Kwantyfikacja kolonizacji i biegunki Vibrio cholerae w modelu dorosłego zerosłego danio pręgowanego
12 lipca 2018
Danio pręgowany jest naturalnym żywicielem Vibrio cholerae i może być używany do podsumowania i badania całego cyklu zakaźnego od kolonizacji do transmisji. Tutaj pokazujemy, jak ocenić poziom kolonizacji V. cholerae i określić ilościowo biegunkę u danio pręgowanego.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie vibrio cholerae, takie jak to, w jaki sposób vibrio cholerae kolonizuje Ciche Wybrzeże i konkuruje z mikrobiotą jelitową o stworzenie niszy. Główną zaletą tej techniki jest to, że ryby są naturalnym żywicielem vibrio cholerae, dzięki czemu możemy badać cały cykl życiowy vibrio cholerae. Procedurę zademonstrują Dhrubajyoti Nag, doktor habilitowany z mojego laboratorium i Paul Breen, doktorant z mojego laboratorium.
Po przygotowaniu kultur V.cholerae zaszczepić danio pręgowanego przez zanurzenie. Najpierw umieść cztery lub pięć danio pręgowanego w 400-mililitrowej zlewce zawierającej 200 mililitrów sterylnej wody infekcyjnej. Następnie dodaj jeden mililitr kultury V.cholerae dla pożądanego stężenia infekcji.
Następnie przykryj zlewkę perforowaną pokrywką. Po przygotowaniu wszystkich zlewek przenieś je do szklanego inkubatora przedniego ustawionego na 28 stopni Celsjusza W przypadku przejściowej ekspozycji, po około sześciu godzinach, wylej wodę ze zlewki przez siatkę na ryby, aby zebrać ryby. Zainfekowaną wodę należy wyrzucić do wybielacza, aby zabić bakterie.
Następnie umieść rybę w 200 mililitrach sterylnej wody infekcyjnej na pięć minut. Po pięciu minutach przepuść tę wodę przez siatkę rybacką, wrzucając wodę do wybielacza. Teraz ryba może trafić do nowej, czystej zlewki z 200 mililitrami sterylnej wody infekcyjnej.
Gdy eksperyment osiągnie pożądany punkt końcowy, należy pobrać 15 mililitrową próbkę wody infekcyjnej do celów diagnostycznych. Następnie zbierz ryby i odpowiednio zutylizuj zainfekowaną wodę. Ustaw brzuszną stronę do góry i zabezpiecz ciało szpilką przez dolną szczękę i drugą szpilką tuż za odbytem.
Odchyl oba kołki od korpusu. Następnie zetrzyj brzuszną powierzchnię ryby 70% etanolem. Następnie wysterylizuj skalpel i nożyczki Vannas za pomocą 70% etanolu i płomienia.
Teraz za pomocą skalpela wykonaj małe podłużne nacięcie w brzuchu, które przenika do łusek, ale naciąć tylko tak głęboko, jak skóra. Następnie nożyczkami ostrożnie przedłuż nacięcie wzdłuż ciała, nie tnąc głębiej niż na poziomie skóry. Unikaj przecinania odbytu.
Następnie wykonaj dwa boczne nacięcia w kierunku głowy, aby rozszerzyć otwór. Następnie przypnij skórę po obu stronach bocznych nacięć do powierzchni preparcyjnej, odchylając szpilki na zewnątrz, z dala od ciała. Przewód pokarmowy powinien być teraz widoczny jako bardzo cienka, blada rurka.
Teraz użyj dwóch par kleszczy sterylizowanych płomieniem, aby ostrożnie usunąć cały przewód pokarmowy, który może być dość delikatny. Przenieś tkankę do probówki hominizacyjnej zawierającej szklane kulki i jeden mililitr zimnego buforu. Następnie homogenizuj tkanki zgodnie z opisem w protokole tekstowym i określ ilościowo poziomy kolonizacji jelit.
Następnie wykonaj seryjne rozcieńczenia homogenatu jelitowego i buforu. Dla każdej ryby przygotuj pięć lub sześć dziesięciokrotnych rozcieńczeń w objętości jednego mililitra. Wiruj rurki do mieszania.
Następnie rozłóż 100 do 200 mikrolitrów każdego rozcieńczenia na płytkach agarowych LB zawierających streptomycynę i X-gal. Inkubować płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 16 do 18 godzin. Po całonocnej inkubacji policz kolonie V.cholerae na płytkach.
Bakterie te zazwyczaj wytwarzają bladoniebieskie kolonie na pożywce LB z X-galem. Jeśli zaobserwuje się kilka morfologii kolonii, nałóż kilka kolonii o każdej morfologii na inną płytkę TCBS. Na TCBS V.cholerae wytwarza duże, lekko spłaszczone żółte kolonie z nieprzezroczystymi środkami i półprzezroczystymi obrzeżami.
