Identyfikacja markerów wirulencji Mycobacterium abscessus do replikacji wewnątrzkomórkowej w fagocytach

Badania przesiewowe bibliotek mutantów i badania transkryptomiczne patogenów wewnątrzkomórkowych mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące adaptacji genomicznych i regulacyjnych patogenów będących przedmiotem zainteresowania, które są wykorzystywane do przetrwania wewnątrz gospodarza. Głównymi zaletami tych technik jest to, że są to techniki badawcze na dużą skalę i zapewniają obiektywny wgląd w adaptację do życia wewnątrzkomórkowego. Implikacje tych technik rozciągają się w kierunku terapii Mycobacterium abscessus, które wiążą się z tą chorobą, dając wgląd w potencjalne cele terapii szczepionkowej.

Zacznij od hodowli ameby Acanthamoeba castellani, lub Ac, w 30 mililitrach pożywki z drożdżami peptonowymi i glukozą w kolbach do hodowli tkankowych o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych w temperaturze pokojowej. Po godzinie użyj pipety o pojemności 25 mililitrów, aby usunąć supernatant i przemyj komórki trzykrotnie 10 mililitrami buforu Ac bez węgla i azotu na pranie. Po ostatnim przepłukaniu odłączyć amebę od dna kolby pojedynczym energicznym wstrząsem i dostosować komórki w probówce Falcona do stężenia pięciokrotnego 10 do 5 ameb na promil w świeżym buforze Ac.

Wysiewaj pięć razy po 10 do czterech ameb na dołek w 96-dołkowej płytce. Umieść płytkę w temperaturze 32 stopni Celsjusza na godzinę bez wstrząsania, aby pływające trofo-zoity ameba przylgnęły do studzienek. W międzyczasie podgrzej bakterie na lodzie i dodaj pięć mikrolitrów rozmrożonych bakterii do każdej studzienki pod koniec inkubacji.

Po 1,5 godziny w temperaturze 32 stopni Celsjusza wyrzuć supernatant, odwracając płytkę na stos sterylnej gazy w wysterylizowanej metalowej tacy pod wyciągiem. Umyj każdą studzienkę trzy razy 200 mikrolitrami świeżego podłoża Ac na studzienkę. Po ostatnim płukaniu inkubować kokulturę z 20 mikrolitrami świeżej pożywki uzupełnionej amikacyną na dołek, aby wyeliminować wszelkie pozostałe prątki zewnątrzkomórkowe przez dwie godziny.

Następnie trzy prania w świeżym podłożu Ac, jak właśnie pokazano. Następnie dodaj 200 mikrolitrów pożywki, uzupełnionej świeżą amikacyną do każdej studzienki, a następnie dodaj pięć razy 10 do siedmiu inaktywowanych termicznie bakterii Escherichia coli. Po 48 godzinach poddać komórki lizie 10 mikrolitrów 10% dodecylosiarczanu sodu na studzienkę przez 30 minut w temperaturze 32 stopni Celsjusza i rozprowadzić pięć mikrolitrów lizatu na płytkach Columbia Agar zawierających 5% krwi owczej.

Dalej rozcieńczyć lizaty, dodając 25 mikrolitrów sterylnej wody na każdą kroplę. Gdy wszystkie lizaty zostaną platerowane, uszczelnij płytki plastikową folią parafinową i inkubuj kultury przez trzy do czterech dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Kiedy kolonie pojawią się na płytkach, sfotografuj kultury i zidentyfikuj mutanty upośledzone pod względem wzrostu wewnątrzkomórkowego przez osady o najmniejszej liczbie kolonii bakteryjnych.

W celu ekstrakcji RNA prątków wewnątrzkomórkowych najpierw wyhoduj M.abscessus w pożywce 7H9 uzupełnionej glicerolem i glukozą do środkowej fazy wykładniczej w 50-mililitrowych probówkach przy 120 obr./min. Pod koniec hodowli przemyj bakterie dwa razy 10 mililitrami buforu Ac na pranie i zmierz średnicę 600, aby oszacować stężenie bakterii. Następnie dodaj 8,5 razy 10 do ośmiu prątków do 8,5 razy 10 do sześciu ameb w 10 mililitrach świeżej pożywki Ac na godzinę inkubacji w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 80 obr./min.

