Name: Analiza wewnętrznego zaburzenia AtHIRD11 i wiązania się z jonami metali za pomocą kapilarnej elektroforezy żelowej i powinowactwa do elektroforezy kapilarnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Poznaj analizę białek wewnętrznie nieuporządkowanych za pomocą kapilarnej elektroforezy żelowej i powinowactwa do elektroforezy kapilarnej. Ta metoda pozwala szybko badać zmiany konformacyjne przy wiązaniu jonów metali.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za to, że Masakuza Hara (Instytut Badawczy Zielonej Nauki i Technologii, Uniwersytet Shizuoka, Japonia) za dostarczenie próbek białka AtHIRD11.

1. Przygotowanie przyrządów do elektroforezy kapilarnej
<ol>
	<li>Przygotuj naczynia włosowate
	<ol>
		<li>Za pomocą noża do szkła przeciąć kapilarnę z gołej stopionej krzemionki z zewnętrzną powłoką poliimidową i średnicą wewnętrzną 50 μm na kapilary o długości 33 cm (w eksperymencie CGE) i 30 cm (w eksperymencie ACE). Wykonaj cięcie na szklanej płycie. 
		Uwaga: 2 różne konfiguracje eksperymentalne zostały opracowane dla 2 różnych instrumentów. Aby można je było stosować na innych instrumentach, należy wykonać odpowiedni transfer metody i dostosować długość kapilary do dozwolonej długości instrumentu.</li>
		<li>Użyj pisaka, aby zaznaczyć środek okna detekcji o szerokości 1 cm w odległości 24,5 cm od jednego końca kapilary w eksperymencie CGE i w odległości 21,5 cm od jednego końca kapilary w eksperymencie ACE (długość efektywna).</li>
		<li>Usuń zewnętrzną powłokę poliimidową z naczyń włosowatych, wypalając ją palnikiem, 0,5 cm przed i po znaku. Podobnie użyj lampy lutowniczej, aby usunąć 1 cm powłoki z obu końców naczyń włosowatych. 
		Uwaga: Efektywna długość może się nieznacznie różnić, ponieważ zależy od zastosowanego przyrządu do elektroforezy kapilarnej.</li>
		<li>Oczyść końce naczyń włosowatych i okienek detekcyjnych etanolem i miękką chusteczką. 
		Uwaga: Niepowlekane naczynia włosowate są mniej elastyczne i podatne na pękanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zainstaluj kapilary
	<ol>
		<li>Zainstaluj kapilar w systemie CE z okienkiem detekcji w pobliżu wylotu. 
		UWAGA: Różne modele instrumentów CE mają różne systemy mocowania naczyń włosowatych. Zapoznaj się z instrukcją obsługi używanego instrumentu, aby uzyskać dokładne instrukcje.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotuj rozwiązania
<ol>
	<li>Przygotowanie rozwiązań do analizy CGE
	<ol>
		<li>Przygotować bufor tris(hydroksymetylo)aminometanu (Tris)-SDS (100 mM/1% w/v) o pH 8,0.
		<ol>
			<li>Użyj maski oddechowej i kabiny do zważenia 1,00 g dodecylosiarczanu sodu (SDS) w zlewce o pojemności 100 ml.</li>
			<li>Dodać 1,21 g Tris do zlewki o pojemności 100 ml i rozpuścić za pomocą 50 ml wody dejonizowanej i mieszadła magnetycznego na mieszadle magnetycznym.</li>
			<li>Umieścić elektrodę pH w roztworze i dostosować pH do 8,0 za pomocą 1,0 M HCl.</li>
			<li>Wlać roztwór do kolby miarowej o pojemności 100 ml i dodać wodę dejonizowaną do kreski. Delikatnie potrząśnij, aby uniknąć tworzenia się piany.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować 0,1 M roztwór NaOH.
		<ol>
			<li>Odważyć 4,0 g NaOH w kolbie miarowej o pojemności 100 ml. Napełnij go do kreski wodą dejonizowaną, aby uzyskać zapas o pojemności 1 M.</li>
			<li>Za pomocą pipety gruszkowej o pojemności 10 ml przenieś 10 ml tego roztworu do innej kolby miarowej o pojemności 100 ml i napełnij ją wodą dejonizowaną do kreski.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować roztwór 0,1 M HCl.
		<ol>
			<li>Umieścić 10 ml 10 M HCl w kolbie miarowej o pojemności 100 ml za pomocą pipety miarowej o pojemności 10 ml i napełnić ją wodą dejonizowaną do kreski do kreski. Powtórz ten krok, aby uzyskać 0,1 M HCl.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować roztwór próbki.
		<ol>
			<li>Odważyć 0,5 mg białka do probówki o pojemności 1 ml. Dodać 0,5 ml żelowego buforu Tris-SDS z kroku 2.1.1 za pomocą mikropipety.</li>
			<li>Rozpuść białko, delikatnie wstrząsając, aby uniknąć tworzenia się piany i degradacji białka. 
			UWAGA: Stosować ultradźwięki, jeśli białko nie może zostać rozpuszczone zgodnie z opisem; Unikaj podgrzewania roztworu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wlać roztwory do fiolek.
		<ol>
			<li>Przefiltrować każdy roztwór przez filtr z polifluorku winylidenu (PVDF) 0,22 μm za pomocą odpowiedniej strzykawki bezpośrednio do fiolki. 
			UWAGA: W przypadku roztworów zawierających żel ciśnienie wsteczne może być wysokie ze względu na jego wysoką lepkość.</li>
			<li>Przygotuj w sumie 15 fiolek i zaznacz każdą z nich, aby uniknąć pomyłki.
			<ol>
				<li>Napełnij 3 fiolki dostępnym w handlu buforem żelowym z dodecylosiarczanu sodu (SDS) o pH 8, 
				UWAGA: Zastosowanie dostępnego na rynku buforu żelowego SDS zapewnia bardziej precyzyjne wyniki.</li>
				<li>Napełnić 1 fiolkę 0,1 M NaOH i 1 fiolkę 0,1 M HCl do przepłukiwania.</li>
				<li>Napełnić 1 fiolkę roztworem próbki.</li>
				<li>Napełnij 5 fiolek wodą dejonizowaną i 4 fiolki 0,1 ml wody dejonizowanej (fiolki do zanurzania). 
				UWAGA: Fiolki do zanurzania są używane jako fiolki na odpady podczas płukania kapilary przed każdym uruchomieniem. Końce kapilarne zanurza się w wodzie w celu spłukania wszelkich pozostałości żelu.</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie rozwiązań do analizy ACE
	<ol>
		<li>Przygotować 1 M roztwór NaOH.
		<ol>
			<li>Odważyć 4,0 g NaOH w kolbie miarowej o pojemności 100 ml.</li>
			<li>Napełnij go do kreski wodą dejonizowaną, aby uzyskać zapas o pojemności 1 M.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować 0,1 M kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) w 0,1 M roztworze NaOH.
		<ol>
			<li>Przenieść 10 ml 0,1 M NaOH do kolby miarowej o pojemności 100 ml za pomocą pipety z bańką o pojemności 10 ml. Napełnij go do kreski wodą dejonizowaną.</li>
			<li>Zważyć 2,42 g EDTA na łodzi wagowej i rozpuścić związek stały w 100 ml 0,1 M NaOH.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować roztwór buforowy Tris (30 mM).
		<ol>
			<li>Do zlewki o pojemności 500 ml dodać 3,63 g Tris, 200 ml wody dejonizowanej i kostkę mieszającą. Umieść zlewkę na płytce mieszającej i włącz ją.</li>
			<li>Umieścić elektrodę pH-metru w zlewce i dostosować pH do 7,4 za pomocą 0,1 M HCl.</li>
			<li>Napełnij roztwór kolbą miarową o pojemności 1 l i napełnij do kreski wodą dejonizowaną. 
			UWAGA: Procedurę tę należy powtórzyć lub potrzebna jest większa kolba miarowa, ponieważ do całej analizy potrzeba więcej niż 1 l.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować roztwór markera przepływu elektroosmotycznego (EOF) acetanilidu (60 μM).
		<ol>
			<li>Dodać 6 mg acetanilidu i 100 ml buforu Tris do kolby miarowej o pojemności 100 ml.</li>
			<li>Umieścić kolbę miarową w łaźni ultradźwiękowej i włączyć ją na 30 minut.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować roztwór próbki (1 mg/ml).
		<ol>