Aby określić poziom mucyny w biegunce ryb, wykonaj test na 96-dołkowej płytce. W trzech egzemplarzach załaduj 100 mikrolitrów wody infekcyjnej na każdy warunek testowy, w tym ślepą próbę, do studzienek. Następnie wymieszaj 50 mikrolitrów świeżego, 0,1% roztworu kwasu periodycznego z każdym dołkiem testowym.
Do wymieszania należy użyć pipetowania. Następnie zawiń płytkę szczelnie w folię i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do półtorej godziny. Po inkubacji schłodzić płytkę do temperatury pokojowej.
Do każdej studzienki dodaj 100 mikrolitrów roztworu Fuchsiny i wymieszaj z pipetowaniem. Teraz ponownie zawiń talerz i połóż go na bujaku w temperaturze pokojowej. Po około 20 minutach odczytaj płytkę z prędkością 560 nanometrów za pomocą czytnika płytek.
Aby określić ilościowo reakcję wywołaną przez mucynę w roztworze. Aby zmierzyć poziom białka w biegunce ryb, użyj testu Bradforda. Wymieszaj 66 mikrolitrów jednego z wzorców BSA lub 66 mikrolitrów wody infekcyjnej z 1 000 mikrolitrów odczynnika do testu Bradforda w jednorazowej kuwecie.
Teraz inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. A następnie odczytaj absorbancję przy 660 nanometrach na spektrofotometrze. Prostą miarą wielkości biegunki jest zmętnienie wody mierzone na głębokości 600 nanometrów.
Dobrze wymieszaj wodę, dodaj jeden mililitr do jednorazowej kuwety i dokonaj pomiaru. Do podstawowego, ślepego pomiaru użyj czystej wody infekcyjnej. Można również zmierzyć wydalane bakterie V.cholerae.
Można to zrobić z rybami, które po zaszczepieniu zostały przeniesione do czystej wody. Wykonaj seryjne rozcieńczenia roztworu wody w zbiorniku, jak opisano wcześniej. Następnie rozcieńczenia należy rozcieńczyć na selektywnych podłożach i inkubować płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 24 godziny.
Później policz kolonie zgodnie z wcześniejszym opisem, a następnie określ CFU. Grupy danio pręgowanego trzymane w 200 mililitrach wody zostały zaszczepione pięcioma milionami CFU pandemicznej. Po sześciu godzinach w wodzie zaatakowanej przez bakterie ryby przenoszą się do czystej wody na 18 godzin.
Następnie pobrano jelita powietrzne. Szacuje się, że każda ryba zawierała od 100 000 do 1 000 000 komórek V. cholerae. Woda infekcyjna została użyta do innych testów.
Poziom mucyny był wyższy, gdy dawki zakaźne były wyższe. Poziom OD600 w wodzie był znacznie wyższy, gdy ryby były zarażone V. cholerae. Wreszcie, całkowity poziom białka w zakażonej wodzie ryb był prawie dwukrotnie wyższy niż obserwowany w wodzie niezakażonych ryb.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zarazić dorosłego danio pręgowanego vibrio cholerae i określić ilościowo biegunkę wywołaną infekcją. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak testy transmisji, w celu oceny zakażenia ryb naiwnych przez wcześniej zakażone ryby.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Danio pręgowane stanowią naturalnego gospodarza dla Vibrio cholerae, co pozwala badaczom na analizę całego cyklu infekcyjnego, od kolonizacji po transmisję. Niniejszy artykuł opisuje metodę oceny poziomu kolonizacji V. cholerae oraz ilościowego określenia biegunki u danio pręgowanych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Choroby zakaźne
- Modele zwierzęce
Wstęp
- Rybki danio są skutecznymi modelami do badania infekcji V. cholerae.
- Metoda ta pozwala na obserwację kolonizacji oraz konkurencji z mikrobiotą jelitową.
- Zrozumienie cyklu życiowego V. cholerae jest kluczowe dla opracowania metod interwencyjnych.
- Niniejsze badanie dostarcza wiedzy na temat dynamiki infekcji u naturalnego gospodarza.
Cel badania
- Zaprezentowanie metody badania kolonizacji zebrafish przez V. cholerae.
- Ilościowe określenie wpływu V. cholerae na stan zdrowia zebrafish.
- Zbadanie interakcji między V. cholerae a mikrobiotą jelitową.
Zastosowane metody
- Przygotowanie kultur V. cholerae.
- Inokulacja danio pręgowanych poprzez zanurzenie w sterylnej wodzie infekcyjnej.
- Zastosowanie określonych stężeń V. cholerae do infekcji.
