Optymalizacja mikrodysekcji laserowej w celu izolacji zwojów jelitowych ze świeżo zamrożonej tkanki ludzkiej
June 14th, 2018
Celem tego protokołu jest uzyskanie próbek RNA o wysokiej integralności z zwojów jelitowych wyizolowanych z nieutrwalonej, świeżo wyciętej tkanki jelita ludzkiego za pomocą mikrodysekcji laserowej (LCM). Protokół ten obejmuje przygotowanie błyskawicznie zamrożonych próbek ludzkiej tkanki jelitowej, kriosekcję, barwienie i odwodnienie etanolowe, LCM i ekstrakcję RNA.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące jelitowego układu nerwowego, takie jak profil ekspresji zwojów jelitowych w jelitach dorosłych ludzi. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do uzyskania wysokiej wydajności RNA z ludzkich zwojów jelitowych przy maksymalnym zachowaniu jakości RNA. Zacznij od tkanki jelitowej pociętej na 20 centymetrów długości.
Najpierw odetnij tkankę tłuszczową i łączną. Unikaj nacinania błony surowiczej, co może prowadzić do strukturalnego uszkodzenia splotu mięśniowo-jelitowego. Następnie należy wykonać podłużne nacięcie na całej długości przyciętej próbki, najlepiej w miejscu przyczepu krezkowego.
Następnie wypreparuj i wyrzuć taeniae coli z okrężnicy, aby tkanka mogła się spłaszczyć. Teraz rozłóż jelito błoną śluzową do dołu na schłodzonej desce do krojenia. Następnie wytnij paski o szerokości 1,25 centymetra na całej długości tkanki.
Po ich pokrojeniu przenieś każdy kawałek do schłodzonego roztworu do przechowywania tkanek w celu tymczasowego przechowywania. Następnie pokrój każdy pasek na segmenty o długości od dwóch do 1,5 centymetra. Po pokrojeniu paska na segmenty osusz segmenty.
Ważne jest, aby tkanka była bardzo sucha, aby kryształki lodu nie tworzyły się na tkance po zamrożeniu. Teraz ułóż wysuszone kawałki tkanki, błoną śluzową do góry, na zimnej, jednorazowej plastikowej formie. Następnie spłaszcz każdy kawałek za pomocą zakrzywionych kleszczy, aby usunąć uwięzione pęcherzyki powietrza.
Tkanki będą się rozszerzać w miarę spłaszczania. Po spłaszczeniu segmentów tkanki oceń ich grubość przed zamrożeniem. W razie potrzeby wepchnij krawędzie próbki do środka, aż próbka jelitowa zbliży się do swojej pierwotnej grubości.
Teraz przenieś załadowaną formę bazową na zawiesinę suchego lodu i 2-metylobutanu. Tkanka powinna całkowicie zamarznąć w ciągu 30 do 60 sekund. Następnie natychmiast osusz spód formy za pomocą zimnych chusteczek, które były trzymane na suchym lodzie.
Teraz sprawdź próbkę. Zwróć uwagę na wszelkie próbki, które nie wyglądają na płaskie. Następnie zawiń formę w folię aluminiową, która została wstępnie oznaczona i schłodzona przed użyciem.
Następnie przykryj folię warstwą folii, aby zminimalizować odwodnienie. Próbki należy przechowywać na lodzie do czasu, gdy będzie można je przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po przygotowaniu wymaganych materiałów wlej od trzech do pięciu milimetrów kopca TFM na duży uchwyt próbki kriostatu i natychmiast przenieś próbkę jelitową, surowiczą stroną do góry, na TFM.
Po kilku sekundach w temperaturze pokojowej przenieś uchwyt próbki do suchego lodu i przykryj go sproszkowanym suchym lodem. Przed krojeniem upewnij się, że TFM znajduje się poniżej płaszczyzny splotu mięśniowo-jelitowego. Następnie zamontuj uchwyt próbki w głowicy próbki kriostatu i wyrównaj próbkę z ostrzem kriostatu.
Ustaw płaszczyznę splotu mięśniowo-jelitowego równolegle do ostrza tnącego. Teraz wykonaj osiem mikronowych odcinków przez surowiczość i mięsień podłużny, aż dotrze do splotu mięśniowo-jelitowego. Aby zlokalizować splot mięśniowo-jelitowy, zamontuj próbkę i zabarwij ją wodnym barwnikiem, takim jak 1% fiolet krystaliczny.
Aby kontynuować, zidentyfikuj połączenie między podłużnymi i okrężnymi warstwami mięśni. Na początku sekcji surowiczość będzie zaznaczona obecnością tkanki łącznej. Część pozostałego tłuszczu krezkowego może być również obecna wzdłuż błony surowiczej.
