Name: Edycja genu CRISPR/Cas9 w celu stworzenia warunkowych mutantów ludzkiego pasożyta malarii P. falciparum (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Poznaj metodę edycji genomu CRISPR/Cas9 do tworzenia warunkowych mutantów w pasożycie malarii Plasmodium falciparum. Technika ta umożliwia badanie funkcji białek i odkrywanie nowych celów terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Muthugapatti Kandasamy z University of Georgia (UGA) Biomedical Microscopy Core za pomoc techniczną oraz Jose-Juan Lopez-Rubio za udostępnienie plazmidów pUF1-Cas9 i pL6. Praca ta została wsparta nagrodami Fundacji ARCS dla D.W.C. i H.M.K., funduszami startowymi UGA dla V.M., grantami Fundacji March of Dimes (Basil O'Connor Starter Scholar Research Award) dla V.M. oraz grantami US National Institutes of Health (R00AI099156 i R01AI130139) dla V.M. i (T32AI060546) dla HMK.

<ol><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22World+Malaria+Report%22">World Malaria Report</a>. , World Health Organization. Geneva. (2017).</li>
<li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenic+basis+of+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).</li>
<li>Florentin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PfClpC+Is+an+Essential+Clp+Chaperone+Required+for+Plastid+Integrity+and+Clp+Protease+Stability+in+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">PfClpC Is an Essential Clp Chaperone Required for Plastid Integrity and Clp Protease Stability in Plasmodium falciparum.</a> Cell Reports. 21 (7), 1746-1756 (2017).</li>
<li>Muralidharan, V., Oksman, A., Pal, P., Lindquist, S., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+heat+shock+protein+110+stabilizes+the+asparagine+repeat-rich+parasite+proteome+during+malarial+fevers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum heat shock protein 110 stabilizes the asparagine repeat-rich parasite proteome during malarial fevers.</a> Nature Communications. 3, 1310(2012).</li>
<li>Muralidharan, V., Oksman, A., Iwamoto, M., Wandless, T. J., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asparagine+repeat+function+in+a+Plasmodium+falciparum+protein+assessed+via+a+regulatable+fluorescent+affinity+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+the+USA%22%5BJournal%5D)">Asparagine repeat function in a Plasmodium falciparum protein assessed via a regulatable fluorescent affinity tag.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences the USA. 108 (11), 4411-4416 (2011).</li>
<li>Beck, J. R., Muralidharan, V., Oksman, A., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEX+component+HSP101+mediates+export+of+diverse+malaria+effectors+into+host+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PTEX component HSP101 mediates export of diverse malaria effectors into host erythrocytes.</a> Nature. 511 (7511), 592-595 (2014).</li>
<li>Ghorbal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 819-821 (2014).</li>
<li>Wagner, J. C., Platt, R. J., Goldfless, S. J., Zhang, F., Niles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing+in+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum.</a> Nature Methods. 11 (9), 915-918 (2014).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096(2014).</li>
<li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+Genome+Editing+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li>
<li>Kirkman, L. A., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+variation+and+the+generation+of+diversity+in+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Antigenic variation and the generation of diversity in malaria parasites.</a> Current Opinion in Microbiology. 15 (4), 456-462 (2012).</li>
<li>Lee, A. H., Symington, L. S., Fidock, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Repair+Mechanisms+and+Their+Biological+Roles+in+the+Malaria+Parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">DNA Repair Mechanisms and Their Biological Roles in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 469-486 (2014).</li>
<li>Cobb, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Exported+Chaperone+PfHsp70x+Is+Dispensable+for+the+Plasmodium+falciparum+Intraerythrocytic+Life+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">The Exported Chaperone PfHsp70x Is Dispensable for the Plasmodium falciparum Intraerythrocytic Life Cycle.</a> mSphere. 2 (5), (2017).</li>
<li>Prommana, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+knockdown+of+Plasmodium+gene+expression+using+the+glmS+ribozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+One%22%5BJournal%5D)">Inducible knockdown of Plasmodium gene expression using the glmS ribozyme.</a> Public Library of Science One. 8 (8), e73783(2013).</li>
<li>Ganesan, S. M., Falla, A., Goldfless, S. J., Nasamu, A. S., Niles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+RNA-protein+modules+integrated+with+native+translation+mechanisms+to+control+gene+expression+in+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Synthetic RNA-protein modules integrated with native translation mechanisms to control gene expression in malaria parasites.</a> Nature Communications. 7, 10727(2016).</li>
<li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+homologous+recombination+in+vitro+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li>
<li>Drew, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+food+vacuole+plasmepsins+are+activated+by+falcipains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Plasmodium food vacuole plasmepsins are activated by falcipains.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (19), 12870-12876 (2008).</li>
<li>Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. -H., Su, X. -Z., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+Plasmodium+falciparum+within+human+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92, 973-977 (1995).</li>
