Tworzenie biofilmu w jamie ustnej na różnych materiałach do implantów dentystycznych

Tutaj prezentujemy protokół oceny tworzenia biofilmu w jamie ustnej na materiałach tytanowych i cyrkonowych dla łączników protez dentystycznych, w tym analizę żywotności komórek bakteryjnych i cech morfologicznych. Do analizy biofilmu w jamie ustnej wykorzystuje się model in situ związany z potężnymi technikami mikroskopowymi.

Tworzenie biofilmu w jamie ustnej na różnych materiałach do implantów dentystycznych. Biofilmy bakteryjne to złożone, funkcjonalnie i strukturalnie zorganizowane zbiorowiska drobnoustrojów, charakteryzujące się różnorodnością gatunków drobnoustrojów, które syntetyzują zewnątrzkomórkową, biologicznie aktywną matrycę polimerową. Implanty zębowe i ich elementy protetyczne są podatne na kolonizację bakteryjną i tworzenie się biofilmu.

Stosowanie materiałów o składzie chemicznym i topografii powierzchni, które zapewniają niską adhezję mikrobiologiczną, może zmniejszyć częstość występowania i postęp chorób okołoimplantacyjnych. Ze względu na ogólną złożoność środowiska i niejednorodność biofilmu w jamie ustnej potrzebne są techniki mikroskopowe, które umożliwią analizę strukturalną biofilmu z powierzchni zębów i materiałów dentystycznych. W artykule opisano szereg protokołów stosowanych w celu porównania tworzenia biofilmu w jamie ustnej na różnych materiałach do implantów dentystycznych.

Etapy związane z wykorzystaniem tworzenia biofilmu w tym badaniu były następujące:Zapisz łuk szczęki za pomocą wycisku alginianowego. Wycisk alginianowy należy zalać kamieniem typu IV, aby wykonać model łuku szczękowego. Wykonaj klipsy mocujące z drutu mikrochromowanego i umieść je na modelu.

Manipuluj samoutwardzalną żywicą akrylową zgodnie z instrukcjami producenta i wciśnij żywicę akrylową między dwie szklane płytki podczas fazy plastycznej, aby uzyskać arkusz o grubości trzech milimetrów. Połóż arkusz akrylowy na obszarze podniebiennym modelu, zgodnie z konstrukcją urządzenia, a przed polimeryzacją odetnij nadmiar żywicy akrylowej. Wytwarzaj krążki woskowe za pomocą matrycy o średnicy 10 milimetrów i grubości dwóch milimetrów.

Zanurz cztery krążki woskowe w żywicy akrylowej, dwa z nich między zębami przedtrzonowymi, a pozostałe dwa obok drugich zębów trzonowych. Pozwól żywicy akrylowej spolimeryzować w zbiorniku ciśnieniowym pod 20 funtami sprężonego powietrza przez 20 minut. Wykończ urządzenie wewnątrzustne za pomocą rękojeści elektrycznej oraz punktów frezowania i polerowania.

Wypolerować powierzchnie próbki papierami ściernymi chłodzonymi wodą o zmniejszającej się ścieralności. Czyścić próbki płynnym detergentem i kąpielą ultradźwiękową z kranem oraz alkoholem izopropylowym przez 15 minut. Następnie osusz chłonnymi ręcznikami papierowymi.

Przymocuj próbki w urządzeniu wewnątrzustnym za pomocą nietoksycznego kleju topliwego. Zainstaluj urządzenie zawierające próbki w jamie ustnej. Wkładkę wewnątrzustną zawierającą próbki należy nosić przez 48 godzin.

Przygotuj roztwór do barwienia, dodając trzy mikrolitry SYTO 9 i trzy mikrolitry jodku propydyny do jednego mililitra sterylnej wody destylowanej. Przenieść próbki na płytkę 24-dołkową i dokładnie przemyć PBS w celu usunięcia nieprzylegających komórek. Dodać odpowiednią objętość roztworu barwnika fluorescencyjnego, aby pokryć próbkę zawierającą biofilm.

Dodaj barwnik bardzo ostrożnie, aby nie zdezorganizować biofilmu. Inkubować próbkę przez 20 do 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Delikatnie umyj próbkę biofilmu sterylną wodą destylowaną, aby usunąć nadmiar barwnika.

Umieść próbkę w naczyniu ze szklanym dnem w celu analizy biofilmu za pomocą wielofotonowej laserowej mikroskopii skaningowej. Rozmiar uzyskanych obrazów wynosił 5,16 x 5,16 mm, co odpowiada 26,64 milimetrom kwadratowym całkowitej powierzchni każdego okazu lub 33,94% całkowitej powierzchni. Obrazy zostały przeanalizowane za pomocą oprogramowania Fidżi.

