Name: Kwantyfikacja kolonizacji i biegunki Vibrio cholerae w modelu dorosłego zerosłego danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji kolonizacji Vibrio cholerae i biegunki u dorosłych danio pręgowanych. Ta technika pozwala badać cykl życiowy bakterii w naturalnym żywicielu i analizować interakcje z mikrobiotą jelitową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Podziękowania dla Melody Neely, Jona Allena, Basel Abuaita i Donny Runft za ich wysiłki w rozwoju modelu danio pręgowanego. Opisane tutaj badania były wspierane przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych Narodowych Instytutów Zdrowia pod numerami nagród R21AI095520 i R01AI127390 (dla Jeffreya H. Witheya). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Stanowego Wayne. Metoda ta została po raz pierwszy opisana w Runft i wsp.12
1. Określanie poziomów kolonizacji jelit
UWAGA: Kolonizacja jelit jest najbardziej użytecznym wskaźnikiem w modelu danio pręgowanego, ponieważ może być użyta do porównania względnej przydatności różnych szczepów V. cholerae lub efektów mutacji lub nokautów genów.
<ol>
	<li>Inokulacja danio pręgowanego przez zanurzenie 
	UWAGA: Ten sposób narażenia przypomina naturalny przebieg infekcji.
	<ol>
		<li>Preparat V. cholerae
		<ol>
			<li>Zaszczepić 5 ml bulionu lizogenicznego (LB) izolowaną kolonią V. cholerae z płytki LB i inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (180 obr./min) przez 6–8 godzin (hodowla przez noc).</li>
			<li>Zaszczepić 25 ml świeżej autoklawizowanej pożywki LB w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml z 50 μl powyższej kultury przez noc. Inkubować przez 16–18 godzin w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (150 obr./min).</li>
			<li>Odczytać gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) rozcieńczenia nocnej kultury w stosunku 1/10, aby oszacować liczbę bakterii na ml (OD600 = 1 wynosi ~109 CFU/ml).</li>
			<li>Zebrać komórki przez odwirowanie z prędkością 6 000 g przez 10 minut. Usunąć pożywkę za pomocą pipety lub przelać ją do roztworu dezynfekującego. Zawiesić komórki w sterylnym PBS do pożądanego stężenia, zwykle między 1 x 107 do 1 x 1010 na ml PBS. 
			UWAGA: Tutaj odnosimy się do autoklawizowanej wody z odwróconej osmozy zawierającej 60 mg/l soli morskich jako sterylnej wody infekcyjnej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Inokulacja i inkubacja
		<ol>
			<li>Umieść cztery lub pięć danio pręgowanego w zlewce o pojemności 400 ml zawierającej 200 ml sterylnej wody infekcyjnej.</li>
			<li>Dodać 1 ml V. cholerae (z kroku 1.1.1.4.), aby uzyskać pożądane stężenie infekcji (zwykle 5 x 104 do 5 x 107 CFU/ml) w 200 ml wody infekcyjnej.</li>
			<li>Przykryj zlewkę perforowaną pokrywką, aby ryba nie wyskoczyła; dobrze nadaje się do tego górna część pudełka na końcówki o pojemności 200 μl.</li>
			<li>Oznaczyć każdą zlewkę i umieścić ją w inkubatorze ze szklanym frontem ustawionym na temperaturę 28 °C na czas trwania doświadczenia.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Procedura dla narażenia przejściowego 
		UWAGA: Przejściowe narażenie na V. cholerae (zwykle 6 godzin), po którym następuje usunięcie bakterii zaszczepiających, jest przydatne do badania transmisji i dokładniejszego określenia ilościowego wydalanych bakterii.
		<ol>
			<li>Po 6 godzinach ekspozycji wylej wodę ze zlewki przez siatkę, aby zebrać rybę. Wylej zainfekowaną wodę do pojemnika z wybielaczem, aby zabić V. cholerae.</li>
			<li>Umieść usuniętą rybę w zlewce z 200 ml sterylnej wody infekcyjnej. Pozwól rybie pływać w tej czystej wodzie przez 5 minut, aby usunąć bakterie powierzchniowe z ryby.</li>
			<li>Powtórzyć procedurę z siatką (krok 1.2.2) i umieścić rybę w nowej zlewce z 200 ml sterylnej wody infekcyjnej. Trzymaj rybę w tej zlewce na czas trwania eksperymentu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>eutanazja
	<ol>
		<li>Gdy eksperyment osiągnie pożądany punkt końcowy, należy pobrać próbkę wody infekcyjnej (zwykle wystarcza 15 ml), aby umożliwić zmniejszenie liczby wydalanych bakterii i pomiar biegunki (np. test mucyny, zawartość białka i/lub OD), jeśli jest to pożądane (sekcja 2).</li>
		<li>Pozostałą część wody przelej przez siatkę rybacką (aby zebrać ryby) do wybielacza, aby zabić V. cholerae w wodzie.</li>
		<li>Umieścić rybę w zlewce zawierającej wodę infekcyjną oraz 336 μg/ml metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu (trikainy) i inkubować ryby w roztworze trikainy przez 20 minut w temperaturze RT. 
		UWAGA: Siatki rybackie zostały wysterylizowane 10% roztworem wybielacza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwarstwienie
	<ol>
		<li>Przygotowanie ryb
		<ol>
			<li>Wyjmij rybę z roztworu tricainy za pomocą jednorazowej plastikowej łyżki i umieść ją na powierzchni preparucyjnej.</li>
			<li>Ustaw rybę brzuszną stroną skierowaną do góry i przypnij ją przez dolną szczękę, tak aby koniec szpilki był odchylony od środka ciała. Umieść kolejną szpilkę tuż za odbytem, również pod kątem od ciała.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Odsłonięcie przewodu pokarmowego
		<ol>
			<li>Przetrzyj brzuszną powierzchnię ryby niestrzępiącą się chusteczką zamoczoną w 70% etanolu.</li>
			<li>Wysterylizuj skalpel i nożyczki Vannas, zanurzając je w 70% etanolu i paląc.</li>
			<li>Wykonaj małe nacięcie wzdłuż brzucha tuż pod skórą, penetrując łuski i używając skalpela. Uważaj, aby nie ciąć zbyt głęboko, ponieważ przewód pokarmowy znajduje się tuż pod skórą.</li>
			<li>Za pomocą nożyczek ostrożnie rozciągnij nacięcie wzdłuż ciała, nie przecinając głębiej niż poziom skóry i omijając odbyt.</li>
			<li>Wykonaj dwa boczne nacięcia nożyczkami w kierunku głowy ryby, aby umożliwić otwarcie nacięcia.</li>
			<li>Przypnij skórę po obu stronach bocznych nacięć do powierzchni preparcyjnej, odchylając szpilki na zewnątrz, z dala od ciała. 
			UWAGA: Końcówki szpilek były wcześniej sterylizowane poprzez podpalenie ich alkoholem.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Usunięcie przewodu pokarmowego 
		UWAGA: Przewód pokarmowy powinien być widoczny jako blada, bardzo cienka rurka na wierzchu innych narządów.
		<ol>
			<li>Wysterylizuj kleszcze płomieniowo, a następnie użyj ich do usunięcia całego przewodu pokarmowego (zwykle o długości 12–15 mm). Umieścić jelito w probówce homogenizacyjnej zawierającej szklane kulki (patrz kroki 1.4.1–1.4.2) i 1 ml 1x PBS lub LB na lodzie.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>homogenizacja
	<ol>
		<li>Przygotuj probówki homogenizacyjne wcześniej, wlewając ~1,5 g szklanych kulek o średnicy 1 mm do probówek z nakrętką o pojemności 2 ml (napełnij je mniej więcej do połowy), a następnie wysterylizuj je w autoklawie.</li>
		<li>Dodaj 1 ml sterylnego LB lub 1x PBS.</li>
		<li>Po dodaniu jelit danio pręgowanego (krok 1.3.3.1) do probówek, bardzo mocno zakręć nakrętki, a następnie zabezpiecz probówki w homogenizatorze wirowym.</li>
		<li>Homogenizować próbki przez 1 minutę na maksymalnym ustawieniu, a następnie schłodzić je na lodzie przez 1–2 minuty. Powtórzyć ten cykl homogenizacji jeszcze raz, aby uzyskać pełną homogenizację. 
		Uwaga: Sprawdzi się również kilka alternatywnych metod homogenizacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja poziomów kolonizacji jelit
	<ol>
