Mikroskopia fluorescencyjna z arkuszem świetlnym do badania mysiego serca

Główną zaletą tej technologii jest to, że pozwala na szybkie obrazowanie serca myszy. I może być używany do obserwacji obecności kanałów powietrznych po terapii genowej. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w kardiologię rozwojową, może być również stosowana w innych systemach, takich jak neurologia i pulmonologia.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby będą zmagać się z tą techniką, ponieważ montaż obrazowania serca dorosłej myszy może być trudny i różni się od innych, tradycyjnych technik, takich jak mikroskopia konfokalna i odwrócona. Umieść laser o fali ciągłej o trzech długościach fal 405 nanometrów, 473 nanometrach i 532 nanometrach. Następnie przymocuj lustro pierwsze i wyrównaj je z płaszczyzną lustra pod kątem 45 stopni do belki.

Spowoduje to skierowanie lasera w kierunku rozdzielacza wiązki, który tworzy dwustronny układ oświetlenia. Następnie przepuść wiązkę przez filtr o neutralnej gęstości o średnicy 50 milimetrów, ekspander wiązki i otwór na szpilkę o średnicy 25 milimetrów, wszystkie umieszczone w odległości 150 milimetrów od siebie. Przepuść wiązkę przez rozdzielacz wiązki 50-50, umieszczony 150 milimetrów od otworu.

Następnie umieść lustro dwa 150 milimetrów od rozdzielacza wiązki, pod kątem 90 stopni do przedniej belki i wyrównaj je tak, aby jego płaszczyzna lustra była pod kątem 45 stopni do wiązki. Następnie umieść lustro trzy 100 milimetrów od lustra drugiego i wyrównaj je tak, aby jego płaszczyzna lustra była pod kątem 45 stopni do wiązki odbitej od lustra drugiego. Użyj tej odbitej wiązki, aby uformować jedną stronę arkusza świetlnego z podwójnym oświetleniem.

Po drugiej stronie rozdzielacza wiązki umieść lustro piąte tak, aby jego płaszczyzna lustra znajdowała się pod kątem 45 stopni do wiązki emitowanej w kierunku do przodu. Użyj wiązki emitowanej przez lustro piąte, aby utworzyć drugą stronę arkusza świetlnego z podwójnym oświetleniem. Następnie skonfiguruj system dwustronnego oświetlenia w sposób systemowy.

Umieść soczewkę cylindryczną w odległości 150 milimetrów od lustra trzeciego, a drugą identyczną soczewkę cylindryczną w odległości 150 milimetrów od lustra piątego, po drugiej stronie zestawu podwójnego oświetlenia. Następnie umieść dwa lustra, każde w jednej linii z cylindrycznymi soczewkami, w odległości 50 milimetrów, aby odbijać wiązkę pod kątem 90 stopni. Po obu stronach arkusza świetlnego utwórz achromatyczny dublet z pary soczewek, przy czym pierwsza soczewka jest umieszczona 100 milimetrów od poprzedniego zwierciadła i ma średnicę jednego cala i ogniskową 100 milimetrów.

Drugi obiektyw powinien być umieszczony 160 milimetrów od obiektywu pierwszego, o średnicy jednego cala i ogniskowej 60 milimetrów. Następnie należy umieścić obiektywy oświetlające jeden i dwa w odległości 150 milimetrów od poprzednich dubletów achromatycznych, tak aby znajdowały się w jednej linii z wiązką. Wiązka emitowana przez obiektywy tworzy arkusz świetlny do obrazowania próbek.

Najpierw przygotuj próbkę kulki fluorescencyjnej, rozcieńczając roztwór kulek o wielkości 0,53 mikrometra, od jednego do 150 000, we wstępnie podgrzanym roztworze dopasowującym współczynnik załamania światła, z jednoprocentową agarozą o niskiej temperaturze topnienia. Następnie użyj kawałka rurki ze szkła borokrzemianowego o średnicy wewnętrznej 12 milimetrów i średnicy zewnętrznej 18 milimetrów, do długości 30 milimetrów. Odpipetować roztwór agarozy w kulce rurki borokrzemianowej i pozostawić agarozę do zestalenia się w temperaturze pokojowej.

