Name: Ocena czynności nerek w mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Poznaj kompleksową ocenę czynności nerek w mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych. Metoda obejmuje analizę albuminurii, izolację kłębuszków oraz badania mikroskopowe struktury nerek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez British Heart Foundation, Richard Bright VEGF Research Trust i MRC.

<ol><li>Humtstrom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+structural+kidney+damage+in+spontaneously+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Development of structural kidney damage in spontaneously hypertensive rats.</a> Journal of Hypertension. 30 (6), 1087-1091 (2012).</li>
<li>Kitada, M., Ogura, Y., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+diabetic+nephropathy%3A+their+utility+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nephrology+and+Renovascular+Disease%22%5BJournal%5D)">Rodent models of diabetic nephropathy: their utility and limitations.</a> International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 14 (9), 279-290 (2016).</li>
<li>Tesch, G. H., Lim, A. K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21147843">Recent insights into diabetic renal injury form the db/db mouse model of type 2 diabetic nephropathy.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (2), F301-F310 (2011).</li>
<li>Fogo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+FSGS%3A+lessons+for+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Animal models of FSGS: lessons for pathogenesis and treatment.</a> Seminars in Nephrology. 23 (2), 161-171 (2003).</li>
<li>Stevens, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28574576">VEGF-A165b protects against proteinuria in a mouse model with progressive depletion of all endogenous VEGF-A splice isoforms from the kidney.</a> Journal of Physiology. 595 (19), 6281-6298 (2017).</li>
<li>Cosgrove, D., Kalluri, R., Miner, J. H., Segal, Y., Borza, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+a+mouse+model+to+study+the+molecular+pathobiology+of+Alport+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Kindey+International%22%5BJournal%5D)">Choosing a mouse model to study the molecular pathobiology of Alport glomerulonephritis.</a> Kindey International. 71 (7), 615-618 (2007).</li>
<li>Kujal, P., Vernerova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%2F6+nephrectomy+as+an+experimental+model+of+chronic+renal+failure+and+adaptation+to+reduced+nephron+number%5BTitle%5D)+AND+%22Ceskoslenska+Fysiologuie%22%5BJournal%5D)">5/6 nephrectomy as an experimental model of chronic renal failure and adaptation to reduced nephron number.</a> Ceskoslenska Fysiologuie. 57 (4), 104-109 (2008).</li>
<li>Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li>
<li>Oltean, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF165b+overexpression+restores+normal+glomerular+water+permeability+in+VEGF164-overexpressing+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">VEGF165b overexpression restores normal glomerular water permeability in VEGF164-overexpressing adult mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (7), F1026-F1036 (2012).</li>
<li>Salmon, A. H., Neal, C. R., Bates, D. O., Harper, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor+increases+the+ultrafiltration+coefficient+in+isolated+intact+Wistar+rat+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor increases the ultrafiltration coefficient in isolated intact Wistar rat glomeruli.</a> Journal of Physiology. 570 (Pt 1), 141-156 (2006).</li>
<li>Zheng, F., Striker, G. E., Esposito, C., Lupia, E., Striker, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+differences+rather+than+hyperglycemia+determine+the+severity+of+glomerulosclerosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Strain differences rather than hyperglycemia determine the severity of glomerulosclerosis in mice.</a> Kidney International. 54 (6), 1999-2007 (1998).</li>
<li>Betz, B., Conway, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+the+use+of+animal+models+in+diabetic+nephropathy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Diabetes+Reports%22%5BJournal%5D)">An update on the use of animal models in diabetic nephropathy research.</a> Current Diabetes Reports. 16 (18), (2016).</li>
<li>Savin, V. J., Terreros, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filtration+in+single+isolated+mammalian+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Filtration in single isolated mammalian glomeruli.</a> Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).</li>
<li>Neal, C. R., Crook, H., Bell, E., Harper, S. J., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+glomeruli+by+electron+microscopy+reveals+a+distinct+restrictive+urinary+subpodocyte+space%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of glomeruli by electron microscopy reveals a distinct restrictive urinary subpodocyte space.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 16 (5), 1223-1235 (2005).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+technique%2C+theory%2C+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22North+American+Journal+of+Medicine+%26+Science%22%5BJournal%5D)">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medicine & Science. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).</li>
<li>Adembri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis+induces+albuminuria+and+alterations+in+the+glomerular+filtration+barrier%3A+a+morphofunctional+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Sepsis induces albuminuria and alterations in the glomerular filtration barrier: a morphofunctional study in the rat.</a> Critical Care. 15 (6), R277(2011).</li>
<li>Ma, S. T., Liu, D. L., Deng, J. J., Niu, R., Liu, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+arctiin+on+glomerular+filtration+barrier+damage+in+STZ-induced+diabetic+nephropathy+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Phytotherapy+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of arctiin on glomerular filtration barrier damage in STZ-induced diabetic nephropathy rats.</a> Phytotherapy Research. 27 (10), 1474-1480 (2013).</li>