			<li>Umieść probówkę mikrowirówki o pojemności 0,5 ml na wadze precyzyjnej i dodaj 0,3 mg liofilizowanego proszku AtHIRD11 do probówki.</li>
			<li>Za pomocą mikropipety dodaj 0,3 ml 30 mM buforu Tris (pH 7,4) do probówki. Ostrożnie wstrząśnij probówką, aby rozpuścić białko.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotuj roztwory ligandów.
		<ol>
			<li>Przygotować roztwór podstawowy CaCl2 (5 mM).
			<ol>
				<li>Weź łódkę wagową, umieść ją na wadze analitycznej i zważ 36,76 mg CaCl2*H2O.</li>
				<li>Za pomocą mikropipety przepłukać CaCl2*H2Oz łodzi ważącej do kolby miarowej o pojemności 50 ml z uprzednio przygotowanym buforem Tris.</li>
				<li>Napełnić kolbę miarową buforem Tris do kreski.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Przygotować pozostałe roztwory podstawowe (5 mM).
			<ol>
				<li>Powtórzyć krok 2.2.6.1, używając innych soli metali zamiast CaCl2*H2O[MgCl2: 23,80 mg, BaCl2: 26,02 mg, Sr(NO3)2: 52,91 mg, MnCl2: 31,46 mg, SeCl4: 52,91 mg, CoCl2*2H2O: 41,47 mg, CuCl2*2H2O: 42,62 mg, ZnCl2: 3,41 mg i NiCl2*6H2O: 59,43 mg]. 
				UWAGA: Roztwór ZnCl2 ma stężenie 0,5 mM. Ponieważ zaobserwowano silne oddziaływania między jonami a wewnętrzną ścianą naczyń włosowatych, stężenie zmniejszyło się o współczynnik 104.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Przygotować roztwór CaCl2 o stężeniu 500 μM.
			<ol>
				<li>Napełnić 10 ml roztworu podstawowego CaCl2 i umieścić go w kolbie miarowej o pojemności 100 ml.</li>
				<li>Napełnić kolbę miarową buforem Tris do kreski i wstrząsnąć kolbą.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Przygotować roztwór CaCl2 o stężeniu 250 μM.
			<ol>
				<li>Napełnić 5 ml roztworu podstawowego CaCl2 i umieścić go w kolbie miarowej o pojemności 100 ml.</li>
				<li>Napełnić kolbę miarową buforem Tris do kreski i wstrząsnąć kolbą.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Powtórzyć kroki 2.2.6.3 i 2.2.6.4 dla pozostałych roztworów podstawowych.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Napełnij roztwory w fiolkach. 
		UWAGA: Każdy powtórzony cykl wymaga zestawu fiolek wlotowych i wylotowych. Zastosowanie świeżych roztworów ligandów na wlocie i wylocie zmniejsza przesunięcia w czasie migracji po każdym przebiegu.
		<ol>
			<li>Napełnić 250 μM roztworem CaCl2 w strzykawce o pojemności 10 ml.</li>
			<li>Umieścić filtr PVDF 0,22 μm na strzykawce i przepchnąć 2 ml roztworu przez filtr za pomocą strzykawki w celu odrzucenia przefiltrowanego roztworu.</li>
			<li>Napełnić 10 fiolek do maksymalnej dozwolonej objętości pozostałym roztworem 250 μM CaCl2 ze strzykawki. Oznaczyć każdą z nich jako fiolkę wlotową roztworu CaCl 2 o objętości 250 μM.</li>
			<li>Napełnić 10 fiolek do połowy roztworem CaCl2 o stężeniu 250 μM. Oznaczyć każdą z nich jako fiolkę z wylotem roztworu CaCl 2 o stężeniu 250 μM.</li>
			<li>Powtórzyć kroki 2.2.7.1-2.2.7.4 dla pozostałych roztworów zawierających sole metali.</li>
			<li>Powtórz kroki dla każdej pary fiolek wlotowych i wylotowych, używając zamiast tego roztworu buforowego Tris o stężeniu 30 mM (pH 7,4). 
			Uwaga: Bufor Tris o pH 7,4 o stężeniu 30 mmol/l jest stosowany pomiędzy seriami w celu uzyskania danych dotyczących czasu migracji białka przy braku jonów metali. Jest to konieczne, aby zaniedbywać zmiany w EOF.</li>
			<li>Powtórzyć powyższe czynności dla jednej fiolki, używając roztworu markera EOF acetanilidu (60 μM). Powtórz również te kroki, używając roztworu próbki (1 mg/ml).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Elektroforetyczne rozdzielanie żelu kapilarnego
Uwaga: Przygotuj separację zgodnie z metodą opisaną w poprzedniej pracy Nachbara i wsp.4.
<ol>
	<li>Przygotowanie analizy
	<ol>
		<li>Kondycjonuj naczynia włosowate
		<ol>
			<li>Ustaw termostat na 23 °C.</li>
			<li>Przepłukiwać kapilarnę przez 10 minut pod ciśnieniem 2,5 bara 0,1 M NaOH.</li>
			<li>Przepłukiwać kapilar przez 5 minut pod ciśnieniem 2,0 bar 0,1 M HCl.</li>
			<li>Przepłukiwać kapilarnę przez 2 minuty pod ciśnieniem 2,0 bara wodą dejonizowaną.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wypełnij bufor żelu SDS
		<ol>
			<li>Napełniaj kapilarnę przez 10 minut pod ciśnieniem 2,0 bara dostępnym w handlu żelowym buforem SDS o pH 8,0.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przepłucz kapilę przed każdym biegiem separacji
		<ol>
			<li>Przepłukiwać kapilarnę przez 3 minuty pod ciśnieniem 4,0 bar 0,1 M NaOH.</li>
			<li>Przepłukiwać kapilarnę przez 1 minutę pod ciśnieniem 4,0 bar 0,1 M HCl.</li>
			<li>Przepłukiwać kapilarę przez 1 minutę pod ciśnieniem 4,0 bara wodą dejonizowaną.</li>
			<li>Przepłukiwać kapilarnę przez 10 minut pod ciśnieniem 4,0 bara za pomocą buforu żelowego SDS.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchamianie separacji
	<ol>
		<li>Wstrzyknąć roztwór próbki do eksperymentów CGE (krok 2.1.4) hydrodynamicznie, stosując 0,1 bara przez 4 minuty na wlocie.</li>
		<li>Stosować -16,5 kV i ciśnienie 2,0 bar na obu końcach kapilary przez 25 minut.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza elektroforetyczna kapilarna o powinowactwie
Uwaga: Przygotuj separację zgodnie z metodą opisaną w poprzednich pracach Nachbara i wsp.4 oraz Alhazmi et al.5.
<ol>
	<li>Kondycjonuj naczynia włosowate
	<ol>
		<li>Ustaw termostat na 23 °C. 
		UWAGA: Temperatura jest używana zgodnie z opublikowanymi protokołami i może być zmieniona na inne temperatury4,5. Jednak interakcje są zależne od temperatury i odpowiednio się zmieniają.</li>
		<li>Przepłukać kapilarnę przez 40 minut pod ciśnieniem 2,5 bara 0,1 M NaOH.</li>
		<li>Przepłukiwać kapilarnę przez 10 minut pod ciśnieniem 1,0 bara wodą dejonizowaną.</li>
		<li>Przepłukiwać kapilarnę przez 30 minut pod ciśnieniem 1,0 bara za pomocą 30 mM buforu Tris (pH 7,4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie do metod ACE
	<ol>
		<li>Przygotuj metodę pomiarów bez ligandów. 
		Uwaga: Acetanilid nie został dodany do roztworu próbki, ponieważ ukrywa on 2 piki białka.
		<ol>
			<li>Przepłukać kapilarnę przez 1 minutę pod ciśnieniem 2,5 bara 0,1 M roztworem EDTA.</li>
			<li>Płukać kapilarnę przez 1 minutę pod ciśnieniem 2,5 bara wodą dejonizowaną.</li>
			<li>Przepłukać kapilarnę przez 1,5 minuty pod ciśnieniem 2,5 bara za pomocą buforu Tris w celu zrównoważenia.</li>
			<li>Wstrzykiwać roztwór acetanilidu przez 6 s pod ciśnieniem 0,05 bara i wymienić fiolki wlotowe i wylotowe na fiolki z buforem Tris.</li>
			<li>Stosować 0,05 bara przez 2,4 s, aby wepchnąć roztwór acetanilidu z końcówki kapilary głębiej do środka.</li>
			<li>Zastosować napięcie 10,0 kV przez 6 minut i wykryć pik acetanilidu o długości fali 200 nm.</li>
			<li>Powtórzyć czynności 4.2.1.1. - 4.2.1.6. używając próbki białka zamiast roztworu acetanilidu i wykryć wszystkie piki białka.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotuj metodę pomiarów za pomocą ligandów.
		<ol>
			<li>Przepłukać kapilarnę przez 1 minutę pod ciśnieniem 2,5 bara 0,1 M roztworem EDTA.</li>
			<li>Płukać kapilarnę przez 1 minutę pod ciśnieniem 2,5 bara wodą dejonizowaną.</li>