Teraz napełnij wydrukowaną w 3D komorę ABS 99,5-procentowym roztworem gylcerolu. Umieść rurkę ze szkła borokrzemianowego zawierającą koraliki w komorze. Podłącz zmotoryzowany stolik translacyjny 3D do rurki ze szkła borokrzemianowego, aby kontrolować ruch i orientację próbki w komorze ABS.

Następnie użyj specjalnie zaprojektowanego oprogramowania, aby uzyskać obrazy za pomocą kamery sCMOS z szybkością 30 klatek na sekundę. Za pomocą sterownika silnika przesuń próbkę o jeden milimetr w kierunku bocznym i rejestruj obrazy z każdym krokiem o jeden milimetr, aż cała próbka zostanie zobrazowana. Ułóż uzyskane obrazy w stos za pomocą oprogramowania do wizualizacji i zmierz funkcję rozrzutu punktów systemu za pomocą tych obrazów ściegów.

Użyj roztworu dopasowującego współczynnik załamania światła o pH 7,5 i rozpuść jeden procent agarozy w pasującym roztworze. Umieść oczyszczoną próbkę serca dorosłej myszy w roztworze dopasowującym współczynnik załamania światła, z jednym procentem rozpuszczonej agarozy. Następnie włóż próbkę do rurki ze szkła borokrzemianowego i pozwól agarozie zestalić się w temperaturze pokojowej.

Podłącz zmotoryzowany stolik translacyjny 3D do rurki ze szkła borokrzemianowego, aby kontrolować ruch i orientację próbki w drukowanej w 3D komorze ABS. Umieść próbkę tak, aby znajdowała się w środku wiązki Gaussa, utworzonej przez system podwójnego oświetlenia. Następnie ustaw szybkość akwizycji kamery sCMOS na 30 klatek na sekundę.

Teraz, za pomocą sterownika silnika, przesuń próbkę o jeden milimetr w kierunku osiowym i uzyskaj obrazy z każdym krokiem o milimetr. Kontynuuj, aż cała próbka zostanie zobrazowana. Ułóż uzyskane obrazy w stos za pomocą oprogramowania do wizualizacji.

Wywołaj obrazy 3-D przy użyciu tych stosów obrazów. Aby to osiągnąć, należy zdekonwolucjonizować wyznaczoną wcześniej funkcję rozrzutu punktowego i wykorzystać ją dla uzyskanych stosów obrazów. Na koniec ustaw wartość intensywności progu pikseli, aby obserwować kontury serca i dodaj pseudokolor do obrazów w oparciu o tę intensywność w skali szarości.

W pierwszym dniu po porodzie można między innymi uwidocznić zastawki, przedsionek, komorę, mięsień pektynowy i beleczkowanie. W siódmym dniu po porodzie cechy są jeszcze bardziej wyraźne. Przedsionek, komora, wymiary jamy komorowej i grubość ścianki komory są oczywiste.

Aby zbadać różnicowanie kardiomiocytów w sercu, heterozygotyczne myszy knock-in zostały oznaczone cre, aby pokazać kardiomiocyty. Oznaczone komórki są pokazane w tym miejscu, w każdym kierunku płaszczyzny. Trzy płaszczyzny zostały połączone, aby stworzyć trójwymiarowe odwzorowanie serca.

Obszar z czerwonym kółkiem we wstawce przedstawia dwa półprzezroczyste serca myszy po poddaniu technice przezroczystości i włożeniu do rurki ze szkła borokrzemianowego. Oprócz badania myszy po urodzeniu, system obrazowania może być również wykorzystywany do badania serca dorosłej myszy. Tutaj kanały ROMK oznaczone GFP są wyświetlane po 7,5 miesiącach.

Znajdowały się one głównie w ścianie komory. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu jednej do dwóch minut. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby usunąć wszystkie pęcherzyki wokół próbki w probówce.

Inne metody, takie jak automatyczna segmentacja stosów obrazów, mogą być wykonane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania związane z urazami sercowo-naczyniowymi i regeneracją. Po opracowaniu technika ta została wykorzystana przez naukowców do badania architektury serca w postnatalnych i dorosłych stadiach rozwojowych u myszy.