		<li>Przygotować probówki (małe szklane probówki lub probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml) do seryjnego rozcieńczania homogenatu, dodając do każdej probówki 900 μl LB lub 1x PBS. Dla każdej ryby przygotuj 5–6 probówek i wykonaj 10-krotne seryjne rozcieńczenia homogenatu jelitowego, dodając 100 μl homogenatu do pierwszej probówki, wirując go w celu wymieszania, a następnie dodając 100 μl z pierwszej probówki do drugiej probówki.</li>
		<li>Powtarzaj tę procedurę, aż wszystkie rozcieńczenia zostaną przygotowane.</li>
		<li>Umieścić 100–200 μl każdego rozcieńczenia na płytkach agarowych LB zawierających 100 μg/ml streptomycyny (w przypadku stosowania szczepów odpornych na streptomycynę) i 40 μg/ml X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopiranozydu). Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 16–18 godzin.</li>
		<li>Po całonocnej inkubacji należy policzyć kolonie V. cholerae na płytkach, używając automatycznego licznika kolonii lub ręcznie licząc kolonie; pomocne jest oznaczenie policzonych kolonii końcówką markera.</li>
		<li>Oznaczyć jtk na jelito ryby, mnożąc liczbę płytek przez współczynnik rozcieńczenia zawiesiny, biorąc pod uwagę objętość, która została platerowana.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pomiar biegunki ryb
UWAGA: Do oceny biegunki ryb użyto czterech różnych wskaźników: poziom mucyny w wodzie, ogólny poziom wydalanego białka w wodzie, OD600 w wodzie i V. cholerae CFU w wodzie13. Biegunka zwykle staje się widoczna wizualnie po około 6 godzinach od ekspozycji danio pręgowanego na V. cholerae, jak opisano powyżej.
<ol>
	<li>Określ poziom mucyny 
	UWAGA: Wydzielanie mucyny jest indukowane podczas kolonizacji V. cholerae i jest dobrą miarą poziomu wydalania, szczególnie we wczesnym okresie infekcji13. Test mucyny jest odmianą testu Schiffa na mikromiano kwasu okresowego < klasa sup = "xref">19.
	<ol>
		<li>Przygotuj następujące materiały: 50% (w/v) roztwór podstawowy kwasu okresowego i 0,1% roztwór roboczy kwasu okresowego (10 μl 50% roztworu kwasu okresowego dodane do 5 ml 7% kwasu octowego - zużyć natychmiast po przygotowaniu), wzorce mucyny, 96-dołkowe płytki do mikromiareczkowania, odczynnik Schiffa.
		<ol>
			<li>Przygotować wzorce mucyny, zawieszając następujące ilości mucyny (z żołądka świni typu III) w buforze octanu sodu (100 mM octan sodu, 5 mM EDTA, pH do 5,5 z lodowatym kwasem octowym): 400 μg/ml, 300 μg/mL, 200 μg/ml, 150 μg/ml, 100 μg/mL, 75 μg/ml, 50 μg/ml, 25 μg/ml i 10 μg/ml. 
			Przygotować płytkę, dodając 100 μl wody infekcyjnej do każdej studzienki, która zostanie użyta w teście, w następujący sposób: ślepa próba 1x PBS; roztwory wzorcowe mucyny, jak opisano powyżej, lub próbkę wody z zakażenia ryb. Każdą próbkę należy wykonać w trzech egzemplarzach.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dodać 50 μl świeżego 0,1% roztworu kwasu okresowego do każdego dołka za pomocą pipety wielokanałowej i wymieszać, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół.</li>
		<li>Owinąć płytkę szczelnie w folię spożywczą i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1–1,5 godziny.</li>
		<li>Schłodzić płytkę do temperatury pokojowej przez 5–10 minut. Dodać 100 μl roztworu Fuchsiny (odczynnik Schiffa) do każdej studzienki i pipetować w górę i w dół, aby wymieszać.</li>
		<li>Zawinąć płytkę w folię spożywczą i inkubować w temperaturze pokojowej na platformie kołyszącej, aż do uzyskania koloru; kolor rozwija się zazwyczaj w ciągu 20 minut. Odczytać absorbancję przy długości fali 560 nm za pomocą czytnika płytek.</li>
		<li>Wykreślić krzywą wzorcową mucyny (OD560 w porównaniu z μg/ml wzorca mucyny). Określ poziomy mucyny w niewiadomych, identyfikując, gdzie OD560 każdej niewiadomej przypada na krzywej standardowej i odczytując odpowiednie stężenie mucyny dla tej wartości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ poziom białka 
	UWAGA: Oprócz mucyny, ogólny poziom białka w wodzie jest kolejnym wskaźnikiem poziomu biegunki (mętny, płynny stolec) wytwarzany przez ryby. W tej procedurze wykorzystuje się standardowy test Bradforda do oszacowania poziomu białka. Poziomy białka są szacowane na podstawie krzywej wzorcowej albuminy surowicy bydlęcej (BSA).
	<ol>
		<li>Zmieszać 100 μl jednego z wzorców BSA (patrz uwaga poniżej) lub 100 μl wody infekcyjnej (woda ze zlewki zawierającej zakażoną rybę) z 900 μl odczynnika do oznaczania białka Bradforda (odczynnik do testu białka Pierce'a dobrze się do tego nadaje) w jednorazowej kuwecie. Inkubować wszystkie próbki w temperaturze pokojowej przez 2 minuty 
		Uwaga: Zastosowano następujące normy BSA: 1 800 μg/ml, 1 000 μg/ml, 750 μg/ml, 500 μg/mL, 250 μg/ml, 125 μg/mL, 50 μg/ml i 25 μg/ml. Wzorce BSA rozcieńczono w autoklawizowanej wodzie destylowanej.</li>
		<li>Odczytaj OD660 każdej normy lub pobierz je za pomocą spektrofotometru.</li>
		<li>Wykreślić krzywą wzorcową BSA (OD660 w porównaniu z μg/ml). Określić poziomy białka niewiadomych, identyfikując, gdzie OD660 każdej nieznanej przypada na krzywą standardową BSA i odczytać odpowiednie stężenie mucyny dla tej wartości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar OD600 
	UWAGA: Obecność biegunki (mętny, płynny stolec) jest widocznie widoczna po kilku godzinach, a do jej ilościowego określenia można użyć prostego oznaczenia OD600.
	<ol>
		<li>Kilkakrotnie odwróć probówkę zawierającą wodę infekcyjną, aby równomiernie rozprowadzić zawartość. Dodaj 1 ml próbki wody do jednorazowej kuwety. Użyj 1 ml sterylnej wody infekcyjnej jako kontroli ujemnej.</li>
		<li>Wykonać "ślepą" próbę przy użyciu spektrofotometru przy długości fali 600 nm przy użyciu ujemnej próbki kontrolnej. Odczytaj każdą próbkę wody o długości fali 600 nm i zapisz wyniki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznaczanie wydalanej V. cholerae jtk/ml po zakażeniu 
	UWAGA: Głównym składnikiem biegunki wytwarzanej przez danio pręgowanego jest wydalany V. cholerae. Oznaczenie jtk/ml może być wykorzystane do celów takich jak oszacowanie replikacji bakterii w przewodzie pokarmowym ryb oraz jako miara dawki zakaźnej w doświadczeniach transmisyjnych. Środek ten najlepiej wykonać, gdy wystąpiła przejściowa infekcja. Jeśli stosuje się infekcję trwającą 24 godziny, test ten zmierzy połączone inokulum oraz wydalone V. cholerae.
	<ol>
		<li>Pobrać próbkę wody w żądanym punkcie czasowym i seryjnie ją rozcieńczyć zgodnie z wcześniejszym opisem.</li>
		<li>Rozcieńczenia seryjne należy rozcieńczyć na pożywkach selektywnych (agar LB zawierający streptomycynę lub inny odpowiedni antybiotyk lub DCLS) i inkubować w temperaturze 30 °C przez 24 godziny.</li>
		<li>Policz kolonie. Obliczyć jtk na ml wody zgodnie z opisem w kroku 1.5.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Harris, J. B., LaRocque, R. C., Qadri, F., Ryan, E. T., Calderwood, S. B. <a target="_blank" href="http://www.thelancet.com/journals/lancet/article/PIIS0140-6736(12)60436-X/abstract">Cholera.</a> The Lancet. 379 (9835), 2466-2476 (2012).</li>
<li>Dutta, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+cholerae+non-O1%2C+non-O139+serogroups+and+cholera-like+diarrhea%2C+Kolkata%2C+India%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Vibrio cholerae non-O1, non-O139 serogroups and cholera-like diarrhea, Kolkata, India.</a> Emerging Infectious Diseases. 19 (3), 464-467 (2013).</li>