			<li>Przepłukać kapilarę przez 1,5 minuty pod ciśnieniem 2,5 bara roztworem liganda w celu zrównoważenia.</li>
			<li>Wstrzykiwać roztwór acetanilidu przez 6 s pod ciśnieniem 0,05 bara i zmienić fiolki wlotowe i wylotowe na fiolki z buforem zawierającym ligandy.</li>
			<li>Stosować 0,05 bara przez 2,4 s, aby wepchnąć roztwór acetanilidu z końcówki kapilary głębiej do środka.</li>
			<li>Zastosować napięcie 10,0 kV przez 6 minut i wykryć pik acetanilidu o długości fali 200 nm.</li>
			<li>Powtórzyć czynności 4.2.2.1 - 4.2.2.6, używając próbki białka zamiast roztworu acetanilidu i wykryć wszystkie piki białka.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Alternatywnie powtórzyć kroki 4.2.1 i 4.2.2 w celu obliczenia zmiany stosunków ładunku do wielkości dla różnych oddziaływań białko-metal jonowy (opisanych w Reprezentatywnych wynikach).
		<ol>
			<li>Zmieniaj roztwór białkowy co 60 godzin na świeży. 
			UWAGA: W tym momencie eksperyment można wstrzymać. Procedura ta jest powtarzana co najmniej 10 razy dla każdego stężenia ligandów, ponieważ wzór pików różni się nieznacznie w zależności od przebiegu. Jeśli roztwór jest używany dłużej niż 60 godzin, różnice stają się zbyt duże.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Uruchamianie metod
		<ol>
			<li>Uruchomić metodę opisaną w kroku 4.2.2, używając roztworów ligandów ziem alkalicznych (roztwory CaCl2, MgCl2, BaCl2 i SrCl2).</li>
			<li>Kontynuuj stosowanie metody opisanej w kroku 4.2.2, używając roztworów MnCl2, SeCl4, CoCl2, CuCl2, ZnCl2 i NiCl2 zamiast roztworów ligandów ziem alkalicznych. 
			UWAGA: Te ostatnie chlorki metali przejściowych wykazywały silniejsze oddziaływania z kapilarą i nie można ich całkowicie usunąć. Te interakcje powodują przesunięcia w czasie migracji z uruchomienia na uruchomienie. W związku z tym badano je po innych jonach metali.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifunctionality+of+dehydrins%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signaling+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">The multifunctionality of dehydrins: An overview.</a> Plant Signaling & Behavior. 5 (5), 1-6 (2010).</li>
<li>Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dancing+protein+clouds%3A+the+strange+biology+and+chaotic+physics+of+intrinsically+disordered+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dancing protein clouds: the strange biology and chaotic physics of intrinsically disordered proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (13), 6681-6688 (2016).</li>
<li>Hara, M., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11738-011-0749-1">Biochemical characterization of the Arabidopsis KS-type dehydrin protein, whose gene expression is constitutively abundant rather than stress dependent.</a> Acta Physiologia Plantarum. 33 (6), 2103-2116 (2011).</li>
<li>Nachbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+ion+-+dehydrin+interactions+investigated+by+affinity+capillary+electrophoresis+and+computer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Metal ion - dehydrin interactions investigated by affinity capillary electrophoresis and computer models.</a> Journal of Plant Physiology. 216, 219-228 (2017).</li>
<li>Alhazmi, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+platform+to+investigate+protein-metal+ion+interactions+by+affinity+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">A comprehensive platform to investigate protein-metal ion interactions by affinity capillary electrophoresis.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 311-317 (2015).</li>
<li>Redweik, S., Xu, Y., Wätzig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise%2C+fast%2C+and+flexible+determination+of+protein+interactions+by+affinity+capillary+electrophoresis%3A+Part+1%3A+Performance%5BTitle%5D)+AND+%22ELECTROPHORESIS%22%5BJournal%5D)">Precise, fast, and flexible determination of protein interactions by affinity capillary electrophoresis: Part 1: Performance.</a> ELECTROPHORESIS. 33 (22), 3316-3322 (2012).</li>
<li>Ghosal, S. <a target="_blank" href="https://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.fluid.38.050304.092053">Electrokinetic flow and dispersion in capillary electrophoresis.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 38 (1), 309-338 (2006).</li>
<li>Xuan, X., Li, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+study+of+Joule+heating+effects+on+electrokinetic+transportation+in+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Analytical study of Joule heating effects on electrokinetic transportation in capillary electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 1064 (2), 227-237 (2005).</li>
<li>Oledzka, I. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/264234547_Comparative_Evaluation_of_Tissue_Protein_Separations_Applying_One-_Dimensional_Gel_Electrophoresis_and_Capillary_Gel_Electrophoresis">Comparative evaluation of tissue protein separations applying one- dimensional gel electrophoresis and capillary gel electrophoresis.</a> The Open Proteomics Journal. 5 (1), 17-21 (2012).</li>
<li>Alhazmi, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+affinity+capillary+electrophoresis+for+routine+investigations+of+protein-metal+ion+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Separation+Science%22%5BJournal%5D)">Optimization of affinity capillary electrophoresis for routine investigations of protein-metal ion interactions.</a> Journal of Separation Science. 38 (20), 3629-3637 (2015).</li>
<li>Busch, M. H. A., Carels, L. B., Boelens, H. F. M., Kraak, J. C., Poppe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+five+methods+for+the+study+of+drug-protein+binding+in+affinity+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Comparison of five methods for the study of drug-protein binding in affinity capillary electrophoresis.</a> Journal of Chromatography A. 777 (2), 311-328 (1997).</li>
<li>Mozafari, M., Balasupramaniam, S., Preu, L., El Deeb, S., Reiter, C. G., Wätzig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+affinity+capillary+electrophoresis+and+computational+models+for+binding+studies+of+heparinoids+with+P-selectin+and+other+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ELECTROPHORESIS%22%5BJournal%5D)">Using affinity capillary electrophoresis and computational models for binding studies of heparinoids with P-selectin and other proteins.</a> ELECTROPHORESIS. 38 (12), 1560-1571 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W przypadku wszystkich eksperymentów CE przygotowanie kapilary jest krytycznym krokiem. Ponieważ jest to szklana rurka o małej średnicy, może łatwo pęknąć w miejscach, w których powłoka jest usuwana podczas obsługi. Montaż kapilary w instrumencie należy wykonać bardzo ostrożnie.
Krytyczne kroki związane z użyciem metody ACE odnoszą się głównie do konfiguracji eksperymentalnej. Kolejnym krytycznym krokiem jest znalezienie odpowiednich parametrów wtrysku próbki. Wstrzyknięta ilość próbki musi by...