<li>Oltean, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor-A165b+is+protective+and+restores+endothelial+glycocalyx+in+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor-A165b is protective and restores endothelial glycocalyx in diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 26 (8), 1889-1904 (2015).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte-specific+overexpression+of+GLUT1+surprisingly+reduces+mesangial+matric+expansion+in+diabetic+nephropathy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Podocyte-specific overexpression of GLUT1 surprisingly reduces mesangial matric expansion in diabetic nephropathy in mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 299 (1), F91-F98 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje pełne badanie nerek, które powinno zostać przeprowadzone na mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych, umożliwiając uzyskanie ogromnej ilości informacji na temat funkcji nerek i kłębuszków nerkowych od jednej myszy. Krytyczne etapy każdej metody pozwalają na szczegółową analizę funkcjonalną, strukturalną i mechanistyczną funkcji kłębuszków nerkowych, w tym ocenę przepuszczalności nerek jako całości (pomiary uACR i kreatyniny w osoczu), przepuszczalności poszczególnych kłębuszków nerkowych (kłębuszkowe LpA/Vi), badanie zmian strukturalnych (PAS, błękit trichromowy i EM), lokalizacja białka (IF), i ekspresja genów kłębuszków nerkowych (RT-PCR i Western blot). Metody te mają kluczowe znaczenie dla pełnej oceny funkcji kłębuszków nerkowych w mysich modelach choroby nerek.
Oceniając przepuszczalność GFB, w wielu badaniach zdecydowano się na zastosowanie konwencjonalnego uACR lub 24-godzinnej szybkości wydalania albumin jako skutecznego środka17,18. Chociaż techniki te umożliwiają ocenę przepuszczalności GFB jako całości, nie pozwalają na ocenę przepuszczalności poszczególnych kłębuszków nerkowych i ich zmienności. Wcześniejsze badania wykazały, że pomiar kłębuszkowego LpA/Vi jest bardziej czułą miarą zmian przepuszczalności GFB 5,9. Rzeczywiście, w reprezentatywnych wynikach przedstawionych w tym artykule, po 14 tygodniach od indukcji VEGF-A KO, VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b myszy mają znacznie niższy uACR w porównaniu do myszy VEGF-A KO; jednak wynik ten nie znajduje odzwierciedlenia w kłębuszkowych pomiarach LpA/Vi, w których VEGF-A165b nie zapobiegł znacząco wzrostowi przepuszczalności GFB (Figura 1 i Figura 2)5. Pokazuje to, jak ważne jest stosowanie wielu testów do oceny zarówno przepuszczalności nerek, jak i przepuszczalności poszczególnych kłębuszków nerkowych. Ponadto test onkometryczny kłębuszkowy LpA/Vi sugeruje, że przepuszczalność poszczególnych kłębuszków nerkowych z tej samej nerki może się znacznie różnić, zwłaszcza w modelach chorobowych 5,10,19. Jednym z ograniczeń pomiaru kłębuszkowego LpA/Vi jest to, że można go przeprowadzić tylko w eksperymentalnym punkcie końcowym; w związku z tym wymagane są regularne pomiary uACR, aby wskazać eksperymentalny punkt końcowy.
Oprócz oceny fenotypu funkcjonalnego, obecna metoda zachęca również do oceny fenotypu strukturalnego i ultrastrukturalnego. Można to zrobić za pomocą różnych plam, takich jak plamy PAS, trichrom i srebro; każdy z nich w celu oceny różnych aspektów morfologii kłębuszków nerkowych. W ostrych modelach choroby kłębuszków nerkowych, co często ma miejsce w modelach mysich, wykrycie poważnych nieprawidłowości strukturalnych za pomocą tych barwników może być trudne, chyba że jesteś przeszkolonym patologiem nerek. Dlatego sugeruje się przeprowadzenie EM w celu oceny ultrastruktury GFB, co pozwala na ilościowy pomiar parametrów, takich jak GBM, rozmiar i liczba okien śródbłonka oraz charakterystyka podocytów. Takie pomiary wymagają minimalnego przeszkolenia i umożliwiają badaczowi określenie typów/struktur komórek dotkniętych w modelu choroby. W przykładzie pokazanym w reprezentatywnych wynikach stwierdzono, że mysz VEGF-A KO jest łagodnym modelem choroby kłębuszków nerkowych, a zatem nie stwierdzono żadnych poważnych nieprawidłowości strukturalnych w barwieniu PAS. Jednak specyficzny dla podocytów VEGF-A KO indukował zmiany w GBM, podocytach i komórkach śródbłonka podczas badania ultrastruktury kłębuszkównerkowych 5. Niestety, przygotowanie nerki do EM opisane w niniejszej metodzie nie pozwala na wykrycie glikokaliksu śródbłonka, o którym wiadomo również, że ma istotny wpływ na przepuszczalność GFB19. W celu dokładnego zmierzenia głębokości glikokaliksu, nerka powinna być utrwalona perfuzją za pomocą 2,5% aldehydu glutarowego z 1% błękitu alcian w celu znakowania glikokaliksu śródbłonka, jak opisano w Oltean i wsp. 19.
Po ocenie fenotypu funkcjonalnego i strukturalnego można następnie ocenić wzorce ekspresji/aktywacji różnych genów i szlaków, specyficznie w kłębuszkach nerkowych. Wcześniejsza ocena ultrastrukturalna może dostarczyć pewnych informacji na temat typów komórek/zaangażowanych struktur kłębuszkowych, wskazując, czy należy zbadać geny/szlaki specyficzne dla podocytów lub śródbłonka. Na przykład w reprezentatywnych wynikach z myszy VEGF-A KO zaobserwowano zmniejszenie liczby okien śródbłonka (ryc. 3D); w związku z tym zbadano ekspresję białka kłębuszkowego markera śródbłonka, o którym wiadomo, że jest zaangażowany w szlak VEGF-A; VEGFR-2 (rysunek 4B)5. Oprócz ekspresji białek w kłębuszkach nerkowych, ich lokalizację można również wizualizować za pomocą IF. W badaniu przeprowadzonym przez Zhang i wsp.20 potwierdzono nadekspresję GLUT1 specyficzną dla podocytów w podocytach przez kolokalizację IF zwiększonego GLUT1 z podocyną.
W porównaniu z alternatywnymi metodami oceny funkcji kłębuszków nerkowych przedstawionymi w literaturze, zastosowanie opisanej w tym artykule metody oceny funkcji nerek w mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych umożliwia pełną ocenę fenotypu kłębuszkowego pod wieloma względami. Korzystając z tej metody, badacz jest w stanie określić fenotyp nerki modelu i ocenić mechanizm, dlaczego fenotyp się rozwija. Te istotne informacje na temat mechanizmu choroby są niezbędne przy badaniu potencjalnych ścieżek terapeutycznych w tych modelach. Metoda ta może być z łatwością zastosowana w przyszłych badaniach nad funkcją kłębuszków nerkowych, zarówno w ocenie fenotypów choroby, jak i potencjalnych terapii.
Podsumowując, ten ogólny i adaptowalny protokół opisuje pełne badanie nerek dla mysich modeli choroby kłębuszków nerkowych, umożliwiając uzyskanie ogromnej ilości informacji na temat funkcji nerek i kłębuszków nerkowych za pomocą jednej myszy. Metody te pozwalają na szczegółową analizę funkcjonalną, strukturalną i mechanistyczną funkcji kłębuszków nerkowych, którą można zastosować do wszystkich mysich modeli choroby kłębuszków nerkowych.

