Name: Analiza fluorescencji pojedynczej cząsteczki hybrydyzacji in situ (smFISH) w pączkującym wzroście wegetatywnym drożdży i mejozie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Poznaj metodę smFISH do ilościowej analizy RNA w drożdżach pączkujących podczas wzrostu wegetatywnego i mejozy. Technika ta pozwala badać zmienność ekspresji genów i lokalizację subkomórkową RNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Anne Dodson i Stephanie Heinrich za porady, jak zoptymalizować protokół smFISH, Xavierowi Darzacqowi za pomoc z platformą analityczną, Haiyanowi Huangowi za sugestie dotyczące analizy statystycznej. Praca ta była wspierana przez fundusze z March of Dimes (5-FY15-99), Pew Charitable Trusts (00027344), Damon Runyon Cancer Research Foundation (35-15) i Glenn Foundation dla EÜ oraz grantu NSF Graduate Research Fellowship No. DGE-1106400 do JC.

UWAGA: Wszystkie i nośniki używane w tym protokole są wymienione w Tabeli 1. Informacje o dostawcy odczynników są wymienione w Tabeli materiałów.
Dzień 1/Dzień 1-2:
UWAGA: Dla hodowli wegetatywnej, hoduj komórki do OD600 od 0,4 do 0,6 w preferowanym podłożu. W przypadku hodowli mejotycznej należy skłonić komórki do poddania się mejozie przy użyciu preferowanej metody (zwykle hodowla w OD600 1,85).
1. Utrwalanie i trawienie próbki
<ol>
	<li>Utrwal w sumie ~3,5 OD600 komórek w 3% formaldehydzie.
	<ol>
		<li>W przypadku hodowli wegetatywnej dodaj 5,52 ml kultury do 480 μl 37% formaldehydu w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml.</li>
		<li>W przypadku hodowli mejotycznej dodaj 1840 μl kultury do 160 μl 37% formaldehydu w probówkach do mikrowirówek o pojemności 2 ml. Odwróć ~5 razy, aby wymieszać. 
		UWAGA: Formaldehyd jest toksyczny. Obchodzenie się i utylizacja zgodnie z przepisami instytucjonalnymi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść rurki na bębnie rolkowym w temperaturze pokojowej na 20 minut. W przypadku próbek mejotycznych, po utrwaleniu w temperaturze pokojowej przez 20 minut, kontynuuj utrwalanie przez noc w temperaturze 4 °C, obracając. 
	UWAGA: Utrwalanie przez noc zwiększa odtwarzalność i jakość danych smFISH uzyskanych dla próbek mejotycznych. Czas mocowania powinien być zoptymalizowany.</li>
	<li>Podczas utrwalania próbek rozmrozić 200 mM kompleksów rybonukleozydów wanadylu (VRC) w temperaturze 65 °C przez co najmniej 10 minut.</li>
	<li>Przygotować główną mieszankę mineralizacyjną w probówce o pojemności 15 ml: dla 1 próbki zmieszać 425 μl buforu B z 40 μl 200 mM VRC (podgrzanego do 65 °C); dla 5 próbek zmieszać 2125 μl buforu B z 200 μl 200 mM VRC (podgrzanego do 65 °C). Wirować ~5 s, aby całkowicie zawiesić VRC przed dodaniem do mieszanki głównej, która po dodaniu VRC stanie się jasnobrązowo-zielona. 
	UWAGA: Dodanie VRC podczas trawienia poprawia spójność wyników smFISH, potencjalnie poprzez hamowanie zanieczyszczenia nukleazą wprowadzanego przez mieszaninę zymoliazy, która jest oczyszczana z surowego ekstraktu. Ilość VRC wymagana na tym etapie powinna być zoptymalizowana.</li>
	<li>W przypadku próbek wegetatywnych należy odwirować probówki o sile ~1057 x g przez 3 minuty. W przypadku próbek mejotycznych (po utrwaleniu przez noc) odwirować przy 21 000 x g przez 1,5 min. Zdekantować lub odessać supernatant do odpadów formaldehydu. 
	UWAGA: Wszystkie etapy wirowania odbywają się w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zawiesić komórki w 1,5 ml zimnego buforu B, pipetując w górę i w dół lub odwracając probówki i przesuwając w celu wymieszania. Przenieść próbki wegetatywne do probówek o pojemności 2 ml po ponownym zamieszaniu.</li>
	<li>Wirować przy 21 000 x g przez 1,5 min. Usunąć większość cieczy przez zasysanie próżniowe lub pipetowanie, pozostawiając ~100 μl.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 1,5 ml zimnego buforu B.</li>
	<li>Wirować przy 21 000 x g przez 1,5 min. Usunąć większość cieczy przez zasysanie próżniowe lub pipetowanie, pozostawiając ~100 μl.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 1,5 ml zimnego buforu B. Wirować przy 21 000 x g przez 1,5 minuty. Całkowicie odessać ciecz za pomocą próżni lub pipetowania.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 425 μl głównej mieszanki trawienia i krótko zawirować, aby ponownie zawiesić. Dodać 5 μl 100T 10 mg/ml zymoliazy do każdej probówki. 
	UWAGA: Wiruj zymoliazę za każdym razem przed dodaniem do probówek. Dodaj zymoliazę do każdej probówki z osobna, zamiast dodawać do mieszanki głównej. Oba etapy pomagają utrzymać spójność trawienia między rurkami, ponieważ zymoliaza szybko się wytrąca.</li>
	<li>Wiruj 2-3 s do mieszania. Umieścić probówki na bębnie rolkowym i trawić w temperaturze 30 °C przez 15-30 minut. W przypadku komórek wegetatywnych i wczesnych stadiów mejotycznych trwa to zwykle ~15 min, a w przypadku profazy mejotycznej i podziałów mejotycznych trwa to zwykle ~30 min. 
	UWAGA: Sprawdzaj pod mikroskopem co 5 minut po 15 minutach i przerwij trawienie, gdy ~80% komórek wydaje się nieprzezroczystych i niezałamujących. Od tego momentu komórki są bardzo delikatne. Z komórkami należy obchodzić się delikatnie i unikać zasysania próżniowego lub wirowania.</li>
	<li>Odwirować probówki o sile ~376 x g przez 3 minuty. Całkowicie usunąć płyn za pomocą pipetowania.</li>
	<li>Delikatnie ponownie zawiesić komórki z 1 ml buforu B, pipetując w górę i w dół 1-2 razy, aby wymieszać.</li>
	<li>Odwirować probówki o sile ~376 x g przez 3 minuty. Usunąć płyn z buforu B przez pipetowanie. Delikatnie zawieś komórki w 1 ml 70% etanolu (rozcieńczonego wodą wolną od RNaz).</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3,5-4 godziny.</li>
</ol>
2. Hybrydyzacja
<ol>
	<li>Doprowadź formamid do temperatury pokojowej (dla 50 ml porcji zajmuje ~30 minut w łaźni wodnej). 
	UWAGA: Nie otwieraj butelki z formamidem, dopóki butelka nie osiągnie temperatury pokojowej, aby uniknąć utleniania formamidu. 
	UWAGA: Formamid jest toksyczny. Obchodzenie się i utylizacja zgodnie z przepisami instytucjonalnymi.</li>
	<li>Przygotować 10% bufor do przemywania formamidu w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować probówki o stężeniu ~376 x g przez 3 minuty. Usunąć 500 μl 70% etanolu przez pipetowanie. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić pozostałe komórki, a następnie przenieść komórki do probówek o niskiej przyczepności. 
	UWAGA: Stosowanie rurek o niskiej przyczepności znacznie zmniejsza utratę komórek podczas kolejnych prań.</li>
