Analiza chodu zależnych od wieku zaburzeń motorycznych u myszy z neurodegeneracją

W tym badaniu demonstrujemy wykorzystanie kinematycznej analizy chodu opartej na obrazowaniu w płaszczyźnie brzusznej do monitorowania subtelnych zmian w koordynacji ruchowej, jak również postępu neurodegeneracji wraz z wiekiem w modelach mysich (np. linie myszy z mutacją endofiliny).

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach nad starzeniem się i neurodegeneracją, takie jak początek i progresja zaburzeń chodu i motoryki wraz z wiekiem, a w szczególności w mysich modelach chorób neurodegeneracyjnych. Wynik takiego stanu można przełożyć na znacznie lepsze zrozumienie zaburzeń motorycznych u pacjentów z chorobami neurodegeneracyjnymi, na przykład chorobą Parkinsona czy ataksją. Główną zaletą korzystania z analizy chodu opartej na wideo jest to, że umożliwia ona badanie zarówno subtelnych, jak i poważnych zaburzeń motorycznych w mysich modelach neurodegeneracji.

Zacznij od określenia stanu zdrowia każdego zwierzęcia, dokładnie je badając i ważąc na wadze. Delikatnie nałóż czerwoną farbę palcami na łapy zwierzęcia za pomocą pędzla. Umieść zwierzę w zapasowej, czystej klatce, aż farba wyschnie.

Następnie ustaw prędkość bieżni w prawym górnym panelu urządzenia. Następnie umieść zwierzę w komorze testowej i przykryj je ciemną szmatką, aby każde zwierzę mogło się przystosować przez jedną do dwóch minut. Włącz światło w komorze testowej, przekręcając przełącznik obrotowy światła bieżni do pozycji włączonej.

Uchyl nieco pokrywę, aby móc obserwować zwierzę podczas wykonywania zadania. Uruchom bieżnię na około pół sekundy, aby ostrzec zwierzę, że zadanie ma się rozpocząć. Przekręć przełącznik obrotowy bieżni do przodu, aby uruchomić bieżnię.

Następnie kliknij przycisk Nagraj w oprogramowaniu imagera. Gdy zwierzę biegnie w stabilny sposób, nagrywaj przez co najmniej pięć sekund przed zatrzymaniem bieżni. Zatrzymaj nagrywanie, klikając Stop w oprogramowaniu imagera i przekręć przełącznik obrotowy bieżni z powrotem do pozycji wyłączonej.

Następnie kliknij przycisk Edytuj w oprogramowaniu imagera, aby otworzyć menu, w którym można ustawić punkt początkowy i końcowy sekcji wideo. Poruszaj się po filmie za pomocą suwaka u dołu ekranu. Aby wybrać bieżący punkt czasu jako punkt początkowy lub końcowy, kliknij odpowiednio Od numeru klatki i Do.

Upewnij się, że sekcja zawiera co najmniej siedem kroków na łapę lub łącznie czternaście kroków, w których zwierzę biegnie stabilnie ze stałą prędkością. Na koniec wprowadź dane identyfikacyjne zwierzęcia, datę urodzenia, wagę i płeć. Zapisz dane w wybranej lokalizacji na komputerze lub serwerze.

Zasada analizy chodu opartej na wideo polega na pomiarze powierzchni stykającej się z powierzchnią w czasie dla każdej pojedynczej łapy. Z nagranych filmów można wyodrębnić wiele parametrów dynamiki chodu i postawy, na przykład czas wymachu, czas i szerokość postawy, długość kroku i częstotliwość. Inne cechy chodu, takie jak współczynnik ataksji lub zmienność kąta kroku, można następnie obliczyć na podstawie pomiarów podstawowych.

Rozpocznij analizę wideo, uruchamiając oprogramowanie do analizy i klikając Wybierz folder badania, aby wybrać folder z nagranymi filmami. Wybierz jeden film i kliknij przycisk Przejdź.Użyj funkcji ponownego rysowania, aby wybrać obszar, w którym działa mysz. Uwaga, ta sekcja powinna zawierać tylko mysz i białe tło.