- Monitorowanie poziomu kolonizacji oraz biegunki u danio pręgowanych.
Główne wyniki
- Wykazano pomyślną kolonizację zebrafish przez V. cholerae.
- Ilościowe oznaczenie biegunki dostarczyło informacji na temat stopnia nasilenia infekcji.
- Metoda ta umożliwia szczegółową obserwację procesu infekcji.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia cyklu życiowego V. cholerae oraz interakcji z gospodarzem.
Wnioski
- Danio pręgowany stanowi cenny model do badania zakażeń V. cholerae.
- Opisana metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad vibrio cholerae.
- Zdobyta wiedza może wpłynąć na przyszłe strategie terapeutyczne w walce z cholerą.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia badaczom z sektora biofarmaceutycznego modelowanie oddziaływań gospodarz-patogen w naturalnym organizmie kręgowca, co wspiera walidację celów terapeutycznych dla strategii przeciwinfekcyjnych. Poprzez kwantyfikację kolonizacji i biegunki jako funkcjonalnych parametrów odczytu, metoda ta zapewnia mechanistyczną redukcję ryzyka dla związków celujących w wirulencję lub przetrwanie w jelitach Vibrio cholerae. System wykorzystujący danio pręgowanego zapewnia ciągłość translacyjną od etapu odkrywania do oceny przedklinicznej patogenów jelitowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących czynników kolonizacji i mechanizmów wirulencji V. cholerae.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny system oceny niezbędności genów dla przetrwania w organizmie gospodarza w kontekście fizjologicznie istotnym.
- Wartość strategiczna: Wspiera ustalanie priorytetów dla celów terapeutycznych poprzez powiązanie funkcji molekularnej z wynikami fenotypowymi w przebiegu infekcji.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe odczyty CFU i mucyn, co umożliwia przesiewowe badanie zależności dawka-odpowiedź dla związków przeciwvirulencyjnych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje kwantyfikację infekcji i biegunki w kohortach rybek danio pręgowanych w celu zapewnienia powtarzalności testu.
- Wartość strategiczna: Ułatwia średnioprzepustową ocenę wpływu związków na obciążenie patogenem oraz odpowiedź gospodarza.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Modeluje wydalanie biegunki istotną dla przebiegu choroby jako translacyjny biomarker patogenezy jelitowej.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużne pobieranie próbek wydalanych bakterii w celu oceny potencjału transmisji po leczeniu.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez korelację oddziaływania na cel z redukcją kolonizacji i biegunki.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w procesy badawcze od wczesnych etapów odkrywania leków po badania przedkliniczne, w których poziom kolonizacji dostarcza informacji o zaangażowaniu celu, a ilościowa ocena biegunki odzwierciedla skuteczność funkcjonalną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących czynników wirulencji poprzez mierzalne obciążenie jelitowe i odpowiedź gospodarza.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie testów poprzez standaryzowane wysiewanie CFU i ilościowe oznaczanie mucyn w celu przesiewania związków.
- Analityka: Dostarcza ilościowych zmiennych zależnych (CFU, OD600, poziomy białek) do porównywania warunków infekcji.
- Badania translacyjne: Łączy redukcję kolonizacji z łagodzeniem biegunki, wspierając ciągłość badań przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnie wykorzystywalną platformę do oceny wielu kandydatów na leki przeciwzakaźne w naturalnym modelu gospodarza.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w walidacji celu dzięki bezpośredniemu pomiarowi ładunku patogenu i patologii gospodarza.
- Wartość operacyjna: Zstandaryzowane protokoły zakażania, pobierania tkanek i analiz biochemicznych zapewniają powtarzalność.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez powiązanie inhibicji celu z obniżonym potencjałem transmisji.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie punktów końcowych dotyczących kolonizacji i biegunki.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z danio pręgowanym, procedurach zakażania oraz sekcji jelit.
- Wymaga dostępu do inkubatorów, sprzętu do wysiewania oraz spektrofotometrów do odczytu CFU i wyników analiz.
- Wymaga standaryzacji stężenia patogenu, czasu ekspozycji oraz parametrów wody we wszystkich eksperymentach.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania modelu przy rozszerzaniu go na inne patogeny jelitowe poza V. cholerae.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak zmienność rozmiaru ryb oraz kruchość jelit podczas sekcji.
Najczęściej zadawane pytania z zakresu biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:40
Inoculating Zebrafish with V. cholerae
1:49
Collecting Intestines and Assessing Bacterial Colonization
4:27
Metrics for Fish Diarrhea: Mucin Levels, Protein Levels, A600 and Excreted Bacteria
6:43
Results: Colonization and Diarrhea, 18 h After a 6 h Infection Period
7:35
Conclusion
