Name: Mikroskopia fluorescencyjna z arkuszem świetlnym do badania mysiego serca (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Poznaj mikroskopię fluorescencyjną z arkuszem świetlnym do badania mysiego serca. Ta metoda umożliwia szybkie obrazowanie struktur serca po terapii genowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby wyrazić wdzięczność Thao Nguyenowi i Atsushi Nakano z UCLA za dostarczenie próbki myszy do obrazu. Badanie to było wspierane przez granty NIH HL118650 (dla Tzung K. Hsiai), HL083015 (dla Tzung K. Hsiai), HD069305 (dla N. C. Chi i Tzung K. Hsiai), HL111437 (dla Tzung K. Hsiai i N. C. Chi), HL129727 (dla Tzung K. Hsiai) oraz finansowanie University of Texas System STARS (dla Juhyun Lee).

Wszystkie procedury związane z wykorzystaniem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komisje Rewizyjne (IACUC) na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles, Kalifornia.
1. Ustawienia systemu obrazowania
Uwaga: Zobacz Rysunek 1 i Rysunek 2.
<ol>
	<li>Pobierz laser o fali ciągłej (CW) o 3 długościach fal: 405 nm, 473 nm i 532 nm. Umieść 2 lustra (M1 i M2) w odległości 150 mm od siebie i wyrównaj je z ich płaszczyznami lustra pod kątem 45° do wiązki. 
	Uwaga: Ten krok jest wykonywany w celu przekierowania lasera z dala od konfiguracji dwustronnego oświetlenia. Wynikowa belka będzie w tym samym kierunku co belka początkowa.</li>
	<li>Przepuść wiązkę przez przysłonę/otwór irysowy (PH) o średnicy 25 mm, filtr o neutralnej gęstości (NDF) o średnicy 50 mm o zakresie gęstości optycznej 0 - 4,0, ekspander wiązki (BE), szczelinę 30 mm (S) o szerokości ~0 - 6 mm i lustro (M3), wszystkie umieszczone w odległości 150 mm od siebie. Umieść lustro tak, aby jego płaszczyzna lustra znajdowała się pod kątem 45° do wiązki.</li>
	<li>Przeprowadź wiązkę przez rozdzielacz wiązki 50:50 umieszczony w odległości 150 mm od M3. Umieść lustro (M6) w odległości 150 mm od rozdzielacza wiązki i ustaw je tak, aby jego płaszczyzna lustra znajdowała się pod kątem 45° w stosunku do wiązki emitowanej w kierunku do przodu. Użyj odbitej wiązki, aby uformować jedną stronę arkusza świetlnego z podwójnym oświetleniem.</li>
	<li>Umieść lustro (M4) w odległości 150 mm od rozdzielacza wiązki i ustaw je tak, aby jego płaszczyzna lustra znajdowała się pod kątem 45° w stosunku do wiązki, która została wyemitowana pod kątem 90° od rozdzielacza wiązki. Umieścić drugie lustro (M5) w odległości 150 mm od M4 i ustawić je tak, aby jego płaszczyzna lustra znajdowała się pod kątem 45° w stosunku do wiązki odbitej od M6. Użyj wiązki emitowanej przez M5, aby uformować drugą stronę arkusza świetlnego z podwójnym oświetleniem.</li>
	<li>Ustaw system oświetlenia dwustronnego w sposób symetryczny (patrz Rysunek 1). Umieść jedną soczewkę cylindryczną (CL1) [średnica (d) = 1 cal; ogniskowa (f) = 50 mm] 150 mm w linii wiązki emitowanej z M5 z jednej strony, a drugą identyczną soczewkę cylindryczną (CL2) 150 mm w linii z wiązką emitowaną z M6 po drugiej stronie układu z podwójnym oświetleniem. Umieść 2 lustra (M7 i M8) każde w jednej linii z soczewkami cylindrycznymi w odległości 50 mm, aby odbijać wiązkę pod kątem 90°.</li>
	<li>Utwórz achromatyczny dublet z pary soczewek. Umieść pierwszą soczewkę, L1 (d = 1 cal; f = 100 mm), 100 mm od M7, a drugą soczewkę, L2 (d = 1 cal; f = 60 mm), 160 mm od L1. Powtórz to po drugiej stronie podwójnego oświetlenia z identycznymi soczewkami (L3, L4) umieszczonymi w tej samej odległości od M8.</li>
	<li>Umieść lustra M9 i M10 w odległości 60 mm od soczewek L2 i L4 i w jednej linii z wiązką. Umieść obiektywy oświetlające OL1 i OL2 (d = 2 cale; f = 150 mm), 150 mm od M9 i M10 i w jednej linii z wiązką. Wiązka emitowana przez obiektywy tworzy arkusz świetlny do obrazowania próbek.</li>
	<li>Użyj drukarki 3D, aby wydrukować uchwyt próbki z akrylonitrylu butadienu i styrenu (ABS). Osadź kawałek szkła nakrywkowego [współczynnik załamania światła (RI) = 1,4745] z każdej strony komory, prostopadle do wiązki świetlnej, aby zminimalizować niedopasowanie współczynnika załamania. Równomiernie umieść komorę pomiędzy wiązkami emitowanymi przez soczewki obiektywu.</li>
	<li>Zainstaluj mikroskop stereoskopowy z obiektywem o powiększeniu 1X i naukową kamerą z komplementarnym półprzewodnikiem tlenku metalu (sCMOS) prostopadłą do płaszczyzny oświetlenia (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
</ol>
2. Kalibracja systemu obrazowania
<ol>
	<li>Pobierz fluorescencyjne kulki polistyrenowe o średnicy 0,53 μm.</li>
	<li>Przygotować próbkę kulki fluorescencyjnej, rozcieńczając roztwór kulki w roztworze dopasowującym współczynnik załamania światła (RIMS) z 1% agarozą o niskiej temperaturze topliwości do 1:150 000. Wyciąć kawałek rurki ze szkła borokrzemianowego o średnicy wewnętrznej 12 mm i średnicy zewnętrznej 18 mm na długość 30 mm. 
	Uwaga: Rurka ze szkła borokrzemianowego służy do dopasowania współczynnika załamania światła (1,47).</li>
	<li>Wymieszać rozcieńczoną próbkę kulki z 1% agarozą i odpipetować roztwór kulki/agarozy do rurki borokrzemianowej. Pozostawić agarozę do zestalenia się w temperaturze pokojowej (23 °C).</li>