<li>Huq, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecological+relationships+between+Vibrio+cholerae+and+planktonic+crustacean+copepods%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Ecological relationships between Vibrio cholerae and planktonic crustacean copepods.</a> Applied and Environmental Microbiology. 45 (1), 275-283 (1983).</li>
<li>Halpern, M., Landsberg, O., Raats, D., Rosenberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturable+and+VBNC+Vibrio+cholerae%3A+interactions+with+chironomid+egg+masses+and+their+bacterial+population%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Culturable and VBNC Vibrio cholerae: interactions with chironomid egg masses and their bacterial population.</a> Microbial Ecology. 53 (2), 285-293 (2007).</li>
<li>Broza, M., Halpern, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen+reservoirs.+Chironomid+egg+masses+and+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pathogen reservoirs. Chironomid egg masses and Vibrio cholerae.</a> Nature. 412 (6842), 40(2001).</li>
<li>Halpern, M., Izhaki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+as+hosts+of+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fish as hosts of Vibrio cholerae.</a> Frontiers in Microbiology. 8 (282), (2017).</li>
<li>Senderovich, Y., Izhaki, I., Halpern, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+as+reservoirs+and+vectors+of+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Fish as reservoirs and vectors of Vibrio cholerae.</a> PLoS ONE. 5 (1), e8607(2010).</li>
<li>Traore, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+Vibrio+cholerae+in+fish+and+water+from+a+reservoir+and+a+neighboring+channel+in+Ouagadougou%2C+Burkina+Faso%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infection+in+Developing+Countries%22%5BJournal%5D)">Occurrence of Vibrio cholerae in fish and water from a reservoir and a neighboring channel in Ouagadougou, Burkina Faso.</a> The Journal of Infection in Developing Countries. 8 (10), 1334-1338 (2014).</li>
<li>Booth, L. V., Lang, D. A., Athersuch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Vibrio+cholerae+non-01+from+a+Somerset+farmworker+and+his+tropical+fish+tank%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection%22%5BJournal%5D)">Isolation of Vibrio cholerae non-01 from a Somerset farmworker and his tropical fish tank.</a> Journal of Infection. 20 (1), 55-57 (1990).</li>
<li>Torres-Vitela, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://jfoodprotection.org/doi/abs/10.4315/0362-028X-60.3.237">Incidence of Vibrio cholerae in fresh fish and ceviche in Guadalajara, Mexico.</a> Journal of Food Protection. 60 (3), 237-241 (1997).</li>
<li>Rowe, H. M., Withey, J. H., Neely, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+zoonotic+aquatic+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+%26+Comparative+Immunology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for zoonotic aquatic pathogens.</a> Developmental & Comparative Immunology. 46 (1), 96-107 (2014).</li>
<li>Runft, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+natural+host+model+for+Vibrio+cholerae+colonization+and+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a natural host model for Vibrio cholerae colonization and transmission.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1710-1717 (2014).</li>
<li>Mitchell, K. C., Breen, P., Britton, S., Neely, M. N., Withey, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Vibrio+cholerae+enterotoxicity+in+a+zebrafish+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantifying Vibrio cholerae enterotoxicity in a zebrafish infection model.</a> Applied and Environmental Microbiology. , (2017).</li>
<li>Klose, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+suckling+mouse+model+of+cholera%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The suckling mouse model of cholera.</a> Trends in Microbiology. 8 (4), 189-191 (2000).</li>
<li>Formal, S. B., Kundel, D., Schneider, H., Kunevn,, Sprinz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+with+Vibrio+cholerae+in+the+ligated+loop+of+the+rabbit+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Studies with Vibrio cholerae in the ligated loop of the rabbit intestine.</a> British Journal of Experimental Pathology. 42, 504-510 (1961).</li>
<li>Williams, E. M., Dohadwalla, A. N., Dutta, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diarrhea+and+accumulation+of+intestinal+fluid+in+infant+rabbits+infected+with+Vibrio+cholerae+in+an+isolated+jejunal+segment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Diarrhea and accumulation of intestinal fluid in infant rabbits infected with Vibrio cholerae in an isolated jejunal segment.</a> The Journal of Infectious Diseases. 120 (6), 645-651 (1969).</li>
<li>Spira, W. M., Sack, R. B., Froehlich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+adult+rabbit+model+for+Vibrio+cholerae+and+enterotoxigenic+Escherichia+coli+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Simple adult rabbit model for Vibrio cholerae and enterotoxigenic Escherichia coli diarrhea.</a> Infection and Immunity. 32 (2), 739-747 (1981).</li>
<li>Ritchie, J. M., Rui, H., Bronson, R. T., Waldor, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back+to+the+future%3A+studying+cholera+pathogenesis+using+infant+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Back to the future: studying cholera pathogenesis using infant rabbits.</a> mBio. 1 (1), (2010).</li>
<li>Kilcoyne, M., Gerlach, J. Q., Farrell, M. P., Bhavanandan, V. P., Joshi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodic+acid-Schiff%27s+reagent+assay+for+carbohydrates+in+a+microtiter+plate+format%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Periodic acid-Schiff's reagent assay for carbohydrates in a microtiter plate format.</a> Analytical Biochemistry. 416 (1), 18-26 (2011).</li>
<li>Balaji, V., Sridharan, G., Jesudason, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity+of+non+O1%2C+non+O139+Vibrios+isolated+from+fresh+water+bodies+in+Vellore%2C+south+India%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Medical+Research%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity of non O1, non O139 Vibrios isolated from fresh water bodies in Vellore, south India.</a> Indian Journal of Medical Research. 110, 155-159 (1999).</li>
<li>Hasan, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nontoxigenic+Vibrio+cholerae+non-O1%2FO139+isolate+from+a+case+of+human+gastroenteritis+in+the+U.S.+Gulf+Coast%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Nontoxigenic Vibrio cholerae non-O1/O139 isolate from a case of human gastroenteritis in the U.S. Gulf Coast.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 9-14 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Danio pręgowany jest stosunkowo nowym modelem do badania V. cholerae, ale niesie ze sobą wiele nadziei na przyszłe odkrycie wcześniej nieznanych aspektów biologii i patogenezy V. cholerae 11,12,13. Model dorosłego ryba pręgowanego ma tę zaletę, że jest zarówno naturalnym żywicielem V. cholerae, który zawiera nienaruszoną, dojrzałą mikrobiotę jelitową, jak i modelem środowiskowym. Wadą modelu jest to, ż...

