Analiza fluorescencji pojedynczej cząsteczki hybrydyzacji in situ (smFISH) w pączkującym wzroście wegetatywnym drożdży i mejozie
25 maja 2018
Ten protokół hybrydyzacji fluorescencji in situ jest zoptymalizowany do ilościowego określenia liczby cząsteczek RNA w pączkujących drożdżach podczas wzrostu wegetatywnego i mejozy.
Ogólnym celem tej zoptymalizowanej hybrydyzacji in situ pojedynczej cząsteczki RNA (smFISH) jest wykrycie i ilościowe określenie pojedynczych cząsteczek RNA na komórkę podczas wzrostu wegetatywnego i mejozy pączkujących drożdży. Metoda ta ujawnia zmienność między komórkami w ekspresji genów w lokalizacji subkomórkowego RNA i dlatego jest potężną techniką badania regulacji genów. Oprócz unikalnych informacji, które mogą zostać ujawnione przez smFISH, główną zaletą tej techniki jest to, że po optymalizacji jest ona solidna i wysoce powtarzalna.
Do zademonstrowania tego protokołu zostanie użyta kultura mejotyczna. Aby utrwalić kulturę w 3% formaldehydzie, dodaj 1840 mikrolitrów kultury do 160 mikrolitrów 37% formaldehydu w dwumililitrowej probówce wirówkowej. Odwróć około pięć razy, aby wymieszać.
Umieść rurkę na bębnie rolkowym w temperaturze pokojowej na 20 minut. Po 20 minutach kontynuuj utrwalanie w temperaturze czterech stopni Celsjusza z rotacją przez noc. Następnego dnia przygotuj się do trawienia, najpierw rozmrażając 200-milimolowe kompleksy rybonukleozydowe wanadylu (VRC) w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez co najmniej 10 minut.
Aby przygotować główną mieszankę mineralizacji, najpierw odpipetuj 2125 mikrolitrów buforu B do 15-mililitrowej probówki. Następnie wiruj ciepły VRC przez pięć sekund, aby całkowicie go zawiesić i dodaj 200 mikrolitrów VRC do 15-mililitrowej probówki. Mieszanka powinna mieć jasnobrązowo-zielony kolor.
Odwirować próbkę mejotyczną o masie 21 000 x g przez półtorej minuty w temperaturze pokojowej. Ostrożnie zassać supernatant, umieszczając końcówkę próżniową po przeciwnej stronie osadu, aby uniknąć zakłócenia osadu. Ponownie zawiesić komórki w półtora mililitra zimnego buforu B, pipetując w górę iw dół w celu wymieszania.
Wirować przy 21 000 x g przez półtorej minuty. Usuń większość płynu przez aspirację próżniową, pozostawiając około 100 mikrolitrów. Ponownie zawiesić komórki w półtora mililitra zimnego buforu B. Odwirować próbki, usunąć płyn i ponownie zawiesić komórki w półtora mililitra zimnego buforu B.
Wirować przy 21 000 x g przez półtorej minuty. Całkowicie odessać ciecz przez pipetowanie. Ponownie zawiesić komórki w 425 mikrolitrach głównej mieszanki mineralizacyjnej i krótko wirować.
Dodaj pięć mikrolitrów zymoliazy do probówki i wiruj przez dwie do trzech sekund, aby wymieszać. Umieść probówkę na bębnie rolkowym i traw w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 15 do 30 minut. Po 15 minutach sprawdzaj komórki pod mikroskopem co pięć minut i przerwij trawienie, gdy około 80% komórek wydaje się nieprzezroczystych i niezałamujących.
Odwirować probówkę o stężeniu 376 x g przez trzy minuty. Całkowicie usunąć supernatant. Delikatnie zawiesić komórki jednym mililitrem buforu B, pipetując w górę i w dół jeden do dwóch razy w celu wymieszania.
Odwirować probówkę i usunąć bufor. Delikatnie zawieś ponownie komórki w jednym mililitrze 70% etanolu i inkubuj w temperaturze pokojowej przez trzy i pół do czterech godzin. Aby rozpocząć procedurę hybrydyzacji, odwiruj probówkę z komórkami o sile 376 x g przez trzy minuty.
Usuń 500 mikrolitrów 70% etanolu z probówki. Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby ponownie zawiesić pozostałe komórki i przenieść je do probówki o niskiej przyczepności. Przeniesienie próbki do probówki o niskiej przyczepności ma kluczowe znaczenie dla zapobiegania nadmiernej utracie komórek podczas kolejnych płukań formamidem.
Odwirować rurkę o niskiej przyczepności i usunąć cały etanol. Dodaj jeden mililitr 10% buforu do płukania formamidu do probówki i delikatnie pipetuj w górę iw dół dwa do trzech razy, aby ponownie zawiesić komórki. Pozwól komórkom zastygnąć w temperaturze pokojowej przez około 20 minut, przygotowując roztwory hybrydyzacyjne, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Odwirować próbkę i usunąć supernatant do odpadów niebezpiecznych. Dodaj co najmniej 50 mikrolitrów każdego roztworu hybrydyzacyjnego do probówki i przesuń probówkę, aby wymieszać. Inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza na bębnie rolkowym przez co najmniej 16 godzin w ciemności.