	<li>Napełnij komorę ABS (od kroku 1.7) 99,5% roztworem glicerolu. Umieść rurkę ze szkła borokrzemianowego zawierającą koraliki w komorze. Umieść komorę ABS w systemie obrazowania tak, aby znajdowała się w środku wiązki Gaussa utworzonej przez system podwójnego oświetlenia.</li>
	<li>Podłącz zmotoryzowany stolik translacyjny 3D do rurki ze szkła borokrzemianowego, aby kontrolować ruch i orientację próbki w komorze ABS (patrz rysunek uzupełniający 1).</li>
	<li>Rejestruj obrazy za pomocą kamery sCMOS z szybkością 30 klatek na sekundę (fps). Za pomocą sterownika silnika przesuń próbkę o 1 mm w kierunku bocznym i uzyskuj obrazy z każdym krokiem 1 mm za pomocą kamery sCMOS. Kontynuuj, aż cała próbka zostanie zobrazowana.</li>
	<li>Ułóż uzyskane obrazy w stos za pomocą oprogramowania do wizualizacji (patrz tabela materiałów). Zmierz funkcję rozproszenia punktowego (PSF) systemu, korzystając z tych obrazów ściegów. Użyj tego PSF do dekonwolucji podczas przetwarzania obrazu w późniejszych krokach.</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Wypreparuj serca myszy P1 typu dzikiego i podwójnie heterozygotycznej myszy knockin sarcolipin-Cre z genem Rosa26-YFP (SlnCre/+; R26YFP reporter/+) na P7. 
	Uwaga: Eutanazja została przeprowadzona przy użyciu pentobarbitalu i techniki opisanej przez Robbinsa i wsp.10. Sekcja została przeprowadzona zgodnie z techniką opisaną przez National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI)10,11.</li>
	<li>Wykonaj chemiczne oczyszczanie mysich serc zgodnie z opisem Kevina Sunga i wsp.12. 
	Uwaga: Poniższe czynności należy wykonywać w dygestorium, ponieważ używane chemikalia są toksyczne.
	<ol>
		<li>Opłucz serca w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) 3x przez 10 min. Po wypłukaniu umieścić serca w 4% roztworze paraformaldehydu i inkubować te próbki w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Umieścić próbki w 4% roztworze akryloamidu zawierającym 0,5% w/v dichlorowodorku 2,2'-Azobis. Pozostawić próbki do inkubacji w temperaturze 4 °C przez noc. Po całonocnej inkubacji usunąć próbki i inkubować je w temperaturze 37 °C przez 2-3 godziny.</li>
		<li>Przepłukać próbki PBS, a następnie umieścić je w roztworze 8% w/v dodecylosiarczanu sodu i 1,25% m/v kwasu borowego. Próbki inkubować w temperaturze 37 °C do momentu, aż staną się klarowne. Może to potrwać kilka godzin, w zależności od grubości próbki. Po oczyszczeniu usuń próbki i umieść je w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami na 1 dzień.</li>
		<li>Przygotować roztwór dopasowujący współczynnik załamania światła z 40 g ośrodka o niejonowym gradiencie gęstości (patrz tabela materiałów) w 30 ml 0,02 M buforu fosforanowego (PB), 0,1% Tween-20 i 0,01% azydku sodu. Doprowadzić roztwór do pH 7,5 za pomocą wodorotlenku sodu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść oczyszczoną próbkę w RIMS o współczynniku załamania światła 1,46 - 1,48 i 1% agarozie. Umieścić próbkę w rurkach ze szkła borokrzemianowego i pozostawić agarozę do zestalenia się w temperaturze pokojowej (23 °C).</li>
	<li>Podłącz zmotoryzowany stolik translacyjny 3D do rurki ze szkła borokrzemianowego, aby kontrolować ruch i orientację próbki w drukowanej w 3D komorze ABS (patrz rysunek uzupełniający 1).</li>
</ol>
4. Obrazowanie serca u dorosłych
<ol>
	<li>Wstrzyknąć 8,7 x 1012 wirusów typu adeno-associated virus vector 9 (AAV9) zawierających specyficzny dla serca promotor troponiny T (cTnT) i białko zielonej fluorescencji (GFP) w objętości 100 μl do żyły ogonowej 2-miesięcznej myszy typu dzikiego (C57BL/6). 
	Uwaga: AAV9 został opracowany zgodnie z techniką opisaną przez Yuan i wsp.13. Powoduje to, że GFP wiąże się z nerkowym zewnętrznym kanałem potasowym rdzeniowym (ROMK) produkując AAV9-cTnT-ROMK-GFP (patrz Tabela Materiałów).</li>
	<li>Przeprowadź sekcję serc dorosłych myszy w wieku 7,5 miesiąca zgodnie z techniką opisaną przez NHLBI11. Przygotować próbki, wykonując kroki 3.1 - 3.3.</li>
	<li>Podłączyć sterownik silnika do siłownika silnika. Przymocuj siłownik do rurki ze szkła borokrzemianowego, aby kontrolować ruch i orientację próbki w drukowanej w 3D komorze ABS.</li>
	<li>Umieść próbkę tak, aby znajdowała się w środku wiązki Gaussa utworzonej przez system podwójnego oświetlenia. Rejestruj obrazy za pomocą kamery sCMOS z szybkością 100 kl./s.</li>
	<li>Za pomocą sterownika silnika przesuń próbkę o 1 mm w kierunku osiowym i rejestruj obrazy z każdym krokiem co 1 mm za pomocą kamery sCMOS. Kontynuuj, aż cała próbka zostanie zobrazowana. 
	Uwaga: System jest sterowany za pomocą specjalnie opracowanego oprogramowania do sterowania przyrządami.</li>
	<li>Ułóż uzyskane obrazy w stos za pomocą oprogramowania do wizualizacji (patrz tabela materiałów). Twórz obrazy 3D, korzystając z tych stosów obrazów i oprogramowania do wizualizacji14. Zdekonwolucjonizuj plik PSF z kroku 2.6 z uzyskanym stosem obrazów. Ustaw wartość intensywności progu piksela, aby obserwować kontury serca i dodawać pseudokolor do obrazów w oparciu o tę intensywność w skali szarości.</li>
</ol>