<li>Janse, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transfection+of+Plasmodium+berghei+facilitates+novel+selection+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">High efficiency transfection of Plasmodium berghei facilitates novel selection procedures.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 145 (1), 60-70 (2006).</li>
<li>Counihan, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+parasites+deploy+RhopH2+into+the+host+erythrocyte+to+obtain+nutrients%2C+grow+and+replicate%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum parasites deploy RhopH2 into the host erythrocyte to obtain nutrients, grow and replicate.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Klemba, M., Beatty, W., Gluzman, I., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+plasmepsin+II+to+the+food+vacuole+of+the+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Trafficking of plasmepsin II to the food vacuole of the malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Journal of Cell Biology. 164 (1), 47-56 (2004).</li>
<li>Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP+v2%3A+a+web+tool+for+the+next+generation+of+CRISPR+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Resesarch%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering.</a> Nucleic Acids Resesarch. 44 (W1), W272-W276 (2016).</li>
<li>Peng, D., Tarleton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EuPaGDT%3A+a+web+tool+tailored+to+design+CRISPR+guide+RNAs+for+eukaryotic+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Genomes%22%5BJournal%5D)">EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens.</a> Microbial Genomes. 1 (4), e000033(2015).</li>
<li>Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Gene+Disruption+in+Diverse+Strains+of+Toxoplasma+gondii+Using+CRISPR%2FCAS9%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9.</a> mBio. 5 (3), (2014).</li>
<li>Janssen, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+gene+modification+and+gene+knock+out+in+the+human-infective+parasite+Trichomonas+vaginalis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated gene modification and gene knock out in the human-infective parasite Trichomonas vaginalis.</a> Scientific Reports. 8 (1), 270(2018).</li>
<li>Spillman, N. J., Beck, J. R., Ganesan, S. M., Niles, J. C., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chaperonin+TRiC+forms+an+oligomeric+complex+in+the+malaria+parasite+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The chaperonin TRiC forms an oligomeric complex in the malaria parasite cytosol.</a> Cellular Microbiology. 19 (6), (2017).</li>
<li>Brancucci, N. M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidylcholine+Regulates+Sexual+Stage+Differentiation+in+the+Human+Malaria+Parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidylcholine Regulates Sexual Stage Differentiation in the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum.</a> Cell. , (2017).</li>
<li>Ng, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-modified+pfmdr1+protects+Plasmodium+falciparum+asexual+blood+stages+and+gametocytes+against+a+class+of+piperazine-containing+compounds+but+potentiates+artemisinin-based+combination+therapy+partner+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-modified pfmdr1 protects Plasmodium falciparum asexual blood stages and gametocytes against a class of piperazine-containing compounds but potentiates artemisinin-based combination therapy partner drugs.</a> Molecular Microbiology. 101 (3), 381-393 (2016).</li>
<li>Lim, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UDP-galactose+and+acetyl-CoA+transporters+as+Plasmodium+multidrug+resistance+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">UDP-galactose and acetyl-CoA transporters as Plasmodium multidrug resistance genes.</a> Nature Microbiology. , (2016).</li>
<li>Adjalley, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+Plasmodium+falciparum+sexual+development+reveals+potent+transmission+blocking+activity+by+methylene+blue%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of Plasmodium falciparum sexual development reveals potent transmission blocking activity by methylene blue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (47), E1214-E1223 (2011).</li>
<li>Sidik, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genome-wide+CRISPR+Screen+in+Toxoplasma+Identifies+Essential+Apicomplexan+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes.</a> Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).</li>
<li>Amberg-Johnson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+inhibition+of+apicomplexan+FtsH1+disrupts+plastid+biogenesis+in+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">Small molecule inhibition of apicomplexan FtsH1 disrupts plastid biogenesis in human pathogens.</a> elife. 6, (2017).</li>
<li>Crawford, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid-free+CRISPR%2FCas9+genome+editing+in+Plasmodium+falciparum+confirms+mutations+conferring+resistance+to+the+dihydroisoquinolone+clinical+candidate+SJ733%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+One%22%5BJournal%5D)">Plasmid-free CRISPR/Cas9 genome editing in Plasmodium falciparum confirms mutations conferring resistance to the dihydroisoquinolone clinical candidate SJ733.</a> Public Library of Science One. 12 (5), e0178163(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wdrożenie CRISPR/Cas9 u P. falciparum zarówno zwiększyło skuteczność, jak i skróciło czas potrzebny na modyfikację genomu pasożyta w porównaniu z wcześniejszymi metodami manipulacji genetycznej. Ten obszerny protokół przedstawia kroki niezbędne do generowania warunkowych mutantów przy użyciu CRISPR/Cas9 u P. falciparum. Chociaż metoda ta jest ukierunkowana specjalnie na generowanie mutantów HA-glmS , strategia ta może być dostosowana do różnych potrzeb, w tym znakowania genów, nokautowania genó...

