Name: Optymalizacja mikrodysekcji laserowej w celu izolacji zwojów jelitowych ze świeżo zamrożonej tkanki ludzkiej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Poznaj mikrodysekcję laserową do izolacji zwojów jelitowych ze świeżo zamrożonej tkanki ludzkiej w celu uzyskania wysokiej jakości RNA. Ta metoda umożliwia badanie profili ekspresji genów w jelitowym układzie nerwowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni darczyńcom i ich rodzinom, dzięki którym ta praca była możliwa. Jesteśmy również wdzięczni za pomoc personelu Międzynarodowego Instytutu Medycyny i Tennessee Donor Services za pomoc w koordynacji pobierania tkanek wykorzystywanych w tym badaniu. Praca ta była wspierana przez granty z National Institutes of Health, NIH OT2-OD023850 do EMS2 oraz wsparcie stypendialne z NIH T32-DK007673 dla AMZ. Jesteśmy wdzięczni pracownikom Vanderbilt Translational Pathology Shared Resource za dostęp do instrumentu LCM i porady dotyczące przygotowania tkanek. Wspólny zasób Vanderbilt Tissue Pathology jest częściowo wspierany przez granty NIH P30-CA068485-14 i U24-DK059637-13. Dziękujemy Centrum Dostępu do Technologii Genomu na Wydziale Genetyki Washington University School of Medicine za pomoc w analizie genomicznej. GTAC jest częściowo wspierany przez NCI Cancer Center Support Grant #P30 CA91842 dla Siteman Cancer Center oraz przez #UL1TR002345 grantów ICTS/CTSA z National Center for Research Resources (NCRR), komponent National Institutes of Health (NIH) oraz NIH Roadmap for Medical Research. Wyłączną odpowiedzialność za tę publikację ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentuje ona oficjalne stanowisko NCRR lub NIH.