	<li>Ponownie odwirować probówki przy ciśnieniu ~376 x g przez 3 minuty. Usunąć cały etanol za pomocą pipetowania.</li>
	<li>Dodać 1 ml 10% buforu do płukania formamidu i delikatnie pipetować w górę i w dół 2-3 razy, aby ponownie zawiesić komórki.</li>
	<li>Pozostaw komórki w temperaturze pokojowej na ~ 20 minut, przygotowując roztwór hybrydyzacyjny. Dla 1 próbki zmieszać 50 μl buforu hybrydyzacyjnego (temp. pokojowa), 5 μl 200 mM VRC (podgrzanego do 65 °C) i 1 μl każdej sondy (200 nM final). Dla 5 próbek wymieszaj 250 μl buforu hybrydyzacyjnego (temp. pokojowa), 25 μl 200 mM VRC (podgrzanego do 65 °C) i 5 μl każdej sondy (200 nM final).
	<ol>
		<li>Rozmrozić bufor hybrydyzacyjny (zamrożony w temperaturze -20 °C) do temperatury pokojowej przed otwarciem probówki, aby zapobiec utlenianiu formamidu.</li>
		<li>Po dodaniu 200 mM VRC, wiruj przez 5-10 s przed dodaniem sond, które są projektowane i kupowane komercyjnie, a następnie odtwarzane zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Jeśli dwie sondy są inkubowane jednocześnie, dodać 1 μl roztworu sondy #1 w stosunku 1:10, a także 1 μl roztworu sondy #2 w stosunku 1:10, aby uzyskać końcowe rozcieńczenie ~1:500 dla każdej sondy. Stężenie potrzebne do uzyskania najlepszego stosunku sygnału do szumu musi być zoptymalizowane (szczegółowe informacje można znaleźć w dyskusji).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować próbki o stężeniu ~376 x g przez 3 minuty. Usunąć supernatant do odpadów niebezpiecznych za pomocą pipetowania.</li>
	<li>Dodać co najmniej 50 μl roztworu hybrydyzacyjnego do każdej probówki. Przesuń rurki, aby wymieszać.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 30 °C na bębnie rolkowym przez co najmniej 16 godzin w ciemności.</li>
</ol>
Dzień 2/Dzień 3
3. Mycie i obrazowanie
<ol>
	<li>Doprowadzić formamid do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Przygotować 10% formamidowy bufor do przemywania (FWB) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Wyjmij rurki z bębna rolkowego i umieść je w pudełku pokrytym folią, aby chronić je przed światłem. </li>
	<li>Odwirować próbki o stężeniu ~376 x g przez 3 minuty. Usunąć supernatant do odpadów niebezpiecznych za pomocą pipetowania.</li>
	<li>Zawiesić ponownie w 1 ml 10% FWB, delikatnie pipetując w górę i w dół 2-3 razy.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 30 °C przez 30 minut (bez obracania) w pojemniku pokrytym folią.</li>
	<li>Odwirować próbki przy ciśnieniu ~376 x g przez 3 minuty. Usunąć supernatant do odpadów niebezpiecznych za pomocą pipetowania i pozostawić ~50 μl.</li>
	<li>W międzyczasie przygotuj DAPI/FWB w stożkowej probówce o pojemności 15 ml: Dla 1 próbki wymieszaj 1000 μl 10% buforu do płukania formamidu z 1 μl 5 mg/ml DAPI. W przypadku 10 próbek zmieszać 10 ml 10% buforu do przemywania formamidu z 10 μl 5 mg/ml DAPI. Zawiesić w 1 ml DAPI/FWB, delikatnie pipetując w górę i w dół 2-3 razy.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 30 °C przez 30 minut (bez obracania) w pojemniku pokrytym folią.</li>
	<li>Rozmrozić odczynniki przeciwwybielające na lodzie.</li>
	<li>Odwirować próbki przy ciśnieniu ~376 x g przez 3 minuty. Całkowicie usunąć supernatant przez pipetowanie. W razie potrzeby ponownie odwirować w celu usunięcia całego supernatantu.</li>
	<li>W przypadku próbek, które nie są obrazowane natychmiast, należy ponownie zawiesić osad w 50 μl buforu GLOX bez enzymów. Pipetować w górę i w dół 3-4 razy, aby wymieszać.
	<ol>
		<li>Przechowywać wszystkie nieobrazowane próbki w pudełku pokrytym folią w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą gotowe do obrazowania. Gdy próbka będzie gotowa do obrazowania, odwirować próbki o stężeniu ~376 x g przez 2 minuty i całkowicie usunąć supernatant przez pipetowanie. Zawiesić w GLOX z enzymami, jak poniżej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku próbek poddawanych natychmiastowemu obrazowaniu należy dodać 15-20 μl buforu GLOX z enzymami. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby wymieszać. 
	UWAGA: Dodawana objętość może się różnić w zależności od wielkości osadu komórkowego. Zalecamy ponowne zaparcie osadu w 15 μl buforu GLOX z enzymami i sprawdzenie gęstości komórek pod mikroskopem. Jeśli komórki są zbyt gęste (komórki zlepiają się jedna na drugiej), dodaj dodatkowy bufor GLOX z enzymami. Jeśli komórki są zbyt rzadkie, odwirować próbkę i usunąć ~5 μl buforu.</li>
	<li>Odpipetować 5 μl na szkiełko nakrywkowe (18 mm x 18 mm, nr 1) i umieścić szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym.</li>
	<li>Umieść chusteczkę laboratoryjną na szkiełku, w którym umieszcza się szkiełko nakrywkowe. Delikatnie naciśnij chusteczkę laboratoryjną, aby ustawić szkiełko (powinien być widoczny płyn spływający ze wszystkich czterech krawędzi szkiełka nakrywkowego).</li>
	<li>Przenieś szkiełko do pomieszczenia mikroskopu w pudełku pokrytym folią aluminiową.</li>
	<li>Obraz za pomocą szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego o dużym powiększeniu (60-100X) i dużej aperturze numerycznej. 
	UWAGA: Aby zebrać maksymalną liczbę fotonów emitowanych przez sondy smFISH, nie zaleca się stosowania mikroskopów konfokalnych, ponieważ znacznie ograniczają one ilość zbieranego światła. W tym przypadku dane zostały zebrane na mikroskopie wyposażonym w obiektyw 100X, 1,4 NA, przy użyciu filtrów CY5 (EX632/22, EM679/34) zobrazowanych z prędkością 1,3 s, 100% T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1,3 s, 100% T; i DAPI (EX390/18, EM435/48), 0,05-0,1 s, 32%-50% T. Należy również uzyskać obraz referencyjny w jasnym polu. Uzyskaj 15-25 wycinków o wielkości kroku 0,1-0,2 μm, od całkowicie poniżej ostrości pola widzenia do całkowicie powyżej, aby upewnić się, że wszystkie plamki RNA są uwzględnione.</li>
</ol>
4. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Analizuj dane smFISH za pomocą opublikowanych narzędzi analitycznych smFISH, takich jak FISH-quant17 i StarSearch2, lub za pomocą niestandardowych programów, w zależności od dokładnych wymagań eksperymentu. 
	UWAGA: Dobry potok analizy powinien pozwolić użytkownikom na określenie progu oddzielania prawdziwych plamek RNA od tła i wyprowadzanie statystyk, takich jak współrzędne X, Y i Z (opcjonalnie) oraz intensywność każdej plamki, liczba plamek w każdej komórce i ewentualnie dopasowanie parametrów jako sposób na odfiltrowanie fałszywych detekcji.</li>
</ol>