Coraz powszechniejsze staje się używanie modeli mysich do naśladowania ludzkiej choroby nerek. Takie mysie modele obejmują spontaniczne modele, takie jak szczury z spontanicznym nadciśnieniem tętniczym (SHR)1, szczury i myszy z cukrzycą indukowaną streptozotocyną (STZ)2 oraz myszy z cukrzycą typu db/db typu II3, modele modyfikowane genetycznie, takie jak modele pierwotnego ogniskowego segmentalnego stwardnienia kłębuszków nerkowych (FSGS) specyficzne dla podocytów4, model nokautu czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego A (VEGF-A) (VEGF-A KO) specyficznego dla podocytów5 i modele zespołu Alporta6, oraz nabyte modele, takie jak nefrektomia 5/67 i model jednostronnej niedrożności moczowodu (UUO)8. Aby ocenić różne aspekty funkcji kłębuszków nerkowych w tych modelach, dostępnych jest kilka technik. Celem niniejszej pracy metodycznej jest zademonstrowanie kompleksowego badania, które należy przeprowadzić na mysich modelach choroby nerek, aby w pełni ocenić funkcję kłębuszków nerkowych.
Uzasadnieniem dla użycia tej metody jest to, że umożliwia ona pełną ocenę fenotypu kłębuszkowego pod wieloma względami. Obejmuje to ocenę przepuszczalności kłębuszków nerkowych, zarówno dla białka, jak i wody, nieprawidłowości strukturalnych kłębuszków nerkowych oraz zmian w ekspresji/splicingu mRNA i białek niezbędnych do prawidłowego funkcjonowania kłębuszków nerkowych. Korzystając z tej metody, badacz jest w stanie określić fenotyp nerki modelu i ocenić mechanizm, dlaczego fenotyp się rozwija. Jest to istotna informacja na temat mechanizmu choroby, która jest niezbędna przy badaniu potencjalnych ścieżek terapeutycznych w tych modelach.
W literaturze często występuje się z mysim modelem choroby kłębuszków nerkowych, gdzie fenotyp jest determinowany przez zwiększony poziom albuminy w moczu. Istnieją jednak dowody sugerujące, że pojedyncza metoda określania funkcji kłębuszków nerkowych nie zawsze jest skuteczna; pomiar szybkości wydalania albumin z moczem lub stosunku albuminy kreatyniny w moczu (uACR) dostarcza jedynie informacji o całkowitej funkcji nerek, a nie o poszczególnych kłębuszkach nerkowych. Wcześniejsze badania wykazały, że przepuszczalność może się różnić w różnych kłębuszkach nerkowych z tego samego nerki5,9,10. Ponadto ocena przepuszczalności poszczególnych kłębuszków nerkowych jest bardziej czułym sposobem oceny funkcji kłębuszków nerkowych; technika pomiaru przepuszczalności poszczególnych kłębuszków nerkowych (LpA/Vi) okazała się bardziej wrażliwa na zmiany funkcji kłębuszków nerkowych niż pomiar uACR9. Ten test jest korzystny w modelach mysich, które są odporne na białkomocz, takich jak te na tle c57BL/6 11. Zaletą niniejszej pracy metodologicznej jest to, że bada ona zarówno całkowitą przepuszczalność albuminy przez nerki, jak i indywidualną przepuszczalność kłębuszków nerkowych dla wody.
Badanie nieprawidłowości strukturalnych kłębuszków nerkowych jest często oceniane na podstawie szeregu plam, takich jak kwasy okresowe Schiffa (PAS), plamy trichromowe i srebrne. Umożliwiają one przeszkolonemu patologowi nerek ocenę poziomu choroby nerek za pomocą metody punktacji. Chociaż wszystkie są dobrymi metodami, zmiany w makrostrukturze kłębuszków nerkowych nie zawsze są obserwowane w modelach ostrego uszkodzenia nerek12. W metodzie tej proponuje się, aby oprócz przeprowadzenia opisanych powyżej technik histologicznych nerek, ultrastruktura kłębuszków nerkowych była również oceniana za pomocą mikroskopii elektronowej (EM). Barwiony kłębuszek nerkowy może wyglądać stosunkowo normalnie pod zwykłym mikroskopem świetlnym; jednak po ocenie za pomocą EM analizowane są niewielkie zmiany szerokości błony podstawnej kłębuszków nerkowych (GBM), zacierania się procesu stopy podocytów, fenestracji śródbłonka i pokrycia przestrzeni sub-podocytów. Dlatego ważne jest, aby ocenić zarówno ultrastrukturę, jak i mikrostrukturę kłębuszków nerkowych w celu określenia mechanizmu dysfunkcji kłębuszków nerkowych.
Oprócz oceny nieprawidłowości strukturalnych kłębuszków nerkowych, zmiany w ekspresji mRNA i białka oraz splicingu, a także aktywacji białek (np. fosforylacja), powinny być badane w celu dalszego wyjaśnienia mechanizmów choroby kłębuszków nerkowych. Patrząc na chorobę kłębuszków nerkowych lub, na przykład, gdy gen jest nadmiernie eksprymowany specyficznie w komórkach kłębuszków nerkowych, takich jak w myszy swoistej dla podocytów myszy VEGF-A VEGF-A class<="xref">5, ważne jest, aby zmiany białka i mRNA były badane tylko w komórkach kłębuszkowych, a nie w całej nerce. Protokół ten opisuje metodę, w której kłębuszki nerkowe są izolowane z kory nerkowej myszy, a następnie izolowane jest białko/RNA. Pozwala to na specyficzną analizę dysregulacji białka/mRNA w kłębuszkach nerkowych modelu choroby.
Ten protokół opisuje pełne badanie nerek, które powinno być przeprowadzone na mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych, umożliwiając uzyskanie ogromnej ilości informacji na temat funkcji nerek i kłębuszków nerkowych za pomocą jednej myszy. Metody te pozwalają na szczegółową analizę funkcjonalną, strukturalną i mechanistyczną funkcji kłębuszków nerkowych, którą można zastosować do wszystkich mysich modeli choroby kłębuszków nerkowych.

