Name: Frakcjonowanie subkomórkowe ze świeżych i mrożonych próbek przewodu pokarmowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Poznaj metodę frakcjonowania subkomórkowego białek z bioptatów jelitowych, stosowaną do próbek świeżych i mrożonych. Technika umożliwia analizę lokalizacji białek cytoplazmatycznych i jądrowych w badaniach gastroenterologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Anderowi Lopezowi i Miren Telletxea za pomoc w nagrywaniu i edycji filmów. ACR jest finansowany ze stypendium Ikerbasque i projektu badawczego Asociación de Celiacos Madrid (ACM). JRB jest finansowany przez projekt ISCIII-PI16/00258 i współfinansowany przez Unię Europejską, EFRR/EFS "Sposób na Europę". Państwo Islamskie jest finansowane z grantu 2015111068 projektu badawczego Urzędu Zdrowia Kraju Basków. IRG i AJM są wspierane przez granty na stypendia przeddoktoranckie odpowiednio z UPV/EHU i Baskijskiego Departamentu Edukacji.

To badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Szpitala Uniwersyteckiego Cruces, a analizy zostały przeprowadzone po uzyskaniu świadomej zgody od wszystkich badanych lub ich rodziców.
1. Kolekcja biopsji
UWAGA: Próbki biopsji z dystalnego dwunastnicy pacjentów są pobierane podczas rutynowej endoskopii diagnostycznej, która zarządza biopsjami o wadze od 2 do 10 mg. Tkanka poddana biopsji to złożona tkanka złożona z różnych typów komórek, w tym komórek nabłonkowych, odpornościowych i śródbłonka. Gastroenterolodzy kliniczni wykonują endoskopię zgodnie z ustalonymi wytycznymi klinicznymi.
<ol>
	<li>Umieść biopsję na sterylnej bibule filtracyjnej zaraz po endoskopii.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby przenieść biopsje w probówkach o pojemności 1,5 ml, namocz je PBS i umieść w krioprobówce.</li>
	<li>Trzymaj probówki na lodzie, dopóki nie dotrą do laboratorium.
	<ol>
		<li>Natychmiast rozpocznij przetwarzanie świeżych biopsji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku biopsji mrożonej należy błyskawicznie zamrozić probówki zawierające biopsję i przechowywać w ciekłym azocie do czasu użycia. 
	UWAGA: Ważne jest, aby utrzymać próbkę w stanie zamrożonym do momentu dodania buforu 1 uzupełnionego na zimno.</li>
</ol>
2. Przygotowanie bufora
Uwaga: Zanim zaczniesz, uzupełnij w następujący sposób.
<ol>
	<li>Dodać 1 mM DTT (stężenie końcowe) oraz koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy (1x stężenie końcowe) do buforu hipotonicznego 1 i buforu hipertonicznego 2 (Tabela 1).
	<ol>
		<li>Przygotować 1,5 ml buforu 1 i 150 μl buforu 2 na próbkę. Naziemna telewizja cyfrowa zapobiegnie utlenianiu próbek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować bufor do przemywania jąder przez dodanie 1% detergentu (nonyl fenoksyetoksyetanolu) do końcowego stężenia 0,1% do już uzupełnionego buforu 1. Przygotować 1 ml buforu do przemywania jąder na próbkę.</li>
</ol>
3. Homogenizacja biopsji
<ol>
	<li>Świeże biopsje
	<ol>
		<li>Umieść jednorazowy tłuczek w mikserze z napędem. Upewnij się, że tłuczek sięga dna tuby.</li>
		<li>Wyjmij biopsję z krioprobówki i umieść ją w probówce o pojemności 1,5 ml z końcówką do pipety.</li>
		<li>Dodać 200 μl uzupełnionego buforu 1 do probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Homogenizować biopsję za pomocą tłuczka, aż tkanka zostanie całkowicie rozerwana i trzymać ją na lodzie.</li>
		<li>Po homogenizacji wszystkich biopsji przejdź do kroku 4. 
