Edycja genu CRISPR/Cas9 w celu stworzenia warunkowych mutantów ludzkiego pasożyta malarii P. falciparum

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii ludzkiego pasożyta malarii, P.Falciparum, pomagając odkryć funkcję białka poprzez warunkowe wyłączenie. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na stosunkowo łatwe generowanie mutantów warunkowych w porównaniu z poprzednimi metodami. Aby rozpocząć, przejdź do Chop Chop i wybierz Fasta Target'Under Target, wklej 200 par zasad z trzech głównych końców otwartej ramki odczytu genu i 200 par zasad od początku trzech pierwszych UTR genu.

W obszarze'wybierz P.Falciparum'i wybierz CRISPR/Cas9'w obszarze Używanie'Następnie kliknij Znajdź miejsca docelowe'Wybierz sekwencję gRNA z przedstawionych opcji, preferując najbardziej wydajną gRNA, która znajduje się najbliżej miejsca modyfikacji i ma najmniej miejsc poza celem. Kup sekwencję gRNA i jej odwrotny dopełniacz w postaci oczyszczonych oligonukleotydów w żelu poliakrylamidowym. Sekwencję gRNA używaną do celowania w PfH-sp70x można znaleźć w protokole tekstowym.

Dodaj po 40 mikrogramów pMK-U6, pUF1-Cas9 i pHA-glmS DNA do sterylnej probówki wirówkowej o średnicy 1,5 milimetra. Dodaj jedną dziesiątą objętości DNA trzymolowego octanu sodu w wodzie do probówki i dobrze wymieszaj za pomocą wiru. Następnie dodaj do probówki 2,5-krotność objętości 100-procentowego etanolu i dobrze wymieszaj za pomocą wiru przez co najmniej 30 sekund.

Umieść probówkę na lodzie lub w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na 30 minut. Następnie odwirować probówkę w temperaturze 18, 300 razy G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant z probówki, nie naruszając osadu.

Dodaj do probówki trzykrotność objętości 70 procent etanolu i krótko wymieszaj za pomocą wiru. Odwirować probówkę o temperaturze 18, 300 razy G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie ostrożnie usunąć supernatant z probówki, nie naruszając osadu.

Pozostaw probówkę otwartą i pozostaw granulkę do wyschnięcia na powietrzu przez 15 minut. Przechowuj wytrącone DNA w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż będzie potrzebne do transfekcji. Aby transfekować erytrocyty, należy przygotować bufor cytomiksowy 1X oraz niekompletne i kompletne RPMI zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Filtr wysterylizuj bufor za pomocą filtra 0,22 mikrona. Dodaj 380 mikrolitrów cytomiksu 1X do DNA i wiruj, aby się rozpuścił. Pozwól DNA rozpuścić się w cytomiksie 1X przez 10 minut, wirując co trzy minuty przez 10 sekund.

W sterylnej, stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów połącz 300 mikrolitrów izolowanych ludzkich erytrocytów w niekompletnym RPMI z czterema mililitrami cytomiksu 1X. Odwirować erytrocyty w temperaturze 870 razy G przez trzy minuty. Następnie usunąć supernatant z osadu RBC.

Ponownie zawiesić osad RBC za pomocą mieszaniny DNA-cytomiks i przenieść go do 0,2-centymetrowej kuwety do elektroporacji. Określ erytrocyty, korzystając z warunków wymienionych w protokole tekstowym. Po elektroporacji przenieś zawartość z kuwety do 15-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej pięć mililitrów pełnego RPMI.

Odwirować probówkę o temperaturze 870 razy G przez trzy minuty w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnie zdekantować supernatant. Teraz ponownie zawiesić osad w czterech mililitrach całkowitego RPMI i przenieść do jednej studzienki na sześciodołkowej płytce do hodowli tkankowej.

Dodaj 400 mikrolitrów kultury schizontu o wysokiej zawartości schizontu do przeniesionych krwinek czerwonych. Utrzymuj wszystkie kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza poniżej trzech procent tlenu, trzech procent CO2 i 94 procent azotu. Następnego dnia umyj kulturę czterema mililitrami pełnego RPMI.