Po zakończeniu hybrydyzacji umieść probówkę z komórkami w pudełku pokrytym folią, aby chronić przed światłem. Odwirować próbkę o masie 376 x g przez trzy minuty. Usunąć sklarowany osad do odpadów niebezpiecznych za pomocą pipetowania.
Zawiesić próbkę w jednym mililitrze 10% buforu do płukania formamidu, delikatnie pipetując w górę i w dół dwa do trzech razy. Umieść probówkę z komórkami z powrotem w pudełku pokrytym folią, aby chronić przed światłem i inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po 30 minutach odwirować próbkę.
Usunąć supernatant do odpadów niebezpiecznych przez pipetowanie, pozostawiając około 50 mikrolitrów. Ponownie zawiesić próbkę w jednym mililitrze roztworu DAPI, delikatnie pipetując w górę i w dół dwa do trzech razy. Ponownie umieść probówkę z komórkami w pudełku pokrytym folią i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 30 minut.
Odwirować próbkę i całkowicie usunąć supernatant za pomocą pipetowania. W przypadku próbek, które nie zostaną natychmiast zobrazowane, należy ponownie zawiesić osad w 50 mikrolitrach buforu GLOX bez enzymów. Pipetuj w górę i w dół trzy do czterech razy, aby wymieszać.
Przechowywać w pokrytym folią pudełku w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do obrazowania. W przypadku próbek poddawanych natychmiastowemu obrazowaniu należy dodać od 15 do 20 mikrolitrów buforu GLOX z enzymami. Odpipetować pięć mikrolitrów na szkiełko nakrywkowe i umieścić szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym.
Umieść chusteczkę laboratoryjną na szkiełku w miejscu, w którym umieszczono szkiełko nakrywkowe. Delikatnie naciśnij chusteczkę, aby ustawić suwak. Umieść szkiełko w pudełku pokrytym folią aluminiową w celu przeniesienia do pomieszczenia mikroskopu.
Protokół ten został wykorzystany do zbadania ekspresji genu NDC80, który ulega ekspresji dwóch izoform mRNA. Długa, niezdekodowana izoforma transkryptu ma 400 par zasad, pięć pierwszych rozszerzeń w porównaniu z krótką izoformą. Zaprojektowano dwa zestawy sond.
Zestaw CF 590 wiąże się z unikalnym regionem pięciu pierwszych długiej izoformy, a zestaw Q 670 wiąże się ze wspólnym regionem obu izoform. W zoptymalizowanych warunkach wyraźnie zidentyfikowano wyraźne plamki smFISH dla obu zestawów sond. Dwa zestawy sond wykorzystano do badania ekspresji NDC80 podczas wzrostu wegetatywnego i mejozy.
W komórkach wegetatywnych wykryto silny sygnał z zestawu sond Q 670, ale nie z zestawu sond CF 590. W przeciwieństwie do tego, silny sygnał z obu zestawów sond został wykryty w mejotycznej profazie, a większość plamek miała sygnał kolokalizowany. Analiza Northern blot potwierdziła, że długa izoforma była wyrażana specyficznie w mejozie.
Stwierdzono, że komórki wegetatywne mają medianę pięciu krótkich transkryptów izoform na komórkę, podczas gdy w mejotycznych komórkach profazowych mediana znacznie spadła do czterech transkryptów na komórkę. W profazie mejotycznej mediana liczby długich transkryptów izoformy na komórkę wynosiła 21, a 100% komórek wyrażało transkrypt. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 72 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby najpierw zoptymalizować czas trawienia i stężenie sond smFISH wymagane do osiągnięcia optymalnego stosunku sygnału do szumu. Ponadto należy pamiętać o dodawaniu VRC podczas trawienia i hybrydyzacji przez noc, aby zapobiec aktywności nukleazy. Dzięki temu odkryciu technika ta utorowała naukowcom drogę do zbadania dynamicznej regulacji genów i lokalizacji subkomórkowego RNA.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać jednocząsteczkową RNA FISH w pączkującej mejozie drożdży.
Przegląd
Ten zoptymalizowany protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ pojedynczych cząsteczek (smFISH) służy do ilościowego oznaczania cząsteczek RNA w drożdżach pączkujących podczas wzrostu wegetatywnego i mejozy. Metoda ta pozwala uwidocznić zmienność ekspresji genów między poszczególnymi komórkami oraz subkomórkową lokalizację RNA.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Regulacja genów
Wstęp
- Hybrydyzacja in situ pojedynczych cząsteczek RNA umożliwia detekcję poszczególnych cząsteczek RNA.
- Technika ta pozwala na poznanie zmienności ekspresji genów.
- Jest ona szczególnie użyteczna w badaniach nad drożdżami pączkującymi.