<ol><li>Gershon, M. D. <a target="_blank" href="https://www.amazon.com/Second-Brain-Scientific-Groundbreaking-Understanding/dp/0060182520">The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine</a>. , HarperCollinsPublishers. 1st edn (1998).</li>
<li>Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high-purity+myenteric+plexus+from+adult+human+and+mouse+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract.</a> Scientific Reports. 5, 9226(2015).</li>
<li>Huang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin-induced+proteome+alteration+during+cell+subculture+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells.</a> Journal of Biomedical Science. 17, 36(2010).</li>
<li>Bottner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microdissection+as+a+new+tool+to+investigate+site-specific+gene+expression+in+enteric+ganglia+of+the+human+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterology+and+Motility%22%5BJournal%5D)">Laser microdissection as a new tool to investigate site-specific gene expression in enteric ganglia of the human intestine.</a> Neurogastroenterology and Motility. 22 (2), 168-172 (2010).</li>
<li>Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li>
<li>Hetz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+gene+expression+analysis+in+enteric+ganglia+of+human+colon+after+laser+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Age-related gene expression analysis in enteric ganglia of human colon after laser microdissection.</a> Front Aging Neurosci. 6, 276(2014).</li>
<li>PALM Protocols - RNA handling. , ZEISS. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf">https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf</a> (2011).</li>
<li>Schlaudraff, F. L. M. Workflows & Protocols: How to Use a Leica Laser Microdissection System and Qiagen Kits for Successful RNA Analysis. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/">https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/</a> (2015).</li>
<li>Arcturus HistoGene Frozen Section Staining Kit: User Guide. <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/KIT0401_HistoGeneFrozenSectionStainingKit_UG.pdf">Biosystems, A</a>. , (2010).</li>
<li>Cummings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+RNA+integrity-preserving+staining+protocol+for+laser+capture+microdissection+of+endometrial+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue.</a> Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).</li>
<li>Grover, P. K., Cummins, A. G., Price, T. J., Roberts-Thomson, I. C., Hardingham, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+cost-effective+and+flexible+method+for+processing+of+snap-frozen+tissue+to+prepare+large+amounts+of+intact+RNA+using+laser+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">A simple, cost-effective and flexible method for processing of snap-frozen tissue to prepare large amounts of intact RNA using laser microdissection.</a> Biochimie. 94 (12), 2491-2497 (2012).</li>
<li>Heumuller-Klug, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+intestinal+mRNA%3A+a+matter+of+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterolology%22%5BJournal%5D)">Degradation of intestinal mRNA: a matter of treatment.</a> World Journal of Gastroenterolology. 21 (12), 3499-3508 (2015).</li>
<li>Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq%3A+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12, 42(2014).</li>
<li>Sigurgeirsson, B., Emanuelsson, O., Lundeberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+degraded+RNA+addressed+by+3%27+tag+counting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sequencing degraded RNA addressed by 3' tag counting.</a> PLoS One. 9 (3), 91851(2014).</li>
<li>Potter, S. S., Brunskill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Laser capture.</a> Methods in Molecular Biology. 886, 211-221 (2012).</li>
<li>Funke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microdissection+of+intestinal+epithelial+cells+and+downstream+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Laser microdissection of intestinal epithelial cells and downstream analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 755, 189-196 (2011).</li>
<li>Kolijn, K., van Leenders, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+RNA+extraction+kits+and+histological+stains+for+laser+capture+microdissected+prostate+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue.</a> BMC Res Notes. 9, 17(2016).</li>
<li>Muyal, J. P., Muyal, V., Kaistha, B. P., Seifart, C., Fehrenbach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+RNA+extraction+techniques+from+frozen+and+fresh+lung+tissues%3A+checkpoint+towards+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies.</a> Diagnostic Pathology. 4, 9(2009).</li>
<li>Mikulowska-Mennis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-quality+RNA+from+cells+isolated+by+laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection.</a> Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).</li>
<li>Pietersen, C. Y., Lim, M. P., Woo, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+high+quality+RNA+from+single+cell+populations+in+human+postmortem+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Obtaining high quality RNA from single cell populations in human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).</li>
<li>Guo, M., Wang, H., Potter, S. S., Whitsett, J. A., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SINCERA%3A+A+Pipeline+for+Single-Cell+RNA-Seq+Profiling+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biololgy%22%5BJournal%5D)">SINCERA: A Pipeline for Single-Cell RNA-Seq Profiling Analysis.</a> PLoS Computational Biololgy. 11 (11), 1004575(2015).</li>
<li>Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychrophilic+proteases+dramatically+reduce+single-cell+RNA-seq+artifacts%3A+a+molecular+atlas+of+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development.</a> Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Procedura ta umożliwia efektywne zbieranie licznych zwojów jelitowych jako źródła do wyprowadzania RNA do sekwencjonowania RNA. W tym przypadku przyspieszyliśmy procesy opisane w istniejących protokołach, jednocześnie maksymalnie zachowując integralność RNA. Ponieważ wszystkie etapy tej procedury są współzależne, ważne jest, aby wszystkie problemy zostały wyeliminowane od początku badania i aby wszystkie próbki były przygotowane tak podobnie do siebie, jak to możliwe, w celu uzyskania wiarygodnego sekwencjonowania RNA.</...