Vibrio cholerae to wodna, Gram-ujemna bakteria, która powoduje chorobę człowieka cholerę, a także sporadyczną biegunkę1,2. V. cholerae występuje w środowisku w wielu rejonach globu, często związany z innymi organizmami wodnymi. Te organizmy stowarzyszone obejmują plankton, masy jaj owadów, skorupiaki i gatunki ryb kręgowych3,4,5,6,7. W kilku badaniach wyizolowano V. cholerae z przewodu pokarmowego ryb w różnych obszarach geograficznych7,8,9,10. Obecność V. cholerae w rybach wskazuje, że ryby mogą pełnić rolę rezerwuaru środowiskowego. Ryby mogą być również zamieszane w przenoszenie choroby na ludzi i w geograficzne rozprzestrzenianie się szczepów V. cholerae6.
Aby lepiej zrozumieć, jak V. cholerae oddziałuje z rybami, Danio rerio, lepiej znany jako danio pręgowany, został opracowany jako modelowy system do badania V.e11. Danio pręgowany pochodzi z południowej Azji, w tym z regionu Zatoki Bengalskiej, który jest uważany za najwcześniejszy zbiornik V. cholerae. Przed pierwszą pandemią, która rozpoczęła się w 1817 roku, nie została zgłoszona poza terenami dzisiejszych Indii i Bangladeszu. W związku z tym danio pręgowany i V. cholerae prawie na pewno kojarzyły się ze sobą w ewolucyjnych skalach czasowych, co sugeruje, że danio pręgowany jest żywicielem V. cholerae w naturalnym środowisku12.
Model danio pręgowanego dla V. cholerae jest prosty do wykonania i może być używany do badania całego cyklu życia patogennego V. cholerae. Ryby są narażone na V. cholerae poprzez kąpiel w wodzie, która została zaszczepiona znaną liczbą V. cholerae. W ciągu kilku godzin następuje kolonizacja jelit, a następnie wytwarzanie biegunki. Biegunka składa się z mucyny, białek, wydalanych bakterii i innej treści jelitowej. Stopień biegunki można określić ilościowo za pomocą kilku prostych pomiarów13. V. cholerae, która została wydalona przez zakażone ryby, może następnie zarazić naiwne ryby, kończąc cykl zakaźny. W związku z tym model danio pręgowanego podsumowuje proces choroby człowieka V. cholerae12,14.
Najczęściej używanymi modelami zwierzęcymi V. cholerae były historycznie myszy i króliki14,15,16,17,18. Modele te odegrały zasadniczą rolę w poszerzeniu naszej wiedzy na temat patogenezy V. cholerae. Ponieważ jednak myszy i króliki nie są naturalnymi żywicielami V. cholerae, istnieją ograniczenia co do tego, jakie aspekty cyklu życiowego V. cholerae można badać. Kolonizacja V. cholerae u myszy i królików zazwyczaj wymaga braku mikrobioty jelitowej lub wstępnego leczenia antybiotykami w celu uszkodzenia mikrobioty jelitowej. Oba modele wymagają albo zgłębnika, aby wprowadzić bakterie do przewodu pokarmowego, albo manipulacji chirurgicznej, aby bezpośrednio wstrzyknąć bakterie do jelit. Danio pręgowany ma tę zaletę, że dorosłe ryby z nienaruszoną mikrobiotą jelitową są łatwo skolonizowane, a proces zakaźny zachodzi naturalnie, bez konieczności jakiejkolwiek manipulacji.
Obecna praca pokazuje wykorzystanie danio pręgowanego jako modelu w zakażeniu V. cholerae. Infekcja, rozwarstwienie, wyliczenie kolonizacji V. cholerae i kwantyfikacja biegunki wywołanej przez V. cholerae zostaną opisane12,13. Model ten może być przydatny dla naukowców zainteresowanych zarówno procesem choroby V. cholerae, jak i środowiskowym stylem życia V. cholerae.