<ol><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4537058/">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li>
<li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).</li>
<li>High, F. A., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+role+of+Notch+in+cardiac+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).</li>
<li>Sachinidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+specific+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+imaging+to+localize+cardiac+lineage+and+protein+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution.</a> Scientific Reports. 7, 42209(2017).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+excision+of+murine+aorta%3B+a+versatile+technique+in+the+study+of+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52172(2014).</li>
<li>National Heart, L., Blood Institute, <a target="_blank" href="http://community.parentprojectmd.org/profiles/blogs/standard-operating-procedures-for-duchenne-animal-models">Standard Operating Procedures (SOP's) for Duchenne Animal Models</a>. , (2015).</li>
<li>Sung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+three-dimensional+tissue+clearing+and+incorporation+of+colorimetric+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping.</a> Scientific Reports. 6, 30736(2016).</li>
<li>Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+adeno-associated+virus+vector+producer+cell+line+method+for+scalable+vector+production+of+different+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes.</a> Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).</li>
<li>FEI, <a target="_blank" href="https://www.fei.com/software/amira-user-guide/">Amira User's Guide</a>. , Konrad-Zuse-Zentrum fur Informationstechnik. Berlin. 59-138 (2017).</li>
<li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+3D+dynamics+in+thickly+fluorescent+specimens+beyond+the+diffraction+limit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit.</a> Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).</li>
<li>Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+and+fast+live+imaging+with+two-photon+scanned+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy.</a> Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+light-sheet+imaging+with+virtual+reality+to+recapitulate+developmental+cardiac+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics.</a> JCI Insight. 2 (22), (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj system i technika LSFM wykorzystuje dwustronną wiązkę oświetlenia połączoną z oczyszczaniem optycznym do obrazowania serca myszy w okresie poporodowym i dorosłym jego rozwoju. Tradycyjna pojedyncza wiązka oświetlenia cierpi z powodu rozpraszania i absorpcji fotonów przez grubsze i większe próbki tkanek 1,3. Dwustronne wiązki zapewniają bardziej równomierne oświetlenie próbki, minimalizując w ten sposób efekt pasków i innych artefaktów, które często ...