Ta metoda ma na celu uzyskanie wysokiej jakości próbek RNA zwojów jelitowych z ludzkiej tkanki jelitowej za pomocą laserowej mikrodysekcji (LCM). Opisany tutaj protokół został zoptymalizowany w celu zapewnienia wystarczającej jakości RNA i wydajności do sekwencjonowania RNA (sekwencjonowanie RNA) i jest przeznaczony do stosowania ze świeżo wyciętą, nieutrwaloną, błyskawicznie zamrożoną ludzką tkanką jelitową.
Funkcjonalne zaburzenia żołądkowo-jelitowe i perystaltyka jelit dotykają co czwartej osoby w Stanach Zjednoczonych. Jelitowy układ nerwowy (ENS), określany również jako drugi brain1, jest często w centrum tych zaburzeń, ponieważ odgrywa kluczową rolę w homeostazie i ruchliwości jelit. Manipulacja motoryką jelit była na ogół ograniczona do chirurgicznej resekcji tkanki zwojowej/niekurczliwej, przewlekłych modyfikacji diety i/lub leków. Co zaskakujące, pełna transkryptom dorosłego ENS pozostaje do zsekwencjonowania, co znacznie ogranicza naszą zdolność do identyfikacji cząsteczek w ENS, które mogą być ukierunkowane farmaceutycznie lub wykorzystane w terapiach komórkami macierzystymi.
Istnieje stosunkowo niewiele metod izolowania RNA z ludzkich zwojów jelitowych. Pierwsze podejście, dysocjacja komórek2, wymaga wysokich temperatur inkubacji i długiego czasu inkubacji; oba są znane z tego, że sprzyjają degradacji RNA i zmieniają transkryptom2,3. Alternatywne podejście, LCM, bardziej niezawodnie zachowuje transkryptom i chroni integralność RNA. Chociaż w kilku badaniach wykorzystano LCM do pobrania zwojów nerwowych ze świeżo zamrożonej ludzkiej tkanki jelitowej4,5,6, podejścia te były albo utrudnione przez słabą jakość i ilość RNA, albo były dość pracochłonne, albo wymagały modyfikacji technik barwienia lub ekstrakcji RNA, aby działały w naszych rękach. Inne protokoły LCM zaprojektowane do zachowania RNA, które zostały znalezione w instrukcjach produktów LCM, zapewniały dodatkowe ulepszenia7,8, ale adaptacja była potrzebna w przypadku zastosowania do izolacji zwojów jelitowych8,9. Z tych powodów opracowaliśmy zoptymalizowany protokół oparty na tych zasobach, który daje znaczne ilości RNA o wysokiej integralności z ludzkich zwojów jelitowych, ma stosunkowo szybki przepływ pracy i daje spójne wyniki w dużej liczbie próbek.
W tym badaniu prezentujemy streszczenie zoptymalizowanych procedur, które ułatwiają izolację RNA o wysokiej integralności z zwojów jelitowych pochodzących z wyciętej ludzkiej tkanki jelitowej. Nasza metoda obejmuje pięć ważnych aspektów. Po pierwsze, świeżo wycięte, nieutrwalone próbki jelita ludzkiego powinny zostać przycięte do odpowiedniego rozmiaru, nadmiar wilgoci usunięty za pomocą tkanki laboratoryjnej i spłaszczony w dużej formie podstawowej przed błyskawicznym zamrożeniem na zawiesinie suchego lodu i 2-metylobutanu (2-MB). Po drugie, wycinki histologiczne jelita powinny być przygotowane tak, aby uzyskać pełną płaszczyznę splotu mięśniowo-jelitowego na szkiełku, które oferuje dużą ładowność zwojów jelitowych. Powodzenie na tym etapie zależy w dużej mierze od procesu przygotowania tkanki. Po trzecie, niejednorodna struktura zwojów w ENS wymaga zastosowania szkiełek membranowych z polietylenu z naftalanu (PEN) 6, które oferują największą szybkość i precyzję podczas procesu LCM. Po czwarte, barwniki kompatybilne z etanolem, takie jak fiolet krezylowy, powinny być stosowane w celu zachowania integralności RNA podczas barwienia zwojów jelitowych. Wreszcie, proces ekstrakcji RNA ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego wyniku z RNA-Seq. Poszukiwaliśmy podejścia do ekstrakcji RNA, które zapewnia wysoką integralność RNA, maksymalizuje wydajność RNA przy rozpoczynaniu od małych zbiorów zwojów jelitowych, eliminuje zanieczyszczenie DNA i zachowuje jak najwięcej gatunków RNA.
Podsumowując, optymalizacja tych czynników w obecnym badaniu znacznie przyspiesza przepływ pracy i daje próbki zwojów jelitowych o wyjątkowej ilości i jakości RNA. Wyniki były w dużej mierze spójne w sporej grupie próbek, co wskazuje na spójność tego podejścia. Co więcej, wykorzystaliśmy te podejścia do pomyślnego zsekwencjonowania dziesiątek próbek RNA ze zwojów jelitowych. Przedstawione tutaj strategie można również szeroko zaadaptować do wykonywania LCM pożądanych zwojów lub jąder obwodowego i ośrodkowego układu nerwowego oraz innych przypadków wymagających izolacji wysokiej jakości RNA.

