Name: Tworzenie biofilmu w jamie ustnej na różnych materiałach do implantów dentystycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Poznaj metodę oceny tworzenia biofilmu jamy ustnej na tytanie i cyrkonii w implantologii dentystycznej. Protokół wykorzystuje zaawansowaną mikroskopię do analizy żywotności i morfologii bakterii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują José Augusto Maulin z Microscopy Multiuser Laboratory (School of Medicine of Ribeirão Preto) za hojną pomoc przy analizach EDS i SEM oraz Hermano Teixeira Machado za hojną pomoc techniczną w edycji wideo.

To badanie zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board of the School of Dentistry of Ribeirão Preto, a uczestnik ochotnik podpisał pisemną zgodę (Proces 2011.1.371.583).
1. Tworzenie biofilmu in situ
<ol>
	<li>Selekcja uczestników
	<ol>
		<li>Wybieraj pacjentów na podstawie następujących kryteriów włączenia: zdrowa osoba z pełnym uzębieniem i bez klinicznych objawów chorób jamy ustnej.</li>
		<li>Wyklucz pacjentów na podstawie następujących kryteriów wykluczenia: ciąża, laktacja, próchnica, choroba przyzębia lub antybiotykoterapia w ciągu ostatnich 3 miesięcy, palanie tytoniu lub jakakolwiek choroba ogólnoustrojowa, która może mieć wpływ na stan przyzębia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie aparatu wewnątrzustnego
	<ol>
		<li>Zarejestrować łuk szczęki za pomocą wycisku alginianowego.</li>
		<li>Przygotuj kamień typu IV, dodając 19 ml wody do 100 g proszku kamiennego. Wlej kamień do formy alginianowej, aby wykonać model łuku szczęki.</li>
		<li>Zaprojektuj i wyprodukuj akrylowe urządzenie wewnątrzustne do podtrzymywania próbek testowych (krążki tytanowe i ceramiczne).
		<ol>
			<li>Za pomocą szczypiec ortodontycznych #139 wykonaj zapięcia retencyjne z drutu NiCr (o średnicy 0,7 mm) i umieść je na modelu. Aby ustawić zacisk między górnymi zębami przedtrzonowymi, zegnij jeden koniec każdego drutu tak, aby tworzyły pętlę.
			<ol>
				<li>Dostosuj pętlę w okolicy brodawki międzyzębowej. W zgryzie należy wprowadzić delikatną krzywiznę, aby nie kolidować z punktami styku i z okluzją. Wykonaj zagięcie pod kątem 90° na końcu zacisku, aby utrzymać go w akrylu.</li>
				<li>Aby dopasować zacisk do górnego drugiego zęba trzonowego, dostosuj krzywiznę drutu w trzeciej części szyjnej (przedsionkowej) do konturu zęba (dystalnej) i wykonaj fałd pod kątem 90° na końcu zacisku w celu utrzymania w akrylu. 
				UWAGA: W celu zapewnienia odpowiedniej retencji/stabilności wyrobiska wewnątrzustnego, klamry retencyjne umieszczono między górnymi zębami przedtrzonowymi a dystalną stroną drugiego zęba trzonowego po obu stronach łuku zębowego.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Manipuluj samoutwardzalną żywicą akrylową zgodnie z instrukcjami producenta i wciśnij żywicę akrylową między 2 szklane płytki (z umieszczoną przekładką o grubości 3 mm) podczas fazy plastycznej, aby uzyskać arkusz o grubości 3 mm.</li>
			<li>Połóż arkusz akrylowy na obszarze podniebiennym modelu, zgodnie z projektem urządzenia, a nadmiar żywicy akrylowej odetnij rzeźbiarką przed polimeryzacją.</li>
			<li>Wytwarzać krążki woskowe za pomocą metalowej matrycy [o średnicy 10 mm, grubości 2 mm (powierzchnia 78,5 mm2)], umieszczając stopiony wosk w matrycy i czekając, aż wosk zastygnie. Ręcznie zanurz 4 krążki woskowe w żywicy akrylowej, 2 z nich między zębami przedtrzonowymi, a pozostałe 2 obok drugich zębów trzonowych.</li>
			<li>Pozwól żywicy akrylowej polimeryzować w zbiorniku ciśnieniowym pod ciśnieniem sprężonego powietrza 20 psi przez 20 minut.</li>
			<li>Wykończ urządzenie wewnątrzustne elektryczną rękojeścią i nożem do laboratorium dentystycznego, a następnie wypoleruj je gumą ścierną.</li>
			<li>Wyreguluj urządzenie, aby zapewnić prawidłowe dopasowanie do ust, korzystając z opisanego powyżej sprzętu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbek tytanu i tlenku cyrkonu 
	Uwaga: Próbki (n = 14) mają średnicę 10 mm i grubość 2 mm oraz powierzchnię 78,5 mm2.
	<ol>
		<li>Powierzchnie próbek należy wypolerować papierami ściernymi chłodzonymi wodą o malejącej ścieralności (ziarnistość 600, 1200 i 2000) przez około 20 minut 
		UWAGA: Polerowanie próbek zostało przeprowadzone w celu ujednolicenia chropowatości powierzchni na poziomie 0,2 μm.</li>
		<li>Oczyść i zdezynfekuj próbki i urządzenie wewnątrzustne płynnym detergentem i wodą z kranu, a następnie użyj kąpieli ultradźwiękowej z alkoholem izopropylowym przez 15 minut. Osusz je chłonnymi ręcznikami papierowymi.</li>