		Uwaga: Tłuczki jednorazowe należy wymieniać między biopsjami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Biopsje mrożone 
	UWAGA: Ostrożnie obchodzić się z ciekłym azotem; Kontakt ciekłego azotu ze skórą lub oczami może spowodować poważne obrażenia spowodowane zamarznięciem. Chroń ręce i oczy zawsze podczas pracy z ciekłym azotem.
	<ol>
		<li>Weź trochę ciekłego azotu do pudełka, aby przechowywać krioprobówki pobrane ze zbiornika azotu.</li>
		<li>Znajdź biopsję w zbiorniku z azotem i umieść krioprobówkę w pudełku z ciekłym azotem. Powtórz ten krok dla wszystkich biopsji.</li>
		<li>Przenieś biopsję z krioprobówki do probówki o pojemności 1,5 ml. 
		UWAGA: Biopsje zostaną podłączone do zamrożonej probówki. Wciśnij biopsję sterylną końcówką pipety, aby odczepiła się od probówki.</li>
		<li>Dodać 200 μl uzupełnionego buforu 1.</li>
		<li>Homogenizować tkankę za pomocą tłuczka i moździerza, aż do całkowitego rozerwania tkanki, utrzymując temperaturę na poziomie 4 °C przez cały czas trwania zabiegu. 
		Uwaga: Nie pozwól, aby biopsje rozmroziły się przed dodaniem buforu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Izolacja cytoplazmy
<ol>
	<li>Inkubować homogenizowaną biopsję na lodzie przez 10 minut.</li>
	<li>Dodać 10 μl 1% detergentu (nonyl phenoxyethoxylethanol) do każdej próbki do końcowego stężenia 0,05%. 
	UWAGA: Komórki pęcznieją i pękają w wyniku lizy osmotycznej, ponieważ łagodny detergent naruszy błonę komórkową.</li>
	<li>Inkubować na lodzie przez 5 minut.</li>
	<li>Krótko przetrząsnąć i odwirować przy 400 x g w temperaturze 4 °C przez 2 min.</li>
	<li>Po wirowaniu usuń supernatant i przenieś go do nowej czystej probówki o pojemności 1,5 ml; będzie to frakcja cytoplazmatyczna. Nie wyrzucaj granulek.</li>
</ol>
5. Izolacja jądrowa
<ol>
	<li>Zawiesić osad z poprzedniego etapu za pomocą 200 μl buforu do przemywania jąder.</li>
	<li>Wirować probówkę przez 2 minuty w temperaturze 400 x g i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i powtórzyć procedurę mycia jeszcze dwa razy. 
	UWAGA: Mycie usunie zanieczyszczenia cytoplazmatyczne we frakcji jądrowej.</li>
	<li>Po trzecim przemyciu ponownie zawiesić osad w 100 μl buforu 2.</li>
	<li>Wstrząsać energicznie próbką w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Alternatywnie inkubować próbkę na lodzie i wirować co 5 minut.</li>
	<li>Po wstrząśnięciu odwirować próbkę przez 10 minut przy maksymalnej prędkości (> 12 000 x g) i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po wirowaniu przenieść supernatant do nowej, czystej probówki o pojemności 1,5 ml. To będzie frakcja jądrowa.</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja białka
Uwaga: Określ ilościowo białka za pomocą zestawu do oznaczania białek kwasem bicinchoninowym (BCA). Stężenie białek we frakcjach będzie się wahać od 0,5 do 5 μg/μL, przy czym jest niższe we frakcji jądrowej (patrz tabela 2 dla stężeń białek wynikających z biopsji 2 mg).
<ol>
	<li>Przygotować krzywą wzorcową z następującymi ilościami albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (μg)12: 0-0,5-1-2-3-4-5-6.</li>
	<li>Przygotować odczynniki potrzebne do użycia 100 μl końcowej mieszanki BCA na próbkę.</li>
	<li>Odpipetować 2 μl każdej frakcji białkowej na płytce 96-dołkowej, dodać mieszankę BCA i postępować zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi odczytu.</li>
</ol>