Rośliny są bardziej zależne od swojego środowiska niż wiele innych form życia. Ponieważ rośliny nie mogą przenosić się w inne miejsca, muszą dostosować się do zmian zachodzących w otoczeniu (np. suszy, zimna i wysokiego stężenia soli). W związku z tym rośliny wyższe wytworzyły wyspecjalizowane białka stresu, takie jak dehydryny, które spełniają różnorodne zadania w celu zmniejszenia stresu komórkowego związanego z wysokim zasoleniem. Białka te wiążą wodę i jony wewnątrz komórek, zmniejszają stres oksydacyjny poprzez wiązanie jonówCu2+ i oddziałują z fosfolipidami, a także cytoszkieletami. Co więcej, wiązanie jonów Zn2+ pozwala tym białkom działać jako czynniki transkrypcyjne. Opisano również ich zdolność do wiązania jonów Ca2+ po fosforylacji1.
Wielofunkcyjne zachowanie tych białek jest związane z brakiem hydrofobowych reszt aminokwasowych. W związku z tym nie mają żadnych oddziaływań hydrofobowych wewnątrz łańcucha peptydowego, a także ograniczonej struktury. Ponieważ jednak białka te nie mają restrykcyjnej struktury, mogą zajmować różne konformery w tych samych warunkach. Dlatego najlepiej można je opisać jako zespół struktur, a nie jako pojedynczą konformację. Białka o tych właściwościach są znane jako białka wewnętrznie nieuporządkowane (IDP) i są szeroko stosowaną koncepcją dla białek stresu i wzajemnych oddziaływań między różnymi szlakami w komórkach eukariotycznych2.
Jednym z tych stresujących IDPów jest AtHIRD11. Jest to jeden z najbardziej narażonych na suszę IDP Arabidopsis thaliana. W związku z tym różne konformery można rozdzielić według ich efektywnego stosunku promienia do ładunku, a do dalszych badań zastosowano elektroforezę kapilarną (CE). Poprzednie eksperymenty ACE wykazały interakcje między AtHIRD11 a jonami metali przejściowych, takimi jak Cu2+-, Zn2+-, Co2+ i jony Ni2+. Szczegółowe wyniki można znaleźć w Hara et al.3 oraz Nachbar et al.4.
Metoda ACE, która zostanie tutaj użyta, jest oparta na naszych wcześniejszych opublikowanych pracach6. Jednakże dodanie markera EOF acetanilidu do próbki białka nie jest odpowiednie. AtHIRD11 pokazuje szerokie wzorce pików, a dodanie markera EOF do próbki ukryłoby dwa piki. W związku z tym znacznik jest używany w osobnym przebiegu. Zanim zachowanie wiązania zostanie zbadane, potwierdzono, że piki znalezione podczas poprzednich eksperymentów pochodzą od różnych konformerów. W związku z tym CGE służy do rozróżniania konformerów białkowych, zmodyfikowanego białka potranslacyjnego i zanieczyszczeń, takich jak fragmenty AtHIRD11, na podstawie ich różnych mas. Następnie badane jest scharakteryzowane zachowanie wiązania próbki AtHIRD11 z różnymi jonami metali.
Celem tego artykułu jest opisanie eksperymentalnego zestawu do rozróżniania IDP od innych składników próbki w celu oceny różnic w zachowaniu wiązania różnych konformistów.