		<li>Utrwal próbki w wewnątrzustnym urządzeniu doustnym za pomocą około 0,1 ml nietoksycznego kleju topliwego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
		<li>Zainstaluj urządzenie zawierające próbki w jamie ustnej. 
		UWAGA: Wkładkę wewnątrzustną zawierającą próbki należy nosić przez 48 godzin. Urządzenie zostało usunięte i przechowywane w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS), podczas gdy pacjent jadł i czyścił jamę ustną.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ocena żywotności bakterii
Uwaga: Wielkość próby n = 10.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór barwiący, dodając 3 μl SYTO9 (zielony fluorescencyjny barwnik kwasu nukleinowego) i 3 μl jodku propidyny (czerwony fluorescencyjny barwnik kwasu nukleinowego) do 1 ml sterylnej wody destylowanej. 
	UWAGA: Przygotować roztwory chronione przed światłem.</li>
	<li>Przenieś próbki na płytkę 24-dołkową i dokładnie umyj je PBS w celu usunięcia wszelkich nieprzylegających komórek.</li>
	<li>Dodać odpowiednią objętość (1 ml) roztworu barwnika fluorescencyjnego, aby pokryć próbkę zawierającą biofilm. Dodaj barwnik bardzo ostrożnie, aby nie zdezorganizować biofilmu.</li>
	<li>Inkubować próbkę przez 20 - 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Delikatnie umyj próbkę biofilmu sterylną wodą destylowaną, aby usunąć nadmiar barwnika.</li>
	<li>Umieść próbkę w naczyniu ze szklanym dnem i wykonaj wielofotonową laserową mikroskopię skaningową w celu analizy biofilmu. 
	UWAGA: Analizę żywotności komórek bakteryjnych przeprowadzono przy użyciu systemu mikroskopii wielofotonowej. Fluorescencję jodku propydyny wykryto za pomocą filtra o długości fali wzbudzenia/emisji 546/680 nm i 477/600 nm dla SYTO9. Wielkość uzyskanych obrazów wynosiła 5,16188 x 5,16188 mm, co odpowiada 26,64mm2 całkowitej powierzchni każdego egzemplarza (78,5 mm2) lub 33,94% całkowitej powierzchni. Obrazy zostały wykonane z najbardziej centralnej części próbki, o rozdzielczości 1024 x 1024 pikseli. Obrazy kanału czerwonego i zielonego zostały przeanalizowane oddzielnie za pomocą oprogramowania Fidżi31. Każda komórka została wybrana za pomocą narzędzia do zaznaczania, a intensywność fluorescencji mierzono za pomocą zintegrowanej gęstości pikseli, odejmując tło obrazu.</li>
</ol>
3. Analiza składu chemicznego próbek za pomocą spektroskopii dyspersyjnej energii (EDS)
Uwaga: Wielkość próby n = 3.
<ol>
	<li>Wybierz 3 próbki każdego materiału testowego wolnego od biofilmu i oceń skład chemiczny w 2 różnych obszarach każdej próbki za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego sprzężonego ze spektrometrem energii dyspersyjnej, o napięciu wiązki elektronów 10 kV32.</li>
</ol>
4. Analiza morfologiczna biofilmu bakteryjnego za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej
Uwaga: Wielkość próby n = 1.
<ol>
	<li>Utrwalić biofilm, zanurzając próbki w 2,5% aldehydzie glutarowym rozcieńczonym w 0,1 M buforze kakodylanu sodu o pH 7,0 - 7,3 na 24 godziny.</li>
	<li>Przemyć próbkę w buforze PBS (pH = 7,6).</li>
	<li>Utrwalaj biofilm 1% tetratlenkiem osmu przez 1 godzinę.</li>
	<li>Przemyć próbkę w buforze PBS (pH = 7,6).</li>
	<li>Próbki biofilmu należy ostrożnie odwodnić, zanurzając je w roztworach etanolu o rosnących stężeniach (50%, 70%, 90%, 95% i 100%). 
	UWAGA: Wykonaj 3 wymiany etanolu w stężeniu 100%. Etap całkowitego odwodnienia trwa około 2 godzin.</li>
	<li>Przenieść próbki do suszarki w punkcie krytycznym i dokonać kilku podstawień dwutlenkiem węgla (CO2 ), aż próbki wyschną.</li>
	<li>Wyjąć wysuszone próbki z aparatu i zamontować je na uchwytach skaningowego mikroskopu elektronowego.</li>
	<li>Napylaj warstwę złota o grubości 20 nm na powierzchnię próbki przez 120 s.</li>
	<li>Włóż pokryte złotem krążki do komory skaningowego mikroskopu elektronowego. Uzyskaj obrazy z 5 różnych obszarów każdej próbki, pod napięciem 20 - 30 kV pod zmiennym ciśnieniem i przy 650-krotnym powiększeniu12.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół opisany w tym badaniu został opracowany w celu oceny tworzenia biofilmu na materiałach tytanowych i cyrkonowych do łączników protetycznych, w tym analizy żywotności komórek bakteryjnych i cech morfologicznych. W tym celu zaprojektowano model tworzenia biofilmu in situ , składający się z urządzenia wewnątrzustnego zdolnego do przechowywania próbek badanych materiałów i utrzymywania ich w pozycji ekspozycji na dynamiczne środowisko jamy ustnej przez 48 godzin. Urządzenie zostało uznane przez ochotnika za ...