<ol><li>Cox, B., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+subcellular+fractionation+and+protein+extraction+for+use+in+mass-spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).</li>
<li>Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+quantitative+and+dynamic+mapping+of+protein+subcellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization.</a> eLife. 5, (2016).</li>
<li>Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPreedy%2C+VR+%22Methods+in+disease+investigating+the+gastrointestinal+tract%22">Methods in disease investigating the gastrointestinal tract</a>. , Greenwich Medical Media. (1998).</li>
<li>Alex, P., Gucek, M., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+proteomics+in+the+study+of+inflammatory+bowel+diseases%3A+Current+status+and+future+directions+with+available+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+bowel+diseases%22%5BJournal%5D)">Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies.</a> Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).</li>
<li>Ericsson, C., Franzén, B., Nistér, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+tissue+biobanks.+Tissue+handling%2C+cryopreservation%2C+extraction%2C+and+use+for+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+oncologica+%28Stockholm%2C+Sweden%29%22%5BJournal%5D)">Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis.</a> Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).</li>
<li>Hoffmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+application+of+a+subcellular+fractionation+method+to+kidney+and+testis+for+the+determination+of+conjugated+linoleic+acid+in+selected+cell+organelles+of+healthy+and+cancerous+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).</li>
<li>Foster, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mammalian+Organelle+Map+by+Protein+Correlation+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling.</a> Cell. 125 (1), 187-199 (2006).</li>
<li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, e440-e445 (2015).</li>
<li>Börner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+protein+extraction+from+human+pancreatic+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues.</a> BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).</li>
<li>Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+disease%3A+protease+functions+in+intestinal+mucosal+pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+clinical+practice.+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology.</a> Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).</li>
<li>Cutler, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCutler%2C+P+%22Protein+purification+protocols%22">Protein purification protocols</a>. , Humana Press. (2004).</li>
<li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bicinchoninic+Acid+%28BCA%29+Assay+for+Protein+Quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Protein+Protocols+Handbook%22%5BJournal%5D)">The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation.</a> The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).</li>
<li>McLane, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+localization+of+T-bet+and+Eomes+in+CD8+T+cell+memory+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology+%28Baltimore%2C+Md.%3A+1950%29%22%5BJournal%5D)">Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).</li>
<li>Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRM1+nuclear+export+protein+in+normal+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+biochemistry+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease.</a> International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół służy do frakcjonowania jądrowego i cytoplazmatycznego biopsji jelita. Oczyszczone białka nie są denaturowane i mogą być stosowane nie tylko w analizie western blot, jak pokazano na rysunku 2 i 3 , ale także w testach wymagających natywnie sfałdowanych białek, takich jak immunoprecypitacja, test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) lub natywna elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE).
Opisana metoda polega...