Następnie arkusz zewnętrznej podłużnej warstwy mięśniowej staje się widoczny Po osiągnięciu granicy między podłużnymi i okrężnymi warstwami mięśni zostanie zaobserwowana część zwojów jelitowych. W następnych kilku sekcjach splot mięśniowo-jelitowy stanie się bardzo widoczny z dużymi połaciami zwojów obecnych w jednym odcinku. Teraz zbierz sekcje szeregowe do mikrodysekcji przechwytywania laserowego.
Chill PEN wsuwa się w kriostat przez pięć do 10 sekund i użyj ich do zamontowania sekcji. Najlepsze sekcje będą miały dużo neuronów i gleju. Teraz przystąp do barwienia, a następnie odwadniania sekcji zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
W ramach przygotowań włóż wkład z nasadkami LCM do stolika mikroskopu LCM. Następnie załaduj przykładowy slajd na stół montażowy i uzyskaj obraz ogólny slajdu. Zidentyfikuj żądane miejsce dla LCM i załaduj nasadkę na szkiełko.
Następnie wyrównaj laser na podczerwień i dostosuj moc i czas trwania lasera dla miejsca przechwytywania o średnicy od 20 do 30 mikronów. Następnie nakreśl żądane zwoje jaj do zebrania. Upewnij się, że pozostajesz w granicach obszaru kolekcjonerskiego na czapce, która jest wyświetlana jako zielone kółko.
Dla każdego z zwojów wyznaczonych przez ślad cięcia UV wyreguluj plamki IR tak, aby co najmniej jeden punkt IR pojawiał się co 100 do 500 mikronów, aby upewnić się, że wszystkie zwoje zostaną zebrane, gdy nasadka zostanie zdjęta z próbki. Następnie naciśnij przycisk IR UV Cut, aby kontynuować zbieranie wszystkich zaznaczonych zwojów. Po zakończeniu odbioru przenieś nasadkę w nowe miejsce i powtórz proces zbierania.
Można to powtarzać przez 60 do 80 minut. Gdy nasadka LCM zostanie załadowana wystarczającą ilością zwojów, przenieś ją do stacji kontroli jakości. Jeśli na nasadce znajdują się zanieczyszczenia, zetrzyj je za pomocą pędzla z cienką końcówką, który został przygotowany do użycia RNA.
Użyj końcówki do pipety w przypadku wszelkich trudnych do usunięcia zanieczyszczeń. Następnie przymocuj nakrętkę do 0,5 mililitrowej probówki do mikrofuzy wypełnionej 230 mikrolitrami buforu do lizy RNA. Odwróć nakrętkę, krótko ją zawiruj, a następnie inkubuj próbkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
Później odwiruj próbkę przez pięć minut przy 5 000 g lub szybciej, a następnie przenieś probówkę do mikrofuge do suchego lodu. Próbka jest teraz gotowa do ekstrakcji RNA. Podczas wyciągania dwóch czapek zwojów jelitowych na próbkę uzyskano więcej niż jeden nanogram RNA, wystarczający do sekwencjonowania RNA, a RNA było doskonałej jakości.
Integralność RNA pokazanej próbki wynosi 8,3. Pobrano również próbki o wskaźnikach integralności 7,5 i 6,9. W sumie ponad 95% wszystkich przygotowanych próbek było wystarczająco dobrych do sekwencjonowania RNA.
Jakość zestawów danych RNA-Seq oceniono za pomocą potoku bioinformatycznego. Odchylenie końcowe wskazuje, że próbki zostały pomyślnie zsekwencjonowane i miały tylko skromne odchylenie trzech głównych końców. Wykres biotypu genu pokazuje, że wyniki sekwencjonowania były w dużej mierze spójne.
Po opanowaniu technika ta może być wykorzystana do zbierania biologicznych powtórzeń RNA ze zwojów jelitowych o wystarczającej jakości i ilości do sekwencjonowania RNA w ciągu zaledwie ośmiu do 12 godzin. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby próbki jelit ludzkich były zamrożone tak płasko, jak to możliwe. Zapewni to możliwość pobrania bardzo dużych przekrojów ludzkich zwojów jelitowych, które są szybko i łatwo przetwarzane za pomocą mikrodysekcji laserowej.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejsze badanie opisuje protokół ekstrakcji RNA o wysokiej integralności z gangliów przewodu pokarmowego izolowanych z świeżo wyciętego ludzkiego tkanki jelitowej za pomocą laserowej dysekcji z przechwytywaniem (LCM). Metoda ma na celu zbadanie profili ekspresji układu nerwowego przewodu pokarmowego w ludzkim jelitach, zwiększając nasze zrozumienie funkcji nerwowych w przewodzie pokarmowym.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia molekularna
- Gastroenterologia
Tło
- Układ nerwowy przewodu pokarmowego odgrywa krytyczną rolę w funkcjonowaniu przewodu pokarmowego.