Pod koniec inkubacji zbiera komórki przez odwirowanie i przemłukuje osad trzykrotnie w 10 mililitrach świeżego buforu Ac na przemycie w tych samych warunkach wirówki. Następnie ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach świeżego buforu Ac uzupełnionego amikacyną w celu wyeliminowania wszelkich bakterii zewnątrzkomórkowych i inkubować komórki przez cztery godziny w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 80 obr./min, a następnie dwa płukania w świeżym buforze Ac. Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić zainfekowane ameby w czterech mililitrach zimnego roztworu trzy, uzupełnionego 280 mikrolitrami beta merkaptoetanolu, aby rozbić ameby na lodzie przez 10 minut.

Pod koniec inkubacji odwirować lizat komórkowy, aby osadzać uwolnione bakterie wewnątrzkomórkowe i ponownie zawiesić osad bakteryjny w jednym mililitrze zimnego roztworu trzy. Ważne jest, aby usunąć cały supernatant, aby uniknąć zanieczyszczenia RNA ameby lub proteazami, które mogły stworzyć próbki. Zbierz uwolnione bakterie za pomocą drugiego wirowania i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu ekstrakcyjnego.

Następnie inkubować przez 24 godziny w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Przenieś roztwór prątków do dwóch mililitrowych probówek śrubowych zawierających kulki cyrkonu do znaku gradacji 500 mikrolitrów i przechowuj probówki przez kolejne 24 godziny w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza, aby ułatwić aktywację RNA syn i rozpuszczenie komórek. W dniu analizy rozmrozić próbki na lodzie i poddać komórki lizie za pomocą dwóch rund homogenizacji przy 6000 obr./min przez 25 sekund, a następnie jednej rundy homogenizacji przy 6000 obr./min przez 20 sekund.

Pomiędzy każdą rundą homogenizacji próbki należy schłodzić na lodzie przez jedną minutę, aby uniknąć degradacji RNA. Po trzeciej rundzie homogenizacji schłodzić próbki na lodzie przez 20 minut i dodać 200 mikrolitrów chloroformu rozcieńczonego w alkoholu izoamylowym do każdej probówki. Wirować przez jedną minutę, następnie odwirować próbki i dodać 0,8 mililitra zimnego izopropanolu do fazy wodnej na dwie do trzech godzin inkubacji w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji ponownie odwirować próbki i umyć granulki w 500 mikrolitrach zimnego 70% etanolu bez mieszania. Następnie natychmiast usuń etanol przez odwirowanie. Odessać supernatant do suszenia granulek w koncentratorze odśrodkowym i ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach wody wolnej od DNA/RNA.

Ekstrakcja prątkowatego MRNA, jak pokazano, umożliwia ocenę indukowanych i represjonowanych rodzin genów poprzez grupowanie genów zgodnie z ich rolami w reagowaniu na środowisko o ograniczonym źródle składników odżywczych i minerałów lub na środowisko niedotlenione lub kwaśne. W odporności na stres oksydacyjny i nitrozatywny lub w ekspresji czynników wirulencji w odpowiedzi na amebę środowiskową. Podejmując się tych procedur, należy pamiętać o jednoczesnym wykonaniu hodowli i izolacji RNA kontrolowanych i zakażonych próbek, aby uniknąć efektów wsadowych.

Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak sekwencjonowanie podwójnego RNA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące interakcji patogenów gospodarza. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie mikrobiologii w kierunku zjadliwości prątków w modelu gospodarza ameby. Nie zapominaj, że praca z amebami może być niezwykle niebezpieczna, ponieważ ameby mogą przekształcić się w torbiele, jeśli nie zastosujesz się do kroków opisanych w procedurze.