<ol><li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li>
<li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li>
<li>Rahman, S., Zenklusen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+resolution+fluorescent+in+situ+hybridization+%28smFISH%29+in+the+yeast+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule resolution fluorescent in situ hybridization (smFISH) in the yeast S. cerevisiae.</a> Methods Mol Biol. 1042, 33-46 (2013).</li>
<li>Gaspar, I., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strength+in+numbers%3A+quantitative+single-molecule+RNA+detection+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Strength in numbers: quantitative single-molecule RNA detection assays.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (2), 135-150 (2015).</li>
<li>Vargas, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+transcriptionally+coupled+and+uncoupled+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of transcriptionally coupled and uncoupled splicing.</a> Cell. 147 (5), 1054-1065 (2011).</li>
<li>Waks, Z., Klein, A. M., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+variability+of+alternative+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell variability of alternative RNA splicing.</a> Mol Syst Biol. 7, 506(2011).</li>
<li>Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-RNA+counting+reveals+alternative+modes+of+gene+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (12), 1263-1271 (2008).</li>
<li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309(2006).</li>
<li>Senecal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+modulate+c-Fos+transcriptional+bursts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcription factors modulate c-Fos transcriptional bursts.</a> Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).</li>
<li>Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+SNVs+to+quantify+allele-specific+expression+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells.</a> Nat Methods. 10 (9), 865-867 (2013).</li>
<li>Hansen, C. H., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allele-specific+detection+of+single+mRNA+molecules+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Allele-specific detection of single mRNA molecules in situ.</a> Nat Methods. 10 (9), 869-871 (2013).</li>
<li>Ginart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+allele-specific+expression+in+single+cells+reveals+epigenetic+mosaicism+in+an+H19+loss-of-imprinting+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Visualizing allele-specific expression in single cells reveals epigenetic mosaicism in an H19 loss-of-imprinting mutant.</a> Genes Dev. 30 (5), 567-578 (2016).</li>
<li>Long, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mating+type+switching+in+yeast+controlled+by+asymmetric+localization+of+ASH1+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mating type switching in yeast controlled by asymmetric localization of ASH1 mRNA.</a> Science. 277 (5324), 383-387 (1997).</li>
<li>Park, H. Y., Trcek, T., Wells, A. L., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unbiased+analysis+method+to+quantify+mRNA+localization+reveals+its+correlation+with+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">An unbiased analysis method to quantify mRNA localization reveals its correlation with cell motility.</a> Cell Rep. 1 (2), 179-184 (2012).</li>
<li>Jourdren, L., Delaveau, T., Marquenet, E., Jacq, C., Garcia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CORSEN%2C+a+new+software+dedicated+to+microscope-based+3D+distance+measurements%3A+mRNA-mitochondria+distance%2C+from+single-cell+to+population+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">CORSEN, a new software dedicated to microscope-based 3D distance measurements: mRNA-mitochondria distance, from single-cell to population analyses.</a> RNA. 16 (7), 1301-1307 (2010).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetochore+inactivation+by+expression+of+a+repressive+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Kinetochore inactivation by expression of a repressive mRNA.</a> eLife. 6, e27417(2017).</li>
<li>Mueller, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH-quant%3A+automatic+counting+of+transcripts+in+3D+FISH+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images.</a> Nat Methods. 10 (4), 277-278 (2013).</li>
<li>Brar, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+view+of+the+yeast+meiotic+program+revealed+by+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution view of the yeast meiotic program revealed by ribosome profiling.</a> Science. 335 (6068), 552-557 (2012).</li>
<li>Carlile, T. M., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis+I+is+established+through+division-specific+translational+control+of+a+cyclin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin.</a> Cell. 133 (2), 280-291 (2008).</li>
<li>Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+landmark+events+in+meiosis+by+the+CDK+Cdc28+and+the+meiosis-specific+kinase+Ime2%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2.</a> Genes Dev. 17 (12), 1524-1539 (2003).</li>
<li>Dodson, A. E., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+capture+of+heterochromatin+dynamics+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Heritable capture of heterochromatin dynamics in Saccharomyces cerevisiae.</a> eLife. 4, e05007(2015).</li>
<li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nat Protoc. 7 (2), 408-419 (2012).</li>
<li>Youk, H., Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+single+mRNA+molecules+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Imaging single mRNA molecules in yeast.</a> Methods Enzymol. 470, 429-446 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Przedstawiony tutaj protokół wywodzi się z innych opublikowanych protokołów smFISH 2,3,21,22,23 i jest specjalnie zoptymalizowany dla tła szczepu drożdży SK1. Zoptymalizowane parametry obejmowały liczbę komórek, czas utrwalania, prędkość i czas trwania wirowania, czas trwania trawienia, bufor trawienny, stężenie sondy i bufor hybrydyzacyjny. Inne parametry, takie jak temperatura i czas trwania hybrydyzacji, nie zostały zoptymalizowane. W tej sekcji dzielimy się kilkoma uwagami, które pomogłyby dostosować ten protokół do dowolnego tła szczepu drożdży i interesujących warunków wzrostu.
Ściana komórkowa pączkujących drożdży jest jednym z głównych wyzwań związanych z uzyskaniem wysokiej jakości obrazów smFISH w pączkujących drożdżach, ponieważ ściana komórkowa zapobiega penetracji sondy. Niepełne trawienie ściany komórkowej przez zymoliazę prowadzi do nieefektywnej hybrydyzacji sond i dużej zmienności sygnału między komórkami. Jednak nadmierne trawienie może sprawić, że komórki staną się zbyt kruche, co prowadzi do znacznej utraty komórek podczas etapów płukania i pękania komórek podczas przygotowywania szkiełek do obrazowania. Dlatego optymalizacja czasu trawienia ma kluczowe znaczenie. Zalecamy przeprowadzenie pilotażowego eksperymentu smFISH poprzez trawienie tej samej próbki przez różny czas. W naszym przypadku uzyskaliśmy najlepsze dane smFISH, jeśli zatrzymaliśmy trawienie, gdy ~80% komórek stało się nierefrakcyjnych. Zazwyczaj, w tych samych warunkach wzrostu, różne zmutowane szczepy genetyczne mogą być trawione w podobnym czasie. Jednak czas trawienia różni się w porównaniu z różnymi warunkami wzrostu i różnymi etapami mejozy u pączkujących drożdży. Po ustaleniu czasu jakość smFISH jest powtarzalna. Należy pamiętać, że w przypadku zmutowanych szczepów z wadliwą syntezą i/lub składem ściany komórkowej trawienie może zakończyć się w czasie krótszym niż 15 minut. Stosowanie różnych partii zymoliazy może również nieznacznie zmienić czas trawienia.
Optymalne stężenie sondy jest potrzebne do osiągnięcia wysokiego stosunku sygnału do szumu. Nasze sondy smFISH zaprojektowaliśmy i zakupiliśmy komercyjnie. Dobre sondy (często 20-merowe) powinny mieć procent GC w zakresie od 35% do 45%, minimalny odstęp 2 par zasad między sondami i niską reaktywność krzyżową. Użyliśmy internetowego projektanta sond od producenta, aby wygenerować listę sond, a jeśli byłoby wystarczająco dużo sond do wyboru, użylibyśmy algorytmu BLAST w bazie danych genomu Saccharomyces, aby wyeliminować sondy z więcej niż 17 parami zasad nakładającymi się na inne regiony genomu. Wybraliśmy bardziej fotostabilny barwnik fluorescencyjny (CAL Fluor 590) do zestawu sond, który wyżarza się do unikalnego obszaru NDC80 luti (CF 590), ponieważ w tym zestawie liczba sond spełniających wszystkie powyższe kryteria (20 sond) była mniejsza niż minimalna liczba zalecana przez producenta (~25 sond). Po rozpuszczeniu roztworu sondy zgodnie z instrukcjami producenta, dokonaliśmy rozcieńczenia roztworu podstawowego w stosunku 1:10 i przechowywaliśmy rozcieńczony roztwór w podwielokrotnościach 5 μl w temperaturze -20 °C. Każda podwielokrotność została użyta tylko jeden raz. W celu optymalizacji należy wykonać seryjne rozcieńczenia z roztworu rozcieńczonego w stosunku 1:10 i sprawdzić, które stężenie daje najlepszy stosunek sygnału do szumu. Zalecamy wykonanie serii rozcieńczeń 1:250, 1:500, 1:1000 i 1:2000 z oryginalnego wywaru. W naszym przypadku współczynnik rozcieńczenia 1:500 dał najlepszy stosunek sygnału do szumu, zarówno dla zestawów sond CF 590, jak i Q 670.
Optymalny czas wiązania ma również kluczowe znaczenie dla powodzenia smFISH w pączkujących drożdżach. Odkryliśmy, że utrwalanie przez noc w temperaturze 4 °C, zamiast utrwalania w temperaturze pokojowej przez 20 minut, znacznie poprawiło spójność i jakość wyników smFISH dla próbek mejotycznych. Chociaż nie testowaliśmy, jak utrwalanie przez noc może wpływać na próbki wegetatywne, fiksacja w temperaturze pokojowej działała dobrze w tych warunkach wzrostu. Dlatego, aby zoptymalizować protokół smFISH dla nowych szczepów lub warunków wzrostu, zalecamy rozpoczęcie od krótkiego czasu utrwalenia w temperaturze pokojowej i wydłużenie czasu utrwalenia w przypadku napotkania dużej zmienności sygnału.
W porównaniu z innymi opublikowanymi protokołami 3,22,23, nasz protokół wykorzystuje inhibitor RNazy VRC podczas trawienia i wyższe stężenie VRC podczas hybrydyzacji. Dodanie VRC w tych dwóch etapach poprawiło spójność wyników smFISH, prawdopodobnie poprzez lepszą ochronę cząsteczek RNA przed aktywnością nukleazy, która może być wprowadzana przez mieszaninę zymoliazy (enzym jest oczyszczany z surowych ekstraktów i może zawierać zanieczyszczenia RNazą). Dlatego zalecamy stosowanie ilości VRC podanej w naszym protokole lub nawet wyższych stężeń VRC w celu optymalizacji.
Znaczna część komórek może zostać utracona podczas etapów płukania zarówno w buforze B, jak i w buforze do przemywania formamidem. Aby zmniejszyć utratę komórek, można zwiększyć prędkość wirowania. W naszym przypadku użycie dużej prędkości (21 000 x g) do granulowania naszych próbek podczas mycia buforem B znacznie zmniejszyło utratę komórek. Jednak po trawieniu zymoliazą komórki stają się bardzo kruche, dlatego zmiana prędkości wirowania nie jest zalecana. Zamiast tego sugerujemy użycie rurek o niskiej przyczepności firmy USA Scientific, które znacznie pomagają w granulowaniu komórek podczas mycia w buforze do płukania formamidu. Ogólnie rzecz biorąc, nasz protokół może konsekwentnie generować monowarstwę komórek wystarczająco gęstą, aby zapewnić wydajne obrazowanie. Zazwyczaj 7 pól widzenia powinno dać >130 komórek nadających się do kwantyfikacji.
Na koniec ważne jest, aby określić optymalne parametry i potrzebne wyniki analizy obrazu. Aby wykryć plamy smFISH, opublikowane programy analityczne zwykle filtrują surowe obrazy za pomocą jądra Gaussa w celu usunięcia sygnału tła i proszą użytkowników o określenie stosunku sygnału do szumu, który ma być używany dla każdego zestawu obrazów 2,17. Niestety, obecnie nie ma jednego standardu, według którego określa się odpowiednie parametry, dlatego konieczne jest przeprowadzenie pewnych empirycznych testów tych różnych ustawień. Aby ustawić parametry potrzebne dla każdego z tych kroków, należy iteracyjnie wprowadzać różne zestawy parametrów i sprawdzać, jak dobrze wyniki uzyskane z każdego zestawu pasują do wyników z ręcznego liczenia w kilku reprezentatywnych komórkach. Po znalezieniu jednego zestawu parametrów, można go użyć do większości obrazów uzyskanych pomimo różnych warunków wzrostu i tła genetycznego.
Ponadto można sprawdzić, czy projekcja obrazów smFISH o maksymalnej intensywności może być wykonana przed kwantyfikacją22. Ten krok upraszcza algorytm wykrywania plamek i znacznie skraca czas obrazowania, choć kosztem niektórych potencjalnie użytecznych informacji o poszczególnych miejscach, takich jak ich lokalizacja subkomórkowa. W naszym przypadku liczba cząsteczek mRNA wytwarzanych przez gen NDC80 była na tyle niska, że plamki były dobrze oddzielone po tym przetwarzaniu (co nie jest rzadkością w przypadku transkryptów u pączkujących drożdży 3,7). W przypadkach, gdy analiza kolokalizacji ma kluczowe znaczenie, potok analizy musi określić lokalizację każdego miejsca smFISH w każdym kanale, aby ocenić kolokalizację. W zależności od konkretnych zadawanych pytań, inne informacje, takie jak intensywność każdego miejsca, mogą być również konieczne pobranie z rurociągu w celu dalszej analizy. Optymalizacja kluczowych kroków w protokole i potoku analizy obrazu ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości danych smFISH w celu zbadania interesującego pytania.