<table><tbody><tr><td>10% Neutralnie buforowana formalina</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>2-metylobutan</td><td>Fisher</td><td>O3551-4</td><td></td></tr><tr><td>3-mL strzykawka</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>50-mL probówki stożkowe, polipropylen&nbsp;</td><td>Corning</td><td>05-526B</td><td></td></tr><tr><td>Formy bazowe 37x24x5mm, jednorazowe</td><td>Mikroskopia elektronowa 5025511</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Belzer UW&nbsp; Rozwiązanie chłodnicze</td><td>Bridge to Life</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>CapSure Macro LCM</td><td>Czapki Arcturus, ThermoFisher</td><td>LCM0211</td><td></td></tr><tr><td>Folia przylegająca, Prasa" n Pieczęć&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; Zadowolony&nbsp; &nbsp;</td><td>Nie dotyczy;</td><td></td></tr><tr><td>Octan fioletu krezylowego</td><td>Acros Organics</td><td>AC405760025</td><td></td></tr><tr><td>Deska do krojenia</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>63308</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 190-proof</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000190</td> Etanol, 200-proof Pharmco-AAPER 111000200 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice z przedłużonym mankietem</td><td>Microflex&nbsp;</td><td></td><td></td>19010144</tr><tr><td>Fartuchy chirurgiczno-jednorazowe</td><td>Kimberly-Clark&nbsp;</td><td>19-088-2116</td><td></td></tr><tr><td>Taca, 20 L (duża polipropylenowa miska sterylizacyjna)</td><td>Nalgene&nbsp; &nbsp;</td><td>1335920B</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki Kimberly-Clark (duże)</td><td>Kimberly-Clark&nbsp;</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki Kimwipes (małe)</td><td>Kimberly-Clark&nbsp;</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>System mikrodysekcji laserowej (ArcturusXT)</td><td>ThermoFisher</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt wiertarski Leica Cryostat Chuck, duży,&nbsp; 40 mm&nbsp;</td><td>Południowo-wschodnia Służba Instrumentów Patologicznych</td><td>N.A.&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny</td><td>Olympus</td><td>CX43</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw mikroskopowy (20x)</td><td>Olympus UPlanFl 20x/0,50, &infin;/0,17</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw mikroskopowy (10x)</td><td>Olympus UPlanFl 10x/0.25, &infin;/-</td><td>N.A.&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sita molekularne</td><td>Acros Organics</td><td>AC197255000</td><td></td></tr><tr><td>Woda bez nukleaz</td> Zestaw do ekstrakcji RNA <td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Applied Biosystems</td><td>12204-01</td><td></td></tr><tr><td>Tłuczek do peletów</td><td>Kimble Kontes</td><td>4621973</td><td></td></tr><tr><td>membrana PEN Szkiełka LCM</td><td>Arcturus, ThermoFisher</td><td>LCM022</td><td></td></tr><tr><td>Probówki bez RNaz, 1,5 ml</td><td>Ambion</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZAP&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Sigma-R2020</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji RNA "A" (PicoPure)</td><td>Applied Biosystems</td><td>12204-01</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji RNA "B" (RNeasy&nbsp; Zestaw Micro)</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>Metoda ekstrakcji RNA "C" (TRIzol)</td>Zestaw do ekstrakcji RNA <td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>"D" (zestaw RNeasy PLUS Mini)</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>Splash Shield, jednorazowa osłona twarzy</td><td>Nożyczki Fisher</td><td>17-310</td><td></td></tr><tr><td>, chirurgiczne, 14,5 cm "ostry-ostry"</td><td>Narzędzia</td> <td>do nauki o sztuce14002-14</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy, octan celulozy (0,2 &mu; m)</td><td>Nalgene&nbsp; &nbsp;</td><td>190-2520</td><td></td></tr><tr><td>Zamrażanie tkanek Podłoże</td><td>Dane ogólne Opieka zdrowotna</td><td>TFM-5</td><td></td></tr><tr><td>Ksyleny</td><td>Fisher</td><td>X3P1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

optymalizacja mikrodysekcji laserowej w celu izolacji zwojów jelitowych ze świeżo zamrożonej tkanki ludzkiej