Biofilmy bakteryjne to złożone, funkcjonalnie i strukturalnie zorganizowane społeczności mikroorganizmów, charakteryzujące się różnorodnością gatunków drobnoustrojów, które syntetyzują pozakomórkową, biologicznie aktywną matrycę polimerową1,2. Adhezja bakterii do powierzchni biotycznych lub abiotycznych jest poprzedzona tworzeniem się nabytej błonki, składającej się głównie z glikoprotein ślinowych1,3,4. Początkowo ustala się słabe oddziaływania fizykochemiczne między mikroorganizmami a błonką, a następnie następują silniejsze interakcje między adhezynami bakteryjnymi a receptorami glikoproteinowymi nabytej błonki. Różnorodność mikrobiologiczna stopniowo wzrasta poprzez koagregację wtórnych kolonizatorów do receptorów już przyłączonych bakterii, tworząc wielogatunkową społeczność1,3,4,5.
Homeostaza mikrobioty jamy ustnej i jej symbiotyczny związek z gospodarzem jest ważna dla utrzymania zdrowia jamy ustnej. Dysbioza w obrębie biofilmów jamy ustnej może zwiększać ryzyko rozwoju próchnicy i chorób przyzębia2,5. Badania kliniczne wykazują związek przyczynowo-skutkowy między gromadzeniem się biofilmu na zębach lub implantach dentystycznych a rozwojem zapalenia dziąseł lub zapalenia błony śluzowej wokół implantu6,7. Postęp procesu zapalnego prowadzi do peri-implantitis i w konsekwencji do utraty implantu8.
Implanty dentystyczne i ich elementy protetyczne są podatne na kolonizację bakteryjną i tworzenie się biofilmu9. Stosowanie materiałów o składzie chemicznym i topografii powierzchni zapewniającej niską adhezję mikrobiologiczną może zmniejszyć częstość występowania i postęp chorób okołoimplantowych9,10. Tytan jest najczęściej używanym materiałem do produkcji łączników protetycznych do implantów; Jednak materiały ceramiczne zostały wprowadzone niedawno i zyskują popularność jako alternatywa dla tytanu ze względu na ich właściwości estetyczne i biokompatybilność11,12. Co również ważne, materiały ceramiczne zostały powiązane z rzekomo zmniejszonym potencjałem przylegania mikroorganizmów, głównie ze względu na ich chropowatość powierzchni, zwilżalność i energię swobodną powierzchni10,13.
Badania in vitro przyczyniły się do znacznego postępu w zrozumieniu adhezji mikrobiologicznej do powierzchni zaczepów protetycznych9,14,15,16,17. Jednak dynamiczne środowisko jamy ustnej, charakteryzujące się zmienną temperaturą i pH oraz dostępnością składników odżywczych, a także obecnością sił ścinających, nie jest odtwarzalne w protokołach eksperymentalnych in vitro18,19. Aby przezwyciężyć ten problem, alternatywą jest zastosowanie modeli tworzenia biofilmu in situ, które korzystnie zachowują jego trójwymiarową strukturę do analizy ex vivo10,20,21,22,23,24.
Analiza złożonej struktury biofilmu utworzonego na podłożach doustnych wymaga użycia technik mikroskopowych zdolnych do wyświetlenia optycznie gęstej materii25. Wielofotonowa laserowa mikroskopia skaningowa to nowoczesna opcja do analizy strukturalnej biofilmu26. Charakteryzuje się zastosowaniem optyki nieliniowej ze źródłem oświetlenia zbliżonym do długości fali podczerwonej, pulsowanym do femtosekund27. Metoda ta jest wskazana do pozyskiwania obrazów materiałów autofluorescencyjnych lub materiałów oznaczonych fluoroforami, oprócz obrazów generowanych przez nieliniowe sygnały optyczne pochodzące ze zjawiska znanego jako generacja drugiej harmonicznej. Jedną z zalet mikroskopii wielofotonowej jest duża głębia obrazu uzyskana przy minimalnym uszkodzeniu komórek spowodowanym intensywnością światła wzbudzenia27.
Do analizy żywotności biofilmu na powierzchniach abiotycznych za pomocą mikroskopii wielofotonowej wymagane jest użycie fluorescencyjnych barwników kwasów nukleinowych o różnych charakterystyce widmowej i zdolności penetracji w komórkach bakteryjnych28. Fluorofory SYTO9 (zielono-fluorescencyjne) i jodek propidyny (czerwono-fluorescencyjne) mogą być używane do wizualnego rozróżniania żywych i martwych bakterii28,29,30. Jodek propidyny wnika tylko do bakterii z uszkodzonymi błonami, podczas gdy SYTO9 wnika do komórek bakteryjnych z nienaruszoną i naruszoną błoną. Gdy oba barwniki są obecne wewnątrz komórki, jodek propidyny ma większe powinowactwo do kwasów nukleinowych i wypiera SYTO9, oznaczając go na czerwono28,30.
Ze względu na złożoność środowiska jamy ustnej i niejednorodność biofilmu jamy ustnej, potrzebne są techniki mikroskopowe, które umożliwią analizę biofilmu powierzchni zębów i materiałów dentystycznych. W artykule opisano szereg protokołów stosowanych do porównywania tworzenia biofilmu w jamie ustnej na materiałach tytanowych i ceramicznych do łączników protetycznych, a także metody stosowane w analizie biofilmów w jamie ustnej na poziomie morfologicznym i komórkowym.