Malaria jest wyniszczającą chorobą wywoływaną przez pasożytnicze pierwotniaki z rodzaju Plasmodium. P. falciparum, najbardziej śmiercionośny pasożyt malarii u ludzi, powoduje około 445 000 zgonów rocznie, głównie u dzieci poniżej piątego roku życia1. Pasożyty Plasmodium mają skomplikowany cykl życiowy obejmujący wektora komara i żywiciela kręgowców. Ludzie po raz pierwszy zarażają się, gdy zakażony komar spożywa posiłek z krwi. Następnie pasożyt atakuje wątrobę, gdzie rośnie, rozwija się i dzieli przez około tydzień. Po tym procesie pasożyty są uwalniane do krwiobiegu, gdzie przechodzą replikację bezpłciową w czerwonych krwinkach (RBC). Wzrost pasożytów w erytrocytach jest bezpośrednio odpowiedzialny za objawy kliniczne związane z malarią2.
Do niedawna produkcja transgenicznego P. falciparum była pracochłonnym procesem, obejmującym kilka rund selekcji leków, które trwały wiele miesięcy i miały wysoki wskaźnik niepowodzeń. Ta czasochłonna procedura opiera się na generowaniu losowych pęknięć DNA w obszarze zainteresowania i endogennej zdolności pasożyta do naprawy swojego genomu poprzez naprawę homologiczną3,4,5,6. Ostatnio edycja genomu Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeat/Cas9 (CRISPR/Cas9) została z powodzeniem wykorzystana w P. falciparum7,8. Wprowadzenie tej nowej technologii do badań nad malarią miało kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia biologii tych śmiertelnych pasożytów Plasmodium. CRISPR/Cas9 pozwala na specyficzne celowanie w geny za pomocą przewodnikowych RNA (gRNA), które są homologiczne do genu będącego przedmiotem zainteresowania. Kompleks gRNA/Cas9 rozpoznaje gen poprzez gRNA, a Cas9 następnie wprowadza pęknięcie dwuniciowe, wymuszając inicjację mechanizmów naprawczych w organizmie9,10. Ponieważ P. falciparum nie ma mechanizmów do naprawy pęknięć DNA poprzez niehomologiczne łączenie końców, wykorzystuje mechanizmy rekombinacji homologicznej i integruje transfekowane homologiczne matryce DNA w celu naprawy indukowanego przez Cas9 / gRNA dwuniciowego złamania11,12.
Tutaj prezentujemy protokół generowania mutantów warunkowego knockdown u P. falciparum za pomocą edycji genomu CRISPR/Cas9. Protokół demonstruje użycie rybozymu glmS do warunkowego obniżenia poziomu białka PfHsp70x (PF3D7_0831700), białka opiekuńczego eksportowanego przez P. falciparum do RBCs gospodarza13,14. Rybozym glmS jest aktywowany przez traktowanie glukozaminą (która w komórkach jest przekształcana w glukozamino-6-fosforan) w celu rozszczepienia powiązanego mRNA, co prowadzi do zmniejszenia białka14. Protokół ten można łatwo dostosować do wykorzystania innych narzędzi do warunkowego knockdownu, takich jak domeny destabilizacyjne lub aptamery RNA4,5,15. Nasz protokół szczegółowo opisuje generowanie plazmidu naprawczego składającego się ze znacznika hemaglutyniny (HA) i sekwencji kodującej rybozym glmS otoczonej sekwencjami, które są homologiczne do otwartej ramki odczytu PfHsp70x (ORF) i 3'-UTR. Opisujemy również wytwarzanie drugiego plazmidu w celu sterowania ekspresją gRNA. Te dwa plazmidy, wraz z trzecim, który napędza ekspresję Cas9, są transfekowane do erytrocytów i wykorzystywane do modyfikacji genomu pasożytów P. falciparum. Na koniec opisujemy technikę opartą na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w celu sprawdzenia integracji znacznika i rybozymu glmS. Protokół ten jest wysoce elastyczny w przypadku modyfikacji lub całkowitego wyeliminowania jakichkolwiek genów P. falciparum, zwiększając naszą zdolność do generowania nowych informacji na temat biologii pasożyta malarii.