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

Celem tej metody jest uzyskanie próbek RNA o wysokiej integralności z zwojów jelitowych pobranych z nieutrwalonej, świeżo wyciętej tkanki jelita ludzkiego za pomocą mikrodysekcji laserowej (LCM). Zidentyfikowaliśmy pięć etapów w przepływie pracy, które są kluczowe dla uzyskania izolatów RNA ze zwojów jelitowych o wystarczająco wysokiej jakości i ilości dla sekwencjonowania RNA. Po pierwsze, podczas przygotowywania tkanki jelitowej, z każdej próbki należy usunąć cały nadmiar płynu przez osuszenie przed spłaszczeniem surowiczości tak bardzo, jak to możliwe, na dnie dużych form podstawowych. Próbki są następnie szybko zamrażane na zawiesinie suchego lodu i 2-metylobutanu. Po drugie, podczas cięcia tkanki ważne jest, aby ustawić krioformy tak, aby odcinki jelita przebiegały równolegle do pełnej płaszczyzny splotu mięśniowo-jelitowego, uzyskując w ten sposób największą powierzchnię zwojów jelitowych na szkiełko. Po trzecie, podczas LCM, szkiełka z membraną z polietylenu naftalanowego (PEN) oferują największą szybkość i elastyczność w zarysowywaniu niejednorodnych kształtów zwojów jelitowych podczas zbierania zwojów jelitowych. Po czwarte, w celu wyraźnej wizualizacji zwojów jelitowych w obrębie sekcji, barwniki kompatybilne z etanolem, takie jak fiolet kresylowy, zapewniają doskonałe zachowanie integralności RNA w stosunku do barwników wodnych. Wreszcie, w przypadku ekstrakcji RNA z przechwyconych zwojów, zaobserwowaliśmy różnice między komercyjnymi zestawami do ekstrakcji RNA, które dały lepszą ilość i jakość RNA, jednocześnie eliminując zanieczyszczenie DNA. Optymalizacja tych czynników w obecnym protokole znacznie przyspiesza przepływ pracy i pozwala uzyskać próbki zwojów jelitowych o wyjątkowej jakości i ilości RNA.

Wprowadziliśmy kilka ulepszeń do istniejących protokołów, które umożliwiają stosunkowo szybkie pozyskiwanie zwojów jelitowych z ludzkich próbek jelita z wykorzystaniem LCM, spełniając standardy dla RNA-Seq. Po pierwsze, zoptymalizowaliśmy szybkie mrożenie fragmentów tkanki jelitowej w dużych formach bazowych umieszczonych na powierzchni zawiesiny suchego lodu w 2-MB (Rysunek 1B). Najlepsze rezultaty podczas kriosekcjonowania i późniejszego LC...

Celem tego protokołu jest uzyskanie próbek RNA o wysokiej integralności z zwojów jelitowych wyizolowanych z nieutrwalonej, świeżo wyciętej tkanki jelita ludzkiego za pomocą mikrodysekcji laserowej (LCM). Protokół ten obejmuje przygotowanie błyskawicznie zamrożonych próbek ludzkiej tkanki jelitowej, kriosekcję, barwienie i odwodnienie etanolowe, LCM i ekstrakcję RNA.

Optymalizacja mikrodysekcji laserowej w celu izolacji zwojów jelitowych ze świeżo zamrożonej tkanki ludzkiej