- Protokół jest stabilny i powtarzalny po przeprowadzeniu optymalizacji.
Cel badania
- Wykrycie i ilościowe określenie cząsteczek RNA w komórkach drożdży.
- Zbadanie ekspresji genów podczas różnych faz wzrostu.
- Analiza ekspresji specyficznych genów, takich jak NDC80.
Zastosowane metody
- Fiksacja kultur drożdży formaldehydem.
- Przygotowanie głównej mieszaniny trawiennej do permeabilizacji komórek.
- Hybrydyzacja sond RNA z docelowymi izoformami mRNA.
- Mikroskopia w celu wizualizacji cząsteczek RNA.
Główne wyniki
- Zidentyfikowano wyraźne sygnały smFISH dla różnych izoform RNA.
- Zaobserwowano zmienność w ekspresji NDC80 między poszczególnymi komórkami.
- Metoda ta pozwoliła na skuteczną kwantyfikację RNA podczas wzrostu wegetatywnego oraz mejozy.
- Zoptymalizowane warunki umożliwiły wyraźną wizualizację lokalizacji RNA.
Wnioski
- smFISH jest potężnym narzędziem do badania regulacji genów u drożdży.
- Protokół ten można zastosować do różnych genów i warunków.
- Uzyskane wyniki przyczyniają się do zrozumienia dynamiki RNA w procesach komórkowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Hybrydyzacja in situ pojedynczych cząsteczek fluorescencyjnych (smFISH) umożliwia bezpośrednią kwantyfikację cząsteczek RNA z rozdzielczością pojedynczej komórki, dostarczając kluczowych informacji na temat heterogeniczności ekspresji genów oraz subkomórkowej lokalizacji transkryptów. Możliwość ta jest niezbędna do ograniczania ryzyka w przypadku wczesnych hipotez odkrywczych i doprecyzowania walidacji celów w modelach drożdżowych istotnych dla regulacji genów eukariotycznych. Solidne i powtarzalne protokoły smFISH wspierają pewność predykcyjną oraz ciągłość translacyjną w ramach portfeli badawczo-rozwojowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę zmienności ekspresji genów na poziomie pojedynczych komórek.
- Wspiera funkcjonalną walidację izoform transkryptycznych i mechanizmów regulacyjnych.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez rozstrzyganie lokalizacji RNA wewnątrzkomórkowej.
- Dostarcza danych ilościowych, które pomagają w wyborze celu i podejmowaniu decyzji o selekcji.
Przesiewy i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane systemy drożdżowe do dalszego przesiewania modulatorów regulacji genów.
- Zapewnia standaryzowane, powtarzalne ilościowe pomiary RNA do opracowywania testów.
- Umożliwia niezawodną detekcję izoform transkrypcyjnych w procesach oceny związków.
- Wspiera skalowalność i ponowne wykorzystanie platformy w badaniach nad ekspresją genów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Uzgadnia wyniki uzyskane w modelu drożdżowym z szerszymi paradygmatami regulacji genów u eukariontów.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po przedkliniczną walidację biomarkerów ekspresji genów.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne poprzez wyjaśnienie dynamiki transkrypcji w systemach istotnych dla przebiegu choroby.
- Umożliwia dostosowany do ryzyka postęp w pracach nad celami regulacji genów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analiza smFISH wpisuje się w proces badawczy – od wstępnej weryfikacji hipotez, poprzez identyfikację kluczowych celów, aż po walidację przedkliniczną, szczególnie w badaniach nad regulacją genów i izoformami transkrypcyjnymi w modelach drożdżowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez ilościowe określanie obfitości i lokalizacji transkryptów.
- Screening: Zapewnia gotowe do analizy, powtarzalne ilościowe oznaczanie RNA w pojedynczych komórkach dla platform screeningowych.
- Analityka: Dostarcza ilościowe, statystycznie wiarygodne pomiary do porównywania ekspresji genów w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Przenosi wnioski z modeli drożdżowych do przedklinicznych strategii biomarkerowych w przypadkach zachowanej dynamiki transkrypcji.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalny, zestandaryzowany przepływ pracy dla analizy ekspresji genów w pojedynczych komórkach w ramach programów badawczo-rozwojowych (R&D).
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad regulacją genów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowaną, powtarzalną i skalowalną kwantyfikację RNA w pojedynczych komórkach.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez wczesne wyjaśnienie biologii na poziomie transkryptów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój celów regulacji genów.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w dziedzinie genetyki drożdży, biologii RNA oraz mikroskopii fluorescencyjnej.
- Wymaga dostępu do wysokiej jakości aparatury obrazowej i oprogramowania analitycznego.
- Konieczna jest standaryzacja projektu sond oraz warunków hybrydyzacji pomiędzy zespołami.
- Można potrzebować adaptacji dla różnych szczepów drożdży lub warunków wzrostu.
- Kluczowe dla stosunku sygnału do szumu oraz jakości danych jest zoptymalizowanie trawienia i stężenia sond.