<table><tbody><tr><td>Klatki metaboliczne</td><td>Aparat Harvarda</td><td>52-6731</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana Tris (10x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5912-1L</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>Albumina myszy Zestaw do oznaczania ilościowego ELISA</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>E90-134</td><td></td></tr><tr><td>TMB ELISA Roztwór substratu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>SPECTRstar nano</td><td>BMG Labtech</td><td>SPECTRstar nano lub równoważny</td><td></td></tr><tr><td>roztwór do stabilizacji RNAlater</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>4-15% prefabrykowany żel białkowy</td><td>BIORAD</td><td>4568084</td><td></td></tr><tr><td>4x Laaemmli Bufor do próbek</td><td>BIORAD</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>Komórka Mini Trans-Blot</td><td>BIORAD</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>10x Bufor do biegania</td><td>Tris BIORAD</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue Dye</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Creatinine Companion</td><td>Exocell</td><td>1012 Płytka</td><td></td>paskowa</tr><tr><td>Roztwór aldehydu glutarowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Kakodylan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>D(+)Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do pobierania krwi EDTA</td><td>BD</td><td>367835</td><td></td></tr><tr><td>23-25G Igła</td><td>BD</td><td>PMC0735</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>10 ml szklana fiolka</td><td>Thomas Scientific</td><td>0914X10</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 10 ml probówki polipropylenowe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10110101</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml Probówki</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10681894</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe formy do tkanek</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22-363-553</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do chirurgicznego rozwarstwiania myszy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-005-204</td><td></td></tr><tr><td>Optymalna substancja tnąca</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehydu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>Szklane rurki kapilarne</td><td>Aparat Harvarda</td><td>EC1 64-0770</td><td></td></tr><tr><td>Wiertnica do przepuszczalności kłębuszków</td> nerkowych <td>zbudowana na Uniwersytecie w Bristolu - niedostępna zamiennie</td><td>Cytowanie platformy LpA: Salmon et al. 2006; J. Physiol</td><td></td></tr><tr><td>Sita ze stali nierdzewnej</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-59984</td><td></td></tr><tr><td>System barwienia kwasem okresowym-Schiffem (PAS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>395B-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksylina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3136</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>MerckMillipore</td><td>108298</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka Poly-Prep</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0425-72EA</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże montażowe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8030</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór tetratlenku osmu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>Agar z żywicy araditowej</td><td>Scientific</td><td>CY212</td><td></td></tr><tr><td>Agar z octanem uranylu</td><td>Scientific</td><td>AGR1260A</td><td></td></tr><tr><td>Agar z cytrynianem ołowiu</td><td>Scientific</td><td>AGR1210</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>np. 957000H</td><td></td></tr><tr><td>Hydrofobowy długopis</td><td>Abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>Nephrin (1243-1256) Przeciwciało</td><td>Acris</td><td>BP5030</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Podocin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0372-200UL</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor Przeciwciało wtórne</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32732</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Podłoże montażowe z DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>NP40 Bufor do lizy komórek</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FNN0021</td><td></td></tr><tr><td>Halt Inhibitor proteazy i fosfatazy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78437X4</td><td></td></tr><tr><td>10x Bufor transferowy</td><td>BIORAD</td><td>1610734</td><td></td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC2002</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała drugorzędowe sprzężone z HRP</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże ECF do Western Blotting</td><td>Fisher</td><td>10713387</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV Odwrotna transkryptaza</td><td>New England Biolabs</td><td>M053S</td><td></td></tr><tr><td>Oligo dT</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18418012</td><td></td></tr><tr><td>Losowe podkłady</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>48190011</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18427088</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor rybonukleazy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>DEPC Woda</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Miskop światła fluorescencyjnego</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J Oprogramowanie do analizy</td><td>Image J</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR Termocykler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM Microscope</td><td>Britannica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ocena czynności nerek w mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Coraz powszechniejsze staje się używanie modeli mysich do naśladowania ludzkiej choroby nerek. Nasze badania koncentrują się na ocenie funkcji kłębuszków nerkowych u myszy z nefropatią cukrzycową i myszami z nokautem VEGF-A specyficznymi dla podocytów; Dlatego ten protokół opisuje pełne badanie nerek stosowane w naszym laboratorium do oceny tych mysich modeli choroby kłębuszków nerkowych, umożliwiając uzyskanie ogromnej ilości informacji na temat funkcji nerek i kłębuszków nerkowych od jednej myszy. W porównaniu z alternatywnymi metodami oceny funkcji kłębuszków nerkowych przedstawionymi w literaturze, zastosowanie metody opisanej w niniejszej pracy umożliwia pełną ocenę fenotypu kłębuszków nerkowych pod wieloma względami. Korzystając z tej metody, badacz może określić fenotyp nerki modelu i ocenić mechanizm, dlaczego fenotyp się rozwija. Te istotne informacje na temat mechanizmu choroby są niezbędne przy badaniu potencjalnych ścieżek terapeutycznych w tych modelach. Metody te pozwalają na szczegółową ocenę funkcjonalną bariery filtracyjnej kłębuszków nerkowych poprzez pomiar stosunku albuminy kreatyniny w moczu oraz przepuszczalności poszczególnych kłębuszków nerkowych, a także badanie strukturalne i ultrastrukturalne z wykorzystaniem mikroskopii barwnikowej i elektronowej Schiffa z zastosowaniem kwasu okresowego Schiffa. Ponadto analiza genów rozregulowanych na poziomie mRNA i białka umożliwia mechanistyczną analizę funkcji kłębuszków nerkowych. Protokół ten przedstawia ogólne, ale możliwe do dostosowania metody, które można zastosować do wszystkich mysich modeli choroby kłębuszków nerkowych.