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące jelitowego układu nerwowego, takie jak profil ekspresji zwojów jelitowych w jelitach dorosłych ludzi. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do uzyskania wysokiej wydajności RNA z ludzkich zwojów jelitowych przy maksymalnym zachowaniu jakości RNA. Zacznij od tkanki jelitowej pociętej na 20 centymetrów długości.Najpierw odetnij tkankę tłuszczową i łączną. Unikaj nacinania błony surowiczej, co może prowadzić do strukturalnego uszkodzenia splotu mięśniowo-jelitowego. Następnie należy wykonać podłużne nacięcie na całej długości przyciętej próbki, najlepiej w miejscu przyczepu krezkowego.Następnie wypreparuj i wyrzuć taeniae coli z okrężnicy, aby tkanka mogła się spłaszczyć. Teraz rozłóż jelito błoną śluzową do dołu na schłodzonej desce do krojenia. Następnie wytnij paski o szerokości 1,25 centymetra na całej długości tkanki.Po ich pokrojeniu przenieś każdy kawałek do schłodzonego roztworu do przechowywania tkanek w celu tymczasowego przechowywania. Następnie pokrój każdy pasek na segmenty o długości od dwóch do 1,5 centymetra. Po pokrojeniu paska na segmenty osusz segmenty.Ważne jest, aby tkanka była bardzo sucha, aby kryształki lodu nie tworzyły się na tkance po zamrożeniu. Teraz ułóż wysuszone kawałki tkanki, błoną śluzową do góry, na zimnej, jednorazowej plastikowej formie. Następnie spłaszcz każdy kawałek za pomocą zakrzywionych kleszczy, aby usunąć uwięzione pęcherzyki powietrza.Tkanki będą się rozszerzać w miarę spłaszczania. Po spłaszczeniu segmentów tkanki oceń ich grubość przed zamrożeniem. W razie potrzeby wepchnij krawędzie próbki do środka, aż próbka jelitowa zbliży się do swojej pierwotnej grubości.Teraz przenieś załadowaną formę bazową na zawiesinę suchego lodu i 2-metylobutanu. Tkanka powinna całkowicie zamarznąć w ciągu 30 do 60 sekund. Następnie natychmiast osusz spód formy za pomocą zimnych chusteczek, które były trzymane na suchym lodzie.Teraz sprawdź próbkę. Zwróć uwagę na wszelkie próbki, które nie wyglądają na płaskie. Następnie zawiń formę w folię aluminiową, która została wstępnie oznaczona i schłodzona przed użyciem.Następnie przykryj folię warstwą folii, aby zminimalizować odwodnienie. Próbki należy przechowywać na lodzie do czasu, gdy będzie można je przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po przygotowaniu wymaganych materiałów wlej od trzech do pięciu milimetrów kopca TFM na duży uchwyt próbki kriostatu i natychmiast przenieś próbkę jelitową, surowiczą stroną do góry, na TFM.Po kilku sekundach w temperaturze pokojowej przenieś uchwyt próbki do suchego lodu i przykryj go sproszkowanym suchym lodem. Przed krojeniem upewnij się, że TFM znajduje się poniżej płaszczyzny splotu mięśniowo-jelitowego. Następnie zamontuj uchwyt próbki w głowicy próbki kriostatu i wyrównaj próbkę z ostrzem kriostatu.Ustaw płaszczyznę splotu mięśniowo-jelitowego równolegle do ostrza tnącego. Teraz wykonaj osiem mikronowych odcinków przez surowiczość i mięsień podłużny, aż dotrze do splotu mięśniowo-jelitowego. Aby zlokalizować splot mięśniowo-jelitowy, zamontuj próbkę i zabarwij ją wodnym barwnikiem, takim jak 1% fiolet krystaliczny.Aby kontynuować, zidentyfikuj połączenie między podłużnymi i okrężnymi warstwami mięśni. Na początku sekcji surowiczość będzie zaznaczona obecnością tkanki łącznej. Część pozostałego tłuszczu krezkowego może być również obecna wzdłuż błony surowiczej.Następnie arkusz zewnętrznej podłużnej warstwy mięśniowej staje się widoczny Po osiągnięciu granicy między podłużnymi i okrężnymi warstwami mięśni zostanie zaobserwowana część zwojów jelitowych. W następnych kilku sekcjach splot mięśniowo-jelitowy stanie się bardzo widoczny z dużymi połaciami zwojów obecnych w jednym odcinku. Teraz zbierz sekcje szeregowe do mikrodysekcji przechwytywania laserowego.Chill PEN wsuwa się w kriostat przez pięć do 10 sekund i użyj ich do zamontowania sekcji. Najlepsze sekcje będą miały dużo neuronów i gleju. Teraz przystąp do barwienia, a następnie odwadniania sekcji zgodnie z opisem w protokole tekstowym.W ramach przygotowań włóż wkład z nasadkami LCM do stolika mikroskopu LCM. Następnie załaduj przykładowy slajd na stół montażowy i uzyskaj obraz ogólny slajdu. Zidentyfikuj żądane miejsce dla LCM i załaduj nasadkę na szkiełko.Następnie wyrównaj laser na podczerwień i dostosuj moc i czas trwania lasera dla miejsca przechwytywania o średnicy od 20 do 30 mikronów. Następnie nakreśl żądane zwoje jaj do zebrania. Upewnij się, że pozostajesz w granicach obszaru kolekcjonerskiego na czapce, która jest wyświetlana jako zielone kółko.Dla każdego z zwojów wyznaczonych przez ślad cięcia UV wyreguluj plamki IR tak, aby co najmniej jeden punkt IR pojawiał się co 100 do 500 mikronów, aby upewnić się, że wszystkie zwoje zostaną zebrane, gdy nasadka zostanie zdjęta z próbki. Następnie naciśnij przycisk IR UV Cut, aby kontynuować zbieranie wszystkich zaznaczonych zwojów. Po zakończeniu odbioru przenieś nasadkę w nowe miejsce i powtórz proces zbierania.Można to powtarzać przez 60 do 80 minut. Gdy nasadka LCM zostanie załadowana wystarczającą ilością zwojów, przenieś ją do stacji kontroli jakości. Jeśli na nasadce znajdują się zanieczyszczenia, zetrzyj je za pomocą pędzla z cienką końcówką, który został przygotowany do użycia RNA.Użyj końcówki do pipety w przypadku wszelkich trudnych do usunięcia zanieczyszczeń. Następnie przymocuj nakrętkę do 0,5 mililitrowej probówki do mikrofuzy wypełnionej 230 mikrolitrami buforu do lizy RNA. Odwróć nakrętkę, krótko ją zawiruj, a następnie inkubuj próbkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Później odwiruj próbkę przez pięć minut przy 5 000 g lub szybciej, a następnie przenieś probówkę do mikrofuge do suchego lodu. Próbka jest teraz gotowa do ekstrakcji RNA. Podczas wyciągania dwóch czapek zwojów jelitowych na próbkę uzyskano więcej niż jeden nanogram RNA, wystarczający do sekwencjonowania RNA, a RNA było doskonałej jakości.Integralność RNA pokazanej próbki wynosi 8,3. Pobrano również próbki o wskaźnikach integralności 7,5 i 6,9. W sumie ponad 95% wszystkich przygotowanych próbek było wystarczająco dobrych do sekwencjonowania RNA.Jakość zestawów danych RNA-Seq oceniono za pomocą potoku bioinformatycznego. Odchylenie końcowe wskazuje, że próbki zostały pomyślnie zsekwencjonowane i miały tylko skromne odchylenie trzech głównych końców. Wykres biotypu genu pokazuje, że wyniki sekwencjonowania były w dużej mierze spójne.Po opanowaniu technika ta może być wykorzystana do zbierania biologicznych powtórzeń RNA ze zwojów jelitowych o wystarczającej jakości i ilości do sekwencjonowania RNA w ciągu zaledwie ośmiu do 12 godzin. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby próbki jelit ludzkich były zamrożone tak płasko, jak to możliwe. Zapewni to możliwość pobrania bardzo dużych przekrojów ludzkich zwojów jelitowych, które są szybko i łatwo przetwarzane za pomocą mikrodysekcji laserowej.