<table><tbody><tr><td>Instrument</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaker inkubator</td><td>New Brunswick Scientific, Edison, NJ</td><td>Excella E25</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>NUAIRE, Plymouth, MN</td> Spektrofotometr <td>z automatycznym przepływem</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo, Waltham, MA</td><td>Geaesys 6</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator Vortex</td><td>Minibeadbeater24</td><td>112011</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna ważąca</td><td>Ohaus, Columbia, MD</td><td>Adventurer Pro</td><td></td></tr><tr><td>Heat Stirer</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>Palnik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>automatyczny licznik kolonii</td><td>REVSCI</td><td>120417B</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Materiały</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>400 ml szklane zlewki</td><td>Pyrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>perforowane pokrywki Uchwyt</td><td>na mikrokońcówki z otworami z pudełka</td><td></td><td></td>na końcówki</tr><tr><td>jednorazowe plastikowe łyżki</td><td>Office Depot, Boca Raton, FL</td><td>D15-25-7008</td><td></td></tr><tr><td>System zbiorników</td> rybnych <td>Aquaneering, San Diego, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczacz wody RO</td><td>Aqua FX</td><td>TK001</td><td></td></tr><tr><td>Siatka rybacka</td><td>Marina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pokarm dla ryb</td><td>Tetra fin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Krewetki solankowe</td><td>Marka Red jungle</td><td>O.S.I. pro 80</td><td></td></tr><tr>Płyta <td></td><td></td><td></td><td>styropianowa</td></tr><tr><td>Szpilki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skalpele</td><td>Fine Scientific tools, Foster City, CA</td><td>10000-10</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fine Scientific tools, Foster City, CA</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki Vannas</td><td>Fine Scientific narzędzia, Foster City, CA</td><td>15000-11</td><td></td></tr><tr><td>Probówki z nakrętką 2 ml</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>02-681-375</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki szklane 1 mm</td><td>Bio Spec</td><td>11079110</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki szklane do rozprowadzania</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>18406-500G</td><td></td></tr><tr><td>Płytka Petriego</td><td>Fisher Brand, Hampton, NH</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówka wirówkowa</td><td>Midsci, Valley Park, MO</td><td>AVSS1700</td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa 50 ml</td><td>Corning Falcon, Corning, Nowy Jork</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Probówki</td><td>Pyrex</td><td>9820</td><td></td></tr><tr><td>Szklana pipeta</td><td>Fisher Brand, Hampton, NH</td><td>13675K</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety</td><td>Sartorius Biohit, G&ouml; ttingen, Niemcy</td><td>m1000/m200/m20</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki</td><td>Genesee Scientific, San Diego, CA</td><td>24-150RS/24-412</td><td></td></tr><tr><td>ChemicalsInstant</td> Sole oceaniczne sól fizjologiczna buforowana fosforanami <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR Life Science, Radnor, PA</td><td>K813-500ml</td><td></td></tr><tr><td></td> Trikaina (metanosulfonian 3-aminobenzoesanu etylu <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> sól</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolilo-&beta;-D-galaktopiranozyd</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>10651745001</td><td></td></tr><tr><td>Schiff' s odczynnik</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>84655-250 ml</td><td></td></tr><tr><td>kwasu periodycznego</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>10450-60-9</td><td></td></tr><tr><td>Mucyna z żołądka świni</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>M2378-100G</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>9046-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do oznaczania białek Pierce 660nm Thermo</td><td>, Waltham, MA</td><td>22660</td><td></td></tr><tr><td>LB medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>NACL</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>TCBS Agar</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>265020</td><td></td></tr><tr><td>DCLS Agar</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>70135-500gm</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft office</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 5</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja kolonizacji i biegunki vibrio cholerae w modelu dorosłego zerosłego danio pręgowanego

