Produkcja elastynopodobnych hydrożeli białkowych do enkapsulacji i barwienia immunologicznego komórek w 3D
May 19th, 2018
Rekombinowane hydrożele modyfikowane białkami są korzystne dla hodowli komórkowych 3D, ponieważ pozwalają na pełne dostrojenie szkieletu polimerowego, a tym samym mikrośrodowiska komórki. W tym miejscu opisujemy proces oczyszczania rekombinowanego białka podobnego do elastyny i jego zastosowanie w enkapsulacji komórek hydrożelowych 3D.
Ogólnym celem tego protokołu jest ekspresja i oczyszczenie rekombinowanych białek podobnych do elastyny do wykorzystania jako przestrajalny hydrożel do enkapsulacji komórek 3D. Ponadto w protokole tym przedstawiono metodologię dalszego znakowania fluorescencyjnego w mikroskopii konfokalnej komórek otorbionych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biomateriałów, medycyny regeneracyjnej i biologii komórki, takie jak zrozumienie roli interakcji komórka-macierz zewnątrzkomórkowa w 3D.
Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona powtarzalną, dostrajalną i modułową platformę materiałową, która jest podatna na badanie wielu typów komórek. Ogólnie rzecz biorąc, wdrożenie tej techniki może poprawić naszą wiedzę na temat krytycznych parametrów sygnalizacji ECM komórek, które mogą decydować o powodzeniu przyszłych terapii regeneracyjnych opartych na komórkach. Na płytce agarowej z ampicyliną i chloramfenikolem należy umieścić wstępnie przygotowany bulion bakteryjny zawierający wektor kodujący interesujący nas ELP.
Następnie inkubuj płytkę z prążkami do góry nogami w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, aby umożliwić rozwój bakterii. Następnego dnia wybierz pojedynczą kolonię z talerza i zaszczep podgrzaną kulturę starterową. Inkubuj kulturę w shakerze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin.
Po okresie inkubacji za pomocą pipety serologicznej przenieść 20 mililitrów kultury starterowej do każdej kolby do odciągu. Pozostawić kolbę ekspresową w potrząsaniu przez jedną godzinę. Po upływie jednej godziny zmierzyć gęstość optyczną porcji z kolby ekspresyjnej na głębokości 600 nanometrów.
Gdy tylko odczyt osiągnie 0,6, zmniejsz temperaturę wytrząsarki do 32 stopni Celsjusza. Gdy odczyt osiągnie 0,8, dodać jeden mililitr jednego molowego sterylnego filtrowanego IPTG, aby wywołać ekspresję ELP w kolbie odciągowej. Pozwól kulturze odciągnąć się przez siedem godzin.
Po siedmiu godzinach odwirować pożywkę do odciągania pokarmu w temperaturze 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wirówce podłogowej. Po odwirowaniu za pomocą szpatułki zebrać osad komórek z pojemnika wirówki i umieścić go w wstępnie zważonej torbie strunowej . Następnie rozpuść osad komórkowy w sterylnym przefiltrowanym buforze TEN.
Masuj osad komórkowy, aby uzyskać jednorodny roztwór. Zamroź worek strunowy z zawieszonymi osadami komórkowymi w pojemniku wtórnym w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Do rozmrożonych komórek dodaj około 30 do 40 miligramów dezoksyrybonukleazy i jeden mililitr 100 milimolowych PMSF na każde 100 mililitrów lizatu komórkowego.
Inkubuj lizat w temperaturze czterech stopni Celsjusza na wytrząsarce przez noc. Po trzecim cyklu zamrażania i rozmrażania odwirować próbki o masie co najmniej 15 000 x g przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu odlać supernatant z pojemnika wirówki i przenieść roztwór do nowego pojemnika wirówki.
Na każde 100 mililitrów supernatantu dodać 5,84 grama chlorku sodu w trzech częściach do końcowego stężenia jednomolowego. Zawiesinę inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Po inkubacji odwirować próbki o masie co najmniej 15 000 x g przez jedną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Po odwirowaniu wyrzuć supernatant z pojemnika wirówki i zmasuj osad. Następnie dodaj 10 mililitrów autoklawizowanej ultraczystej wody na gram granulek otrzymanych po odwirowaniu. Aby upewnić się, że białko całkowicie się rozpuści, użyj metalowej szpatułki do rozgniecenia i ponownego zawieszenia granulki.