Następnie wprowadź wartości w polach długości i szerokości, aby zmienić maskę, która wyklucza czerwony obszar wokół pyska zwierzęcia do analizy. Dostosuj suwaki, filtruj szumy i filtruj futro i ciemne plamy, aby zoptymalizować czarno-biały odcisk łapy. Ustaw suwak szumu filtru na 800 do 950 dla zwierząt czarnych i na 700 do 800 dla zwierząt brązowych lub białych, w zależności od dokładnego koloru futra zwierzęcia, a następnie wybierz opcję W porządku.

Następnie wybierz film, który przeszedł pierwszą korektę i wybierz funkcję Go, aby rozpocząć analizę wideo. Następnie wybierz analizowane wideo i kliknij przycisk Go.Zauważ, że obszar odcisku łapy stykający się z paskiem w czasie dla każdej oddzielnej łapy może być teraz widoczny. Aby porównać oryginalny film i obliczony odcisk łapy dla wybranego obszaru, wybierz funkcję Odtwórz wideo.

Aby poprawić drobne błędy, użyj opcji Popraw, Połącz lub Usuń. Użyj opcji Popraw, aby usunąć nieprawidłowy sygnał. Kliknij raz, aby powiększyć odpowiedni obszar i zaznacz lewą krawędź obiektu do usunięcia drugim kliknięciem, a prawą krawędź trzecim kliknięciem.

Użyj opcji Połącz, aby połączyć dwa sygnały. Kliknij raz, aby powiększyć odpowiedni obszar i kliknij dwukrotnie w środku dwóch obiektów, które chcesz połączyć. Użyj opcji Usuń, aby całkowicie usunąć punkty czasowe z analizy.

Kliknij raz, aby powiększyć odpowiedni obszar i zaznacz lewą granicę obszaru do usunięcia drugim kliknięciem, a prawą krawędź trzecim kliknięciem. Następnie wybierz Następna kończyna, aby przejść przez cztery kończyny. Uwaga, po kliknięciu Next Limb po ostatniej łapie, oprogramowanie kończy analizę i wyświetla wyniki dla zwierzęcia na czterech ekranach.

Na koniec, po przeanalizowaniu wszystkich filmów z jednego eksperymentu, zaznacz wszystkie filmy i kliknij Zmień wyniki, aby wyeksportować wyniki. W wyeksportowanym pliku obliczanych i wymienianych jest około 50 parametrów chodu. Posortuj wynik według grupy, wieku i prędkości biegu i analizuj wszystkie te warunki niezależnie.

W analizie chodu u myszy typu dzikiego z zaawansowanym wiekiem wyniki wykazały, że postawa ze znormalizowaną szerokością zwierzęcia nie zmienia się wraz z wiekiem. Jednak podwójne podparcie kończyn tylnych i obciążenie kończyn wzrasta wraz z wiekiem u zwierząt typu dzikiego. Co więcej, podczas gdy wszystkie badane zwierzęta mogą biegać z prędkością 30 metrów na sekundę w ciągu jednego miesiąca, mutanty endofiliny rozwijają deficyty biegowe wraz z wiekiem.

Dodatkowo rytm chodu jest upośledzony u mutantów endofilinowych. Na przykład czas napędzania mutantów endofiliny skraca się wraz z wiekiem myszy. Próbując wykonać procedurę, należy pamiętać, że najważniejszym krokiem jest nagranie oryginalnego filmu.

Cała dalsza analiza zależy od dobrej jakości filmów. Analiza chodu jest przydatną metodą kategoryzacji chodu i zachowań motorycznych w mysich modelach neurodegeneracji. Jednak niektóre aspekty zachowań motorycznych, na przykład siła mięśni, nie są odpowiednio oceniane tą metodą.

Ale dlatego polecenie uzupełnia analizę chodu opartą na wideo z baterią innych testów zachowań motorycznych, takich jak siła chwytu i chodzenie na belce. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać analizę chodu w modelach mysich, u których wraz z wiekiem rozwija się upośledzenie motoryczne.