwencji białek, a co za tym idzie, potencjalnych właściwości mechanicznych i biochemicznych powstałej matrycy. W tym miejscu przedstawiamy protokół ekspresji rekombinowanego białka elastynopodobnego (ELP), które można wykorzystać do tworzenia hydrożeli o niezależnie regulowanych właściwościach mechanicznych i stężeniu liganda adhezyjnego w komórkach. Ponadto przedstawiamy metodologię enkapsulacji komórek w hydrożelach ELP, a następnie barwienia immunofluorescencyjnego osadzonych komórek w celu dalszej analizy i kwantyfikacji.

ELP wykorzystane w tym protokole składają się z pięciu regionów: znacznika T7, znacznika His6, miejsca cięcia enterokinazy (EK), regionu bioaktywnego oraz regionu przypominającego elastinę (Rysunek 1). Znaczniki T7 i His6 umożliwiają łatwą identyfikację za pomocą standardowych technik Western blot. Wprowadzenie miejsca cięcia EK pozwala na enzymatyczne usunięcie regionu znacznika, jeśli jest to konieczne. Region bioaktywny koduje rozszerzone, pochodzące z fib...

Rekombinowane hydrożele modyfikowane białkami są korzystne dla hodowli komórkowych 3D, ponieważ pozwalają na pełne dostrojenie szkieletu polimerowego, a tym samym mikrośrodowiska komórki. W tym miejscu opisujemy proces oczyszczania rekombinowanego białka podobnego do elastyny i jego zastosowanie w enkapsulacji komórek hydrożelowych 3D.

Produkcja elastynopodobnych hydrożeli białkowych do enkapsulacji i barwienia immunologicznego komórek w 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Ogólnym celem tego protokołu jest ekspresja i oczyszczenie rekombinowanych białek podobnych do elastyny do wykorzystania jako przestrajalny hydrożel do enkapsulacji komórek 3D. Ponadto w protokole tym przedstawiono metodologię dalszego znakowania fluorescencyjnego w mikroskopii konfokalnej komórek otorbionych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biomateriałów, medycyny regeneracyjnej i biologii komórki, takie jak zrozumienie roli interakcji komórka-macierz zewnątrzkomórkowa w 3D.Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona powtarzalną, dostrajalną i modułową platformę materiałową, która jest podatna na badanie wielu typów komórek. Ogólnie rzecz biorąc, wdrożenie tej techniki może poprawić naszą wiedzę na temat krytycznych parametrów sygnalizacji ECM komórek, które mogą decydować o powodzeniu przyszłych terapii regeneracyjnych opartych na komórkach. Na płytce agarowej z ampicyliną i chloramfenikolem należy umieścić wstępnie przygotowany bulion bakteryjny zawierający wektor kodujący interesujący nas ELP.Następnie inkubuj płytkę z prążkami do góry nogami w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, aby umożliwić rozwój bakterii. Następnego dnia w

production-elastin-like-protein-hydrogels-for-encapsulation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Prezentujemy protokoły trójwymiarowej (3D) enkapsulacji komórek w syntetycznych hydrożelach. Procedura enkapsulacji została opisana dla dwóch powszechnie stosowanych metod sieciowania (addycji typu Michaela oraz mechanizmów wolnorodnikowych inicjowanych światłem), a także dla szeregu technik oceny zachowania enkapsulowanych komórek.

Enkapsulacja komórkowa w trójwymiarowych hydrożelach w inżynierii tkankowej

Ten film demonstruje technikę immunologicznego barwienia komórek zamkniętych w hydrożelu 3D. Kultura hydrożelowa zawierająca nerwowe komórki progenitorowe jest utrwalana, przepuszczalna i traktowana roztworem blokującym, aby zapobiec nieswoistemu barwieniu immunologicznemu. Dodaje się koktajl przeciwciał pierwszorzędowych w celu związania określonych białek, a następnie znakowane fluorescencyjnie przeciwciała drugorzędowe i barwienie jądrowe. Próbka jest następnie umieszczana na szkiełku...

Barwienie immunologiczne komórek zamkniętych w układzie hydrożelowym 3D

Kolagen jest kluczowym składnikiem ECM i dostarcza niezbędnych wskazówek dla kilku procesów komórkowych, począwszy od migracji, a skończywszy na różnicowaniu i proliferacji. Poniżej przedstawiono protokół osadzania komórek w hydrożelach kolagenowych 3D oraz bardziej zaawansowaną technikę generowania losowych lub wyrównanych matryc kolagenowych przy użyciu mikrokanałów PDMS.