optimization-laser-capture-microdissection-for-isolation-enteric

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Mikroskopia z przechwytywaniem laserowym, znana również jako laserowa mikrodysekcja (LMD), umożliwia użytkownikowi izolację niewielkiej liczby komórek lub tkanek z zamrożonych lub ...

Mikrorozcięcie laserowe z wychwytem (Laser Capture Microdissection) tkanek ssaków

W niniejszym artykule wideo przedstawiamy metodę izolacji pojedynczych lub wielu neuronów dopaminergicznych (da) Drosophila z larw trzeciego stadium za pomocą mikrodysekcji laserowej (LCM) w klasie przechwytywania podczerwienią (IR). RNA uzyskane z wyizolowanych neuronów może być łatwo wykorzystane w dalszych zastosowaniach, w tym w analizach qRT-PCR lub mikromacierzach.

Mikrodysekcja laserowa neuronów obwodowych Drosophila

Film opisuje laserową sekcję 3D organotypowego modelu współhodowli z precyzją na poziomie mikronów. W modelach organotypowych 3D składniki zrębu, takie jak fibroblasty, są trójwymiarowo współhodowane z komórkami nabłonka nowotworowego. Model 3D służy jako narzędzie eksperymentalne, które umożliwia badanie inwazji i interakcji rak-zrąb w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.

Mikrodysekcja laserowa: technika izolowania inwazyjnych komórek raka jelita grubego z modelu hodowli organotypowej 3D

Ten film przedstawia metodę utrwalania i barwienia do przetwarzania zamrożonej tkanki guza mózgu myszy. Przetworzona tkanka pomaga w różnicowaniu i uzyskaniu określonej populacji komórek podczas późniejszej mikrodysekcji laserowej.