Mikroskopia fluorescencyjna z użyciem arkuszy świetlnych była techniką opracowaną po raz pierwszy w 1903 roku i jest obecnie używana jako metoda do badania ekspresji genów, a także do tworzenia modeli 3D lub 4-D próbek tkanek1,2,3. Ta metoda obrazowania wykorzystuje cienki arkusz światła do oświetlenia pojedynczej płaszczyzny próbki, tak aby tylko ta płaszczyzna została uchwycona przez detektor. Próbka może być następnie przesuwana w kierunku osiowym, aby uchwycić każdą warstwę, sekcja po sekcji, i renderować model 3D po przetworzeniu końcowym uzyskanych obrazów4. Jednak ze względu na absorpcję i rozpraszanie fotonów, LSFM został ograniczony do próbek, które mają albo kilka mikronów grubości, albo są optycznie przezroczyste1.
Ograniczenia LSFM doprowadziły do obszernych badań organizmów, które mają tkanki optycznie przezroczyste, takich jak danio pręgowany. Badania dotyczące rozwoju i różnicowania serca są często prowadzone na danio pręgowanym, ponieważ istnieją konserwatywne geny między ludźmi a danio pręgowanym5,6. Chociaż badania te doprowadziły do postępów w badaniach kardiologicznych związanych z kardiomiopatiami6,7, nadal istnieje potrzeba przeprowadzenia podobnych badań na organizmach wyższego poziomu, takich jak ssaki.
Tkanka serca ssaków stanowi wyzwanie ze względu na grubość i nieprzezroczystość tkanki, absorpcję przez hemoglobinę w czerwonych krwinkach oraz paski, które powstają w wyniku jednostronnego oświetlenia próbki tradycyjnymi metodami LSFM1,8. Aby zrekompensować te ograniczenia, zaproponowaliśmy zastosowanie dwustronnego oświetlenia i uproszczonej wersji techniki CLARITY9 w połączeniu z roztworem do dopasowywania współczynnika załamania światła (RIMS). W związku z tym system ten pozwala na obrazowanie próbki o wymiarach większych niż 10 x 10 x 10 mm3 przy zachowaniu dobrej jakości rozdzielczości w płaszczyźnie osiowej i bocznej8.
Ten system został najpierw skalibrowany za pomocą koralików fluorescencyjnych ułożonych w różnych konfiguracjach w szklanych rurkach. Następnie system wykorzystano do obrazowania poporodowych i dorosłych serc mysich. Po pierwsze, pourodzeniowe serce myszy zostało zobrazowane po 7 dniach (P7), aby ujawnić jamę komorową, grubość ściany komory, struktury zastawki i obecność beleczkowania. Po drugie, przeprowadzono badanie w celu zidentyfikowania komórek, które różnicowałyby się w kardiomiocyty przy użyciu pourodzeniowego serca myszy w ciągu 1 dnia (P1) z kardiomiocytami znakowanymi Cre i żółtym białkiem fluorescencyjnym (YFP). Wreszcie, dorosłe myszy w wieku 7,5 miesiąca zostały zobrazowane, aby zaobserwować obecność nerkowych zewnętrznych kanałów potasowych rdzenia (ROMK) po terapii genowej8.