<table><tbody><tr><td>Próbka AtHIRD11</td><td>Shizuoka University (grupa prof. M. Hara)</td><td>-</td><td>Dehydrin Białko z Arabidopsis thaliana wyrażone w Escherichia coli</td></tr><tr><td>Barefused krzemionka kapilarna</td><td>Polymicro Technologies (Phoenix, USA)</td><td>106815-0017</td><td>TSP050375, 50 &mu; m średnica wewnętrzna, 363 &mu; m średnica zewnętrzna, powłoka poliimidowa</td></tr><tr><td>Agilent 1600A</td><td>Agilent Technologies (Waldbronn, Niemcy)</td><td>obecnie niedostępny</td><td>Przyrząd do elektroforezy kapilarnej; Zamiast tego można użyć Agilent 7100 CE</td></tr><tr><td>Agilent 7100 CE</td><td>Agilent Technologies (Waldbronn, Niemcy)</td><td>G7100A</td><td>Przyrząd do elektroforezy kapilarnej</td></tr><tr><td>Injekt 2 mL</td><td>B. Braun (Melsungen, Niemcy)</td><td>4606051V</td><td>Strzykawka do filtracji</td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe Rotilabo</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Niemcy)</td>Filtr membranowy <td>KY62.1</td><td>PVDF do filtracji roztworowej</td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 10 &mu; L</td><td>Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Niemcy)</td><td>3121 000.023</td><td>Mikropipeta do obsługi próbek</td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 10 &mu; L</td><td>Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Niemcy)</td><td>3121 000.120</td><td>Mikropipeta do obsługi roztworów ligandów</td></tr><tr><td>Pipeta gruszkowa 10 ml</td><td>Duran Group GmbH(Moguncja, Niemcy)</td><td>24 338 08</td><td>Przygotowanie roztworu NaOH</td></tr><tr><td>Pipeta gruszkowa 25 ml</td><td>Duran Group GmbH(Moguncja, Niemcy)</td><td>24 338 14</td><td>Przygotowanie roztworu liganda</td></tr><tr><td>Kolba miarowa Duran glas 25 ml</td><td>Duran Group GmbH(Moguncja, Niemcy)</td><td>24 671 1457</td><td>Przygotowanie roztworu podstawowego liganda</td></tr><tr><td>Kolba miarowa Duran glas 10 ml</td><td>Duran Group GmbH (Moguncja, Niemcy)</td><td>24 671 1054</td><td>Przygotowanie roztworu podstawowego liganda</td></tr><tr><td>Proteome Lab SDS MW Gel Buffer</td><td>Beckman Coulter (Brea, USA)</td><td>komercyjnie już niedostępny</td><td>Separacja podczas elektroforezy kapilarnej w żelu / Alternatywny bufor SDS: Bufor CE-SDS firmy Bio-Rad Laboratories (M&uuml; nchen, Niemcy) Numer katalogowy: 1485032&nbsp;</td></tr><tr><td>Acetanilide</td><td>Sigma-Aldrich (Steinheim, Niemcy)</td><td>397229-5G</td><td>Elektroosmotyczny marker przepływu</td></tr><tr><td>Chlorek manganu(II)</td><td>Sigma-Aldrich (Steinheim, Niemcy)</td><td>13217</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich (Steinheim, Niemcy)</td><td>431788-100G</td><td>Składnik płuczący</td></tr><tr><td>Chlorek baru</td><td>Sigma-Aldrich (Steinheim, Niemcy)</td><td>202738-5G</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Sigma-Aldrich (Steinheim, Niemcy)</td><td>71729-100G</td><td>Białko rozpuszczalne do elektroforezy żelu kapilarnego</td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek niklu(II)</td><td>Sigma-Aldrich (Steinheim, Niemcy)</td><td>654507-5G</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>Chlorek selenu(IV)</td><td>Sigma-Aldrich (Steinheim, Niemcy)</td><td>323527-10G</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>2- amino-2-hydroksy-metylopropano-1.3-diol (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich (Steinheim, Niemcy)</td><td>252859-100G</td><td>Składnik buforowy</td></tr><tr><td>Chlorek(II)</td><td>Merck Millipore ( Darmstadt, Niemcy) 1088160250</td><td></td> <td>Ligand</td></tr><tr><td>Azotan strontu</td><td>Merck Millipore ( Darmstadt, Niemcy)</td> <td>1078720250</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Merck Millipore ( Darmstadt, Niemcy)</td><td>1371015000</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>37% kwas solny</td><td>Merck Millipore ( Darmstadt, Niemcy)</td><td>1003171000</td><td>Regulacja pH</td></tr><tr><td>Chlorek miedzi(II) dwuwodny</td><td>Riedel-de Ha&euml; n (Seelze, Niemcy)</td><td>31286</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L</td><td>Allpax (Papenburg, Niemcy)</td><td>10000084; 0</td><td>Kąpiel ultradźwiękowa</td></tr><tr><td>Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1</td><td>Agilent Technologies (Waldbronn, Niemcy)</td><td>G2070-91126</td><td>Pakiety oprogramowania do obsługi przyrządów CE, pozyskiwania danych i ich oceny</td></tr></tbody></table>