Białka uczestniczą w prawie wszystkich funkcjach biologicznych w komórce, a każda zmiana ich struktury, ilości lub lokalizacji może prowadzić do patogennego scenariusza. Metody frakcjonowania próbek tkanek są użytecznym podejściem do zmniejszania złożoności analiz białek związanych z chorobą. Niektóre badania wykorzystują informacje o lokalizacji białek lub wzbogacają białko z określonego przedziału komórkowego, więc protokół odtwarzalnego frakcjonowania nienaruszonych białek jest przydatny, aby odpowiedzieć na pewne pytania biologiczne. Określenie subkomórkowej lokalizacji białek i monitorowanie ich redystrybucji kompartmentowej lub interakcji w warunkach podstawowych i chorobowych pomoże zidentyfikować różnice funkcjonalne związane z chorobą1,2. W związku z tym metoda ta ma na celu powtarzalne frakcjonowanie biopsji tkanki jelitowej, zarówno świeżej, jak i mrożonej, do cytoplazmatycznych i jądrowych przedziałów subkomórkowych.
Próbki z biopsji jelita są rutynowo pobierane podczas procedur endoskopowych3 (Rysunek 1) i mogą być skutecznie wykorzystywane do oceny ilościowej białek lub badań immunoprecypitacyjnych. Ponieważ próbki tkanek z nabłonka jelitowego będą zawierały białka, które mogą być bezpośrednio zaangażowane w patogenezę choroby4, próbki z biopsji jelita są bardzo cennym źródłem dla skutecznej identyfikacji białek specyficznych dla choroby jelit. Przechowywane zamrożone próbki tkanek pacjenta wraz z informacjami klinicznymi są użytecznymi zasobami do analizy białek, a proste i powtarzalne przygotowanie próbki jest kluczową kwestią w dostarczaniu informacji o kompartmentach komórkowych przy użyciu ograniczonych ilości zamrożonej tkanki5.
Istnieje kilka dostępnych na rynku zestawów do rozdzielania frakcji komórkowych, ale są one droższe i ogólnie bardziej czasochłonne niż protokół przedstawiony tutaj. Protokoły oparte na wieloetapowym wirowaniu gradientowym i ciągłych gradientach były również wcześniej używane do frakcjonowania różnych przedziałów komórkowych w różnych tkankach6,7. Jednak utrzymanie spójności ciągłych gradientów jest często trudnym zadaniem. Podobne protokoły oparte na sekwencyjnej lizie membran zostały opisane wcześniej, ale zazwyczaj wymagają więcej niż dwóch, a czas pracy jest dłuższy8 .
Podczas frakcjonowania próbek tkanek pamiętaj, że próbki tkanek prezentują interakcje komórka-komórka i komórka-matryca, które nie występują w hodowanych komórkach, a są ważne przy procesie ekstrakcji białek. Prawidłowy rozkład między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową bez wpływu na jakość białka będzie krytycznym czynnikiem w izolacji białek tkanki jelitowej9. W tym protokole kontakty komórka-komórka i komórka-matryca są najpierw zrywane, uwalniając komórki i umożliwiając buforowi dotarcie do poszczególnych komórek. Aby uniknąć mieszania się białek z przedziałami przed frakcjonowaniem, rozpad kontaktów musi nastąpić bez zmiany integralności komórek lub błon jądrowych.
Ze względu na wzbogacenie różnych proteaz w błonie śluzowej jelit10, ważne jest, aby kontrolować degradację białka podczas ekstrakcji. Aby zminimalizować potencjalną degradację białek, w do ekstrakcji białek musi znajdować się wiele inhibitorów proteazy. Dodatkowo, jeśli ekstrakty mają być używane do testów funkcjonalnych, ważne jest, aby unikać denaturacji białek lub proteolizy, ponieważ spowoduje to utratę aktywności białek11. W tym celu protokół przeprowadza się w temperaturze 4 °C, a świeży fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF) dodaje się do w końcowym stężeniu 0,1 mM tuż przed użyciem w celu dalszego zahamowania proteolizy.
Pierwszym krokiem w frakcjonowaniu komórek jest rozerwanie tkanek i ich liza. Jak wspomniano wcześniej, celem jest zdezagregacja komórek i rozbicie ich przy minimalnych uszkodzeniach. Próbki tkanki jelitowej muszą być homogenizowane, a komórki poddawane lizie, aby osiągnąć maksymalne pęknięcie błony komórkowej. W tym protokole używamy zmotoryzowanego miksera tłuczkowego do rozbijania tkanki jelitowej, która jest homogenizowana w ciągu kilku sekund za pomocą szybkiego wirowania. Po homogenizacji komórki tkankowe inkubuje się w hipotonicznym buforze, który rozerwie błonę komórkową, ale utrzyma jądra w stanie nienaruszonym, a następnie dodaje się niedenaturujący detergent (nonyl fenoksyetoksyetanol) i krótki wir w celu oddzielenia jąder od frakcji cytoplazmatycznej. Po usunięciu cytoplazmy błona jąder komórkowych jest rozrywana do buforu hipertonicznego z potrząsaniem.
Przedstawiona tutaj metoda jest odpowiednią metodą do subkomórkowego frakcjonowania świeżych i mrożonych biopsji jelitowych, które zostały uzyskane podczas zabiegów endoskopowych i mieszczą się w zakresie od 2 do 10 mg wagi. Protokół jest łatwy i powtarzalny i można go wykonać przy użyciu podstawowego sprzętu laboratoryjnego i odczynników w mniej niż godzinę.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034-1kg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333-1kg</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5588886-1kg</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitory proteinaz i fosfataz</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32959</td><td></td></tr><tr><td>NP-40&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CA-630</td><td>Test detergentowy</td></tr><tr><td>BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td>Zestaw do oznaczania ilościowego białek</td></tr><tr><td>Jednorazowe tłuczki plastikowe</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359947-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator dounce</td><td>VWR</td><td>431-0100</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5415-R</td><td></td></tr><tr><td>Shacker</td><td>IKA</td><td>MS3 basic</td><td></td></tr></tbody></table>

frakcjonowanie subkomórkowe ze świeżych i mrożonych próbek przewodu pokarmowego

Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens

Celem tego protokołu jest frakcjonowanie ludzkiej tkanki jelitowej uzyskanej za pomocą endoskopii na przedziały jądrowe i cytoplazmatyczne w celu analizy lokalizacji określonych białek lub kompleksów białkowych w różnych stanach tkankowych (np. zdrowe vs. chore). Metoda ta jest przydatna do frakcjonowania zarówno świeżych, jak i mrożonych próbek tkanek jelitowych; Jest łatwo dostępny dla wszystkich laboratoriów i nie zajmuje dużo czasu.