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Vibrio cholerae jest najbardziej znany jako czynnik zakaźny, który powoduje chorobę człowieka – cholerę. Poza ludzkim żywicielem V. cholerae występuje głównie w środowisku wodnym, gdzie wchodzi w interakcje z różnymi wyższymi gatunkami wodnymi. Wiadomo, że kręgowce są żywicielami środowiskowymi i stanowią potencjalny rezerwuar V. cholerae w przyrodzie. Zarówno V. cholerae, jak i gatunek ryb teleost Danio rerio, powszechnie znany jako danio pręgowany, pochodzą z subkontynentu indyjskiego, co sugeruje długotrwałą interakcję w środowiskach wodnych. Danio pręgowany jest idealnym organizmem modelowym do badania wielu aspektów biologii, w tym chorób zakaźnych. Danio pręgowany może być łatwo i szybko skolonizowany przez V. cholerae po ekspozycji w wodzie. Kolonizacja jelit przez V. cholerae prowadzi do powstawania biegunki i wydalania replikowanych V. cholerae. Te wydalane bakterie mogą następnie skolonizować nowych rybich gospodarzy. Tutaj pokazujemy, jak ocenić kolonizację jelitową V. cholerae u danio pręgowanego i jak określić ilościowo biegunkę danio pręgowanego wywołaną przez V. cholerae. Model kolonizacji powinien być przydatny dla badaczy, którzy badają, czy geny będące przedmiotem zainteresowania mogą być ważne dla kolonizacji gospodarza i/lub przetrwania w środowisku. Kwantyfikacja biegunki danio pręgowanego powinna być przydatna dla naukowców badających dowolny patogen jelitowy, którzy są zainteresowani badaniem danio pręgowanego jako systemu modelowego.

