Analiza wewnętrznego zaburzenia AtHIRD11 i wiązania się z jonami metali za pomocą kapilarnej elektroforezy żelowej i powinowactwa do elektroforezy kapilarnej

Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące tektoniki białek zaburzeń wewnętrznych, takich jak zmiany konformacyjne spowodowane wiązaniem metalu i żelaza. Główną zaletą tej techniki jest to, że wymaga bardzo mało sprzętu, a efekty można uzyskać bardzo szybko. Procedurę zademonstruje Matthias Stein, doktorant z mojego laboratorium.

Na początek użyj noża do szkła na szklanej płycie, aby wyciąć gołą kapilarnę z topionej krzemionki z zewnętrzną powłoką poliamidową i wewnętrzną średnicą 50 mikronów na długości 33 i 30 centymetrów. Użyj pisaka, aby zaznaczyć środek okna detekcji o szerokości jednego centymetra w odległości 24,5 centymetra od jednego końca kapilary w eksperymencie CGE i w odległości 21,5 centymetra od jednego końca kapilary w eksperymencie ACE. Za pomocą lampy lutowniczej wypal zewnętrzną powłokę poliamidową 0,5 centymetra przed i po każdym znaku.

Podobnie użyj lampy lutowniczej, aby usunąć jeden centymetr powłoki z obu końców naczyń włosowatych. Następnie użyj etanolu i miękkiej chusteczki do oczyszczenia końców naczyń włosowatych i okienek detekcyjnych. Zamontuj kapilarnę w systemie CE z okienkiem detekcji w pobliżu wylotu.

Po przygotowaniu roztworów, zgodnie z protokołem tekstowym, użyj 250 mikromolowego roztworu chlorku wapnia do napełnienia 10-mililitrowej strzykawki. Następnie podłącz filtr PVDF o grubości 0,2 mikrona do strzykawki i przepchnij 2 mililitry roztworu przez filtr, aby go wyrzucić. Użyć pozostałego chlorku wapnia w strzykawce, aby napełnić 10 fiolek do maksymalnej dozwolonej objętości.

Oznaczyć każdą fiolkę jako fiolkę wlotową z 250 mikromolowym roztworem chlorku wapnia. Następnie, używając roztworu chlorku wapnia, napełnij 10 fiolek do połowy. Oznaczyć każdą z nich jako fiolkę wylotową z 250 mikromolowym roztworem chlorku wapnia.

Następnie, innymi roztworami zawierającymi sól metali, napełnij fiolki w podobny sposób. Ponadto, dla każdej pary fiolek wlotowych i wylotowych, należy użyć 30 mikromolowych Tris w celu przygotowania podobnego zestawu fiolek wlotowych i wylotowych. Markerem EOF acetanilidu o stężeniu 60 mikromolowym napełnij 10 fiolek.

Następnie użyj jednego miligrama na mililitr roztworu próbki, aby napełnić jedną fiolkę. Po przygotowaniu analizy, zgodnie z protokołem tekstowym, należy przeprowadzić separację, hydrodynamicznie wstrzykując roztwór próbki do eksperymentów CGE i stosując 0,1 bara przez cztery minuty na wlocie. Następnie zastosuj ujemne 16,5 kilowolta i ciśnienie 2,0 bara na obu końcach kapilary przez 25 minut.

Po przygotowaniu metody do pomiarów bez ligandów, należy przygotować metodę do pomiarów z użyciem ligandów, najpierw używając 0,1 molowego roztworu EDTA do płukania kapilary pod ciśnieniem 2,5 bara przez 1 minutę. Następnie użyj wody dejonizowanej do przepłukania kapilary. Następnie wyrównaj kapilatę za pomocą roztworu liganda, aby przepłukać ją pod ciśnieniem 2,5 bara przez 1,5 minuty.

Następnie wstrzykiwać roztwór acetanilidu pod ciśnieniem 0,05 bara przez 6 sekund i zmienić fiolki wlotowe i wylotowe na fiolki zawierające ligand. Stosować 0,05 bara przez 2,4 sekundy, aby wepchnąć roztwór acetanilidu głębiej od końcówki kapilary. Zastosuj 10,0 kilowoltów przez 6 minut i wykryj pik acetanilidu na długości fali 200 nanometrów.

Po przepłukaniu kapilary wodą dejonizowaną EDTA i roztworem liganda, tak jak poprzednio, wstrzyknąć próbkę białka i zmienić fiolki wlotowe i wylotowe na świeże fiolki zawierające ligand z buforem. Na przemian powtarzaj wykonywanie pomiarów z ligandami i bez. Następnie powtórz metodę, używając roztworów ligandów ziem alkalicznych.

Na koniec skorzystaj z poniższych rozwiązań, aby przeprowadzić tę samą metodę. Następnie oblicz zmianę proporcji wielkości ładunku dla różnych oddziaływań jonów metali białkowych. Poniżej przedstawiono elektroferogram próbki AtHIRD11 uzyskanej podczas eksperymentów CGE.

Rozmiar peptydu zwiększa się od lewej do prawej. Pik numer cztery ma największą masę i wskazuje na nienaruszone białko. Mniejsze szczyty, dwa i trzy, reprezentują mniejsze zanieczyszczenia.

Rysunek ten przedstawia elektroferogram acetanilidu podczas eksperymentów ACE. Roztwór acetanilidu wykazuje tylko jeden wysoki pik, ponieważ nie powinien zawierać żadnych zanieczyszczeń. Czas detekcji maksimum piku wskazuje czas migracji przepływu elektroosmotycznego i jest używany do obliczania oddziaływania.

Ten elektroferogram próbki AtHIRD11 podczas eksperymentu ACE został wykonany przy braku SDS i jonów metali. Oprócz dwóch zanieczyszczeń z elektroferogramu CGE, obecnych jest co najmniej pięć pików, które są związane z samym białkiem. Graficzna ocena zmierzonych przesunięć czasowych migracji w obecności różnych jonów metali dla piku szóstego jest pokazana tutaj.

Jest reprezentowany przez obliczoną wartość Delta R przez RF. Każdy wynik wskazuje, jak silne było przesunięcie przez jego wartość i jego znak, na co wskazuje ogólna zmiana ładunku kompleksów jonów białek metalowych. Po opanowaniu techniki można ją wykonać dla jednego partnera interakcji w ciągu ośmiu godzin, wliczając w to interakcję CGE, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zmianie roztworów białkowych w przypadku długotrwałych pomiarów, ponieważ produkty degradacji mogą z czasem wzrastać, oraz o zmianie roztworów Tris Buffer w celu uzyskania bardziej precyzyjnych wyników.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ciąć i czyścić naczynia włosowate, a także skonfigurować metodę elektroforezy kapilarnej z powinowactwem, aby ocenić zachowanie wiązania wewnętrznych nieuporządkowanych białek.