Rysunek 1 przedstawia barwienie hematoksyliną i eozyną przekroju biopsji jelita z zachowanymi strukturami kosmków i krypt.
Reprezentatywne wyniki frakcjonowania jądrowego i cytoplazmatycznego z zastosowaniem niniejszego protokołu przedstawiono na rycinach 2 i 3. W eksperymencie przedstawionym na rycinie 2, świeżą (Fh) i zamrożoną (Fz) b...

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia prostego frakcjonowania komórkowego w celu subkomórkowej separacji białek cytoplazmatycznych i jądrowych w ludzkich biopsjach jelit świeżych i mrożonych.

Frakcjonowanie subkomórkowe ze świeżych i mrożonych próbek przewodu pokarmowego

The purpose of this protocol is to fractionate human intestinal tissue obtained by endoscopy into nuclear and cytoplasmic compartments for the ...

Celem poniższego protokołu jest wygenerowanie frakcji subkomórkowych z zamrożonych lub świeżych próbek przewodu pokarmowego. Białka biorą udział w prawie wszystkich funkcjach biologicznych w komórce. W każdym wariancie, w którym są one ekstrahowane w danej lokalizacji, może to prowadzić do scenariusza patogennego.Niektóre badania będą wykorzystywać ocenę lokalizacji białka lub będą musiały zaatakować białko z określonego przedziału komórkowego. Tak więc powtarzalne frakcjonowanie nienaruszonych białek jest ważne w tym względzie. Próbki z biopsji jelita grubego są ostatnio uzyskiwane podczas zabiegów endoskopowych i mogą być skutecznie wykorzystywane do oznaczania ilościowego białek lub badań immunoprecypitacji.Kliniczne próbki jelitowe są ważnym źródłem skutecznej identyfikacji białek specyficznych dla tkanek i choroby. Nazwa tej metody polega na frakcjonowaniu ludzkiej tkanki jelitowej uzyskanej za pomocą endoskopii na przedziały jądrowe i cytoplazmatyczne w celu analizy lokalizacji określonego białka lub kompleksów białkowych. Ta metoda służy do frakcjonowania obu.Po pierwsze, zachodzi bioza naszych zamrożonych jelit. W przypadku procedury zamrażania tkanek próbki należy zamrozić natychmiast po ekstrakcji i przechowywać w ciekłym azocie do czasu użycia. Ważne jest, aby próbka była przechowywana w stanie zamrożonym do momentu dodania zimnego buforu homogenizacyjnego.W przypadku świeżych próbek należy przenieść biopsję do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml i trzymać na lodzie do momentu rozpoczęcia procedury. Zamrożone próbki tkanek są zwykle mocowane do ścianki krioprobówki, tkankę można uwolnić za pomocą sterylnej końcówki pipety przed przeniesieniem do stożkowej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 200 ml pierwszego buforu uzupełnionego DDT oraz inhibitorami fosfatazy i proteazy do mikroprobówki zawierającej próbkę.Homogenizować próbkę w naczyniu, aż tkanka zostanie całkowicie rozerwana i utrzymywać ją na lodzie. Inkubować próbkę na lodzie przez 10 minut. Dodaj 10 ml 1-procentowego detergentu do każdej próbki do końcowego stężenia 0,05 procent, aby przerwać błonę komórkową.Inkubować na lodzie przez pięć minut. Krótko zwirować i odwirować przy 400 g w 4 stopniach przez dwie minuty. Usunąć supernatant zawierający cytoplazmatyczną frakcję białkową i