Dynamiczna regulacja ekspresji genów napędza rozwój organizmu, jak również jego reakcję na stres środowiskowy, infekcje i zmiany w metabolizmie. Badania, które koncentrują się na regulacji transkrypcji, opierają się na technologiach mierzących obfitość RNA. Jedna z takich metod, określana jako hybrydyzacja in situ fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFISH), jest stosowana do wykrywania pojedynczych cząsteczek RNA w pojedynczych komórkach1,2. Metoda ta umożliwia pomiar zmienności ekspresji genów między komórkami i określenie lokalizacji wewnątrzkomórkowego RNA.
W najczęściej używanej technice smFISH, wykrywanie pojedynczej cząsteczki RNA wymaga wielu krótkich sond DNA (często ~48 sond 20-merowych), które są komplementarne do docelowego RNA i są sprzężone z tym samym barwnikiem fluorescencyjnym. Wiązanie pojedynczej sondy fluorescencyjnej powoduje słaby sygnał, ale sygnał z zestawu wszystkich sond jest solidny. Ta cecha znacznie poprawia stosunek sygnału do szumu, ponieważ nawet jeśli pojedyncza sonda może wykazywać wiązanie poza celem, oczekuje się, że taki sygnał będzie bardzo słaby w porównaniu z docelową cząsteczką RNA3. W ramach błędu detekcji można policzyć i porównać liczbę cząsteczek RNA w różnych warunkach wzrostu i między różnymi mutantami.
Od momentu pierwszego opracowania, smFISH został przystosowany do badania różnych aspektów ekspresji genów4, takich jak wydłużenie transkrypcji1,2, splicing5,6, burstingal transcriptional class7,8,9, wewnątrzkomórkowa ekspresja alleliczna10,11,12, oraz lokalizacja RNA13,14,15. Ostatnio zastosowaliśmy tę metodę do zbadania ekspresji dwóch izoform transkryptowych tego samego genu, w których izoforma krótkiego transkryptu (NDC80ORF) ma całą sekwencję wspólną z długą izoformą (NDC80luti)16. Aby jednoznacznie zidentyfikować dwie izoformy mRNA, użyliśmy dwóch zestawów sond: jeden zestaw jest specyficzny dla unikalnej sekwencji NDC80 luti, a drugi zestaw, sprzężony z innym barwnikiem fluorescencyjnym, wiąże się ze wspólnym regionem dwóch izoform. NDC80luti RNA jest identyfikowany jako kolokalizowana plamka z obydwoma sygnałami fluorescencyjnymi, podczas gdy NDC80ORF RNA to ten, który zawiera tylko sygnał ze wspólnego zestawu sond. Ponieważ liczba transkryptów NDC80 ORF jest obliczana metodą "odejmowania", wysoka wydajność hybrydyzacji sondy i wysoki stosunek sygnału do szumu są niezbędne do pewnej identyfikacji plam smFISH i zmniejszenia propagacji błędów.
Ten artykuł opisuje zoptymalizowany protokół wykonywania smFISH u pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae. W tym protokole liczba komórek, czas wiązania, czas trawienia, bufor trawienia, stężenie sondy i bufor hybrydyzacyjny użyte w eksperymentach smFISH zostały zoptymalizowane pod kątem tła szczepu SK1 S. cerevisiae poddawanego wzrostowi wegetatywnemu lub mejjozie. Jednak w tym manuskrypcie zwracamy również uwagę: (1) metodę sprawdzania jakości danych smFISH po akwizycji obrazu oraz (2) kroki w protokole, które mogą wymagać dodatkowej optymalizacji dla różnych środowisk szczepów i warunków wzrostu.