Zawiesinę zawiesiny należy inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc na wytrząsarce orbitalnej. Powtórz etapy wirowania na zimno i na gorąco, w sumie przez trzy cykle, aby jeszcze bardziej oczyścić ELP. Następnie dialiuj resztkowy supernatant w membranie dializacyjnej o mocy 3,5 kilodaltonu w porównaniu z czterema litrami wstępnie schłodzonej ultraczystej wody o temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy dni, aby odsolić roztwór białka.
Odwirować końcowy dializowany roztwór we wstępnie schłodzonej wirówce. Zawiesić supernatant w temperaturze 80 stopni Celsjusza w wstępnie zważonej stożkowej probówce. Na koniec liofilizuj zamrożony roztwór przez trzy dni, a następnie zważ końcowy liofilizowany produkt, aby określić wydajność białka.
Za pomocą stempla do biopsji utwórz otwory w arkuszu silikonowym o grubości 0,5 milimetra. Następnie wytnij kwadrat wokół każdego otworu. Następnie za pomocą pęsety usuń plastikową folię z każdej strony poszczególnych foremek.
Po usunięciu folii plastikowej użyj pęsety, aby umieścić identyczną liczbę gołych silikonowych form i szkiełek szklanej pokrywy w naprzemiennych rzędach na pokrywie płytki 48-dołkowej w celu późniejszego spajania plazmowego. Po wytworzeniu wszystkich materiałów do hodowli komórkowych można rozpocząć przygotowanie typu komórki będącej przedmiotem zainteresowania do dalszej enkapsulacji hydrożelowej. Po dysocjacji komórek w zawiesinę pojedynczej komórki, podwielokrotność żądanej liczby komórek do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej.
Następnie odwirować komórki o sile około 200 x g przez trzy minuty. Po odwirowaniu odessać supernatant i przechowywać osad na lodzie. Zawiesić osad komórkowy w roztworze podstawowym ELP do 80% końcowej objętości.
Następnie za pomocą pipety wymieszać roztwór z jednorodną zawiesiną komórek w ELP. Aby uzyskać pozostałą 20% objętość końcową, dodaj roztwór podstawowy THPC do zawiesiny ELP ogniwa. Odpipetować kilka razy, aby zapewnić utworzenie jednorodnej mieszaniny, unikając jednocześnie tworzenia się pęcherzyków powietrza.
Następnie, okrężnymi ruchami, odpipetować mieszaninę komórek ELP THPC do każdej formy na 24-dołkowej płytce. Następnie inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po 15 minutach inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dodatkowe 15 minut.
Po zakończeniu inkubacji ostrożnie dodaj 750 mikrolitrów ciepłej pożywki do hodowli komórkowych do każdej studzienki na 24-dołkowej płytce. Pozostaw hydrożel w temperaturze 37 stopni Celsjusza na żądany czas trwania hodowli. Najpierw odessaj pożywkę z każdej studzienki.
Następnie umyj studzienki jednym mililitrem ciepłego DPBS. Po zakończeniu mycia dodaj 750 mikrolitrów roztworu utrwalającego do każdej studzienki. Następnie inkubować 24-dołkową płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.
Po inkubacji odessać roztwór utrwalający z każdej ze studzienek i wyrzucić utrwalacz do pojemnika na odpady niebezpieczne. Następnie dodaj jeden mililitr DPBS do próbki i natychmiast wyrzuć DPBS do pojemnika na odpady niebezpieczne. Następnie dodaj 750 mikrolitrów roztworu przepuszczalności, aby przepuszczalność próbki przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej na wahaczu z prędkością 15 obrotów na minutę.
Po godzinie odessać roztwór przepuszczalny i dodać do próbki 750 mikrolitrów roztworu blokującego. Pozostawić próbkę na bujaku w temperaturze pokojowej na trzy godziny. Następnie rozcieńczyć pożądane przeciwciała pierwszorzędowe roztworem rozcieńczającym przeciwciała.