analiza wewnętrznego zaburzenia athird11 i wiązania się z jonami metali za pomocą kapilarnej elektroforezy żelowej i powinowactwa do elektroforezy kapilarnej

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Rośliny są silnie zależne od swojego środowiska. Aby dostosować się do stresujących zmian (np. suszy i wysokiego zasolenia), rośliny wyższe rozwijają klasy wewnętrznie nieuporządkowanych białek (IDP) w celu zmniejszenia stresu oksydacyjnego i osmotycznego. W artykule wykorzystano kombinację kapilarnej elektroforezy żelowej (CGE) i elektroforezy powinowactwa do zmiany ruchliwości (ACE) w celu opisania zachowania wiązania różnych konformerów IDP AtHIRD11 z Arabidopsis thaliana. CGE służy do potwierdzenia czystości AtHIRD11 i wykluczenia fragmentów, modyfikacji potranslacyjnych i innych zanieczyszczeń jako przyczyn złożonych wzorców pików. W tej części eksperymentu różne składniki próbki są rozdzielane lepkim żelem wewnątrz kapilary według ich różnych mas i wykrywane za pomocą detektora diodowego. Następnie za pomocą ACE bada się wiązanie próbki z różnymi jonami metali. W takim przypadku ligand jest dodawany do roztworu buforowego i mierzone jest przesunięcie czasu migracji w celu określenia, czy wystąpiło zdarzenie wiązania, czy nie. Jedną z zalet stosowania kombinacji CGE i ACE do określania zachowania wiązania IDP jest możliwość zautomatyzowania elektroforezy żelowej i testu wiązania. Co więcej, CGE wykazuje niższą granicę wykrywalności niż klasyczna elektroforeza żelowa, a ACE jest w stanie szybko określić sposób wiązania liganda. Ponadto ACE może być również stosowany do innych naładowanych gatunków niż jony metali. Jednak zastosowanie tej metody do eksperymentów z wiązaniem jest ograniczone pod względem możliwości określenia liczby miejsc wiązania. Niemniej jednak połączenie CGE i ACE można dostosować do scharakteryzowania zachowania wiązania dowolnej próbki białka w stosunku do wielu naładowanych ligandów.

Rysunek 1 przedstawia elektroferogram dla próbki AtHIRD11 uzyskany podczas eksperymentów CGE. Wielkość peptydów wzrasta od lewej do prawej strony. Pik numer 4 ma największą masę i wskazuje na nienaruszone białko. Mniejsze piki 2 i 3 reprezentują mniejsze zanieczyszczenia (np. produkty degradacji). Pierwszy pik oraz niestabilność linii bazowej przed nim mogły zostać odtworzone również bez próbki białka. W związku z tym są one związane z samym żelem SD...

Ten protokół łączy charakterystykę próbki białka za pomocą elektroforezy żelu kapilarnego oraz szybkie wiązanie przesiewu dla naładowanych ligandów za pomocą elektroforezy kapilarnej o powinowactwie. Jest zalecany w przypadku białek o elastycznej strukturze, takich jak białka wewnętrznie nieuporządkowane, w celu określenia wszelkich różnic w wiązaniu dla różnych konformerów.