Mocz pobierano za pomocą klatek metabolicznych od myszy typu dzikiego (WT), myszy z indukowalnym, podocytowo-specyficznym wyciszeniem genu VEGF-A (VEGF-A KO) oraz myszy VEGF-A KO X Neph-VEGF165b (myszy VEGF-A KO z konstytutywną nadekspresją ludzkiej izoformy VEGF-A165b w podocytach). Po pomiarze stosunku albumin do kreatyniny w moczu w 0, 4, 10 i 14 tygodniu po indukcji VEGF-A KO doksycyliną, u myszy VEGF-A KO rozwinęła się postępująca albuminuria do 10 tygodnia w porównaniu z kontrolnymi myszami WT z tego samego miotu. Wartości bezwzględne przedstawiono na Rysunku 2A, a wartości znormalizowane do poziomu wyjściowego dla każdej myszy na Rysunku 2B. Jednakże albuminurii nie zaobserwowano u myszy VEGF-A X Neph-VEGF-A165b (Rysunek 2), co wskazuje, że VEGF-A165b działa ochronnie w modelu albuminurii5.
Kuleczkowy LpAVi mierzono w pojedynczych kłębuszkach odsianych z nerek myszy WT, VEGF-A KO oraz VEGF-A X Neph-VEGF-A165b. Przykład uchwycenia kłębuszka oraz skurcz zaobserwowany podczas perfuzji 8% BSA przedstawiono na Rysunku 3A. Skurcz ten służy następnie do wyznaczenia kuleczkowego LpA/Vi dla każdego kłębuszka (Rysunek 3B). Myszy VEGF-A KO wykazywały istotnie zwiększony kuleczkowy LpA/Vi w 14. tygodniu po indukcji VEGF-KO w porównaniu z kłębuszkami kontrolnymi WT. Mimo że wartość ta była niższa u myszy VEGF-A X Neph-VEGF-A165b, nadekspresja VEGF-A165b nie zapobiegła zwiększeniu kuleczkowego LpA/Vi w 14. tygodniu5.
Barwienie PAS przekrojów kory nerek 14 tygodni po indukcji KO VEGF-A nie wykazało żadnych strukturalnych nieprawidłowości kłębuszków u myszy VEGF-A KO lub VEGF-A X Neph-VEGF-A165b (Rysunek 4A). Jednakże analiza ultrastruktury kłębuszków za pomocą EM wykazała, że u myszy VEGF-A KO rozwinęła się zwiększona szerokość GBM, zmniejszona liczba fenestr śródbłonka, zmniejszone pokrycie SPS oraz zwiększona średnia szerokość szczelin podocytów (Rysunek 4C-4F). Średnia szerokość wypustek stopowych podocytów oraz liczba szczelin pozostały bez zmian (Rysunek 3B i 3G). Nadekspresja VEGF-A165b u myszy VEGF-A KO zapobiegła zmianom w GBM i szerokości szczelin (Rysunek 4C i 4F). Natomiast VEGF-A165b nie wpłynęła na zmienioną liczbę fenestr i pokrycie SPS (Rysunek 4D i 4E)5.
Analiza RT-PCR przeprowadzona na RNA wyizolowanym z przesianych kłębuszków wykazała, że ludzkie mRNA VEGF-A165b występuje wyłącznie u myszy VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b (Rysunek 5A). Po wyizolowaniu białek z przesianych kłębuszków i ocenie ich poziomu metodą Western blotting stwierdzono, że ekspresja białkowa VEGFR-2 w kłębuszkach była obniżona u myszy VEGF-A KO, co zostało zapobiegnięte poprzez nadekspresję VEGF-A165b (Rysunek 5B i 5C)5.
<img alt="Schemat układu mikrofluidycznego; pułapkowanie komórek, przepływ dwukanałowy, proces enkapsulacji, pompa strzykawkowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schematyczna budowa zestawu do pomiaru przepuszczalności kłębuszkowej (LpA). (A) Kłębuszek zostaje uchwycony za pomocą (B) mikropipety w uchwycie przy użyciu ssania, który jest przymocowany do podstawy w celu zapewnienia stabilności. (C) Prostokątne mikropreparat. (D) Obiektyw mikroskopu 4X z kamerą wideo. (E) 1% roztwór BSA podgrzany do 37 °C. (F) 8% roztwór BSA podgrzany do 37 °C. (G) Zdalny zawór z dwiema liniami zawierającymi perifuzat, który umożliwia szybką wymianę perifuzatu. (H) Droga perifuzatu w kierunku mikropreparatu, który następnie obmywa kłębuszek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres przedstawiający zmiany uACR w ciągu tygodni w badaniu VEGF-A KO; wyniki analizy statystycznej danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Stosunek albumin do kreatyniny w moczu. (A) Wartości uACR w tygodniach 0, 4, 10 i 14 po indukcji VEGF-A KO u myszy WT, VEGF-A KO oraz VEGF-A X Neph-VEGF-A165b. (B) Te same wartości uACR znormalizowane do wartości bazowej (tydzień 0) dla każdej poszczególnej myszy. Wartość uACR istotnie wzrosła u myszy VEGF-A KO w tygodniach 10 i 14 w porównaniu z kontrolnymi myszami WT z tego samego miotu, co zostało zapobiegone u myszy VEGF-A X Neph-VEGF-A165b (*p &lt;0.05; dwuczynnikowa ANOVA, korekta dla porównań parzystych; n= 4 - 12 myszy na punkt czasowy; słupki błędów: standardowy błąd średniej [SEM]). Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Stevens et al5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Porównanie przepuszczalności naczyń krwionośnych; współczynnik ultrafiltracji; wykresy i mikrofotografia do analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Pomiar przepuszczalności kłębuszka dla wody. (A) Kłębuszek zostaje uchwycony mikropipetą za pomocą ssania; perfuzat zostaje zmieniony z 1% BSA (Ai) na 8% BSA (Aii), a następnie obserwuje się obkurczanie kłębuszka. (B) Pomiary wykonane przed i po zmianie na 8% BSA są wykorzystywane do wyznaczenia kłębuszkowego LpA/Vi. (C) U myszy VEGF-A KO stwierdzono zwiększony kłębuszkowy LpA/Vi w 14. tygodniu po indukcji VEGF-A KO w porównaniu z kontrolami WT. Nie zapobieżono temu w sposób znaczący u myszy VEGF-A X Neph-VEGF-A165b (*p &lt;0.05; jednoczynnikowa ANOVA, korekta Bonferroniego dla porównań parzystych; n = 4 - 9 myszy, 15 - 30 kłębuszków; słupki błędu: SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Histologia nerek i wykres słupkowy przedstawiający porównanie wpływu VEGF-A na strukturę i funkcję naczyń." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Analiza strukturalna kłębków nerkowych. (A) Barwienie PAS kory nerek nie wykazało żadnych nieprawidłowości strukturalnych w kłębkach myszy WT, VEGF-A KO oraz VEGF-A X Neph-VEGF-A165b (Ai - iii). EM ujawniła nieprawidłowości ultrastrukturalne w kłębkach myszy VEGF-A KO (Aiv - vi). (B) Średnia szerokość ścieżki podopodowej (FPW) nie różniła się między grupami. (C) Grubość błony podstawawnej kłębka (GBM) zwiększyła się w kłębkach myszy VEGF-A KO, co zostało zapobiegnięte przez VEGF-A165b. (D) Liczba fenestr była zmniejszona w kłębkach myszy VEGF-A KO, co nie uległo zmianie pod wpływem VEGF-A165b. (E) Pokrycie przez podocyty (SPS) było zmniejszone w kłębkach myszy VEGF-A KO, co również pozostało niezmienione pod wpływem VEGF-A165b. (F) Średnia szerokość szczelin była zwiększona w kłębkach myszy VEGF-A KO, co zostało zapobiegnięte przez VEGF-A165b. (G) Liczba szczelin nie różniła się między trzema grupami (*p &lt;0.05; jednoczynnikowa ANOVA, poprawka Bonferroniego dla porównań parzystych; n = 3 myszy, 9 kłębków; słupki błędów: SEM). Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Stevens et al5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Elektroforeza PCR i analiza Western blot; wykres słupkowy ekspresji VEGFR2 porównujący WT i VEGF-A KO." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Ekspresja mRNA i białek markerów. (A) RT-PCR wykazał, że ekspresja mRNA ludzkiego VEGF-A165b była widoczna jedynie w przesianych kłębkach nerkowych myszy VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b. (B) Western blotting wykazał, że ekspresja białka VEGFR-2 była obniżona w kłębkach nerkowych VEGF-A KO, co zostało zapobiegone w kłębkach nerkowych VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b (*p &lt;0.05; jednoczynnikowa analiza ANOVA, korekta Bonferroniego dla porównań par; n = 3- 6 myszy; słupki błędów: SEM). Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Stevens et al5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół opisuje pełne badanie nerek, które powinno być przeprowadzone na mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych. Metody te pozwalają na szczegółową analizę funkcjonalną, strukturalną i mechanistyczną funkcji kłębuszków nerkowych, którą można zastosować do wszystkich mysich modeli choroby kłębuszków nerkowych.