<table><tbody><tr><td>CW Laser</td><td>Laserglow Technologies</td><td>LMM-GBV1-PF3-00300-05</td><td>Wzbudzenie fluoroforów</td></tr><tr><td>Filtr o neutralnej gęstości</td><td>Thorlabs</td><td>NDC-50C-4M</td><td>Kontroluje ilość światła wpadającego do systemu</td></tr><tr><td>Achromatyczny ekspander wiązki</td><td>Thorlabs</td><td>GBE05-A</td><td>Rozszerza wiązkę światła</td></tr><tr><td>Szczelina mechaniczna</td><td>Thorlabs</td><td>VA100C</td><td>Kontroluje szerokość wiązki</td></tr><tr><td>Rozdzielacz wiązki</td><td>Thorlabs</td><td>BS013</td><td>Tworzy wiązkę podwójnego oświetlenia</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy z soczewką obiektywową 1X</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td>Służy do obserwacji próbki</td></tr><tr><td>Kamera ORCA-Flash4.0 LT sCMOS</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-42U</td><td>Służy do przechwytywania obrazów</td></tr><tr><td>Akrylonitrylo-butadien-styren (ABS)</td><td>Stratasys</td><td>uPrint</td><td>Materiał używany do drukowania 3D uchwytu na próbkę</td></tr><tr><td>Koraliki fluorescencyjne z polistyrenu</td><td>Spherotech Inc</td><td>PP-05-10</td><td>Służy do kalibracji systemu obrazowania</td></tr><tr><td>Rurki ze szkła borokrzemianowego</td><td>Corning</td><td>Pyrex 7740</td><td>Rurki do zatapiania próbek</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td>Wypełnienie komory na próbkę</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP39920</td><td>Roztwór do płukania serc myszy</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Mikroskopia elektronowa nauki</td><td>RT-15700</td><td>Pierwszy roztwór do inkubacji</td></tr><tr><td>Akrylamid</td><td>Wako Chemicals</td><td>AAL-107</td><td>Zmieszany z dichlorowodorkiem 2,2'-Azobis do drugiej inkubacji roztwór do inkubacji serc</td></tr><tr><td>myszy Dichlorowodorek 2,2'-Azobis</td><td>Wako Chemicals</td><td>VA-044</td><td>Zmieszany z akrylamidem do drugiego roztworu inkubacyjnego dla serc myszy</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71725</td><td>Zmieszany z kwasem borowym do trzeciej inkubacji roztwór do serca myszy</td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Fischer</td><td>Scientific A74-1</td><td>Zmieszany z dodecylosiarczanem sodu do trzeciej inkubacji roztwór dla serc myszy</td></tr><tr><td>Sigma D2158</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2158</td><td>Zmieszany z PB, Tween-20 i azydkiem sodu jako roztwór dopasowujący współczynnik załamania</td></tr> światła <tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11332465001</td><td>Zmieszany z Sigma D2158, PB i azydkiem sodu jako roztwór dopasowujący współczynnik załamania</td></tr> światła <tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td>zmieszany z Sigma D2158, PB i Tween-20 jako roztwór dopasowujący współczynnik załamania światła</td></tr><tr><td>Wektor wirusa związanego z adenowirusem 9 z specyficznym dla serca promotorem troponiny T oznaczonym GFP</td><td>Vector Biolabs</td><td>VB2045</td><td>Wyraża GFP po związaniu z</td></tr><tr><td>siłownikiem serwomotoru ROMK DC</td><td></td><td>Z825B</td><td>Służy do przemieszczania próbki w kierunku osiowym w arkuszu świetlnym</td></tr><tr><td>K-Cube Szczotkowany sterownik serwomotoru prądu stałego</td><td>Thorlabs</td><td>KDC101</td><td>Łączy się z siłownikiem silnika i steruje ruchem siłownika</td></tr><tr><td>Amira</td><td>FEI Software</td><td>Nie dotyczy</td><td>Oprogramowanie do wizualizacji do tworzenia obrazów 2D i 3D</td></tr></tbody></table>

mikroskopia fluorescencyjna z arkuszem świetlnym do badania mysiego serca

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Mikroskopia fluorescencyjna z arkuszami świetlnymi jest szeroko stosowana do szybkiego pozyskiwania obrazów z wysoką rozdzielczością osiową od mikrometra do milimetra. Tradycyjne techniki arkuszy świetlnych polegają na użyciu pojedynczej wiązki świetlnej skierowanej prostopadle na tkankę próbki. Obrazy dużych próbek, które są wytwarzane przy użyciu pojedynczej wiązki oświetlenia, zawierają paski lub artefakty i mają zmniejszoną rozdzielczość z powodu rozpraszania i absorpcji światła przez tkankę. W tym badaniu wykorzystano dwustronną wiązkę świetlną i uproszczoną technikę optycznego oczyszczania CLARITY dla mysiego serca. Techniki te pozwalają na głębsze obrazowanie poprzez usunięcie lipidów z serca i wytwarzają duże pole obrazowania, większe niż 10 x 10 x 10 mm3. W rezultacie, strategia ta umożliwia nam ilościowe określenie wymiarów komór, śledzenie linii serca i zlokalizowanie przestrzennego rozkładu białek i kanałów jonowych specyficznych dla serca serca od serca myszy po urodzeniu do serca dorosłego z wystarczającym kontrastem i rozdzielczością.