<table><tbody><tr><td>Hydrogum 5</td> Drut NiCr <td>Zhermack Dental</td><td>C302070</td><td></td></tr><tr><td>Durone IV</td><td>Dentsply</td><td>17130500002</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Morelli</td><td>55.01.070</td><td></td></tr><tr><td>JET akryl do automatycznej polimeryzacji</td><td>Cl&aacute; ssico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wosk dentystyczny&nbsp;</td><td>Cl&aacute; ssico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik ciśnieniowy&nbsp;</td><td>Papiery ścierne Essencedental</td><td></td><td></td></tr> o <tr><td>ziarnistości 600</td><td>Papiery ścierne NORTON</td><td>T216</td><td></td></tr> o <tr><td>ziarnistości 1200</td><td>Papiery ścierne NORTON</td><td>T401</td><td></td></tr> o <tr><td>ziarnistości 2000</td><td>NORTON</td><td>T402</td><td></td></tr><tr><td>Metalograficzna maszyna polerska</td><td>Arotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>Klej topliwy</td><td>TECSIL</td><td>PAH M20017</td><td></td></tr><tr><td>Filmtracer LIVE/DEAD Zestaw do żywotności biofilmu</td><td>Invitrogen</td><td>L10316</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet, 10 i mikro; L</td><td>KASVI</td><td>K8-10&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet, 1 000 i mikro; L</td><td>KASVI</td><td>K8-1000B&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa&nbsp;</td><td>KASVI</td><td>K12-024</td><td></td></tr><tr><td>Szklana półmiska</td><td>Thermo Scientific</td><td>150680</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony AxioObserver&nbsp;</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon vision ii laser</td><td>Koherentny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>obiektyw EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Olej DIC</td><td>ZEISS</td><td>440452-9903-000</td><td></td></tr><tr><td>Czujniki SDD - X-Max 20mm&sup2;</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór aldehydu glutarowego</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Bufor kakodylanu sodu&nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>97068&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tetratlenek osmu</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>201030</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S9638</td><td>Służy do wytwarzania soli fizjologicznej buforowanej fosforanami</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9791&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>MERK</td><td>1.06404</td><td></td></tr><tr><td>Kcl</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9333&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol do analizy EMSURE</td><td>MERK</td><td>1.00983</td><td></td></tr><tr><td>CPD 030 Suszarka punktu krytycznego</td><td>BAL-TEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JSM-6610 Skaningowy mikroskop elektronowy</td><td>serii JEOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCD 050 Napylarka</td><td>BAL-TEC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tworzenie biofilmu w jamie ustnej na różnych materiałach do implantów dentystycznych