<table><tbody><tr><td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2086</td><td>Kupujemy te, które są pakowane pojedynczo</td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889-250g</td><td></td></tr><tr><td>DSM1</td><td>Prezent od laboratorium Akhil Vaidya</td><td>Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34</td><td></td></tr><tr><td>Kultura tkankowa TPP Płytki 6-dołkowe</td><td>MIDSCI</td><td>TP92006</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli tkankowych TPP 100 mm (płytka 12 ml)</td><td>MIDSCI</td><td>TP93100</td><td></td></tr><tr><td>Kultura tkankowa TPP 96-dołkowe płytki</td><td>MIDSCI</td><td>TP92096</td><td></td></tr><tr><td>Kultura tkankowa TPP 24-dołkowe płytki</td><td>MIDSCI</td><td>TP92024</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>#B7002S</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2.1</td><td>New England Biolabs</td><td>#B7202S</td><td></td></tr><tr><td>BtgZI</td><td>New England Biolabs</td><td>#R0703L</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>#R0157L</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>#R3104S</td><td></td></tr><tr><td>Afe1</td><td>New England Biolabs</td><td>#R0652S</td><td></td></tr><tr><td>Nhe1-HF</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td>#R3131L</tr><tr><td>Polimeraza DNA T4</td><td>New England Biolabs</td><td>#M0203S</td><td></td></tr><tr><td>500 ml Filtr do butelek Steritop</td><td>Millipore</td><td>SCGPU10RE</td><td>Możesz użyć dowolnego rozmiaru, który odpowiada Twoim potrzebom</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378-100G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500g</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100g</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher</td><td>P288-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-500g</td><td></td></tr><tr><td>pMK-U6</td><td>Generowane przez Muralidharan Lab</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pHA-glmS</td><td>Generowane przez Muralidharan Lab</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pUF1-Cas9</td><td>Prezent od laboratorium Jose-Juan Lopez-Rubio</td><td>Ghorbal et al. Nature Biotech 2014</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280-100G</td><td></td></tr><tr><td>Hipoksantyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9636-25g</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik gentamycyny</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Tymidyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895-1G</td><td></td></tr><tr><td>PL6-eGFP BSD</td><td>Generowany przez Muralidharan Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puf1-cas9 eGFP gRNA</td><td>generowany przez Muralidharan Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel i PCR Clean-up</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.250</td><td></td></tr><tr><td>Albumax I</td><td>Life Technologies</td><td>N/A</td><td>Będziesz chciał wypróbować kilka partii, aby dowiedzieć się, jakie pasożyty będą rosły w najlepszych</td></tr><tr><td>ludzkich krwinkach czerwonych Międzystanowy</td><td>Bank Krwi, Inc</td><td>Wyślij e-mail lub zadzwoń bezpośrednio w celu złożenia zamówienia</td> Zazwyczaj używamy linii pasożytów <td>O+ we krwi</td></tr><tr><td>3D7</td><td>Dostępne na życzenie</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>bulionu lizogenicznego (LB)</td><td>Fisher</td><td>BP1426-2</td><td>Możesz zrobić własny, nie jest konieczne używanie dokładnie tego</td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Fisher</td><td>BP1760-25</td><td>Robimy zapas 1000X w 100mg/ml w wodzie i przechowujemy w -20C</td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Clonetech</td><td>R050A</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EF1alpha</td> Dr<td>. Daniel Goldberg's Lab Washington</td><td>University w St. Louis</td><td>Możesz użyć preferowanej kontroli ładowania dla zachodnich plam. To jest właśnie ten, którego używamy w naszym laboratorium</td></tr><tr><td>Szczurzy klon anty-HA 3F10, monoklonalny</td><td>Wyprodukowany przez Roche, sprzedawany przez Sigma</td><td>11867423001</td><td>Możesz użyć preferowanego przeciwciała anty-HA</td></tr><tr><td>0,6 ml probówki</td><td>Fisher</td><td>AB0350</td><td></td></tr><tr><td>Fisher HealthCare* PROTOKÓŁ* Hema 3* Ręczny system barwienia (utrwalacz + roztwór I i II)</td><td>Fisher</td><td>22-122-911</td><td>Możesz również użyć bejcy</td></tr> <tr><td>giemsaSzkiełka mikroskopowe Fisherfines Premium Mated - Rozmiar: 3 x 1 cal</td><td>Rybak</td><td>12-544-3</td><td></td></tr></tbody></table>