Opisana tutaj technika wykorzystuje dwustronną wiązkę oświetlenia w połączeniu z optycznym wyjaśnianiem próbek tkanki serca myszy, aby uzyskać większą głębokość obrazowania oraz większą objętość obrazowania przy zachowaniu wystarczającej rozdzielczości (Rysunek 1). W celu kalibracji systemu, wewnątrz szklanej rurki oraz w obrębie układu obrazowania umieszczono kuleczki fluorescencyjne. Następnie wykonano obrazowanie kuleczek i zwizualizowano je w płaszczyźnie...

To badanie wykorzystuje technikę mikroskopii fluorescencyjnej z dwustronnym oświetleniem (LSFM) w połączeniu z oczyszczaniem optycznym do badania mysiego serca.

Mikroskopia fluorescencyjna z arkuszem świetlnym do badania mysiego serca

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Główną zaletą tej technologii jest to, że pozwala na szybkie obrazowanie serca myszy. I może być używany do obserwacji obecności kanałów powietrznych po terapii genowej. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w kardiologię rozwojową, może być również stosowana w innych systemach, takich jak neurologia i pulmonologia.Ogólnie rzecz biorąc, osoby będą zmagać się z tą techniką, ponieważ montaż obrazowania serca dorosłej myszy może być trudny i różni się od innych, tradycyjnych technik, takich jak mikroskopia konfokalna i odwrócona. Umieść laser o fali ciągłej o trzech długościach fal 405 nanometrów, 473 nanometrach i 532 nanometrach. Następnie przymocuj lustro pierwsze i wyrównaj je z płaszczyzną lustra pod kątem 45 stopni do belki.Spowoduje to skierowanie lasera w kierunku rozdzielacza wiązki, który tworzy dwustronny układ oświetlenia. Następnie przepuść wiązkę przez filtr o neutralnej gęstości o średnicy 50 milimetrów, ekspander wiązki i otwór na szpilkę o średnicy 25 milimetrów, wszystkie umieszczone w odległości 150 milimetrów od siebie. Przepuść wiązkę przez rozdzielacz wiązki 50-50, umieszczony 150 milimetrów od otworu.Następnie umieść lustro dwa 150 milimetrów od rozdzielacza wiązki, pod kątem 90 stopni do przedniej belki i wyrównaj je tak, aby jego płaszczyzna lustra była pod kątem 45 stopni do wiązki. Następnie umieść lustro trzy 100 milimetrów od lustra drugiego i wyrównaj je tak, aby jego płaszczyzna lustra była pod kątem 45 stopni do wiązki odbitej od lustra drugiego. Użyj tej odbitej wiązki, aby uformować jedną stronę arkusza świetlnego z podwójnym oświetleniem.Po drugiej stronie rozdzielacza wiązki umieść lustro piąte tak, aby jego płaszczyzna lustra znajdowała się pod kątem 45 stopni do wiązki emitowanej w kierunku do przodu. Użyj wiązki emitowanej przez lustro piąte, aby utworzyć drugą stronę arkusza świetlnego z podwójnym oświetleniem. Następnie skonfiguruj system dwustronnego oświetlenia w sposób systemowy.Umieść soczewkę cylindryczną w odległości 150 milimetrów od lustra trzeciego, a drugą identyczną soczewkę cylindryczną w odległości 150 milimetrów od lustra piątego, po drugiej stronie zestawu podwójnego oświetlenia. Następnie umieść dwa lustra, każde w jednej linii z cylindrycznymi soczewkami, w odległości 50 milimetrów, aby odbijać wiązkę pod kątem 90 stopni. Po obu stronach arkusza świetlnego utwórz achromatyczny dublet z pary soczewek, przy czym pierwsza soczewka jest umieszczona 100 milimetrów od poprzedniego zwierciadła i ma średnicę jednego cala i ogniskową 100 milimetrów.Drugi obiektyw powinien być umieszczony 160 milimetrów od obiektywu pierwszego, o średnicy jednego cala i ogniskowej 60 milimetrów. Następnie należy umieścić obiektywy oświetlające jeden i dwa w odległości 150 milimetrów od poprzednich dubletów achromatycznych, tak aby znajdowały się w jednej linii z wiązką. Wiązka emitowana przez obiektywy tworzy arkusz świetlny do obrazowania próbek.Najpierw przygotuj próbkę kulki fluorescencyjnej, rozcieńczając roztwór kulek o wielkości 0,53 mikrometra, od jednego do 150 000, we wstępnie podgrzanym roztworze dopasowującym współczynnik załamania