Oral Biofilm Formation on Different Materials for Dental Implants

Implanty dentystyczne i ich elementy protetyczne są podatne na kolonizację bakteryjną i tworzenie biofilmu. Stosowanie materiałów, które zapewniają niską adhezję mikrobiologiczną, może zmniejszyć częstość występowania i postęp chorób okołoimplantacyjnych. Ze względu na złożoność środowiska jamy ustnej i niejednorodność biofilmu jamy ustnej potrzebne są techniki mikroskopowe, które mogą umożliwić analizę biofilmu powierzchni zębów i materiałów dentystycznych. W artykule opisano szereg protokołów stosowanych do porównywania tworzenia biofilmu w jamie ustnej na materiałach tytanowych i ceramicznych do łączników protetycznych, a także metody stosowane w analizie biofilmów w jamie ustnej na poziomie morfologicznym i komórkowym. Model in situ do oceny tworzenia biofilmu w jamie ustnej na materiałach tytanowych i cyrkonowych do łączników protez dentystycznych, jak opisano w tym badaniu, zapewnia zadowalające zachowanie biofilmu 48 godzin, wykazując tym samym adekwatność metodologiczną. Mikroskopia wielofotonowa pozwala na analizę obszaru reprezentatywnego dla biofilmu powstałego na badanych materiałach. Ponadto zastosowanie fluoroforów i przetwarzanie obrazów za pomocą mikroskopii wielofotonowej pozwala na analizę żywotności bakterii w bardzo niejednorodnej populacji mikroorganizmów. Przygotowanie próbek biologicznych do mikroskopii elektronowej sprzyja strukturalnemu zachowaniu biofilmu, obrazów o dobrej rozdzielczości i braku artefaktów.

Gęstość kolonizacji biofilmu po 48 h wzrostu in situ została w niniejszym badaniu przedstawiona jako proporcja obszaru skolonizowanego na dyskach tytanowych i cyrkonowych w stosunku do całkowitej powierzchni skanowania próbki przy użyciu mikroskopii wielofotonowej (26,64 mm2). Rysunek 2 przedstawia gęstość kolonizacji bakteryjnej na powierzchni trzech badanych materiałów. Wyższą gęstość biofilmu zaobserwowano na powierzchniach odlewanych i...

Tutaj prezentujemy protokół oceny tworzenia biofilmu w jamie ustnej na materiałach tytanowych i cyrkonowych dla łączników protez dentystycznych, w tym analizę żywotności komórek bakteryjnych i cech morfologicznych. Do analizy biofilmu w jamie ustnej wykorzystuje się model in situ związany z potężnymi technikami mikroskopowymi.

Tworzenie biofilmu w jamie ustnej na różnych materiałach do implantów dentystycznych

Dental implants and their prosthetic components are prone to bacterial colonization and biofilm formation. The use of materials that provides low ...