Ocena czynności nerek w mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chorób kłębuszków nerkowych dotyczące funkcjonalnego i strukturalnego fenotypu kłębuszków nerkowych oraz pozwala na mechanistyczną analizę patologii nerek. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją dostosować do wszystkich ocenianych modeli choroby kłębuszków nerkowych. Aby ocenić stosunek kreatyniny albuminy w moczu, umieść jednego sześcio- do ośmiotygodniowego samca myszy w metabolicznej klatce myszy zawierającej wodę i wzbogacający pokarm dietetyczny w cichym pomieszczeniu.Po sześciu godzinach przywróć mysz do jej zwykłej obudowy i zbierz co najmniej 50 mikrolitrów wyjściowej próbki moczu z każdej klatki, powtarzając zbieranie moczu od raz w tygodniu do raz w miesiącu. W punkcie końcowym doświadczenia należy pobrać nerki z brzucha każdego zwierzęcia i umyć narządy w lodowatym PBS. Aby zbadać kłębuszki korowe, usuń i pokrój jeden biegun kory nerkowej na jeden milimetrowy kawałek sześcienny.Aby zbadać głębokie kłębuszki nerkowe, usuń i pokrój w kostkę niewielką część rdzenia na jednomilimetrowe kawałki sześcienne. Następnie umieść fragmenty z każdego odcinka tkanki w indywidualnych fiolkach do mikroskopii elektronowej zawierających pięć mililitrów 2,5% roztworu aldehydu glutarowego i przechowuj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W celu badania histologicznego kłębuszków nerkowych i kłębuszków nerkowych należy usunąć i umocować górną trzecią część nerki w pięciu mililitrach 4% paraformaldehydu w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 24 godziny.Następnie przenieś utrwaloną tkankę do pięciu mililitrów 70% etanolu na 24 godziny przed zatopieniem w parafinie. W celu analizy immunofluorochemicznej kłębuszków korowych i szpikowych, umieść jedną trzecią nerki w formie tkankowej i zanurz tkankę w związku o optymalnej temperaturze cięcia. Następnie umieść formę na suchym lodzie, aż związek zostanie zamrożony i przechowuj próbki w temperaturze 80 stopni Celsjusza, aż zostaną podzielone na sekcje.W celu analizy białek umieść trzy na dwa milimetry sześcienne kory nerkowej w plastikowych probówkach o pojemności 0,5 mililitra i zatrzaskowo zamroź próbki w ciekłym azocie do przechowywania w temperaturze 80 stopni Celsjusza. W celu długotrwałego przechowywania tkanek do analizy RNA, po błyskawicznym zamrożeniu trzech na dwa milimetry sześcienne kawałków nerki, jak właśnie pokazano, dodaj pięć objętości roztworu stabilizującego RNazę do przechowywania w temperaturze 80 stopni Celsjusza. W celu wyizolowania kłębuszków nerkowych należy pokroić pozostałą tkankę nerkową i umieścić fragmenty tkanki w pięciu mililitrach roztworu obrączkowania u ssaków uzupełnionego 1% albuminą surowicy bydlęcej lub BSA na lodzie w celu natychmiastowego przesiania.Aby wyizolować kłębuszki nerkowe, ułóż sita z rosnącymi rozmiarami porów mikronów na szklanej zlewce i umieść plastry nerki na górnym sicie o wielkości porów 425 mikronów. Następnie użyj tłoka strzykawki i świeżego, lodowatego roztworu obrączkarza ssaków uzupełnionego 1% BSA, aby rozgnieść tkankę nerkową przez pierwsze sito. Gdy kawałki nerki są przepychane, zdejmij górne sito i kontynuuj przepychanie fragmentów nerki przez każde sito po kolei.Gdy pozostaną tylko sita o średnicy 100 i 70 mikronów, przenieś plon kłębuszków nerkowych zatrzymany przez ostatnie dwa sita do 50-mililitrowej stożkowej probówki z 10 mililitrami świeżego roztworu pierścienia ssaków uzupełnionego 1% BSA na lodzie. Podziel trzy mililitry zawiesiny kłębuszków nerkowych między dwie 1,5-mililitrowe probówki do mikrowirówek i osadź kłębuszki przez odwirowanie. Po usunięciu supernatantu zamroź kłębuszki nerkowe w ciekłym azocie w celu przechowywania w temperaturze 80 stopni Celsjusza w celu późniejszej ekstrakcji białka i RNA.Następnie umieść pozostały roztwór kłębuszków nerkowych w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu wstrzyknięcia do zestawu do przepuszczalności wody kłębuszkowej na stoliku mikroskopu świetlnego. Po schwytaniu nienaruszonego, pojedynczego kłębuszka nerkowego, uwolnij kapsułkę Bowmana i fragmenty rurkowe za pomocą mikropipety, rozpocznij nagrywanie i perfuzjuj kłębuszki nerkowy świeżym roztworem Ringera uzupełnionym 1% BSA. Po 30 sekundach zmień perfuzat na stężony 8% roztwór pierścienia BSA.Po 10 sekundach perfuzji przełącz perfuzat z powrotem na 1% roztwór dzwonka BSA i zatrzymaj nagrywanie. W celu szczegółowej wizualizacji komórek kłębuszków nerkowych i macierzy resztkowej, należy suszyć utrwalone, zatopione w parafinie próbki kory nerkowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, a następnie przeprowadzić deparafinowanie z kolejnymi zanurzeniami ksylenu i etanolu w dół. Ponownie uwodnić próbki w wodzie destylowanej przez pięć minut i inkubować szkiełka w roztworze kwasu okresowego w komorze wyciągowej.Po pięciu minutach przepłukać szkiełka trzema pięciominutowymi płukaniami w 100 mililitrach wody destylowanej, a następnie 15-minutową inkubacją w odczynniku Schiffa. Pod koniec inkubacji umyj szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez pięć minut i przeciwdziałaj barwieniu hematoksyliną przez trzy sekundy, a następnie dokładnie spłucz pod bieżącą wodą z kranu przez kolejne 15 minut. Następnie odwodnić szkiełka za pomocą wznoszących się zanurzeń w etanolu i dwóch kolejnych trzyminutowych zanurzeń w ksylenie.Po wysuszeniu na powietrzu szkiełka można zamontować za pomocą podłoża montażowego na bazie ksylenu w celu oceny ich struktury kłębuszkowej pod mikroskopem świetlnym przy 400-krotnym powiększeniu. U myszy z nokautem czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego lub VEGF-A rozwija się postępująca albuminuria przez 10 tygodni, w porównaniu z kontrolami z dzikiego miotu, podczas gdy zwierzęta z nadekspresją VEGF165b z nokautem są chronione przed tym stanem. Myszy z nokautem VEGF-A mają znacznie zwiększoną przepuszczalność wody kłębuszkowej w porównaniu z kontrolami typu dzikiego, co jest częściowo ratowane przez nadekspresję VEGF-A165b.Okresowe barwienie skrawków kory nerkowej kwasem Schiffa u myszy z nokautem VEGF-A nie ujawnia żadnych nieprawidłowości strukturalnych kłębuszków nerkowych w świetle analizy mikroskopowej. Jednak po analizie mikroskopii elektronowej myszy z nokautem wykazują zwiększoną szerokość błony podstawnej kłębuszków nerkowych, zmniejszoną liczbę okien śródbłonka, zmniejszone pokrycie przestrzeni subpodocytów i zwiększoną średnią szerokość szczeliny podocytów, podczas gdy średnia liczba szczelin pozostała niezmieniona. Nadekspresja VEGF165b u zwierząt z nokautem VEGF-A ratuje zmiany w błonie podstawnej kłębuszków nerkowych i szerokości szczeliny.Jednak nadekspresja VEGF165b nie wpływa na zmienioną liczbę okien ani pokrycie przestrzeni subpodocytów. RNA wyekstrahowane z przesianych kłębuszków nerkowych potwierdza ludzką ekspresję mRNA VEGF165b u myszy z nadekspresją VEGF165b, korelując ze zmniejszoną ekspresją VEGFR2 u myszy z nokautem VEGF-A, która jest ratowana przez nadekspresję VEGF165b w knocku u zwierząt. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać pełne badanie nerek w celu oceny mysiego modelu choroby kłębuszków nerkowych, w tym oceny przepuszczalności kłębuszków nerkowych zarówno dla albuminy, jak i wody.