światła, z jednoprocentową agarozą o niskiej temperaturze topnienia. Następnie użyj kawałka rurki ze szkła borokrzemianowego o średnicy wewnętrznej 12 milimetrów i średnicy zewnętrznej 18 milimetrów, do długości 30 milimetrów. Odpipetować roztwór agarozy w kulce rurki borokrzemianowej i pozostawić agarozę do zestalenia się w temperaturze pokojowej.Teraz napełnij wydrukowaną w 3D komorę ABS 99,5-procentowym roztworem gylcerolu. Umieść rurkę ze szkła borokrzemianowego zawierającą koraliki w komorze. Podłącz zmotoryzowany stolik translacyjny 3D do rurki ze szkła borokrzemianowego, aby kontrolować ruch i orientację próbki w komorze ABS.Następnie użyj specjalnie zaprojektowanego oprogramowania, aby uzyskać obrazy za pomocą kamery sCMOS z szybkością 30 klatek na sekundę. Za pomocą sterownika silnika przesuń próbkę o jeden milimetr w kierunku bocznym i rejestruj obrazy z każdym krokiem o jeden milimetr, aż cała próbka zostanie zobrazowana. Ułóż uzyskane obrazy w stos za pomocą oprogramowania do wizualizacji i zmierz funkcję rozrzutu punktów systemu za pomocą tych obrazów ściegów.Użyj roztworu dopasowującego współczynnik załamania światła o pH 7,5 i rozpuść jeden procent agarozy w pasującym roztworze. Umieść oczyszczoną próbkę serca dorosłej myszy w roztworze dopasowującym współczynnik załamania światła, z jednym procentem rozpuszczonej agarozy. Następnie włóż próbkę do rurki ze szkła borokrzemianowego i pozwól agarozie zestalić się w temperaturze pokojowej.Podłącz zmotoryzowany stolik translacyjny 3D do rurki ze szkła borokrzemianowego, aby kontrolować ruch i orientację próbki w drukowanej w 3D komorze ABS. Umieść próbkę tak, aby znajdowała się w środku wiązki Gaussa, utworzonej przez system podwójnego oświetlenia. Następnie ustaw szybkość akwizycji kamery sCMOS na 30 klatek na sekundę.Teraz, za pomocą sterownika silnika, przesuń próbkę o jeden milimetr w kierunku osiowym i uzyskaj obrazy z każdym krokiem o milimetr. Kontynuuj, aż cała próbka zostanie zobrazowana. Ułóż uzyskane obrazy w stos za pomocą oprogramowania do wizualizacji.Wywołaj obrazy 3-D przy użyciu tych stosów obrazów. Aby to osiągnąć, należy zdekonwolucjonizować wyznaczoną wcześniej funkcję rozrzutu punktowego i wykorzystać ją dla uzyskanych stosów obrazów. Na koniec ustaw wartość intensywności progu pikseli, aby obserwować kontury serca i dodaj pseudokolor do obrazów w oparciu o tę intensywność w skali szarości.W pierwszym dniu po porodzie można między innymi uwidocznić zastawki, przedsionek, komorę, mięsień pektynowy i beleczkowanie. W siódmym dniu po porodzie cechy są jeszcze bardziej wyraźne. Przedsionek, komora, wymiary jamy komorowej i grubość ścianki komory są oczywiste.Aby zbadać różnicowanie kardiomiocytów w sercu, heterozygotyczne myszy knock-in zostały oznaczone cre, aby pokazać kardiomiocyty. Oznaczone komórki są pokazane w tym miejscu, w każdym kierunku płaszczyzny. Trzy płaszczyzny zostały połączone, aby stworzyć trójwymiarowe odwzorowanie serca.Obszar z czerwonym kółkiem we wstawce przedstawia dwa półprzezroczyste serca myszy po poddaniu technice przezroczystości i włożeniu do rurki ze szkła borokrzemianowego. Oprócz badania myszy po urodzeniu, system obrazowania może być również wykorzystywany do badania serca dorosłej myszy. Tutaj kanały ROMK oznaczone GFP są wyświetlane po 7,5 miesiącach.Znajdowały się one głównie w ścianie komory. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu jednej do dwóch minut. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby usunąć wszystkie pęcherzyki wokół próbki w probówce.Inne metody, takie jak automatyczna segmentacja stosów obrazów, mogą być wykonane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania związane z urazami sercowo-naczyniowymi i regeneracją. Po opracowaniu technika ta została wykorzystana przez naukowców do badania architektury serca w postnatalnych i dorosłych stadiach rozwojowych u myszy.