edycja genu crispr/cas9 w celu stworzenia warunkowych mutantów ludzkiego pasożyta malarii p. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

Malaria jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. Ta choroba, która dotyka przede wszystkim osoby żyjące w regionach tropikalnych i subtropikalnych, jest spowodowana zakażeniem pasożytami Plasmodium. Opracowanie skuteczniejszych leków do walki z malarią może zostać przyspieszone dzięki lepszemu zrozumieniu biologii tego złożonego pasożyta. Manipulacja genetyczna tymi pasożytami jest kluczem do zrozumienia ich biologii; jednak historycznie genom P. falciparum był trudny do manipulowania. Ostatnio edycja genomu CRISPR/Cas9 została wykorzystana w pasożytach malarii, co pozwala na łatwiejsze znakowanie białek, generowanie warunkowych knockdownów białek i delecję genów. Edycja genomu CRISPR/Cas9 okazała się potężnym narzędziem do rozwoju badań nad malarią. W tym miejscu opisujemy metodę CRISPR/Cas9 do generowania mutantów warunkowego knockdown opartych na glmS u P. falciparum. Metoda ta jest wysoce adaptowalna do innych rodzajów manipulacji genetycznych, w tym znakowania białek i nokautowania genów.

Schemat plazmidów użytych w tej metodzie oraz przykład mutacji osłonowej przedstawiono na Rysunku 1. Jako przykład identyfikacji mutantów pasożytów po transfekcji, wyniki reakcji PCR służących do sprawdzenia integracji konstrukcji HA-glmS przedstawiono na Rysunku 2. Reprezentatywny obraz płytki do klonowania pokazano na Rysunku 3, aby zaprezentować zmianę koloru pożywki w obecności pasożytów...

Opisujemy metodę generowania mutantów warunkowego knockdown opartych na glmS w Plasmodium falciparum przy użyciu edycji genomu CRISPR/Cas9.