Każda komórka została wybrana za pomocą narzędzia do zaznaczania, a intensywność fluorescencji mierzono za pomocą zintegrowanej gęstości pikseli, odejmując tło obrazu. Wybrać trzy próbki z każdego badanego materiału i ocenić skład chemiczny w dwóch różnych obszarach każdej próbki, używając skaningowego mikroskopu elektronowego sprzężonego ze spektrometrem energii dyspersyjnej. Utrwalić biofilm, zanurzając próbki w 2,5% aldehydu glutarowego rozcieńczonego w 0,1 M buforze kakodylanu sodu na 24 godziny.

Przemyć w buforze PBS. Po utrwaleniu z 1% tetratlenkiem osmu przez jedną godzinę. Przemyć w buforze PBS.

Próbki biofilmu należy ostrożnie odwodnić, zanurzając je w roztworach etanolu o rosnącym stężeniu. Przenieść próbki do suszarki w punkcie krytycznym i dokonać kilku podstawień dwutlenkiem węgla, aż próbki zostaną wysuszone. Wyjąć wysuszone próbki z aparatu i zamontować je na uchwytach skaningowego mikroskopu elektronowego.

Rozproszyć warstwę złota o grubości 20 nanometrów na powierzchniach próbki przez 120 sekund. Gęstość kolonizacji biofilmu po 48 godzinach wzrostu in situ była reprezentowana w tym badaniu przez proporcję skolonizowanego obszaru do krążków tytanu i tlenku cyrkonu w stosunku do całkowitej zeskanowanej powierzchni próbki przy użyciu mikroskopii wielofotonowej. Rysunek przedstawia bakterie przylegające do powierzchni badanych materiałów.

Na powierzchniach odlewanych i obrabianych maszynowo tarcz tytanowych zaobserwowano większą gęstość biofilmu niż w krążkach cyrkonowych. Ten rysunek przedstawia żywe i martwe bakterie przyklejone do powierzchni próbek. W tym protokole barwiony kwasem nukleinowym jodek propidyny przenika tylko do bakterii z uszkodzoną błoną, a zatem emituje czerwony sygnał fluorescencyjny, który jest związany z martwymi komórkami.

SYTO 9 przenika do komórek bakteryjnych z nienaruszoną lub naruszoną błoną i emituje zielony sygnał fluorescencyjny od żywych mikroorganizmów. Żywotność bakterii komórkowych była podobna między badanymi materiałami z przewagą żywych mikroorganizmów we wszystkich grupach. Pęknięcia, rowki lub wady ścierne powstałe podczas procesu polerowania i/lub obróbki skrawaniem były obecne na powierzchni różnych analizowanych materiałów.

W krążkach cyrkonu zaobserwowano duże obszary przy braku mikroorganizmów i obecności małych polimorficznych agregatów mikrobiologicznych składających się głównie z ziarniaków i pałeczek oraz bakterii nitkowatych. Obecność ziarniaków i pałeczek była rozsiana na powierzchniach obrobionych maszynowo krążków tytanowych. Odlane próbki tytanu prezentowały kolonie mikroorganizmów zaangażowanych w matrycę, których powierzchnia wyglądała jak biofilm.

Na powierzchni krążków cyrkonowych zaobserwowano mniej materiału matrycy w porównaniu z tarczami tytanowymi obrabianymi maszynowo i odlewanymi z tytanu. Analiza EDS wykazała, że w krążkach cyrkonu znajduje się 70,83% tlenku cyrkonu. W odlewanych tarczach tytanowych 95,16% tytanu, a w tarczach tytanowych obrabianych maszynowo 89,86% tytanu.

Protokół opisany w tym badaniu zapewnił zadowalające zachowanie 48-godzinnego biofilmu, wykazując tym samym adekwatność metodologiczną. Zastosowanie źródła fluoru i przetwarzanie obrazów za pomocą mikroskopii wielofotonowej pozwoliło na analizę integralności bakteryjnej w bardzo niejednorodnej populacji mikroorganizmów z reprezentatywnego obszaru tego preparatu przy minimalnym uszkodzeniu komórek. Przygotowanie próbek biologicznych do mikroskopii elektronowej sprzyjało zachowaniu strukturalnemu biofilmu, co zaowocowało obrazem o dobrej rozdzielczości i bez artefaktów.

Pozwoliło to na wizualizację i charakterystykę morfologiczną przylegających mikroorganizmów.