Analiza wewnętrznego zaburzenia AtHIRD11 i wiązania się z jonami metali za pomocą kapilarnej elektroforezy żelowej i powinowactwa do elektroforezy kapilarnej

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące tektoniki białek zaburzeń wewnętrznych, takich jak zmiany konformacyjne spowodowane wiązaniem metalu i żelaza. Główną zaletą tej techniki jest to, że wymaga bardzo mało sprzętu, a efekty można uzyskać bardzo szybko. Procedurę zademonstruje Matthias Stein, doktorant z mojego laboratorium.Na początek użyj noża do szkła na szklanej płycie, aby wyciąć gołą kapilarnę z topionej krzemionki z zewnętrzną powłoką poliamidową i wewnętrzną średnicą 50 mikronów na długości 33 i 30 centymetrów. Użyj pisaka, aby zaznaczyć środek okna detekcji o szerokości jednego centymetra w odległości 24,5 centymetra od jednego końca kapilary w eksperymencie CGE i w odległości 21,5 centymetra od jednego końca kapilary w eksperymencie ACE. Za pomocą lampy lutowniczej wypal zewnętrzną powłokę poliamidową 0,5 centymetra przed i po każdym znaku.Podobnie użyj lampy lutowniczej, aby usunąć jeden centymetr powłoki z obu końców naczyń włosowatych. Następnie użyj etanolu i miękkiej chusteczki do oczyszczenia końców naczyń włosowatych i okienek detekcyjnych. Zamontuj kapilarnę w systemie CE z okienkiem detekcji w pobliżu wylotu.Po przygotowaniu roztworów, zgodnie z protokołem tekstowym, użyj 250 mikromolowego roztworu chlorku wapnia do napełnienia 10-mililitrowej strzykawki. Następnie podłącz filtr PVDF o grubości 0,2 mikrona do strzykawki i przepchnij 2 mililitry roztworu przez filtr, aby go wyrzucić. Użyć pozostałego chlorku wapnia w strzykawce, aby napełnić 10 fiolek do maksymalnej dozwolonej objętości.Oznaczyć każdą fiolkę jako fiolkę wlotową z 250 mikromolowym roztworem chlorku wapnia. Następnie, używając roztworu chlorku wapnia, napełnij 10 fiolek do połowy. Oznaczyć każdą z nich jako fiolkę wylotową z 250 mikromolowym roztworem chlorku wapnia.Następnie, innymi roztworami zawierającymi sól metali, napełnij fiolki w podobny sposób. Ponadto, dla każdej pary fiolek wlotowych i wylotowych, należy użyć 30 mikromolowych Tris w celu przygotowania podobnego zestawu fiolek wlotowych i wylotowych. Markerem EOF acetanilidu o stężeniu 60 mikromolowym napełnij 10 fiolek.Następnie użyj jednego miligrama na mililitr roztworu próbki, aby napełnić jedną fiolkę. Po przygotowaniu analizy, zgodnie z protokołem tekstowym, należy przeprowadzić separację, hydrodynamicznie wstrzykując roztwór próbki do eksperymentów CGE i stosując 0,1 bara przez cztery minuty na wlocie. Następnie zastosuj ujemne 16,5 kilowolta i ciśnienie 2,0 bara na obu końcach kapilary przez 25 minut.Po przygotowaniu metody do pomiarów bez ligandów, należy przygotować metodę do pomiarów z użyciem ligandów, najpierw używając 0,1 molowego roztworu EDTA do płukania kapilary pod ciśnieniem 2,5 bara przez 1 minutę. Następnie użyj wody dejonizowanej do przepłukania kapilary. Następnie wyrównaj kapilatę za pomocą roztworu liganda, aby przepłukać ją pod ciśnieniem 2,5 bara przez 1,5 minuty.Następnie wstrzykiwać roztwór acetanilidu pod ciśnieniem 0,05 bara przez 6 sekund i zmienić fiolki wlotowe i wylotowe na fiolki zawierające ligand. Stosować 0,05 bara przez 2,4 sekundy, aby wepchnąć roztwór acetanilidu głębiej od końcówki kapilary. Zastosuj 10,0 kilowoltów przez 6 minut i wykryj pik acetanilidu na długości fali 200 nanometrów.Po przepłukaniu kapilary wodą dejonizowaną EDTA i roztworem liganda, tak jak poprzednio, wstrzyknąć próbkę białka i zmienić fiolki wlotowe i wylotowe na świeże fiolki zawierające ligand z buforem. Na przemian powtarzaj wykonywanie pomiarów z ligandami i bez. Następnie powtórz metodę, używając roztworów ligandów ziem alkalicznych.Na koniec skorzystaj z poniższych rozwiązań, aby przeprowadzić tę samą metodę. Następnie oblicz zmianę proporcji wielkości ładunku dla różnych oddziaływań jonów metali białkowych. Poniżej przedstawiono elektroferogram próbki AtHIRD11 uzyskanej podczas eksperymentów CGE.Rozmiar peptydu zwiększa się od lewej do prawej. Pik numer cztery ma największą masę i wskazuje na nienaruszone białko. Mniejsze szczyty, dwa i trzy, reprezentują mniejsze zanieczyszczenia.Rysunek ten przedstawia elektroferogram acetanilidu podczas eksperymentów ACE. Roztwór acetanilidu wykazuje tylko jeden wysoki pik, ponieważ nie powinien zawierać żadnych zanieczyszczeń. Czas detekcji maksimum piku wskazuje czas migracji przepływu elektroosmotycznego i jest używany do obliczania oddziaływania.Ten elektroferogram próbki AtHIRD11 podczas eksperymentu ACE został wykonany przy braku SDS i jonów metali. Oprócz dwóch zanieczyszczeń z elektroferogramu CGE, obecnych jest co najmniej pięć pików, które są związane z samym białkiem. Graficzna ocena zmierzonych przesunięć czasowych migracji w obecności różnych jonów metali dla piku szóstego jest pokazana tutaj.Jest reprezentowany przez obliczoną wartość Delta R przez RF. Każdy wynik wskazuje, jak silne było przesunięcie przez jego wartość i jego znak, na co wskazuje ogólna zmiana ładunku kompleksów jonów białek metalowych. Po opanowaniu techniki można ją wykonać dla jednego partnera interakcji w ciągu ośmiu godzin, wliczając w to interakcję CGE, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zmianie roztworów białkowych w przypadku długotrwałych pomiarów, ponieważ produkty degradacji mogą z czasem wzrastać, oraz o zmianie roztworów Tris Buffer w celu uzyskania bardziej precyzyjnych wyników.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ciąć i czyścić naczynia włosowate, a także skonfigurować metodę elektroforezy kapilarnej z powinowactwem, aby ocenić zachowanie wiązania wewnętrznych nieuporządkowanych białek.

analysis-athird11-intrinsic-disorder-binding-towards-metal-ions

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film opisuje metodę analizy interakcji białko-ligand za pomocą elektroforezy kapilarnej z przesunięciem ruchliwości. Metoda ta może być stosowana do charakteryzowania zachowania wiązania białka z różnymi naładowanymi ligandami.