<table><tbody><tr><td>BSA, bez RNaz (50 mg/ml)</td><td>Ambion</td><td>AM2616</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni C.</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C3515</td><td>Sklep pod adresem 4 &deg; C jak krótkoterminowe. Wirować przed użyciem.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9564</td><td>Sklep pod adresem -20 &deg; C po rozpuszczeniu w wodzie. Chronić przed światłem.</td></tr><tr><td>50% siarczan dekstranu</td><td>Milli Pore</td><td>S4030</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej. Bardzo lepka ciecz. Obchodź się z cierpliwością.</td></tr><tr><td>E. coli tRNA</td><td>Sigma</td><td>R4251</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 & C w podwielokrotnościach po rozpuszczeniu w wodzie.</td></tr><tr><td>Etanol (100%, 200 proof)</td> <td>różne</td><td></td><td>łatwopalne.</td></tr><tr><td>37% Formaldehyd</td><td>Fisher</td><td>F79-500</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej. Toksyczny. Używaj i utylizuj ostrożnie.</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Ambion</td><td>AM9342</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Otworzyć po osiągnięciu temperatury zbliżonej do temperatury pokojowej, aby zapobiec utlenianiu. Toksyczny. Używaj i utylizuj ostrożnie.&nbsp;</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>różne</td><td></td><td>Przechowywać w 4 & stopni; C po rozpuszczeniu w wodzie wolnej od nukleaz.</td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 & deg; C w podwielokrotnościach po rozpuszczeniu w 50 mM NaOAc, pH 5.</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>Fosforan potasu (jednozasadowy i dwuzasadowy)</td> <td>Przechowywać</td><td></td><td>w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>Biblioteka sond, rozcieńczona w TE, pH 8,0&nbsp;</td><td>Sklep z technologiami</td><td></td> biosearch <td>na -20 &deg; C w podwielokrotnościach (5 &mikro; L) po rozpuszczeniu w TE pH 8,0, zgodnie z instrukcją producenta. Chronić przed światłem.&nbsp;</td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>różne</td><td></td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>Ambion</td><td>AM9763</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>TE, pH 8,0</td><td>Ambion</td><td>AM9849</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>1 M Tris, pH 8,0</td><td>Ambion</td><td>AM9856</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma</td><td>238813</td><td>Sklep w temperaturze -20 & deg; C w podwielokrotnościach.</td></tr><tr><td>200 mM kompleks rybonukleozydów wanadylu (VRC)</td><td>NEB</td><td>S1402S</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 & deg; C w podwielokrotnościach po rozpuszczeniu, zgodnie z instrukcją producenta.</td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>MP Biomedicals</td><td>08320932</td><td>Sklep w temperaturze -20 & C w podwielokrotnościach po rozpuszczeniu w wodzie.</td></tr><tr><td>Rurki o niskiej przyczepności</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2600</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr></tbody></table>