Edycja genu CRISPR/Cas9 w celu stworzenia warunkowych mutantów ludzkiego pasożyta malarii P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii ludzkiego pasożyta malarii, P.Falciparum, pomagając odkryć funkcję białka poprzez warunkowe wyłączenie. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na stosunkowo łatwe generowanie mutantów warunkowych w porównaniu z poprzednimi metodami. Aby rozpocząć, przejdź do Chop Chop i wybierz Fasta Target'Under Target, wklej 200 par zasad z trzech głównych końców otwartej ramki odczytu genu i 200 par zasad od początku trzech pierwszych UTR genu.W obszarze'wybierz P.Falciparum'i wybierz CRISPR/Cas9'w obszarze Używanie'Następnie kliknij Znajdź miejsca docelowe'Wybierz sekwencję gRNA z przedstawionych opcji, preferując najbardziej wydajną gRNA, która znajduje się najbliżej miejsca modyfikacji i ma najmniej miejsc poza celem. Kup sekwencję gRNA i jej odwrotny dopełniacz w postaci oczyszczonych oligonukleotydów w żelu poliakrylamidowym. Sekwencję gRNA używaną do celowania w PfH-sp70x można znaleźć w protokole tekstowym.Dodaj po 40 mikrogramów pMK-U6, pUF1-Cas9 i pHA-glmS DNA do sterylnej probówki wirówkowej o średnicy 1,5 milimetra. Dodaj jedną dziesiątą objętości DNA trzymolowego octanu sodu w wodzie do probówki i dobrze wymieszaj za pomocą wiru. Następnie dodaj do probówki 2,5-krotność objętości 100-procentowego etanolu i dobrze wymieszaj za pomocą wiru przez co najmniej 30 sekund.Umieść probówkę na lodzie lub w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na 30 minut. Następnie odwirować probówkę w temperaturze 18, 300 razy G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant z probówki, nie naruszając osadu.Dodaj do probówki trzykrotność objętości 70 procent etanolu i krótko wymieszaj za pomocą wiru. Odwirować probówkę o temperaturze 18, 300 razy G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie ostrożnie usunąć supernatant z probówki, nie naruszając osadu.Pozostaw probówkę otwartą i pozostaw granulkę do wyschnięcia na powietrzu przez 15 minut. Przechowuj wytrącone DNA w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż będzie potrzebne do transfekcji. Aby transfekować erytrocyty, należy przygotować bufor cytomiksowy 1X oraz niekompletne i kompletne RPMI zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Filtr wysterylizuj bufor za pomocą filtra 0,22 mikrona. Dodaj 380 mikrolitrów cytomiksu 1X do DNA i wiruj, aby się rozpuścił. Pozwól DNA rozpuścić się w cytomiksie 1X przez 10 minut, wirując co trzy minuty przez 10 sekund.W sterylnej, stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów połącz 300 mikrolitrów izolowanych ludzkich erytrocytów w niekompletnym RPMI z czterema mililitrami cytomiksu 1X. Odwirować erytrocyty w temperaturze 870 razy G przez trzy minuty. Następnie usunąć supernatant z osadu RBC.Ponownie zawiesić osad RBC za pomocą mieszaniny DNA-cytomiks i przenieść go do 0,2-centymetrowej kuwety do elektroporacji. Określ erytrocyty, korzystając z warunków wymienionych w protokole tekstowym. Po elektroporacji przenieś zawartość z kuwety do 15-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej pięć mililitrów pełnego RPMI.Odwirować probówkę o temperaturze 870 razy G przez trzy minuty w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnie zdekantować supernatant. Teraz ponownie zawiesić osad w czterech mililitrach całkowitego RPMI i przenieść do jednej studzienki na sześciodołkowej płytce do hodowli tkankowej.Dodaj 400 mikrolitrów kultury schizontu o wysokiej zawartości schizontu do przeniesionych krwinek czerwonych. Utrzymuj wszystkie kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza poniżej trzech procent tlenu, trzech procent CO2 i 94 procent azotu. Następnego dnia umyj kulturę czterema mililitrami pełnego RPMI.Odwirować kulturę w temperaturze 870 razy G przez trzy minuty. Odessać supernatant. Ponownie zawieś kulturę w czterech mililitrach całkowitego RPMI.48 godzin później umyj kulturę czterema mililitrami całkowitego RPMI. Następnie ponownie zawiesić hodowlę w pełnym RPMI zawierającym jeden mikromolowy DSM1, aby wybrać plazmid Cas9. Po tym czasie należy zastąpić pożywkę hodowlaną świeżym, kompletnym RPMI oraz jednym mikromolowym DSM1 co 48 godzin.Kontynuuj mycie kultur każdego dnia za pomocą pełnego RPMI, aż pasożyty przestaną być widoczne w rozmazie krwi. Aby zrobić rozmaz krwi, odpipetuj 150 mikrolitrów kultury do 0,6 mililitra probówki wirówkowej. Po zagnieżdżeniu komórek przez odwirowanie w temperaturze 1 700 razy G przez 30 sekund, odessać sklarowany sklarowany sklarowany stan.Za pomocą pipety przenieś granulowane komórki na szkiełko podstawowe. Za pomocą drugiego szkiełka podstawionego pod kątem 45 stopni do pierwszego szkiełka rozsmaruj kroplę krwi. Zabejcuj szkiełko za pomocą dostępnego w handlu zestawu do barwienia zgodnie z protokołem producenta.Zobacz pasożyty za pomocą 100-krotnego obiektywu zanurzonego w olejku. Rozpoczynając pięć dni po transfekcji, usuń dwa mililitry kultury z krwinkami czerwonymi ponownie zawieszonymi w pożywce hodowlanej. Dodaj z powrotem dwa mililitry świeżej pożywki i krew o dwuprocentowym hematokrycie.Dodawaj świeżą krew w ten sposób raz w tygodniu, aż do ponownego pojawienia się pasożyta, zgodnie z rzadkim rozmazem krwi. Wykonaj seryjne rozcieńczenia kultury pasożyta, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,5 pasożyta na 200 mikrolitrów. Dodać 200 mikrolitrów rozcieńczonej kultury do dołków 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.Utrzymuj płytkę klonującą, aż pasożyty będą wykrywalne w studzienkach. Co 48 godzin należy wymieniać pożywkę w płytce 96-dołkowej na świeżą pożywkę. Raz w tygodniu, zaczynając pięć dni po rozpoczęciu płytki klonującej, usuń 100 mikrolitrów z każdej studzienki i dodaj z powrotem 100 mikrolitrów świeżej pożywki plus krew.Aby zidentyfikować wszelkie studzienki zawierające pasożyty, umieść 96-dołkową płytkę pod kątem 45 stopni na około 20 minut, pozwalając krwi osiąść pod kątem w płytce. Następnie umieść 96-dołkową płytkę na kasecie świetlnym. Zauważ, że studzienki zawierające pasożyty zawierają pożywkę o żółtym kolorze, w porównaniu z różową pożywką studni wolnych od pasożytów, ze względu na zakwaszenie pożywki przez pasożyty.Za pomocą pipety serologicznej przenieś zawartość studzienek zawierających pasożyty na 24-dołkową płytkę do hodowli tkankowej, aby umożliwić ekspansję parazytemii. Korzystając z analizy PCR, sprawdź te klonalne linie pasożytów pod kątem prawidłowej integracji. Wyniki testu immunofluorescencyjnego przedstawiono tutaj, wykazując pomyślne znakowanie HA PfH-sp70x.Pasożyty PfH-sp70x glmS utrwalono i wybarwiono DAPI jako markerem jądra, a także przeciwciałami przeciwko HA. Białko bogate w histydynę związane z błoną, marker eksportu białka do krwinek czerwonych gospodarza. Przedstawiono tutaj analizę Western Blot poziomu białka PfH-sp70x po leczeniu glukozaminą. Zgodnie z oczekiwaniami poziom białka zmniejsza się w czasie trwania leczenia.Technika ta toruje drogę naukowcom w dziedzinie parazytologii do zbadania fundamentalnych pytań z zakresu biologii pasożyta malarii. Należy pamiętać, że P.Falciparum jest patogenem przenoszonym przez krew i podczas wykonywania tego zabiegu należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.