przenieść go do czystej probówki.Nie wyrzucaj granulek. Ponownie zawiesić osad w 200 ml buforu drugiego uzupełnionego DDT oraz inhibitorami fosfatazy i proteazy. Wirować przy 400 g przez 2 minuty.Wyrzucić sklarowany osad i powtórzyć procedurę mycia jeszcze dwa razy. Po trzecim przemyciu ponownie zawiesić osad w 100 ml buforu drugiego. Wstrząsaj energicznie w 4 stopniach przez 30 minut.Wirować pod kątem 4 stopni na najwyższych obrotach przez 10 minut. Przenieść supernatant zawierający frakcję białka jądrowego do czystej probówki. Frakcje cytoplazmatyczne i jądrowe są teraz gotowe do kwantyfikacji i dalszych eksperymentów.Błona śluzowa jelit jest bogata w kilka proteaz i dlatego degradacja białka musi być kontrolowana podczas ekstrakcji, aby zminimalizować degradację białka, w do ekstrakcji białek należy włączyć wiele inhibitorów proteazy. Dodatkowo ekstrakty mają być używane do dodatkowych testów. Istotne jest, aby uniknąć denaturacji białek lub proteolizy.Ponieważ powoduje to utratę aktywności białka. W wyniku kontaktów komórka-komórka i komórka-macierz, które są obecne w tkankach, pewne modyfikacje muszą zostać wdrożone do protokołów ekstrakcji białek rutynowo stosowanych w hodowlach komórkowych. Oddzielenie komórek od macierzy transkomórkowej bez wpływu na jakość białka jest kluczowym czynnikiem dla skutecznej izolacji białek tkanki jelitowej.Po lewej stronie znajduje się tabela przedstawiająca stężenia białka w każdej z frakcji ze świeżych i mrożonych próbek biopsyjnych o pojemności 2 ml. Stężenia podane są w mikrogramach na mikrolitr. W tym eksperymencie świeża i mrożona próbka były jednocześnie frakcjonowane zgodnie z protokołem.Przeprowadzono Western blot przy użyciu 20 mg każdej próbki. Aby sprawdzić czystość frakcji, HSP90 i tubulinę użyto jako kontroli cytoplazmatycznej, a HDAC1 i H3 jako kontroli jądrowej. Jak można zaobserwować, HSP90 i tubulina znajdują się przede wszystkim w cytoplazmie, a HDAC1 i H3 w jądrze z bardzo szczątkowym mieszaniem między tymi dwiema frakcjami.Aby sprawdzić, czy protokół wpływa na śmierć komórki, wykryliśmy również CASP3. Obie próbki wykazują bardzo minimalne zabarwienie na obecność CASP3, co potwierdza, że procedura nie wpływa na szlak śmierci komórki nawet po błyskawicznym zamrożeniu biopsji. Zamrożone próbki użyte w tym eksperymencie pochodziły od osoby z zapaleniem jelit i zgodnie z oczekiwaniami pSTAT1 pojawia się w cytoplazmie tej próbki, potwierdzając, że modyfikacje białka są utrzymywane po frakcjonowaniu, a zatem mogą być wykorzystane do dalszej analizy funkcjonalnej.Powtarzalność wyników w biopsjach mrożonych przedstawiono na tym rysunku. Frakcje są czyste przy minimalnym mieszaniu białek w kompartmencie. Biopsje świeże i mrożone mogą być w równym stopniu stosowane w tych protokołach, przy czym biopsje mrożone dają czyste i powtarzalne wyniki, jak pokazano na rycinach 1 i 2.Opisany tutaj protokół ma na celu wygenerowanie możliwych frakcji białkowych. Jednak pewna wewnętrzna zmienność w próbce, w tym rozmiar i stan tkanki, może prowadzić do odchyleń w ilościach białka i ilościach dystrybucji we frakcjach.