Elektroforeza kapilarna z przesunięciem ruchliwości i powinowactwa: metoda analizy interakcji próbka-ligand w zależności od zróżnicowanej migracji kompleksów białko-ligand

Chromatografia wykluczania wielkości z łącznikiem plazmy sprzężonej indukcyjnie - spektrometria mas (ICP-MS) to potężne narzędzie do pomiaru zmian w obfitości metaloprotein bezpośrednio z próbek biologicznych. W tym miejscu opisujemy zestaw wzorców metaloprotein używanych do szacowania masy cząsteczkowej i ilości metalu związanego z nieznanymi białkami.

Standardy ilościowej analizy metaloproteomicznej z wykorzystaniem wykluczenia wielkości ICP-MS

Przedstawiamy strategiczny plan i protokół identyfikacji niekodujących wariantów genetycznych wpływających na wiązanie DNA czynnika transkrypcyjnego (TF). Przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny dla testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu powinowactwa DNA (DAPA) analizy wiązania TF DNA zależnego od genotypu.

Badania przesiewowe w kierunku funkcjonalnych niekodujących wariantów genetycznych przy użyciu testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu precypitacji powinowactwa DNA (DAPA)

Tutaj prezentujemy protokół oczyszczania metodą chromatografii z immobilizowanym metalem metodą powinowactwa do metalu, a następnie odtworzenia oznaczonej polihistydyną, niehemowej dioksygenazy wiążącej żelazo, odpowiedniej dla laboratorium nauczania na studiach licencjackich.

Laboratoryjna chromatografia powinowactwa do immobilizowanych metali, rekonstytucja i oznaczanie metaloenzymu znakowanego polihistydyną dla laboratorium licencjackiego

Mobilność jonów-spektrometria mas i techniki modelowania molekularnego mogą scharakteryzować selektywną wydajność chelatacji metali zaprojektowanych peptydów wiążących metale oraz peptydu wiążącego miedź metanobaktyny. Opracowanie nowych klas peptydów chelatujących metale pomoże w opracowaniu metod leczenia chorób związanych z nierównowagą jonów metali.

Techniki spektrometrii ruchliwości jonów i mas do określania struktury i mechanizmów rozpoznawania jonów metali i aktywności redoks oligopeptydów wiążących metale

Prezentujemy test do łatwej kwantyfikacji metali wprowadzonych do próbek przygotowanych za pomocą chromatografii powinowactwa do metali unieruchomionych. Metoda wykorzystuje błękit hydroksynaftolowy jako kolorymetryczny wskaźnik metalu i spektrofotometr UV-Vis jako detektor.

Kwantyfikacja wymywania metali w chromatografii powinowactwa do unieruchomionych metali

Prezentowany tutaj jest protokół metody wymiany wodoru i deuteru (HDX) opartej na elektroforezie kapilarnej w połączeniu ze spektrometrią mas z góry na dół. Podejście to charakteryzuje różnicę w strukturach wyższego rzędu między różnymi gatunkami białek, w tym białkami w różnych stanach i różnymi proteoformami, poprzez prowadzenie jednoczesnej różnicowej separacji HDX i elektroforetycznej.

Wymiana wodorowo-deuterowa oparta na elektroforezie kapilarnej do konformacyjnej charakterystyki białek za pomocą spektrometrii mas z góry na dół

Ten artykuł skupia się na wykorzystaniu elektronicznej spektroskopii absorpcyjnej i izotermicznej kalorymetrii miareczkowej do badania i ilościowego określania termodynamiki wiązania Cu(II) z peptydami i białkami.

Kwantyfikacja oddziaływań wiążących między Cu(II) a resztą peptydowymi w obecności i bez chromoforów

Ten artykuł opisuje eksperymentalny protokół wykorzystujący elektrorozpylanie, ruchliwość jonów, spektrometrię mas, półempiryczne obliczenia kwantowe i dysocjację wywołaną zderzeniem progu o rozdzielczości energetycznej do pomiaru względnej termochemii dysocjacji powiązanych kompleksów metali trójskładnikowych.

Badania termochemiczne trójskładnikowych kompleksów Ni(II) i Zn(II) z wykorzystaniem spektrometrii ruchliwości jonów i mas

Ten artykuł przedstawia procedurę oczyszczania powinowactwa ludzkiego białka rekombinowanego, endonukleazy płatowej 1 (FEN1), które zostało oznaczone znacznikiem 6X-histydyny. Protokół polega na wykorzystaniu dwóch odrębnych unieruchomionych kolumn jonów metalu do oczyszczania znakowanego białka.

Oczyszczanie powinowactwa białka oznaczonego 6X-His-His-Tagged przy użyciu systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek

Poznaj analizę białek wewnętrznie nieuporządkowanych za pomocą kapilarnej elektroforezy żelowej i powinowactwa do elektroforezy kapilarnej. Ta metoda pozwala szybko badać zmiany konformacyjne przy wiązaniu jonów metali.

Analiza wewnętrznego zaburzenia AtHIRD11 i wiązania się z jonami metali za pomocą kapilarnej elektroforezy żelowej i powinowactwa do elektroforezy kapilarnej (Wideo) | JoVE Journal

Analiza wewnętrznego zaburzenia AtHIRD11 i wiązania się z jonami metali za pomocą kapilarnej elektroforezy żelowej i powinowactwa do elektroforezy kapilarnej

Przeglądaj więcej filmów