analiza fluorescencji pojedynczej cząsteczki hybrydyzacji in situ (smfish) w pączkującym wzroście wegetatywnym drożdży i mejozie

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (smFISH) jest potężną techniką do badania ekspresji genów w pojedynczych komórkach ze względu na jej zdolność do wykrywania i liczenia pojedynczych cząsteczek RNA. Uzupełnienie metod opartych na głębokim sekwencjonowaniu, smFISH dostarcza informacji na temat zmienności liczebności transkryptów między komórkami i lokalizacji subkomórkowej danego RNA. Ostatnio wykorzystaliśmy smFISH do zbadania ekspresji genu NDC80 podczas mejozy u pączkujących drożdży, w których istnieją dwie izoformy transkryptu, a izoforma krótkiego transkryptu ma całą sekwencję wspólną z długą izoformą. Aby z pewnością zidentyfikować każdą izoformę transkryptu, zoptymalizowaliśmy znane protokoły smFISH i uzyskaliśmy wysoką spójność i jakość danych smFISH dla próbek pobranych podczas pączkowania mejozy drożdży. Tutaj opisujemy ten zoptymalizowany protokół, kryteria, których używamy do określenia, czy uzyskuje się wysoką jakość danych smFISH, oraz kilka wskazówek dotyczących wdrażania tego protokołu w innych szczepach drożdży i warunkach wzrostu.

Ten protokół hybrydyzacji fluorescencji in situ jest zoptymalizowany do ilościowego określenia liczby cząsteczek RNA w pączkujących drożdżach podczas wzrostu wegetatywnego i mejozy.

Analiza fluorescencji pojedynczej cząsteczki hybrydyzacji in situ (smFISH) w pączkującym wzroście wegetatywnym drożdży i mejozie