Tworzenie biofilmu w jamie ustnej na różnych materiałach do implantów dentystycznych. Biofilmy bakteryjne to złożone, funkcjonalnie i strukturalnie zorganizowane zbiorowiska drobnoustrojów, charakteryzujące się różnorodnością gatunków drobnoustrojów, które syntetyzują zewnątrzkomórkową, biologicznie aktywną matrycę polimerową. Implanty zębowe i ich elementy protetyczne są podatne na kolonizację bakteryjną i tworzenie się biofilmu.Stosowanie materiałów o składzie chemicznym i topografii powierzchni, które zapewniają niską adhezję mikrobiologiczną, może zmniejszyć częstość występowania i postęp chorób okołoimplantacyjnych. Ze względu na ogólną złożoność środowiska i niejednorodność biofilmu w jamie ustnej potrzebne są techniki mikroskopowe, które umożliwią analizę strukturalną biofilmu z powierzchni zębów i materiałów dentystycznych. W artykule opisano szereg protokołów stosowanych w celu porównania tworzenia biofilmu w jamie ustnej na różnych materiałach do implantów dentystycznych.Etapy związane z wykorzystaniem tworzenia biofilmu w tym badaniu były następujące:Zapisz łuk szczęki za pomocą wycisku alginianowego. Wycisk alginianowy należy zalać kamieniem typu IV, aby wykonać model łuku szczękowego. Wykonaj klipsy mocujące z drutu mikrochromowanego i umieść je na modelu.Manipuluj samoutwardzalną żywicą akrylową zgodnie z instrukcjami producenta i wciśnij żywicę akrylową między dwie szklane płytki podczas fazy plastycznej, aby uzyskać arkusz o grubości trzech milimetrów. Połóż arkusz akrylowy na obszarze podniebiennym modelu, zgodnie z konstrukcją urządzenia, a przed polimeryzacją odetnij nadmiar żywicy akrylowej. Wytwarzaj krążki woskowe za pomocą matrycy o średnicy 10 milimetrów i grubości dwóch milimetrów.Zanurz cztery krążki woskowe w żywicy akrylowej, dwa z nich między zębami przedtrzonowymi, a pozostałe dwa obok drugich zębów trzonowych. Pozwól żywicy akrylowej spolimeryzować w zbiorniku ciśnieniowym pod 20 funtami sprężonego powietrza przez 20 minut. Wykończ urządzenie wewnątrzustne za pomocą rękojeści elektrycznej oraz punktów frezowania i polerowania.Wypolerować powierzchnie próbki papierami ściernymi chłodzonymi wodą o zmniejszającej się ścieralności. Czyścić próbki płynnym detergentem i kąpielą ultradźwiękową z kranem oraz alkoholem izopropylowym przez 15 minut. Następnie osusz chłonnymi ręcznikami papierowymi.Przymocuj próbki w urządzeniu wewnątrzustnym za pomocą nietoksycznego kleju topliwego. Zainstaluj urządzenie zawierające próbki w jamie ustnej. Wkładkę wewnątrzustną zawierającą próbki należy nosić przez 48 godzin.Przygotuj roztwór do barwienia, dodając trzy mikrolitry SYTO 9 i trzy mikrolitry jodku propydyny do jednego mililitra sterylnej wody destylowanej. Przenieść próbki na płytkę 24-dołkową i dokładnie przemyć PBS w celu usunięcia nieprzylegających komórek. Dodać odpowiednią objętość roztworu barwnika fluorescencyjnego, aby pokryć próbkę zawierającą biofilm.Dodaj barwnik bardzo ostrożnie, aby nie zdezorganizować biofilmu. Inkubować próbkę przez 20 do 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Delikatnie umyj próbkę biofilmu sterylną wodą destylowaną, aby usunąć nadmiar barwnika.Umieść próbkę w naczyniu ze szklanym dnem w celu analizy biofilmu za pomocą wielofotonowej laserowej mikroskopii skaningowej. Rozmiar uzyskanych obrazów wynosił 5,16 x 5,16 mm, co odpowiada 26,64 milimetrom kwadratowym całkowitej powierzchni każdego okazu lub 33,94% całkowitej powierzchni. Obrazy zostały przeanalizowane za pomocą oprogramowania Fidżi.Każda komórka została wybrana za pomocą narzędzia do zaznaczania, a intensywność