Następnie dodaj 500 mikrolitrów roztworu przeciwciała do każdej próbki. Próbki należy inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia odessać roztwór przeciwciała pierwotnego, a następnie przemyć próbki PBST przez godzinę trzykrotnie w temperaturze pokojowej z prędkością 15 obrotów na minutę.
Następnie rozcieńczyć odpowiednie przeciwciała drugorzędowe w pięciu miligramach na mililitr roztworu podstawowego DAPI, aby osiągnąć końcowe stężenie 2,5 mikrograma na mililitr. Następnie dodaj 500 mikrolitrów roztworu do każdej próbki. Następnie użyj folii aluminiowej, aby przykryć płytkę 24-dołkową i inkubować płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.
Następnego dnia odessać roztwór przeciwciała wtórnego i przemyć próbki PBST trzykrotnie przez 30 minut w temperaturze pokojowej na kołysce. Następnie umieść kroplę twardego medium montażowego na powierzchni szkiełka podstawowego i umieść próbkę na podłożu mocującym. Na koniec użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić próbki do szkiełka pokrywy, aby zapobiec zanieczyszczeniu lub ruchowi próbki.
W tym przypadku ekspresja białka docelowego z ELP na całej długości w kontrolowanych warunkach jest potwierdzona przez obecność prążków o stężeniu 37 kilodaltonów zarówno w analizie SDS-PAGE, jak i western blot. Jednak w niekontrolowanych warunkach kilka pasm o niskiej masie cząsteczkowej jest również widocznych przy użyciu western blot. Pasma o niższej masie cząsteczkowej odpowiadają białkom z mniej niż czterema powtórzeniami domeny podobnej do elastyny, co wskazuje, że białko nie ulega pełnej translacji podczas ekspresji.
Wynik ten jest powszechny przy przeprowadzaniu ekspresji powyżej 32 stopni Celsjusza. Aby zmienić stężenie liganda adhezyjnego komórki przy jednoczesnym utrzymaniu stałych właściwości mechanicznych hydrożelu, dostrajany jest stosunek wariantu ELP zawierającego klej komórkowy pochodzący z fibronektyny i sekwencji adhezji niekomórkowej. Co więcej, mysie neuronalne komórki progenitorowe są również zdolne do życia w ciągu siedmiu dni, gdy są zamknięte w 3% hydrożelu ELP.
Żywe komórki są oznaczone kolorem zielonym ze względu na barwienie kalceiną AM, podczas gdy czerwony homodimer etydyny jest preferencyjnie pobierany przez martwe komórki. Aby zweryfikować fenotyp komórek macierzystych nerwowych komórek progenitorowych, ekspresja markerów kanonicznych, takich jak Sox2 i nestina, jest również wizualizowana przez barwienie immunologiczne, gdy komórki są zamknięte w hydrożelach 3D ELP. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyrażać i oczyszczać białko podobne do elastyny do dalszej enkapsulacji różnych typów komórek, a ponadto badać rolę mikrośrodowiska 3D w modulowaniu fenotypu komórkowego.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje ekspresję i oczyszczanie białek przypominających elastynę do zastosowania w elastycznych żelach, nadających się do enkapsulacji komórek 3D. Zawiera również metody fluorescencyjnego oznaczania enkapsulowanych komórek do analizy w mikroskopii konfokalnej.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Biomateriały
- Medycyna regeneracyjna
- Biologia komórki
Tło
- Rekombinowane żele białkowe oferują możliwość regulacji rdzenia polimeru.
- Żele te mogą znacząco wpływać na mikrośrodowisko komórki.
- Zrozumienie interakcji między komórkami a macierzą pozakomórkową jest kluczowe dla terapii regeneracyjnych.
- Technika ta zapewnia powtarzalną i modułową platformę materiałową.
Cel badania
- Oczyszczenie białek przypominających elastynę do enkapsulacji komórek 3D.
- Możliwość badania interakcji komórka-macierz pozakomórkowa w kontrolowanym środowisku.
- Zdobycie lepszych informacji na temat parametrów sygnalizacji komórkowej wpływających na terapie regeneracyjne.
