Ocena czynności nerek w mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chorób kłębuszków nerkowych dotyczące funkcjonalnego i strukturalnego fenotypu kłębuszków nerkowych oraz pozwala na mechanistyczną analizę patologii nerek. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją dostosować do wszystkich ocenianych modeli choroby kłębuszków nerkowych. Aby ocenić stosunek kreatyniny albuminy w moczu, umieść jednego sześcio- do ośmiotygodniowego samca myszy w metabolicznej klatce myszy zawierającej wodę i wzbogacający pokarm dietetyczny w cichym pomieszczeniu.

Po sześciu godzinach przywróć mysz do jej zwykłej obudowy i zbierz co najmniej 50 mikrolitrów wyjściowej próbki moczu z każdej klatki, powtarzając zbieranie moczu od raz w tygodniu do raz w miesiącu. W punkcie końcowym doświadczenia należy pobrać nerki z brzucha każdego zwierzęcia i umyć narządy w lodowatym PBS. Aby zbadać kłębuszki korowe, usuń i pokrój jeden biegun kory nerkowej na jeden milimetrowy kawałek sześcienny.

Aby zbadać głębokie kłębuszki nerkowe, usuń i pokrój w kostkę niewielką część rdzenia na jednomilimetrowe kawałki sześcienne. Następnie umieść fragmenty z każdego odcinka tkanki w indywidualnych fiolkach do mikroskopii elektronowej zawierających pięć mililitrów 2,5% roztworu aldehydu glutarowego i przechowuj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W celu badania histologicznego kłębuszków nerkowych i kłębuszków nerkowych należy usunąć i umocować górną trzecią część nerki w pięciu mililitrach 4% paraformaldehydu w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 24 godziny.

Następnie przenieś utrwaloną tkankę do pięciu mililitrów 70% etanolu na 24 godziny przed zatopieniem w parafinie. W celu analizy immunofluorochemicznej kłębuszków korowych i szpikowych, umieść jedną trzecią nerki w formie tkankowej i zanurz tkankę w związku o optymalnej temperaturze cięcia. Następnie umieść formę na suchym lodzie, aż związek zostanie zamrożony i przechowuj próbki w temperaturze 80 stopni Celsjusza, aż zostaną podzielone na sekcje.

W celu analizy białek umieść trzy na dwa milimetry sześcienne kory nerkowej w plastikowych probówkach o pojemności 0,5 mililitra i zatrzaskowo zamroź próbki w ciekłym azocie do przechowywania w temperaturze 80 stopni Celsjusza. W celu długotrwałego przechowywania tkanek do analizy RNA, po błyskawicznym zamrożeniu trzech na dwa milimetry sześcienne kawałków nerki, jak właśnie pokazano, dodaj pięć objętości roztworu stabilizującego RNazę do przechowywania w temperaturze 80 stopni Celsjusza. W celu wyizolowania kłębuszków nerkowych należy pokroić pozostałą tkankę nerkową i umieścić fragmenty tkanki w pięciu mililitrach roztworu obrączkowania u ssaków uzupełnionego 1% albuminą surowicy bydlęcej lub BSA na lodzie w celu natychmiastowego przesiania.

Aby wyizolować kłębuszki nerkowe, ułóż sita z rosnącymi rozmiarami porów mikronów na szklanej zlewce i umieść plastry nerki na górnym sicie o wielkości porów 425 mikronów. Następnie użyj tłoka strzykawki i świeżego, lodowatego roztworu obrączkarza ssaków uzupełnionego 1% BSA, aby rozgnieść tkankę nerkową przez pierwsze sito. Gdy kawałki nerki są przepychane, zdejmij górne sito i kontynuuj przepychanie fragmentów nerki przez każde sito po kolei.

Gdy pozostaną tylko sita o średnicy 100 i 70 mikronów, przenieś plon kłębuszków nerkowych zatrzymany przez ostatnie dwa sita do 50-mililitrowej stożkowej probówki z 10 mililitrami świeżego roztworu pierścienia ssaków uzupełnionego 1% BSA na lodzie. Podziel trzy mililitry zawiesiny kłębuszków nerkowych między dwie 1,5-mililitrowe probówki do mikrowirówek i osadź kłębuszki przez odwirowanie. Po usunięciu supernatantu zamroź kłębuszki nerkowe w ciekłym azocie w celu przechowywania w temperaturze 80 stopni Celsjusza w celu późniejszej ekstrakcji białka i RNA.