Przygotowanie żeli kolagenowych 3D i mikrokanalików do badania oddziaływań 3D in vivo

Opisujemy sekwencyjny proces tworzenia za pośrednictwem światła i późniejszego biochemicznego wzorcowania syntetycznych matryc hydrożelowych do zastosowań w trójwymiarowych hodowlach komórkowych. Przedstawiono budowę i modyfikację hydrożeli za pomocą cytokompatybilnej chemii photoclick. Ponadto przedstawiono łatwe techniki ilościowego określania i obserwacji wzorców oraz określania żywotności komórek w tych hydrożelach.

Tworzenie i modelowanie hydrożeli za pośrednictwem światła do zastosowań w hodowlach komórkowych

To jest metoda tworzenia trójwymiarowego rusztowania do hodowli komórkowych z zewnątrzkomórkowej macierzy płucnej. Nienaruszone płuca są przetwarzane na hydrożele, które mogą wspierać wzrost komórek w trzech wymiarach.

Przestrajalne hydrożele z macierzy zewnątrzkomórkowej płuc do hodowli komórek 3D

Różne metody manipulowania trójwymiarową architekturą w hydrożelach na bazie białek są tutaj oceniane pod kątem właściwości materiałów. Sieci makroporowate są funkcjonalizowane peptydem adhezyjnym, a ich wykonalność w hodowli komórkowej jest oceniana przy użyciu dwóch różnych modelowych linii komórkowych.

Łatwa manipulacja architekturą w hydrożelach na bazie białek do zastosowań w hodowlach komórkowych

Ten protokół opisuje wytwarzanie elastycznych makroporowatych mikrokriożeli 3D poprzez integrację mikrofabrykacji z technologią kriożelacji. Po załadowaniu komórkami generowane są mikrotkanki 3D, które można łatwo wstrzyknąć in vivo w celu ułatwienia terapii regeneracyjnej lub złożyć w matryce do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków in vitro.

Mikrotkanki 3D do iniekcyjnej terapii regeneracyjnej i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków

Tutaj opisujemy łatwe przygotowanie hydrożeli iniekcyjnych na bazie chitozanu przy użyciu dynamicznej chemii iminowej. Przedstawiono metody regulacji wytrzymałości mechanicznej hydrożelu i jego zastosowania w hodowli komórkowej 3D.

Przygotowanie hydrożeli iniekcyjnych na bazie chitozanu i jego zastosowanie w hodowli komórkowej 3D

Przetwarzanie ścinaniem podczas tworzenia hydrożelu powoduje produkcję zawiesin mikrożelowych, które są cienkie jak ścinanie, ale szybko się restrukturyzują po usunięciu sił ścinających. Materiały te zostały wykorzystane jako matryca nośna do biodruku złożonych, obciążonych komórkami struktur. W tym miejscu opisano metody stosowane do produkcji łoża nośnego oraz kompatybilne biotusze.

Płynne żele agarozowe utworzone przez obróbkę ścinającą podczas żelowania do zawieszonego biodruku 3D

Ten artykuł opisuje, jak drukować biożele 3D fototostrajalne hydrożele do badania usztywnienia macierzy zewnątrzkomórkowej i aktywacji fibroblastów.

Biodruk 3D fotoprzestrajalnych hydrożeli do badania aktywacji fibroblastów

Mimo że sztywność macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) jest kluczowym regulatorem zachowania komórkowego, podstawowe mechanizmy wyczuwania i przekazywania sygnałów pozostają niejasne. Aby temu zaradzić, udostępniamy protokoły tworzenia podłoży na bazie poliakryloamidu i silikonu o regulowanej sztywności, aby poszerzyć naszą wiedzę o komunikacji między komórkami a ECM.

Generowanie substratów ekstrakomórkowych z poliakryloamidu i silikonu o określonej sztywności dla zastosowań w biologii komórki

Poznaj metodę ekspresji i oczyszczania białek elastynopodobnych do tworzenia regulowanych hydrożeli 3D do enkapsulacji komórek. Technika umożliwia badanie interakcji komórka-macierz pozakomórkowa w biologii komórkowej.

Produkcja elastynopodobnych hydrożeli białkowych do enkapsulacji i barwienia immunologicznego komórek w 3D

Przeglądaj więcej filmów