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Ogólnym celem tej zoptymalizowanej hybrydyzacji in situ pojedynczej cząsteczki RNA (smFISH) jest wykrycie i ilościowe określenie pojedynczych cząsteczek RNA na komórkę podczas wzrostu wegetatywnego i mejozy pączkujących drożdży. Metoda ta ujawnia zmienność między komórkami w ekspresji genów w lokalizacji subkomórkowego RNA i dlatego jest potężną techniką badania regulacji genów. Oprócz unikalnych informacji, które mogą zostać ujawnione przez smFISH, główną zaletą tej techniki jest to, że po optymalizacji jest ona solidna i wysoce powtarzalna.Do zademonstrowania tego protokołu zostanie użyta kultura mejotyczna. Aby utrwalić kulturę w 3% formaldehydzie, dodaj 1840 mikrolitrów kultury do 160 mikrolitrów 37% formaldehydu w dwumililitrowej probówce wirówkowej. Odwróć około pięć razy, aby wymieszać.Umieść rurkę na bębnie rolkowym w temperaturze pokojowej na 20 minut. Po 20 minutach kontynuuj utrwalanie w temperaturze czterech stopni Celsjusza z rotacją przez noc. Następnego dnia przygotuj się do trawienia, najpierw rozmrażając 200-milimolowe kompleksy rybonukleozydowe wanadylu (VRC) w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez co najmniej 10 minut.Aby przygotować główną mieszankę mineralizacji, najpierw odpipetuj 2125 mikrolitrów buforu B do 15-mililitrowej probówki. Następnie wiruj ciepły VRC przez pięć sekund, aby całkowicie go zawiesić i dodaj 200 mikrolitrów VRC do 15-mililitrowej probówki. Mieszanka powinna mieć jasnobrązowo-zielony kolor.Odwirować próbkę mejotyczną o masie 21 000 x g przez półtorej minuty w temperaturze pokojowej. Ostrożnie zassać supernatant, umieszczając końcówkę próżniową po przeciwnej stronie osadu, aby uniknąć zakłócenia osadu. Ponownie zawiesić komórki w półtora mililitra zimnego buforu B, pipetując w górę iw dół w celu wymieszania.Wirować przy 21 000 x g przez półtorej minuty. Usuń większość płynu przez aspirację próżniową, pozostawiając około 100 mikrolitrów. Ponownie zawiesić komórki w półtora mililitra zimnego buforu B. Odwirować próbki, usunąć płyn i ponownie zawiesić komórki w półtora mililitra zimnego buforu B.Wirować przy 21 000 x g przez półtorej minuty. Całkowicie odessać ciecz przez pipetowanie. Ponownie zawiesić komórki w 425 mikrolitrach głównej mieszanki mineralizacyjnej i krótko wirować.Dodaj pięć mikrolitrów zymoliazy do probówki i wiruj przez dwie do trzech sekund, aby wymieszać. Umieść probówkę na bębnie rolkowym i traw w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 15 do 30 minut. Po 15 minutach sprawdzaj komórki pod mikroskopem co pięć minut i przerwij trawienie, gdy około 80% komórek wydaje się nieprzezroczystych i niezałamujących.Odwirować probówkę o stężeniu 376 x g przez trzy minuty. Całkowicie usunąć supernatant. Delikatnie zawiesić komórki jednym mililitrem buforu B, pipetując w górę i w dół jeden do dwóch razy w celu wymieszania.Odwirować probówkę i usunąć bufor. Delikatnie zawieś ponownie komórki w jednym mililitrze 70% etanolu i inkubuj w temperaturze pokojowej przez trzy i pół do czterech godzin. Aby rozpocząć procedurę hybrydyzacji, odwiruj probówkę z komórkami o sile 376 x g przez trzy minuty.Usuń 500 mikrolitrów 70% etanolu z probówki. Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby ponownie zawiesić pozostałe komórki i przenieść je do probówki o niskiej przyczepności. Przeniesienie próbki do probówki o niskiej przyczepności ma kluczowe znaczenie dla zapobiegania nadmiernej utracie komórek podczas kolejnych płukań formamidem.Odwirować rurkę o niskiej przyczepności i usunąć cały etanol. Dodaj jeden mililitr 10% buforu do płukania formamidu do probówki i delikatnie pipetuj w górę iw dół dwa do trzech razy, aby ponownie zawiesić komórki. Pozwól komórkom zastygnąć w temperaturze pokojowej przez około 20 minut, przygotowując roztwory hybrydyzacyjne, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Odwirować próbkę i usunąć supernatant do odpadów niebezpiecznych. Dodaj co najmniej 50 mikrolitrów każdego roztworu hybrydyzacyjnego do probówki i przesuń probówkę, aby wymieszać. Inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza na bębnie rolkowym przez co najmniej 16 godzin w ciemności.Po zakończeniu hybrydyzacji umieść probówkę z komórkami w pudełku pokrytym folią, aby chronić przed światłem. Odwirować próbkę o masie 376 x g przez trzy minuty. Usunąć sklarowany osad do odpadów niebezpiecznych za pomocą pipetowania.Zawiesić próbkę w jednym mililitrze 10% buforu do płukania formamidu, delikatnie pipetując w górę i w dół dwa do trzech razy. Umieść probówkę z komórkami z powrotem w pudełku pokrytym folią, aby chronić przed światłem i inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po 30 minutach odwirować próbkę.Usunąć supernatant do odpadów niebezpiecznych przez pipetowanie, pozostawiając około 50 mikrolitrów. Ponownie zawiesić próbkę w jednym mililitrze roztworu DAPI, delikatnie pipetując w górę i w dół dwa do trzech razy. Ponownie umieść probówkę z komórkami w pudełku pokrytym folią i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 30 minut.Odwirować próbkę i całkowicie usunąć supernatant za pomocą pipetowania. W przypadku próbek, które nie zostaną natychmiast zobrazowane, należy ponownie zawiesić osad w 50 mikrolitrach buforu GLOX bez enzymów. Pipetuj w górę i w dół trzy do czterech razy, aby wymieszać.Przechowywać w pokrytym folią pudełku w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do obrazowania. W przypadku próbek poddawanych natychmiastowemu obrazowaniu należy dodać od 15 do 20 mikrolitrów buforu GLOX z enzymami. Odpipetować pięć mikrolitrów na szkiełko nakrywkowe i umieścić szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym.Umieść chusteczkę laboratoryjną na szkiełku w miejscu, w którym umieszczono szkiełko nakrywkowe. Delikatnie naciśnij chusteczkę, aby ustawić suwak. Umieść szkiełko w pudełku pokrytym folią aluminiową w celu przeniesienia do pomieszczenia mikroskopu.Protokół ten został wykorzystany do zbadania ekspresji genu NDC80, który ulega ekspresji dwóch izoform mRNA. Długa, niezdekodowana izoforma transkryptu ma 400 par zasad, pięć pierwszych rozszerzeń w porównaniu z krótką izoformą. Zaprojektowano dwa zestawy sond.Zestaw CF 590 wiąże się z unikalnym regionem pięciu pierwszych długiej izoformy, a zestaw Q 670 wiąże się ze wspólnym regionem obu izoform. W zoptymalizowanych warunkach wyraźnie zidentyfikowano wyraźne plamki smFISH dla obu zestawów sond. Dwa zestawy sond wykorzystano do badania ekspresji NDC80 podczas wzrostu wegetatywnego i mejozy.W komórkach wegetatywnych wykryto silny sygnał z zestawu sond Q 670, ale nie z zestawu sond CF 590. W przeciwieństwie do tego, silny sygnał z obu zestawów sond został wykryty w mejotycznej profazie, a większość plamek miała sygnał kolokalizowany. Analiza Northern blot potwierdziła, że długa izoforma była wyrażana specyficznie w mejozie.Stwierdzono, że komórki wegetatywne mają medianę pięciu krótkich transkryptów izoform na komórkę, podczas gdy w mejotycznych komórkach profazowych mediana znacznie spadła do czterech transkryptów na komórkę. W profazie mejotycznej mediana liczby długich transkryptów izoformy na komórkę wynosiła 21, a 100% komórek wyrażało transkrypt. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 72 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby najpierw zoptymalizować czas trawienia i stężenie sond smFISH wymagane do osiągnięcia optymalnego stosunku sygnału do szumu. Ponadto należy pamiętać o dodawaniu VRC podczas trawienia i hybrydyzacji przez noc, aby zapobiec aktywności nukleazy. Dzięki temu odkryciu technika ta utorowała naukowcom drogę do zbadania dynamicznej regulacji genów i lokalizacji subkomórkowego RNA.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać jednocząsteczkową RNA FISH w pączkującej mejozie drożdży.