subcellular-fractionation-from-fresh-frozen-gastrointestinal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

In situ frakcjonowanie subkomórkowe komórek ssaków na szkiełkach podstawowych do mikroskopu umożliwia wizualizację lokalizacji białek.

In situ frakcjonowanie subkomórkowe adherentnych i nieadherentnych komórek ssaków

Ten film opisuje protokół izolacji pojedynczych jąder ze świeżo zamrożonej tkanki glejaka. Wyizolowane pojedyncze jądra mogą być wykorzystane jako próbki do technik sekwencjonowania, takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczego jądra (snRNA) i test pojedynczych jąder do sekwencjonowania chromatyny dostępnej dla transpozazy (snATAC) w celu uzyskania głębszego wglądu w niejednorodność między- i wewnątrznowotworową obserwowaną w glejaku ośrodkowych tkanek nerwowych.

Izolacja jąder ze świeżo mrożonych tkanek glejaka: metoda uzyskiwania nienaruszonych jąder z próbek guza glejaka

Tutaj opisujemy prostą metodę izolacji przestrzennie odrębnych komórek powierzchni nabłonka mysiego okrężnicy od leżących poniżej komórek o kryptobazie.

Metoda kriosekcji do mikrodysekcji mysiej błony śluzowej okrężnicy

Tutaj przedstawiono protokół izolacji i tworzenia pierwotnych kultur fibroblastów/miofibroblastów (MF) z zamrożonych komórek tkanki żołądka, jelita cienkiego i okrężnicy o fenotypie MF. Komórki te wyrażają CD90, α-SMA i wimentynę. MF mogą być używane do różnych testów funkcjonalnych, w tym aktywności enzymatycznej i produkcji cytokin.

Izolacja fibroblastów/miofibroblastów CD 90+ z ludzkich mrożonych próbek przewodu pokarmowego

Celem tego protokołu jest uzyskanie próbek RNA o wysokiej integralności z zwojów jelitowych wyizolowanych z nieutrwalonej, świeżo wyciętej tkanki jelita ludzkiego za pomocą mikrodysekcji laserowej (LCM). Protokół ten obejmuje przygotowanie błyskawicznie zamrożonych próbek ludzkiej tkanki jelitowej, kriosekcję, barwienie i odwodnienie etanolowe, LCM i ekstrakcję RNA.

Optymalizacja mikrodysekcji laserowej w celu izolacji zwojów jelitowych ze świeżo zamrożonej tkanki ludzkiej

Tutaj prezentujemy protokół izolacji błony plazmatycznej, cytoplazmy i mitochondriów komórek U937 bez użycia szybkiego wirowania. Technika ta może być stosowana do oczyszczania frakcji subkomórkowych w celu późniejszego zbadania lokalizacji białka za pomocą immunoblottingu.

Frakcjonowanie komórek U937 przy braku wirowania z dużą prędkością

Ten protokół opisuje kilka procedur przygotowania wysokiej jakości zamrożonych próbek tkanek podczas sekcji zwłok do użycia w teście kometarnym do oceny uszkodzeń DNA: 1) zmielona tkanka, 2) zeskrobane komórki nabłonkowe z przewodu pokarmowego, oraz 3) sześcienne próbki tkanek, wymagające homogenizacji za pomocą urządzenia do mielenia tkanek.

Wykorzystanie zamrożonej tkanki w teście komety do oceny uszkodzeń DNA

Niejednorodność wewnątrznowotworowa jest nieodłączną cechą nowotworów, w tym glejaków. Opracowaliśmy prosty i wydajny protokół, który wykorzystuje kombinację i wirowania gradientowego do izolowania pojedynczych jąder ze świeżo mrożonych tkanek glejaka do badań sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i ATAC.

Izolacja jąder ze świeżo zamrożonych guzów mózgu dla sekwencji RNA pojedynczego jądra i sekwencji ATAC

Ten protokół frakcjonowania pozwoli badaczom wyizolować białka cytoplazmatyczne, jądrowe, mitochondrialne i błonowe z komórek ssaków. Dwie ostatnie frakcje subkomórkowe są dalej oczyszczane za pomocą gradientu gęstości izopikenowej.

Frakcjonowanie komórek U937 przez izopiknowe oczyszczanie w gradimencie gęstości

Protokół zapewnia niezawodne i zoptymalizowane podejście do izolacji jąder z próbek guzów litych do sekwencjonowania wieloomowego przy użyciu platformy 10x Genomics, w tym zalecenia dotyczące warunków dysocjacji tkanek, kriokonserwacji zawiesin pojedynczych komórek i oceny izolowanych jąder.

Zoptymalizowana izolacja jąder ze świeżych i mrożonych próbek guzów litych do sekwencjonowania wieloomowego

Opisujemy mysi model pooperacyjnej niedrożności jelit generowany przez manipulację jelitową. Funkcję pasażu pokarmowego, zmiany patologiczne i aktywację komórek odpornościowych oceniano 24 godziny po zabiegu.

Pooperacyjny model mysiej niedrożności jelit

Poznaj metodę frakcjonowania subkomórkowego białek z bioptatów jelitowych, stosowaną do próbek świeżych i mrożonych. Technika umożliwia analizę lokalizacji białek cytoplazmatycznych i jądrowych w badaniach gastroenterologicznych.

Frakcjonowanie subkomórkowe ze świeżych i mrożonych próbek przewodu pokarmowego

Przeglądaj więcej filmów