fluorescencji mierzono za pomocą zintegrowanej gęstości pikseli, odejmując tło obrazu. Wybrać trzy próbki z każdego badanego materiału i ocenić skład chemiczny w dwóch różnych obszarach każdej próbki, używając skaningowego mikroskopu elektronowego sprzężonego ze spektrometrem energii dyspersyjnej. Utrwalić biofilm, zanurzając próbki w 2,5% aldehydu glutarowego rozcieńczonego w 0,1 M buforze kakodylanu sodu na 24 godziny.Przemyć w buforze PBS. Po utrwaleniu z 1% tetratlenkiem osmu przez jedną godzinę. Przemyć w buforze PBS.Próbki biofilmu należy ostrożnie odwodnić, zanurzając je w roztworach etanolu o rosnącym stężeniu. Przenieść próbki do suszarki w punkcie krytycznym i dokonać kilku podstawień dwutlenkiem węgla, aż próbki zostaną wysuszone. Wyjąć wysuszone próbki z aparatu i zamontować je na uchwytach skaningowego mikroskopu elektronowego.Rozproszyć warstwę złota o grubości 20 nanometrów na powierzchniach próbki przez 120 sekund. Gęstość kolonizacji biofilmu po 48 godzinach wzrostu in situ była reprezentowana w tym badaniu przez proporcję skolonizowanego obszaru do krążków tytanu i tlenku cyrkonu w stosunku do całkowitej zeskanowanej powierzchni próbki przy użyciu mikroskopii wielofotonowej. Rysunek przedstawia bakterie przylegające do powierzchni badanych materiałów.Na powierzchniach odlewanych i obrabianych maszynowo tarcz tytanowych zaobserwowano większą gęstość biofilmu niż w krążkach cyrkonowych. Ten rysunek przedstawia żywe i martwe bakterie przyklejone do powierzchni próbek. W tym protokole barwiony kwasem nukleinowym jodek propidyny przenika tylko do bakterii z uszkodzoną błoną, a zatem emituje czerwony sygnał fluorescencyjny, który jest związany z martwymi komórkami.SYTO 9 przenika do komórek bakteryjnych z nienaruszoną lub naruszoną błoną i emituje zielony sygnał fluorescencyjny od żywych mikroorganizmów. Żywotność bakterii komórkowych była podobna między badanymi materiałami z przewagą żywych mikroorganizmów we wszystkich grupach. Pęknięcia, rowki lub wady ścierne powstałe podczas procesu polerowania i/lub obróbki skrawaniem były obecne na powierzchni różnych analizowanych materiałów.W krążkach cyrkonu zaobserwowano duże obszary przy braku mikroorganizmów i obecności małych polimorficznych agregatów mikrobiologicznych składających się głównie z ziarniaków i pałeczek oraz bakterii nitkowatych. Obecność ziarniaków i pałeczek była rozsiana na powierzchniach obrobionych maszynowo krążków tytanowych. Odlane próbki tytanu prezentowały kolonie mikroorganizmów zaangażowanych w matrycę, których powierzchnia wyglądała jak biofilm.Na powierzchni krążków cyrkonowych zaobserwowano mniej materiału matrycy w porównaniu z tarczami tytanowymi obrabianymi maszynowo i odlewanymi z tytanu. Analiza EDS wykazała, że w krążkach cyrkonu znajduje się 70,83% tlenku cyrkonu. W odlewanych tarczach tytanowych 95,16% tytanu, a w tarczach tytanowych obrabianych maszynowo 89,86% tytanu.Protokół opisany w tym badaniu zapewnił zadowalające zachowanie 48-godzinnego biofilmu, wykazując tym samym adekwatność metodologiczną. Zastosowanie źródła fluoru i przetwarzanie obrazów za pomocą mikroskopii wielofotonowej pozwoliło na analizę integralności bakteryjnej w bardzo niejednorodnej populacji mikroorganizmów z reprezentatywnego obszaru tego preparatu przy minimalnym uszkodzeniu komórek. Przygotowanie próbek biologicznych do mikroskopii elektronowej sprzyjało zachowaniu strukturalnemu biofilmu, co zaowocowało obrazem o dobrej rozdzielczości i bez artefaktów.Pozwoliło to na wizualizację i charakterystykę morfologiczną przylegających mikroorganizmów.