Stosowane metody
- Ekspresja białek przypominających elastynę w systemach bakteryjnych.
- Oczyszczanie białek do formowania żelu.
- Fluorescencyjne oznaczanie enkapsulowanych komórek.
- Mikroskopia konfokalna do obrazowania interakcji komórkowych.
Główne wyniki
- Skuteczna ekspresja białek przypominających elastynę.
- Opracowanie elastycznego żelu do 3D kultury komórek.
- Zwalidowanie technik fluorescencyjnego oznaczania do mikroskopi konfokalnej.
- Uzyskanie wglądu w interakcje komórka-macierz pozakomórkowa w środowiskach 3D.
Konkluzje
- Protokół zapewnia solidną metodę badania zachowania komórek w 3D.
- Rekombinowane żele mogą być dostosowane do różnych typów komórek.
- To podejście może ulepszyć przyszłe terapię regeneracyjne oparte na komórkach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables reproducible, tunable hydrogel platforms for 3D cell encapsulation, addressing the translational gap between 2D in vitro models and in vivo microenvironments. By providing independent control over mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration, it supports mechanistic de-risking in early discovery and improves predictive confidence in cell-based regenerative therapy development. The method enhances workflow continuity from target validation through preclinical modeling by enabling standardized, quantitative assessment of cell-ECM interactions in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by modulating ECM mechanics and ligand density to clarify pathway-specific cell responses.
- Operational Value: Provides a modular material system for consistent phenotypic screening across multiple cell types under defined 3D conditions.
- Predictive Value: Supports lead identification by reducing mechanistic ambiguity in cell-ECM signaling parameters critical for regenerative medicine targets.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized hydrogels with quantifiable mechanical and biochemical outputs for reliable compound or genetic perturbation screening.
- Reproducibility: Enables batch-to-batch consistency in hydrogel formulation, supporting assay standardization and cross-functional data comparison.
- Scalability: Supports platform reuse in downstream workflows through lyophilized protein storage and rapid reconstitution for high-throughput encapsulation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Facilitates modeling of pathophysiological microenvironments by tuning hydrogel properties to match tissue-specific ECM profiles.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by maintaining consistent 3D culture conditions across workflow stages.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven go/no-go decisions based on quantitative immunostaining readouts of stemness markers and viability in encapsulated cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification and preclinical evaluation, providing a tunable 3D system that improves biological fidelity at each stage.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling precise control over ECM variables that influence cellular phenotype and signaling.
- Screening: Delivers assay-ready hydrogels with reproducible encapsulation efficiency and downstream compatibility with immunostaining and imaging workflows.
- Analytics: Generates quantitative fluorescence readouts from immunostained biomarkers (e.g., Sox2, nestin) and viability assays, enabling objective comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Maintains phenotypic stability of progenitor cells over extended culture periods, supporting continuity from mechanistic discovery to preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Positions the ELP expression and purification pipeline as a reusable platform capability for multiple projects requiring customizable 3D microenvironments.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing biological noise through tunable, defined 3D matrices that better reflect in vivo ECM complexity.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via lyophilizable protein stocks and standardized encapsulation protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets through mechanistic insights into cell-ECM dependencies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by generating quantitative, imaging-based endpoints for assessing cellular responses in 3D.
Implementation Considerations
- Requires expertise in recombinant protein expression, bacterial culture, and purification techniques including centrifugation, dialysis, and lyophilization.
- Dependent on access to shakers, centrifuges, and electrophoresis/wblotting equipment for expression validation and quality control.
- Necessitates standardization of hydrogel formulation ratios and crosslinking conditions across teams to ensure mechanical and ligand consistency.
- Requires adaptation of cell dissociation and resuspension protocols for different cell types to maintain viability during encapsulation.
- Practical limitations include the need for optimization of ELP variant ratios to independently tune mechanics and adhesion without compromising gelation kinetics.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:58
ELP Expression Protocol
5:06
Cell Encapsulation in 3D Elastin-like Protein Hydrogels
7:11
Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels
9:47
Results: Purification of Elastin-like Protein and its Application for 3D Hydrogel Cell Encapsulation
11:18
Conclusion