Kriokonserwowane utrwalanie i barwienie skrawków tkanek: procedura przetwarzania zamrożonych skrawków tkanki mózgowej do mikrodysekcji laserowej

Mikrodysekcja laserowa to technika, która pozwala na odzyskanie wybranych komórek z niewielkich ilości miąższu. W tym miejscu opisujemy protokół pozyskiwania ludzkich wysp trzustkowych z próbek chirurgicznych do wykorzystania w badaniach transkryptomicznych. Nasz protokół poprawia wewnętrzną autofluorescencję ludzkich komórek beta, ułatwiając w ten sposób ich pobieranie.

Ulepszony protokół mikrodysekcji laserowej ludzkich wysp trzustkowych z próbek chirurgicznych

Izolacja pojedynczych neuronów dopaminowych lub brzusznego obszaru nakrywki za pomocą bezpośredniej lub pośredniej immunohistochemii jest demonstrowana za pomocą mikrodysekcji laserowej. Omówiono parametry izolacji tkanki ze szkiełka podstawowego za pomocą lasera na podczerwień oraz od szkiełek membranowych z wykorzystaniem kombinacji lasera podczerwonego i ultrafioletowego.

Mikrodysekcja laserowa - demonstracja izolacji pojedynczych neuronów dopaminowych i całego brzusznego obszaru nakrywki

Tutaj opisujemy protokół powtarzalnej mikrodysekcji laserowej (LCM) do izolowania siatki beleczkowej (TM) do dalszej analizy RNA. Możliwość analizowania zmian w ekspresji genów w TM pomoże w zrozumieniu mechanizmów molekularnych leżących u podstaw chorób oczu związanych z TM.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji siatki beleczkowej o wysokiej czystości z oczu myszy do analizy ekspresji genów

Tutaj opisujemy izolację komórek glejowych jelitowych z błony podśluzowej jelita za pomocą sekwencyjnych inkubacji EDTA do chelatowania kationów dwuwartościowych, a następnie inkubacji w nieenzymatycznym roztworze do odzyskiwania komórek. Posiewanie powstałej zawiesiny komórkowej na poli-D-lizynie i lamininie daje w wyniku wysoce wzbogaconą hodowlę komórek glejowych podśluzówkowych do analizy funkcjonalnej.

Izolacja komórek glejowych jelitowych z błony podśluzowej i blaszki właściwej dorosłej myszy

Mikrodysekcja laserowa (LMD) jest czułą i wysoce powtarzalną techniką, która może być wykorzystana do odkrycia ścieżek pośredniczących w heterogeniczności i inwazji glejaka. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół izolacji dyskretnych obszarów z tkanki glejaka za pomocą laserowego LMD, a następnie analizy transkryptomicznej.

Mikrodysekcja podregionów glejaka do wychwytywania laserowego w celu przestrzennej i molekularnej charakterystyki heterogeniczności wewnątrznowotworowej, onkostrumieni i inwazji

Ten protokół opisuje szczegółowe, niskonakładowe przygotowanie próbki do sekwencjonowania pojedynczego jądra, w tym sekcję górnych zwojów szyjnych i gwiaździstych myszy, dysocjację komórek, krioprezerwację, izolację jądra i kodowanie kreskowe hashtagów.

Izolacja i multipleksowanie jądra o niskim poziomie wejściowym z przeciwciałami kodowymi zwojów współczulnych myszy do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra

Czubki korzeniowe grzbietowe (DRG) zawierają pierwotne ciała komórkowe neuronów czuciowych i przekazują obwodowe sygnały czuciowe do rdzenia kręgowego. Niniejszy protokół opisuje metodę rozpinania czupczyków korzeniowych grzbietowych u myszy, która wspiera standaryzowaną izolację strukturalnie nietkniętych czupczyków, identyfikację anatomiczną segmentów, intuicyjną instrukcję dla początkujących użytkowników oraz zmniejszone uszkodzenie tkanki podczas procedury.

Sekcja i odizolowanie klastrów czuciowych rdzenia kręgowego myszy

Poznaj mikrodysekcję laserową do izolacji zwojów jelitowych ze świeżo zamrożonej tkanki ludzkiej w celu uzyskania wysokiej jakości RNA. Ta metoda umożliwia badanie profili ekspresji genów w jelitowym układzie nerwowym.

Optymalizacja mikrodysekcji laserowej w celu izolacji zwojów jelitowych ze świeżo zamrożonej tkanki ludzkiej

Przeglądaj więcej filmów