V. cholerae kolonizacja przewodów pokarmowych rybek danio przeżpławnych
Aby przedstawić przykład typowych poziomów kolonizacji, jakie obserwujemy, zaszczepiono 5 x 106 CFU pandemicznego szczepu EL Tor V. cholerae N16961 do 20 mL wody w zlewce zawierającej kilka danio pręgowanych. Po 6 h infekcji ryby opłukano w świeżej wodzie i przeniesiono do zlewki zawierającej 20 mL autoklawowanej wody do infekcji, z...

Danio pręgowany jest naturalnym żywicielem Vibrio cholerae i może być używany do podsumowania i badania całego cyklu zakaźnego od kolonizacji do transmisji. Tutaj pokazujemy, jak ocenić poziom kolonizacji V. cholerae i określić ilościowo biegunkę u danio pręgowanego.

Kwantyfikacja kolonizacji i biegunki Vibrio cholerae w modelu dorosłego zerosłego danio pręgowanego

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie vibrio cholerae, takie jak to, w jaki sposób vibrio cholerae kolonizuje Ciche Wybrzeże i konkuruje z mikrobiotą jelitową o stworzenie niszy. Główną zaletą tej techniki jest to, że ryby są naturalnym żywicielem vibrio cholerae, dzięki czemu możemy badać cały cykl życiowy vibrio cholerae. Procedurę zademonstrują Dhrubajyoti Nag, doktor habilitowany z mojego laboratorium i Paul Breen, doktorant z mojego laboratorium.Po przygotowaniu kultur V.cholerae zaszczepić danio pręgowanego przez zanurzenie. Najpierw umieść cztery lub pięć danio pręgowanego w 400-mililitrowej zlewce zawierającej 200 mililitrów sterylnej wody infekcyjnej. Następnie dodaj jeden mililitr kultury V.cholerae dla pożądanego stężenia infekcji.Następnie przykryj zlewkę perforowaną pokrywką. Po przygotowaniu wszystkich zlewek przenieś je do szklanego inkubatora przedniego ustawionego na 28 stopni Celsjusza W przypadku przejściowej ekspozycji, po około sześciu godzinach, wylej wodę ze zlewki przez siatkę na ryby, aby zebrać ryby. Zainfekowaną wodę należy wyrzucić do wybielacza, aby zabić bakterie.Następnie umieść rybę w 200 mililitrach sterylnej wody infekcyjnej na pięć minut. Po pięciu minutach przepuść tę wodę przez siatkę rybacką, wrzucając wodę do wybielacza. Teraz ryba może trafić do nowej, czystej zlewki z 200 mililitrami sterylnej wody infekcyjnej.Gdy eksperyment osiągnie pożądany punkt końcowy, należy pobrać 15 mililitrową próbkę wody infekcyjnej do celów diagnostycznych. Następnie zbierz ryby i odpowiednio zutylizuj zainfekowaną wodę. Ustaw brzuszną stronę do góry i zabezpiecz ciało szpilką przez dolną szczękę i drugą szpilką tuż za odbytem.Odchyl oba kołki od korpusu. Następnie zetrzyj brzuszną powierzchnię ryby 70% etanolem. Następnie wysterylizuj skalpel i nożyczki Vannas za pomocą 70% etanolu i płomienia.Teraz za pomocą skalpela wykonaj małe podłużne nacięcie w brzuchu, które przenika do łusek, ale naciąć tylko tak głęboko, jak skóra. Następnie nożyczkami ostrożnie przedłuż nacięcie wzdłuż ciała, nie tnąc głębiej niż na poziomie skóry. Unikaj przecinania odbytu.Następnie wykonaj dwa boczne nacięcia w kierunku głowy, aby rozszerzyć otwór. Następnie przypnij skórę po obu stronach bocznych nacięć do powierzchni preparcyjnej, odchylając szpilki na zewnątrz, z dala od ciała. Przewód pokarmowy powinien być teraz widoczny jako bardzo cienka, blada rurka.Teraz użyj dwóch par kleszczy sterylizowanych płomieniem, aby ostrożnie usunąć cały przewód pokarmowy, który może być dość delikatny. Przenieś tkankę do probówki hominizacyjnej zawierającej szklane kulki i jeden mililitr zimnego buforu. Następnie homogenizuj tkanki zgodnie z opisem w protokole tekstowym i określ ilościowo poziomy kolonizacji jelit.Następnie wykonaj seryjne rozcieńczenia homogenatu jelitowego i buforu. Dla każdej ryby przygotuj pięć lub sześć dziesięciokrotnych rozcieńczeń w objętości jednego mililitra. Wiruj rurki do mieszania.Następnie rozłóż 100 do 200 mikrolitrów każdego rozcieńczenia na płytkach agarowych LB zawierających streptomycynę i X-gal. Inkubować płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 16 do 18 godzin. Po całonocnej inkubacji policz kolonie V.cholerae na płytkach.Bakterie te zazwyczaj wytwarzają bladoniebieskie kolonie na pożywce LB z X-galem. Jeśli zaobserwuje się kilka morfologii kolonii, nałóż kilka kolonii o każdej morfologii na inną płytkę TCBS. Na TCBS V.cholerae wytwarza duże, lekko spłaszczone żółte kolonie z nieprzezroczystymi środkami i półprzezroczystymi obrzeżami.Aby określić poziom mucyny w biegunce ryb, wykonaj test na 96-dołkowej płytce. W trzech egzemplarzach załaduj 100 mikrolitrów wody infekcyjnej na każdy warunek testowy, w tym ślepą próbę, do studzienek. Następnie wymieszaj 50 mikrolitrów świeżego, 0,1% roztworu kwasu periodycznego z każdym dołkiem testowym.Do wymieszania należy użyć pipetowania. Następnie zawiń płytkę szczelnie w folię i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do półtorej godziny. Po inkubacji schłodzić płytkę do temperatury pokojowej.Do każdej studzienki dodaj 100 mikrolitrów roztworu Fuchsiny i wymieszaj z pipetowaniem. Teraz ponownie zawiń talerz i połóż go na bujaku w temperaturze pokojowej. Po około 20 minutach odczytaj płytkę z prędkością 560 nanometrów za pomocą czytnika płytek.Aby określić ilościowo reakcję wywołaną przez mucynę w roztworze. Aby zmierzyć poziom białka w biegunce ryb, użyj testu Bradforda. Wymieszaj 66 mikrolitrów jednego z wzorców BSA lub 66 mikrolitrów wody infekcyjnej z 1 000 mikrolitrów odczynnika do testu Bradforda w jednorazowej kuwecie.Teraz inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. A następnie odczytaj absorbancję przy 660 nanometrach na spektrofotometrze. Prostą miarą wielkości biegunki jest zmętnienie wody mierzone na głębokości 600 nanometrów.Dobrze wymieszaj wodę, dodaj jeden mililitr do jednorazowej kuwety i dokonaj pomiaru. Do podstawowego, ślepego pomiaru użyj czystej wody infekcyjnej. Można również zmierzyć wydalane bakterie V.cholerae.Można to zrobić z rybami, które po zaszczepieniu zostały przeniesione do czystej wody. Wykonaj seryjne rozcieńczenia roztworu wody w zbiorniku, jak opisano wcześniej. Następnie rozcieńczenia należy rozcieńczyć na selektywnych podłożach i inkubować płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 24 godziny.Później policz kolonie zgodnie z wcześniejszym opisem, a następnie określ CFU. Grupy danio pręgowanego trzymane w 200 mililitrach wody zostały zaszczepione pięcioma milionami CFU pandemicznej. Po sześciu godzinach w wodzie zaatakowanej przez bakterie ryby przenoszą się do czystej wody na 18 godzin.Następnie pobrano jelita powietrzne. Szacuje się, że każda ryba zawierała od 100 000 do 1 000 000 komórek V. cholerae. Woda infekcyjna została użyta do innych testów.Poziom mucyny był wyższy, gdy dawki zakaźne były wyższe. Poziom OD600 w wodzie był znacznie wyższy, gdy ryby były zarażone V. cholerae. Wreszcie, całkowity poziom białka w zakażonej wodzie ryb był prawie dwukrotnie wyższy niż obserwowany w wodzie niezakażonych ryb.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zarazić dorosłego danio pręgowanego vibrio cholerae i określić ilościowo biegunkę wywołaną infekcją. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak testy transmisji, w celu oceny zakażenia ryb naiwnych przez wcześniej zakażone ryby.

quantifying-vibrio-cholerae-colonization-diarrhea-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Bernut, A. i in., Rozszyfrowanie i obrazowanie patogenezy oraz układania korzeni Mycobacterium abscessus w embrionach danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2015).Ten film pokazuje protokół izolowania i ilościowego określania ropnia Mycobacterium z zakażonego zarodka danio pręgowanego. Procedura obejmuje eutanazję zarodków, lizę tkanek oraz homogenizację w celu uwolnienia bakterii, a następnie wirowanie i ponowną zawiesinę w buforze powierzchniowo czynnym. Na koniec zawiesina bakteryjna jest...