crisprcas9-gene-editing-to-make-conditional-mutants-human-malaria

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Przedstawiono szczegóły dotyczące sposobu wykorzystania mapowania QTL z mapą genetyczną opartą na całej sekwencji genomu do identyfikacji genu oporności na leki w Toxoplasma gondii i jak można to zweryfikować za pomocą systemu CRISPR/Cas9, który skutecznie edytuje cel genomowy, w tym przypadku gen oporności na leki.

Mapowanie QTL i edycja CRISPR/Cas9 w celu identyfikacji genu oporności na leki w Toxoplasma gondii

Ukierunkowana edycja genów za pomocą CRISPR/Cas9 znacznie ułatwiła zrozumienie biologicznych funkcji genów. W tym przypadku wykorzystujemy metodologię CRISPR/Cas9 do modelowania mutacji kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin w celu zbadania ich aktywności onkogennej.

Wykorzystanie edycji genów CRISPR/Cas9 do zbadania onkogennej aktywności zmutowanej kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin

Tutaj opisujemy protokół wprowadzania nokautu genu do zewnątrzkomórkowego amastigotu Trypanosoma cruzi za pomocą systemu CRISPR/Cas9. Fenotyp wzrostu może być śledzony albo przez liczenie komórek w aksenowej kulturze amastigotów, albo przez proliferację wewnątrzkomórkowych amastigotów po inwazji komórek gospodarza.

Wprowadzenie nokautu genu bezpośrednio do stadium amastigoty Trypanosoma cruzi za pomocą systemu CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 jest coraz częściej używany do charakteryzowania funkcji genów w organizmach niemodelowych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób generować linie nokautujące Culex pipiens, od przygotowania mieszanek iniekcyjnych, po pozyskiwanie i wstrzykiwanie zarodków komarów, a także jak hodować, krzyżować i badać przesiewowo komary, którym wstrzyknięto implanty i ich potomstwo pod kątem pożądanych mutacji.

Przygotowanie i wstrzykiwanie zarodków komarów Culex w celu wygenerowania mutacji zerowych przy użyciu CRISPR/Cas9

Ten protokół szczegółowo opisuje etapy ukierunkowanej mutagenezy CRISPR/Cas9 u muszek piaskowych: pobieranie zarodków, wstrzykiwanie, hodowla owadów i identyfikacja, a także wybór interesujących mutacji.

Mucha piaskowa (Phlebotomus papatasi) Mikroiniekcja zarodka do mutagenezy CRISPR/Cas9

Celem tego protokołu jest umożliwienie bezproblemowej edycji genomu C. elegans za pomocą CRISPR/Cas9 przy użyciu złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych i markera co-CRISPR dpy-10 do badań przesiewowych. Protokół ten może być stosowany do dokonywania różnych modyfikacji genetycznych u C. elegans, w tym insercji, delecji, wymiany genów i podstawiania kodonów.

Edycja CRISPR/Cas9 genu rbm-3.2 C. elegans przy użyciu markera przesiewowego dpy-10 Co-CRISPR i złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych.

Protokół opisuje, jak dokonać zmian w genomie komarów malarii Anopheles za pomocą systemu φC31. Opisane modyfikacje obejmują zarówno integrację, jak i wymianę transgenicznych kaset w genomie linii dokujących zawierających attP.

Ukierunkowana na miejsce integracja za pośrednictwem φC31 i wymiana kaset w wektorach Anopheles malarii

Ten artykuł opisuje protokół szybkiej identyfikacji indeli indukowanych przez CRISPR/Cas9 i selekcji linii mutantów u komara Aedes aegypti za pomocą analizy topnienia w wysokiej rozdzielczości.

Wykrywanie indel po mutagenezie CRISPR/Cas9 przy użyciu analizy stopienia w wysokiej rozdzielczości u komara Aedes aegypti

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić efektywną edycję zasady adeninowej bez ograniczeń PAM, aby zbudować precyzyjny model choroby danio pręgowanego za pomocą zSpRY-ABE8e.

Wydajna edycja bazy bez PAM do modelowania chorób genetycznych człowieka u danio pręgowanego za pomocą zSpRY-ABE8e

Genetyka chemiczna polega na zastąpieniu reszty strażnika aminokwasem zawierającym inny łańcuch boczny w docelowym locus. W tym przypadku wygenerowaliśmy zmutowanego pasożyta zawierającego hipomorficzny allel cdpk1 i zidentyfikowaliśmy szlaki kompensacyjne przyjęte przez pasożyta na tle mutacji.

Zrozumienie rozwoju szlaków kompensacyjnych u zmutowanego pasożyta malarii zawierającego hipomorficzny allel kinaz roślinopodobnych

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół edycji genomu poprzez mikroiniekcję embrionalną u komara A. aegypti przy użyciu technologii CRISPR-Cas9.

Edycja genomu u komara Aedes aegypti z żółtą febrą przy użyciu CRISPR-Cas9

Poznaj metodę edycji genomu CRISPR/Cas9 do tworzenia warunkowych mutantów w pasożycie malarii Plasmodium falciparum. Technika ta umożliwia badanie funkcji białek i odkrywanie nowych celów terapeutycznych.

Edycja genu CRISPR/Cas9 w celu stworzenia warunkowych mutantów ludzkiego pasożyta malarii P. falciparum

Przeglądaj więcej filmów