light-sheet-fluorescence-microscopy-for-the-study-of-the-murine-heart

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W sercu, zdarzenia molekularne koordynują funkcję elektryczną i kurczliwą narządu. Zaprezentowany tu zestaw technik mikroskopii fluorescencyjnej pola lokalnego umożliwia rejestrację zmiennych komórkowych w nienaruszonych sercach. Identyfikacja mechanizmów definiujących czynność serca ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia, jak serce działa w sytuacjach patologicznych.

Mikroskopia fluorescencyjna w polu lokalnym: obrazowanie sygnałów komórkowych w nienaruszonych sercach

Tutaj opisujemy podejście do mikroskopii świetlnej w celu wizualizacji nacieku leukocytów CD45+ w mysim modelu aseptycznego, piorunującego zapalenia mięśnia sercowego, które jest indukowane przez leczenie myszami CD11c.DTR toksyną dyfterytową dotchawiczą.

Ilościowa wizualizacja nacieku leukocytów w mysim modelu piorunującego zapalenia mięśnia sercowego za pomocą mikroskopii świetlnej

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji rozwijających się serc u danio pręgowanego w 4-Dimensions (4-D). Obrazowanie 4D, za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z arkuszami świetlnymi (LSFM), wykonuje trójwymiarowe (3-D) obrazy w czasie, aby zrekonstruować rozwijające się serca. Pokazujemy jakościowo i ilościowo, że naprężenie ścinające aktywuje sygnalizację wsierdzia Notch podczas rozwoju komory, co sprzyja trabekulacji serca.

Mikroskopia fluorescencyjna arkuszy świetlnych w celu uchwycenia 4-wymiarowych obrazów wpływu modulacji naprężeń ścinających na rozwijające się serce danio pręgowanego

Opisujemy zoptymalizowane narzędzia do badania serca danio pręgowanego in vivo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkusza świetlnego. W szczególności sugerujemy jasne transgeniczne linie serca i prezentujemy nowe techniki delikatnego osadzania i unieruchamiania, które pozwalają uniknąć wad rozwojowych i wad serca. Przewidziano również możliwy potok pozyskiwania i analizy danych dostosowany do obrazowania serca.

Mikroskopia świetlna szybkiej dynamiki serca w zarodkach danio pręgowanego

Przedstawiamy metodę mezoskopowej rekonstrukcji całego serca myszy poprzez połączenie nowych osiągnięć w transformacji tkanek i barwieniu z rozwojem osiowo skanowanego mikroskopu świetlnego.

Mezoskopowe obrazowanie optyczne całego serca myszy

Ten protokół demonstruje izolację pod kontrolą mikroskopii i barwienie immunofluorescencyjne mysich żył płucnych. Przygotowujemy próbki tkanek zawierających lewy przedsionek, żyły płucne i odpowiadające im płuca i wybarwiamy je pod kątem sercowej troponiny T i Connexin 43.

Mikrodysekcja i barwienie immunofluorescencyjne rękawów mięśnia sercowego w mysich żyłach płucnych

Protokół wykorzystuje zaawansowaną mikroskopię świetlną wraz z dostosowanymi metodami oczyszczania tkanek do badania skomplikowanych struktur serca w sercach gryzoni, co ma ogromny potencjał dla zrozumienia morfogenezy i przebudowy serca.

Obrazowanie w arkuszach świetlnych w celu ujawnienia struktury serca w sercach gryzoni

Trójwymiarowa (3D) rekonstrukcja uszkodzenia serca w reperfuzji ostrego zawału mięśnia sercowego (repAMI) umożliwia wierną kwantyfikację i kolokalizację powiązanych wzorców wpływających na chorobę. W tym przypadku zapewniono zautomatyzowane obrazowanie sterowane arkuszem świetlnym do jednoczesnego pomiaru uszkodzenia serca, obszaru ryzyka i odpowiedzi komórek odpornościowych.

Jednoczesna analiza 3D uszkodzenia serca i odpowiedzi immunologicznej w ostrym zawale mięśnia sercowego z reperfuzją przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła

Zaprojektowano cykliczny bioreaktor ciśnieniowy, który umożliwia poddawanie tkanki zastawek serca fizjologicznym oraz patologicznym warunkom ciśnieniowym. Program LabVIEW pozwala użytkownikom na kontrolowanie wartości, amplitudy oraz częstotliwości ciśnienia. Urządzenie to może być wykorzystywane do badania mechanobiologii tkanki zastawek serca lub izolowanych komórek.

Projekt cyklicznego bioreaktora ciśnieniowego do badań ex vivo zastawek tętniczych serca

Opisano metodologię szacowania orientacji włókien komorowych na podstawie obrazów in vivo geometrii serca pacjenta do spersonalizowanego modelowania. Walidacja metodologii przeprowadzona przy użyciu normalnych i niewydolnych serc psów pokazuje, że nie ma znaczących różnic między szacowaną a nabytą orientacją włókien na poziomie klinicznie obserwowalnym.

Modelowanie serca w zależności od pacjenta: ocena orientacji włókien komorowych

Poznaj mikroskopię fluorescencyjną z arkuszem świetlnym do badania mysiego serca. Ta metoda umożliwia szybkie obrazowanie struktur serca po terapii genowej.

Mikroskopia fluorescencyjna z arkuszem świetlnym do badania mysiego serca

Przeglądaj więcej filmów