Następnie umieść pozostały roztwór kłębuszków nerkowych w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu wstrzyknięcia do zestawu do przepuszczalności wody kłębuszkowej na stoliku mikroskopu świetlnego. Po schwytaniu nienaruszonego, pojedynczego kłębuszka nerkowego, uwolnij kapsułkę Bowmana i fragmenty rurkowe za pomocą mikropipety, rozpocznij nagrywanie i perfuzjuj kłębuszki nerkowy świeżym roztworem Ringera uzupełnionym 1% BSA. Po 30 sekundach zmień perfuzat na stężony 8% roztwór pierścienia BSA.

Po 10 sekundach perfuzji przełącz perfuzat z powrotem na 1% roztwór dzwonka BSA i zatrzymaj nagrywanie. W celu szczegółowej wizualizacji komórek kłębuszków nerkowych i macierzy resztkowej, należy suszyć utrwalone, zatopione w parafinie próbki kory nerkowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, a następnie przeprowadzić deparafinowanie z kolejnymi zanurzeniami ksylenu i etanolu w dół. Ponownie uwodnić próbki w wodzie destylowanej przez pięć minut i inkubować szkiełka w roztworze kwasu okresowego w komorze wyciągowej.

Po pięciu minutach przepłukać szkiełka trzema pięciominutowymi płukaniami w 100 mililitrach wody destylowanej, a następnie 15-minutową inkubacją w odczynniku Schiffa. Pod koniec inkubacji umyj szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez pięć minut i przeciwdziałaj barwieniu hematoksyliną przez trzy sekundy, a następnie dokładnie spłucz pod bieżącą wodą z kranu przez kolejne 15 minut. Następnie odwodnić szkiełka za pomocą wznoszących się zanurzeń w etanolu i dwóch kolejnych trzyminutowych zanurzeń w ksylenie.

Po wysuszeniu na powietrzu szkiełka można zamontować za pomocą podłoża montażowego na bazie ksylenu w celu oceny ich struktury kłębuszkowej pod mikroskopem świetlnym przy 400-krotnym powiększeniu. U myszy z nokautem czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego lub VEGF-A rozwija się postępująca albuminuria przez 10 tygodni, w porównaniu z kontrolami z dzikiego miotu, podczas gdy zwierzęta z nadekspresją VEGF165b z nokautem są chronione przed tym stanem. Myszy z nokautem VEGF-A mają znacznie zwiększoną przepuszczalność wody kłębuszkowej w porównaniu z kontrolami typu dzikiego, co jest częściowo ratowane przez nadekspresję VEGF-A165b.

Okresowe barwienie skrawków kory nerkowej kwasem Schiffa u myszy z nokautem VEGF-A nie ujawnia żadnych nieprawidłowości strukturalnych kłębuszków nerkowych w świetle analizy mikroskopowej. Jednak po analizie mikroskopii elektronowej myszy z nokautem wykazują zwiększoną szerokość błony podstawnej kłębuszków nerkowych, zmniejszoną liczbę okien śródbłonka, zmniejszone pokrycie przestrzeni subpodocytów i zwiększoną średnią szerokość szczeliny podocytów, podczas gdy średnia liczba szczelin pozostała niezmieniona. Nadekspresja VEGF165b u zwierząt z nokautem VEGF-A ratuje zmiany w błonie podstawnej kłębuszków nerkowych i szerokości szczeliny.

Jednak nadekspresja VEGF165b nie wpływa na zmienioną liczbę okien ani pokrycie przestrzeni subpodocytów. RNA wyekstrahowane z przesianych kłębuszków nerkowych potwierdza ludzką ekspresję mRNA VEGF165b u myszy z nadekspresją VEGF165b, korelując ze zmniejszoną ekspresją VEGFR2 u myszy z nokautem VEGF-A, która jest ratowana przez nadekspresję VEGF165b w knocku u zwierząt. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać pełne badanie nerek w celu oceny mysiego modelu choroby kłębuszków nerkowych, w tym oceny przepuszczalności kłębuszków nerkowych zarówno dla albuminy, jak i wody.