Odwirować kulturę w temperaturze 870 razy G przez trzy minuty. Odessać supernatant. Ponownie zawieś kulturę w czterech mililitrach całkowitego RPMI.

48 godzin później umyj kulturę czterema mililitrami całkowitego RPMI. Następnie ponownie zawiesić hodowlę w pełnym RPMI zawierającym jeden mikromolowy DSM1, aby wybrać plazmid Cas9. Po tym czasie należy zastąpić pożywkę hodowlaną świeżym, kompletnym RPMI oraz jednym mikromolowym DSM1 co 48 godzin.

Kontynuuj mycie kultur każdego dnia za pomocą pełnego RPMI, aż pasożyty przestaną być widoczne w rozmazie krwi. Aby zrobić rozmaz krwi, odpipetuj 150 mikrolitrów kultury do 0,6 mililitra probówki wirówkowej. Po zagnieżdżeniu komórek przez odwirowanie w temperaturze 1 700 razy G przez 30 sekund, odessać sklarowany sklarowany sklarowany stan.

Za pomocą pipety przenieś granulowane komórki na szkiełko podstawowe. Za pomocą drugiego szkiełka podstawionego pod kątem 45 stopni do pierwszego szkiełka rozsmaruj kroplę krwi. Zabejcuj szkiełko za pomocą dostępnego w handlu zestawu do barwienia zgodnie z protokołem producenta.

Zobacz pasożyty za pomocą 100-krotnego obiektywu zanurzonego w olejku. Rozpoczynając pięć dni po transfekcji, usuń dwa mililitry kultury z krwinkami czerwonymi ponownie zawieszonymi w pożywce hodowlanej. Dodaj z powrotem dwa mililitry świeżej pożywki i krew o dwuprocentowym hematokrycie.

Dodawaj świeżą krew w ten sposób raz w tygodniu, aż do ponownego pojawienia się pasożyta, zgodnie z rzadkim rozmazem krwi. Wykonaj seryjne rozcieńczenia kultury pasożyta, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,5 pasożyta na 200 mikrolitrów. Dodać 200 mikrolitrów rozcieńczonej kultury do dołków 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.

Utrzymuj płytkę klonującą, aż pasożyty będą wykrywalne w studzienkach. Co 48 godzin należy wymieniać pożywkę w płytce 96-dołkowej na świeżą pożywkę. Raz w tygodniu, zaczynając pięć dni po rozpoczęciu płytki klonującej, usuń 100 mikrolitrów z każdej studzienki i dodaj z powrotem 100 mikrolitrów świeżej pożywki plus krew.

Aby zidentyfikować wszelkie studzienki zawierające pasożyty, umieść 96-dołkową płytkę pod kątem 45 stopni na około 20 minut, pozwalając krwi osiąść pod kątem w płytce. Następnie umieść 96-dołkową płytkę na kasecie świetlnym. Zauważ, że studzienki zawierające pasożyty zawierają pożywkę o żółtym kolorze, w porównaniu z różową pożywką studni wolnych od pasożytów, ze względu na zakwaszenie pożywki przez pasożyty.

Za pomocą pipety serologicznej przenieś zawartość studzienek zawierających pasożyty na 24-dołkową płytkę do hodowli tkankowej, aby umożliwić ekspansję parazytemii. Korzystając z analizy PCR, sprawdź te klonalne linie pasożytów pod kątem prawidłowej integracji. Wyniki testu immunofluorescencyjnego przedstawiono tutaj, wykazując pomyślne znakowanie HA PfH-sp70x.

Pasożyty PfH-sp70x glmS utrwalono i wybarwiono DAPI jako markerem jądra, a także przeciwciałami przeciwko HA. Białko bogate w histydynę związane z błoną, marker eksportu białka do krwinek czerwonych gospodarza. Przedstawiono tutaj analizę Western Blot poziomu białka PfH-sp70x po leczeniu glukozaminą. Zgodnie z oczekiwaniami poziom białka zmniejsza się w czasie trwania leczenia.

Technika ta toruje drogę naukowcom w dziedzinie parazytologii do zbadania fundamentalnych pytań z zakresu biologii pasożyta malarii. Należy pamiętać, że P.Falciparum jest patogenem przenoszonym przez krew i podczas wykonywania tego zabiegu należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.