oral-biofilm-formation-on-different-materials-for-dental-implants

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Biofilmy tworzące się na powierzchniach zębów są wysoce złożone i narażone na stałe wrodzone oraz egzogenne wyzwania środowiskowe, które modulują ich architekturę, fizjologię oraz transkryptom. Opracowaliśmy zestaw narzędzi do badania składu, organizacji strukturalnej i ekspresji genów w biofilmach jamy ustnej, które można zaadaptować do innych obszarów badań nad biofilmami.

Analityczny zestaw narzędzi do kompleksowej oceny biochemicznej, strukturalnej i transkrypcyjnej biofilmów jamy ustnej indukowanych przez paciorkowce z grupy mutans

Przedstawiamy protokół analizy strukturalnej i składu naturalnego biofilmu jamy ustnej pobranego z aparatów ortodontycznych z wykorzystaniem hybrydyzacji in situ fluorescencyjnej (FISH) oraz konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej (CLSM). Próbki biofilmu jamy ustnej pobrano z aparatów do rozszerzania podniebienia, zeskrobując z ich powierzchni płatki żywicy akrylowej i przekazując je do obróbki molekularnej.

Analiza biofilmu jamy ustnej w aparatach do rozszerzania podniebienia z wykorzystaniem hybrydyzacji in situ fluorescencyjnej i konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej

Źródło: Schlafer, S, i Frost Kristensen, M. Monitorowanie pH zewnątrzkomórkowego w biofilmach międzykrólestwowych za pomocą mikroskopii konfokalnej. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje hodowlę biofilmów Streptococcus mutans i Candida albicans w międzykrólestwowych warunkach w warunkach podobnych do jamy ustnej, aby modelować interakcje bakteria-grzyb, umożliwiając badanie synergii mikroorganizmów, adhezji pośredniczonej glukanem oraz kwasowej zjadliwości w patogenezie jamy ustnej.

Ustanowienie biofilmów międzykrólestwowych bakterii i grzybów do badania patogenezy jamy ustnej

Przedstawiono protokół jednoczesnej kwantyfikacji i porównania trzech składników komórkowych i zewnątrzkomórkowych w biofilmach. Metodologia obejmuje wykorzystanie konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej, oprogramowania do analizy strukturalnej i wizualizacji biofilmu oraz oprogramowania do analizy statystycznej.

Jednoczesna kwantyfikacja komórkowych i zewnątrzkomórkowych składników biofilmów

Celem tego artykułu jest opisanie użycia systemu mikroprzepływowego do tworzenia wielogatunkowych biofilmów, które zawierają gatunki typowo identyfikowane w ludzkiej naddziąsłowej płytce nazębnej. Podkreślono metody opisu architektury biofilmu, żywotności biofilmu oraz podejścia do zbierania biofilmu do analiz zależnych od kultury lub niezależnych od kultury.

Zastosowanie wysokowydajnego systemu mikroprzepływowego in vitro do tworzenia wielogatunkowych biofilmów w jamie ustnej

Zmiany w mikrobiomie jamy ustnej w dzieciństwie budzą coraz większe zainteresowanie. Porównanie różnych badań mikrobiomu ujawnia brak ustandaryzowanych protokołów pobierania próbek. Ograniczona przestrzeń sprawia, że pobieranie próbek dźwiękowych bruzd poddziąsłowych u dzieci jest wyzwaniem. Próbkowanie punktowe na papierze jest tutaj szczegółowo przedstawione jako metoda z wyboru dla tego obszaru.

Pobieranie biofilmu w jamie ustnej do analizy mikrobiomu u zdrowych dzieci

Produkty naturalne stanowią obiecujące punkty wyjścia dla rozwoju nowych leków i środków terapeutycznych. Jednak ze względu na dużą różnorodność chemiczną znalezienie nowych związków terapeutycznych z roślin jest trudnym i czasochłonnym zadaniem. Opisujemy uproszczone podejście do identyfikacji cząsteczek przeciwdrobnoustrojowych i antybiofilmu z ekstraktów i frakcji roślinnych.

Systematyczne podejście do identyfikacji nowych cząsteczek przeciwdrobnoustrojowych i przeciwbiofilmowych z ekstraktów i frakcji roślinnych w celu zapobiegania próchnicy zębów

Niniejszy protokół opisuje model eksperymentalny oparty na barwieniu tuszem, który może być wykorzystany do dekontaminacji powierzchni implantów in vitro i badań chropowatości, aby przyczynić się do podejmowania decyzji klinicznych.

Wpływ metod mechanicznych stosowanych w leczeniu peri-implantitis na dekontaminację i chropowatość powierzchni implantów

Niniejsze pilotażowe badanie in vitro miało na celu ocenę skuteczności czyszczenia trzech różnych narzędzi dekontaminacyjnych oraz możliwych zmian powierzchni po zabiegu, przy użyciu permanentnego czerwonego tuszu do naśladowania obecności biofilmu doustnego.

Pilotażowe badanie in vitro mające na celu ocenę zdolności czyszczenia oraz wpływu różnych metod dekontaminacji na powierzchnie implantów

Opisana metoda obejmuje izolację i charakterystykę ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba (hDPSCs) z wykorzystaniem dysocjacji enzymatycznej miazgi (DPSC-ED) lub bezpośredniego wypływu komórek macierzystych z eksplantów tkanki miazgi (DPSC-OG). Następnie przeprowadzono porównawczą różnicowanie obu typów hDPSCs w odontoblasty in vitro.

Izolacja, charakterystyka i różnicowanie porównawcze ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zębowej pochodzących z zębów trwałych z wykorzystaniem dwóch różnych metod

Poznaj metodę oceny tworzenia biofilmu jamy ustnej na tytanie i cyrkonii w implantologii dentystycznej. Protokół wykorzystuje zaawansowaną mikroskopię do analizy żywotności i morfologii bakterii.

Tworzenie biofilmu w jamie ustnej na różnych materiałach do implantów dentystycznych

Przeglądaj więcej filmów