single-molecule-fluorescence-situ-hybridization-smfish-analysis

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Szybkie techniki wizualizacji coraz unieruchomionych komórek drożdży, tutaj stosowane do świetlówek dziennikarzom w cichej krycia loci HML i...

Szybkie Technika Wizualizacja żywo unieruchomionych komórek drożdży

Drożdże szczapowe, Schizosaccharomyces pombe, stanowią dobry system modelowy do badania podstawowych procesów komórkowych. W niniejszej pracy opisujemy metodę ilościowej analizy żywych komórek drożdży szczapowych. W tym konkretnym doświadczeniu skupiamy się na organizacji genomu w obrębie jądra komórkowego, jednak metoda ta może być również wykorzystana do badania czynników cytozolowych.

Ilościowa analiza fluorescencyjna żywych komórek drożdży szczepowych przy użyciu mikroskopii

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do liczenia mRNA w pojedynczych komórkach w rozdzielczości pojedynczej cząsteczki.

Wizualizacja i analiza cząsteczek mRNA z wykorzystaniem fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ u Saccharomyces cerevisiae

Zapewniamy powtarzalną podstawową metodę długoterminowej mikroskopii cyklu życia płciowego drożdży rozszczepialnych. Z niewielkimi korektami, przedstawiony protokół pozwala na skupienie badań na różnych etapach procesu rozrodczego.

Mikroskopia płciowego cyklu życiowego drożdży rozszczepialnych

Ten manuskrypt opisuje metodę znakowania pojedynczych transkryptów informacyjnego RNA (mRNA) za pomocą fluorescencyjnie znakowanych sond DNA, do wykorzystania w eksperymentach z hybrydyzacją fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ (smFISH) u E. coli. smFISH to metoda wizualizacji, która pozwala na jednoczesne wykrywanie, lokalizację i kwantyfikację pojedynczych cząsteczek mRNA w utrwalonych pojedynczych komórkach.

Metoda znakowania transkryptów w poszczególnych komórkach Escherichia coli do eksperymentów hybrydyzacji fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ

Ten manuskrypt przedstawia szczegółową metodę generowania sond ramienia chromosomu X i przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu zbadania stanu kohezji chromatydy siostrzanej w oocytach Drosophila zatrzymanych w prometafazie i metafazie I. Protokół ten jest odpowiedni do określenia, czy spójność ramienia mejotycznego jest nienaruszona, czy zakłócona w różnych genotypach.

Wykorzystanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do monitorowania stanu kohezji ramienia w oocytach prometafazy i metafazy I drosophila

Tutaj prezentujemy obrazowanie żywych komórek, które jest nietoksyczną metodą mikroskopii, która pozwala badaczom badać zachowanie białek i dynamikę jądrową w żywych komórkach drożdży rozszczepialnych podczas mitozy i mejozy.

Badanie dynamiki jądrowej drożdży rozszczepienia mitotycznego i mejotycznego za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek

Ten protokół opisuje zastosowanie hybrydyzacji in situ fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFISH) do pomiaru kinetyki in vivo syntezy i degradacji mRNA.

Sondowanie kinetyki mRNA w czasie i przestrzeni u Escherichia coli przy użyciu dwukolorowej hybrydyzacji fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (smFISH) to metoda dokładnego ilościowego określania poziomów i lokalizacji określonych RNA na poziomie pojedynczej komórki. W tym miejscu przedstawiamy nasze zatwierdzone protokoły laboratoryjne dotyczące przetwarzania na mokrym stole, obrazowania i analizy obrazu w celu ilościowego oznaczania pojedynczych komórek określonych RNA.

Analiza pojedynczych komórek alleli aktywnych transkrypcyjnie za pomocą pojedynczej cząsteczki FISH

Mikroskopia poklatkowa jest cennym narzędziem do badania mejozy u pączkujących drożdży. Protokół ten opisuje metodę, która łączy synchronizację cyklu komórkowego, mikroskopię poklatkową i warunkowe wyczerpanie białka docelowego, aby zademonstrować, jak badać funkcję określonego białka podczas segregacji chromosomów mejotycznych.

Zastosowanie mikroskopii poklatkowej i specyficznego dla etapu zubożenia komórek białek do badania mejozy u S. cerevisiae

Protokół ten opisuje dwie metody zatrzymania cyklu komórkowego drożdży oraz opcjonalnego uwalniania oraz rozwija zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej do badania procesów zależnych od cyklu komórkowego u S. cerevisiae.

Manipulacja i analiza procesów zależnych od cyklu komórkowego u drożdży pączkujących

Poznaj metodę smFISH do ilościowej analizy RNA w drożdżach pączkujących podczas wzrostu wegetatywnego i mejozy. Technika ta pozwala badać zmienność ekspresji genów i lokalizację subkomórkową RNA.

Analiza fluorescencji pojedynczej cząsteczki hybrydyzacji in situ (smFISH) w pączkującym wzroście wegetatywnym drożdży i mejozie (Wideo) | JoVE Journal

Analiza fluorescencji pojedynczej cząsteczki hybrydyzacji in situ (smFISH) w pączkującym wzroście wegetatywnym drożdży i mejozie

Przeglądaj więcej filmów