assessment-of-kidney-function-in-mouse-models-of-glomerular-disease

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Pomiar współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR) jest złotym standardem oceny funkcji nerek. Tutaj opisujemy metodę wysokoprzepustową, która umożliwia określenie GFR u przytomnych myszy za pomocą pojedynczego wstrzyknięcia bolusa, oznaczenie izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-inuliny w osoczu i obliczenie GFR za pomocą dwufazowego modelu rozpadu wykładniczego.

Wysokoprzepustowa metoda pomiaru współczynnika filtracji kłębuszkowej u świadomych myszy

Opisujemy modele umiarkowanego i ciężkiego uszkodzenia nerek wywołanego niedokrwieniem i reperfuzją, w których myszy przechodzą jednostronne zaciskanie szypułki nerki, po którym następuje równoczesna lub opóźniona nefrektomia przeciwległa. Modele te konsekwentnie powodują dysfunkcję nerek i zwłóknienie pourazowe, ale ciężkość urazu i przeżycie zależą od pochodzenia myszy, wieku i sprzętu chirurgicznego.

Model niedokrwienno-reperfuzyjny ostrego uszkodzenia nerek i zwłóknienia pourazowego u myszy

Mysi model uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego nerek opisany tutaj składa się z prawej nefrektomii, która zapewnia tkankę kontrolną i zaciskania lewej szypułki nerki w celu wywołania niedokrwienia, które powoduje ostre uszkodzenie nerek. Model ten wykorzystuje laparotomię w linii środkowej, w której wszystkie kroki są wykonywane przez jedno nacięcie.

Uszkodzenie reperfuzyjne niedokrwienia nerek: mysi model urazu i regeneracji

Tutaj prezentujemy protokół do badania immunologii odrzucenia. Przedstawiony model chirurgiczny informuje o krótkim czasie operacji i zwięzłej technice. W zależności od kombinacji szczepu dawca-biorca, w przeszczepionej nerce może rozwinąć się ostre odrzucenie komórkowe lub przewlekłe uszkodzenie przeszczepu allogenicznego, zdefiniowane przez zwłóknienie śródmiąższowe i zanik kanalików słuchowych.

Przeszczep nerki u myszy: modele odrzucenia przeszczepu allogenicznego

Określenie współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR) jest złotym standardem do oceny ogólnej funkcji nerek. Jednak tradycyjne procedury pomiaru tego parametru są kłopotliwe i wymagają dużej inwestycji czasu. W tym miejscu opisujemy szybszą i minimalnie inwazyjną metodę przezskórnego oznaczania GFR.

Przezskórna ocena czynności nerek u świadomych gryzoni

Tutaj opisujemy protokół pomiaru współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR) u świadomych, swobodnie poruszających się myszy za pomocą transdermalnego monitora GFR.

Transdermalny pomiar szybkości filtracji kłębuszkowej u myszy

Ten artykuł opisuje metodę hodowli i analizy wyrostków komórek kłębuszkowych nabłonków ciemieniowych zamkniętych kłębuszków wyizolowanych z nerki myszy. Metoda ta może być stosowana do badania szlaków zaangażowanych w proliferację i migrację komórek nabłonka okładzinowego.

Rozrost kłębuszków nerkowych jako test ex vivo do analizy szlaków zaangażowanych w aktywację komórek nabłonka ciemieniowego

Tutaj prezentujemy protokół z wykorzystaniem mikroskopii 2-fotonowej u szczurów z Monachium Wistar Fromter z powierzchniowymi kłębuszkami nerkowymi w celu ilościowego określenia wpływu przedłużonej niedrożności moczowodu na dynamikę i funkcję kłębuszków nerkowych.

Wykorzystanie mikroskopii 2-fotonowej do ilościowego określenia wpływu przewlekłej jednostronnej niedrożności moczowodu na procesy kłębuszkowe

Ten protokół szczegółowo opisuje etapy chirurgiczne tworzenia mysiej wspólnej przetoki tętniczo-żylnej. Opracowaliśmy ten model do badania patofizjologii kończyn związanej z dostępem do hemodializy.

Mysi model dysfunkcji ręki związanej z dostępem do hemodializy

To badanie przedstawia łatwy w użyciu, kompletny i prosty zestaw metod do oznaczania i analizowania kłębuszków nerkowych z mysich nerek oczyszczonych metodą CUBIC. Dane, takie jak liczba i objętość kłębuszków nerkowych, można łatwo i niezawodnie uzyskać za pomocą dekstranu izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-Dextran, mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych (LSFM) lub popularnej mikroskopii konfokalnej i oprogramowania, takiego jak Imaris.

Wydajna i szybka metoda etykietowania i analizy kłębuszków mysich

W tym artykule przedstawiono model niedokrwiennej CKD z wykorzystaniem jednostronnego IRI nerki z kontralateralną nefrektomią wykonaną dzień przed pobraniem próbki; protokół ten umożliwia ocenę funkcjonalną opartą na surowicy, wysoką przeżywalność oraz powtarzalną patologię PREWKinek w ciągu 28 i 42 dni, zapewniając wszechstronną platformę do badań mechanistycznych i interwencyjnych.

Model myszy przejścia z ostrej do przewlekłej choroby nerek wywołanego niedokrwieniem nerek lub uszkodzeniem reperfuzyjnym

Poznaj kompleksową ocenę czynności nerek w mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych. Metoda obejmuje analizę albuminurii, izolację kłębuszków oraz badania mikroskopowe struktury nerek.

Ocena czynności nerek w mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych

Przeglądaj więcej filmów