- RNA wysokiej jakości jest niezbędne do badania profili ekspresji genów.
- Laserowa dysekcja z przechwytywaniem umożliwia precyzyjne izolację struktur komórkowych.
- Ta technika umożliwia szczegółowe analizy molekularne z nienaruszonych tkanek.
Cel badania
- Uzyskanie dużej wydajności RNA z ludzkich gangliów przewodu pokarmowego.
- Zachowanie jakości RNA przy minimalizowaniu uszkodzenia tkanki.
- Ocenienie profili ekspresji genów w ludzkim układzie nerwowym przewodu pokarmowego.
Stosowane metody
- Laserowa dysekcja z przechwytywaniem (LCM) gangliów przewodu pokarmowego z ludzkich próbek tkankowych.
- Świeżo wycięta tkanina jelitowa była przetwarzana w celu izolację gangliów.
- Krytycznymi krokami były kriosekcjowanie, barwienie i odwodnienie.
- Ekstrakcja RNA postępowała zgodnie z technikami LCM w celu osiągnięcia wysokiej integralności RNA.
Główne wyniki
- Protokół dał ponad 1 nanogram wysokiej jakości RNA do sekwencjonowania.
- Indeksy integralności RNA wskazywały na doskonałą jakość RNA nadającą się do RNA-Seq.
- Więcej niż 95% próbek było wystarczających do analiz sekwencjonowania.
Wnioski
- To badanie demonstruje skuteczną metodę izolacji RNA z ludzkich gangliów przewodu pokarmowego.
- Wyniki umożliwiają głębsze wgląd w mechanizmy molekularne układu nerwowego przewodu pokarmowego.
- Ta metoda ma zastosowanie w badaniach nad zaburzeniami przewodu pokarmowego i funkcjami nerwowymi.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Laser-capture microdissection (LCM) enables precise isolation of enteric ganglia from human intestinal tissue, providing high-integrity RNA for transcriptomic analysis. This approach supports target validation in gastrointestinal neuroscience by delivering disease-relevant molecular data from primary human tissue. The method reduces biological noise and enhances predictive confidence in early discovery workflows focused on enteric nervous system pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating pure populations of enteric ganglia for RNA-seq analysis.
- Operational Value: Preserves RNA integrity while minimizing contamination from surrounding tissue layers.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking through direct measurement of gene expression in disease-relevant human neural tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, high-quality RNA inputs suitable for reproducible transcriptomic assays.
- Operational Value: Uses PEN-membrane slides and ethanol-compatible dyes to improve capture efficiency and RNA yield.
- Scientific Value: Enables quantitative dependent variable measurements (e.g., RNA integrity number) for assay qualification.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant human tissue data that bridges discovery and preclinical validation.
- Operational Value: Yields sufficient RNA quantity (>1 ng per sample) for downstream sequencing applications.
- Scientific Value: Supports translational biomarker discovery by enabling profiling of enteric nervous system targets in human tissue.
Pipeline & Workflow Integration
The LCM workflow fits within the discovery biology phase, enabling hypothesis testing and pathway clarification prior to lead identification. It generates quantitative molecular readouts that inform go/no-go decisions in target selection. The method produces reusable, standardized tissue preparations that support enterprise-scale screening campaigns.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by isolating pure neuronal populations for molecular profiling.
- Screening: Delivers standardized, high-integrity RNA samples enabling reliable compound effect measurements.
- Analytics: Provides RNA integrity number (RIN) and yield metrics to assess sample quality before sequencing.
- Translational Research: Connects human tissue data to preclinical models through conserved gene expression patterns.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable protocol for isolating neural tissue across multiple tissue blocks and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in neural target validation.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized tissue preparation, staining, and LCM parameters.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid acquisition of human-validated molecular data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on human enteric nervous system expression profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, cryosectioning, and laser-capture microdissection.
- Dependent on cryostat, LCM system, and RNA-compatible staining reagents (e.g., Cresyl Violet).
- Necessitates standardized protocols for tissue flattening, freezing, and section orientation.
- Must account for tissue variability across donors and intestinal regions when scaling.
- Limited by RNA degradation risks if samples are not processed rapidly or kept sufficiently dry.