Izolacja i hodowla bakterii z zarodków danio dano w celu oceny obciążenia infekcją

Źródło: Nag, D. i inni. Ilościowe określenie kolonizacji i biegunki Vibrio cholerae w modelu dorosłych danio dano. J. Vis. Exp. (2018)Ten film prezentuje protokół mającycy mierzenie obciążenia bakteryjnego jelitowego u dorosłych danio zakażonych antybiotykoopornym szczepem Vibrio cholerae. Po eutanazji i sekcji przewód jelitowy jest izolowany, ujednolicany szklanymi kulkami i przetwarzany w celu uwolnienia bakterii. Powstały homogenat jest nakładany na selektywne ośrodko, a niebieskobiałe...

Ilościowa analiza obciążenia bakteryjnego jelitowego u danio pręgowanego Vibrio cholerae

Źródło: Nag, D., et.al. Ilościowe określenie kolonizacji i biegunki Vibrio cholerae w modelu dorosłych danio dano. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje szczepienie dorosłych danio patogennym szczepem Vibrio cholerae w celu badania kolonizacji jelit i wyników chorób. Pokazuje, jak toksyny bakteryjne zaburzają integralność jelit, prowadząc do wycieku płynu, wydzieliny śluzowej i wodnistej biegunki przed przygotowaniem ryb do dalszej analizy.

Kolonizacja jelit i indukowanie biegunki przez Vibrio cholerae u dorosłych danio

Źródło: Flores, E. i inni. Wykorzystanie pierwotniaka Paramecium caudatum jako nośnika infekcji pokarmowych u larw danio danio. J. Vis. Exp. (2019).Ten film demonstruje metodę ustalania modelu bakteryjnego zakażenia jelit przenoszonego przez żywność u larw danio pręgowanego poprzez karmienie ich paramecjami zakażonymi fluorescencyjnym E. coli.

Modelowanie infekcji jelit u larw danio pręgowanego przy użyciu bakterii przenoszonych przez żywność

Ten film demonstruje metodę ilościowego określania infekcji grzybiczej u larw danio pręgowanego. Zarodniki grzybów są mikrowstrzykiwane do larwalnej komory tyłomózgowia, a larwy są inkubowane, aby umożliwić rozwój infekcji. Zakażone larwy są zbierane w określonych odstępach czasu, a postęp infekcji ocenia się poprzez wyliczenie jednostek tworzących kolonie.

Technika ilościowego określania infekcji grzybiczej u larw danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół modelowania ludzkiej gruźlicy u dorosłego danio pręgowanego przy użyciu jego naturalnego patogenu Mycobacterium marinum. Wyekstrahowane DNA i RNA z narządów wewnętrznych zakażonego danio pręgowanego można wykorzystać do ujawnienia całkowitego obciążenia prątkami u ryb i odpowiedzi immunologicznej gospodarza za pomocą qPCR.

Modelowanie gruźlicy u dorosłych ryb pręgowanych zakażonych Mycobacterium marinum

Protokół opisuje intubację dorosłego danio pręgowanego za pomocą leku biologicznego; następnie preparację i przygotowanie jelita do cytometrii, mikroskopii konfokalnej i qPCR. Metoda ta pozwala na podawanie związków bioaktywnych w celu monitorowania wychwytu jelitowego i wywołanego miejscowego bodźca immunologicznego. Ma to znaczenie dla badania dynamiki jelit w profilaktyce doustnej.

Doustna intubacja dorosłego danio pręgowanego: model oceny wychwytu związków bioaktywnych w jelitach

Tutaj opisujemy protokół immunizacji dorosłego danio pręgowanego (Danio rerio) szczepionką opartą na DNA i pokazujemy walidację udanego szczepienia. Metoda ta jest odpowiednia do przedklinicznych badań przesiewowych kandydatów na szczepionki w różnych modelach infekcji.

Uodparnianie dorosłych ryb danio pręgowanego do przedklinicznych badań przesiewowych szczepionek opartych na DNA

Danio rerio) stają się powszechnie używanym modelem zwierzęcym kręgowców do kolonizacji i patogenezy mikrobiologicznej. Protokół ten opisuje zastosowanie pierwotniaka Paramecium caudatum jako nośnika infekcji przenoszonych przez żywność u larw danio pręgowanego. P. caudatum łatwo internalizuje bakterie i jest wchłaniany przez larwy danio pręgowanego poprzez naturalne zachowania żerowania.

Wykorzystanie pierwotniaka Paramecium caudatum jako nośnika infekcji przenoszonych przez żywność u larw danio pręgowanego

Przedstawiona tutaj jest bezpieczna i skuteczna metoda infekowania larw danio pręgowanego fluorescencyjnie znakowanym beztlenowym C. difficile za pomocą mikroiniekcji i nieinwazyjnego mikrozgłębnika.

Opracowanie modelu zakażenia larw danio pręgowanego w kierunku Clostridioides difficile

Ten protokół przedstawia podstawowe kroki do uzyskania wolnych od zarazków (GF) zarodków ryb i utrzymania ich od larw do stadium młodocianego, w tym pobieranie próbek i wykrywanie ich sterylnego statusu. Zastosowanie modeli GF w przypadku infekcji jest ważne dla zrozumienia roli drobnoustrojów w zdrowiu gospodarza.

Generowanie, utrzymanie i identyfikacja wolnych od zarazków modeli danio pręgowanego od larw do stadiów młodocianych

Poznaj metodę kwantyfikacji kolonizacji Vibrio cholerae i biegunki u dorosłych danio pręgowanych. Ta technika pozwala badać cykl życiowy bakterii w naturalnym żywicielu i analizować interakcje z mikrobiotą jelitową.

Kwantyfikacja kolonizacji i biegunki Vibrio cholerae w modelu dorosłego zerosłego danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów