Name: Optogenetyka Identyfikacja typu neuronalnego za pomocą szklanej optrody u obudzonych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Poznaj metodę optogenetycznego rejestrowania jednostkowego aktywności neuronów u przebudzonych myszy za pomocą szklanej optrody. Technika umożliwia niezawodną identyfikację typów neuronów in vivo w badaniach neurobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy byli wspierani przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki KAKENHI Grant JP16K11200 i 17H02223 oraz Grant na Badania z Uniwersytetu Medycznego Kanazawa S2016-8 i C2017-3. Dziękujemy Yuhichi Kudzie za wsparcie w wykonaniu zdjęć.

Wszystkie procedury są wykonywane zgodnie z wytycznymi Japońskiego Towarzystwa Fizjologicznego i za zgodą Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Medycznego Kanazawa.
1. Budowa uchwytu szklanego optrode
UWAGA: Do budowy szklanego uchwytu na optrodę używany jest komercyjny uchwyt elektrody (Rysunek 1A).
<ol>
	<li>Delikatnie wyciągnij stalową rurkę do kontroli ciśnienia z lufy uchwytu.</li>
	<li>Wiercąc, poszerz otwór po stronie gniazda sworznia w lufie uchwytu. Wykonaj otwór o średnicy 3 mm i głębokości 12 mm.</li>
	<li>Umieść rurę ze stali nierdzewnej (3 mm średnicy, 0,5 mm grubości i 8 mm długości; <silna klasa="xfig">Rysunek 1A2) w otworze.</li>
	<li>Włóż ceramiczną dzieloną tuleję współpracującą do tulejek ⌀2,5 mm (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1A1) do otworu.</li>
	<li>Przymocuj lufę uchwytu elektrody do wręgu w kształcie litery L za pomocą kleju epoksydowego.</li>
	<li>Wykonaj otwory (o średnicy 3 mm) w wrębie i przymocuj go do manipulatora za pomocą.</li>
</ol>
2. Instalacja słupka czołowego
<ol>
	<li>Przygotuj specjalnie zbudowaną sztycę głowicy wykonaną z przekładki na płytce drukowanej. Za pomocą frezu uformuj kolumnową przekładkę płytki drukowanej w kształt prostopadłościanu i pokrój ją na 2 słupki głowicy za pomocą piły (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). Spłaszcz dolną część słupka głowicy za pomocą frezu.</li>
	<li>Do badania należy przygotować transgeniczne zwierzę, u którego światłoczuła opsyna ulega ekspresji w określonym typie neuronu. W tej pracy wykorzystano transgeniczną mysz (myszy VGAT-ChR2), u której neurony hamujące wyrażają rodopsynę kanałową-2 (ChR2)11.</li>
	<li>Znieczulić zwierzę mieszaniną 0,3 mg/kg medetomidyny, 4,0 mg/kg midazolamu i 5,0 mg/kg butorfanolu po podaniu dootrzewnowym. Aby potwierdzić, że zwierzę jest w pełni znieczulone, przetestuj jego reakcje na szczypanie ogona.</li>
	<li>Umieść mysz w stereotaktycznej ramce na poduszce grzewczej. Wcześniej wyczyść ramkę stereotaktyczną i poduszkę grzewczą 70% alkoholem. Umieść zęby w otworze pręta zgryzowego i lekko dokręć zacisk nosowy. Zamocuj obie strony głowy za pomocą nauszników. Gdy głowa jest prawidłowo zamocowana przez nauszniki, dokręć nos clamp. Nałóż maść okulistyczną na oczy.</li>
	<li>Ogol skórę głowy małymi nożyczkami i oczyść skórę głowy bawełnianym wacikiem z glukonianu chlorheksydyny. Przed zabiegiem należy wysterylizować wszystkie narzędzia chirurgiczne oraz słupek głowy za pomocą autoklawu (121 °C, 15 min).</li>
	<li>Przetnij skórę głowy wzdłuż linii środkowej nożyczkami i odsuń ją na bok. Wykonaj nacięcie od tyłu głowy do oczu (około 20 mm). Usuń okostną bawełnianym wacikiem zamoczonym w 70% alkoholu i osusz czaszkę.</li>
	<li>Przymocuj słupek głowicy do manipulatora. Umieść słupek głowy płasko na czaszce wokół bregmy za pomocą manipulatora.</li>
	<li>Wymieszaj monomer (4 krople), katalizator (1 kropla) i polimer (1 mała łyżka) cementu dentystycznego na małym naczyniu, które jest wcześniej schłodzone w lodówce. Umieść cement dentystyczny (poniżej 1 g) na kości czołowej i ciemieniowej czaszki, aby przymocować słupek głowy do czaszki.</li>
	<li>Gdy cement dentystyczny stanie się twardy, wyjmij mysz z ramki stereotaktycznej. Nałóż maść z antybiotykiem na odsłoniętą skórę. Wstrzyknąć antagonistę medetomidyny (0,3 mg/kg) i antybiotyki (oksytetracyklinę; 20 mg/kg). Umieść i monitoruj mysz na poduszce grzewczej w klatce, aż się obudzi, a następnie umieść ją z powrotem w klatce w obudowie.</li>
	<li>Zwierzę należy umieścić w indywidualnej klatce z urządzeniem urozmaicającym warunki bytu. Codziennie zmieniaj papierową ściółkę dla zwierząt, aby utrzymać klatkę w czystości i zapobiec infekcji. Uważnie monitoruj, czy zwierzę nie wykazuje żadnych oznak dyskomfortu. Nałóż lidokainę na ranę, jeśli podejrzewasz ból. Podawaj meloksykam lub karprofen raz na 24 godziny przez 48 godzin zarówno po założeniu głowy, jak i operacji kraniotomii. Miejscowa lidokaina może być podawana dodatkowo, jeśli NLPZ nie jest odpowiednia.</li>
</ol>
3. Aklimatyzacja
<ol>
	<li>Dwa dni (minimum) po wyzdrowieniu ze znieczulenia należy zaaklimatyzować zwierzęta do stanu unieruchomienia głowy w komorze rejestracyjnej. Wykonuj sesje aklimatyzacyjne przez co najmniej 5 dni.</li>
	<li>Podczas sesji aklimatyzacyjnych umieść zwierzę w komorze rejestracyjnej z głowicą przymocowaną do specjalnie skonstruowanego zacisku. Podczas sesji, w celu ograniczenia ruchów, przykryj ciało wykonaną na zamówienie połówką rurką z żywicy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C), wykonaną przy użyciu drukarki 3D. 
	UWAGA: W dniu 1 sesja aklimatyzacyjna powinna trwać 5 minut. Następnie zwiększa się go codziennie do 10, 20, 40 i 60 minut odpowiednio przez dni 2, 3, 4 i 5.</li>
	<li>Na koniec każdej sesji daj zwierzęciu nagrodę w postaci jedzenia. Jeśli zwierzę ma ciągłe problemy podczas aklimatyzacji, przerwij sesję.</li>
</ol>
4. Kraniotomia
UWAGA: Po aklimatyzacji, kraniotomia jest wykonywana nad obszarem mózgu w celu nagrania. Kraniotomia wykonywana jest w ramie stereotaktycznej w znieczuleniu, podobnie jak w przypadku montażu słupka głowy. Procedura pooperacyjna jest taka sama, jak w przypadku montażu słupka głównego. 
<ol>
	<li>Przed kraniotomią należy oczyścić czaszkę bawełnianym wacikiem z glukonianem chlorheksydyny i 70% alkoholem.</li>
	<li>Ostrożnie zeskrob czaszkę nad miejscem nagrania wiertłem dentystycznym. Gdy kość stanie się wystarczająco cienka, przetnij ją czubkiem skalpela i usuń.</li>
	<li>Umieść cement dentystyczny wokół odsłoniętego obszaru, aby wzmocnić czaszkę.</li>
	<li>Przykryj odsłonięty obszar mózgu klejem silikonowym po tym, jak cement dentystyczny stanie się twardy. Postępowanie pooperacyjne jest zgodne z opisem w kroku 2.8.</li>
</ol>
5. Zapis elektrofizjologiczny
<ol>
	<li>Pozwól zwierzęciu dojść do siebie przez co najmniej 1 dzień po kraniotomii przed wykonaniem zapisu elektrofizjologicznego. Umieść zwierzę w komorze rejestracyjnej w taki sam sposób, w jaki robiono to podczas sesji aklimatyzacyjnych, gdy rozpoczyna się nagrywanie.</li>
	<li>Wykonać szklane pipety z kapilar ze szkła borokrzemianowego (OD = 1,5 mm, ID = 0,9 mm, 90,0 mm długości) ciągniętych na ściągaczu elektrod. Ich średnica końcówki wynosi 2–3 μm, a rezystancja 4–6 MΩ przy napełnieniu 10 mM PBS. Długość elektrody wynosi 40–50 mm. W niektórych nagraniach do 10 mM PBS dodaje się 2% neurobiotyny.</li>
	<li>Przymocuj napełnioną szklaną pipetę do specjalnie wykonanego uchwytu optrode.</li>
	<li>Włóż srebrny drut z powłoką Ag-Cl (o średnicy 0,2 mm) do szklanej pipety. Podłącz srebrny drut do szpilki za pomocą cienkiego powlekanego przewodu elektrycznego. Podłącz pin do headstage wzmacniacza nagrywającego.</li>
	<li>Podłącz patchcord światłowodowy (rdzeń = 960 μm, okładzina = 1 000 μm, NA = 0,63) za pomocą tulejki z tlenku cyrkonu (OD = 2,5 mm) do dzielonej tulei współpracującej na uchwycie optrody. Wsuń krosowy do tulei, aż końcówka tulejki zetknie się z tylną częścią szklanej pipety. krosowy dostarcza światło (długość fali = 465 nm) z diody LED. Światło LED jest sterowane przez jednokanałowy sterownik LED.</li>
	<li>Usuń klej silikonowy z kraniotomii. Od czasu do czasu umieszczaj podgrzaną sól fizjologiczną (38 °C) na powierzchni mózgu, aby zapobiec wysuszeniu powierzchni mózgu podczas sesji nagraniowej. W razie potrzeby usuń oponę twardą za pomocą ostrej pęsety.</li>
	<li>Włóż szklaną elektrodę do tkanki mózgowej za pomocą manipulatora. Monitoruj rezystancję elektrody po jej włożeniu. Wymień elektrodę, gdy rezystancja jest niższa niż oczekiwano, ponieważ końcówka elektrody może być uszkodzona. Na interesującej nas głębokości przeszukaj i wyizoluj pojedyncze kolce, dostosowując głębokość w krokach co 2 do 5 μm.</li>
	<li>Po odizolowaniu pojedynczej jednostki dostarcz światło LED i obserwuj reakcję na bodźce świetlne.</li>
	<li>Rejestruj aktywność neuronalną po identyfikacji typów komórek. Wykonuj nagrania przez 2–3 godziny. Jeśli zapis jest wykonywany w kolejnych dniach (maksymalnie 2 dni), kraniotomię należy pokryć klejem silikonowym. Po zakończeniu nagrywania i złożeniu zwierzęcia w ofierze wyjmij sztyft głowy i umieść go w acetonie, aby go umyć i ponownie wykorzystać.</li>
</ol>

<ol><li>Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting neural circuits.</a> Cell. 165 (3), 524-534 (2016).</li>
<li>Gore, F., Schwartz, E. C., Salzman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+neural+activity+in+physiologically+classified+neurons%3A+triumphs+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Manipulating neural activity in physiologically classified neurons: triumphs and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370 (1677), 20140216(2015).</li>
<li>Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identified+GABAergic+and+glutamatergic+neurons+in+the+mouse+inferior+colliculus+share+similar+response+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identified GABAergic and glutamatergic neurons in the mouse inferior colliculus share similar response properties.</a> Journal of Neuroscience. 37 (37), 8952-8964 (2017).</li>
<li>Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+sound-evoked+afterdischarge+in+the+auditory+midbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-lasting sound-evoked afterdischarge in the auditory midbrain.</a> Scientific Reports. 6, 20757(2016).</li>
<li>Munoz, W., Tremblay, R., Rudy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-assisted+patching%3A+in+vivo+recording+of+genetically+and+morphologically+identified+neurons+throughout+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-assisted patching: in vivo recording of genetically and morphologically identified neurons throughout the brain.</a> Cell Reports. 9 (6), 2304-2316 (2014).</li>
<li>Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINP%3A+a+new+method+of+tagging+neuronal+populations+for+identification+during+in+vivo+electrophysiological+recording%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording.</a> PLoS One. 4 (7), e6099(2009).</li>
<li>Kuwada, S., Batra, R., Stanford, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monaural+and+binaural+response+properties+of+neurons+in+the+inferior+colliculus+of+the+rabbit%3A+effects+of+sodium+pentobarbital%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Monaural and binaural response properties of neurons in the inferior colliculus of the rabbit: effects of sodium pentobarbital.</a> Journal of Neurophysiology. 61 (2), 269-282 (1989).</li>
<li>Populin, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthetics+change+the+excitation%2Finhibition+balance+that+governs+sensory+processing+in+the+cat+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 25 (25), 5903-5914 (2005).</li>
<li>Duque, D., Malmierca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-specific+adaptation+in+the+inferior+colliculus+of+the+mouse%3A+anesthesia+and+spontaneous+activity+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects.</a> Brain Structure and Function. 220 (6), 3385-3398 (2015).</li>
<li>Cai, R., Richardson, B. D., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+to+predictable+versus+random+temporally+complex+stimuli+from+single+units+in+auditory+thalamus%3A+impact+of+aging+and+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Responses to predictable versus random temporally complex stimuli from single units in auditory thalamus: impact of aging and anesthesia.</a> Journal of Neuroscience. 36 (41), 10696-10706 (2016).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).</li>
<li>Ito, T., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+classes+of+GABAergic+neurons+in+the+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two classes of GABAergic neurons in the inferior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 29 (44), 13860-13869 (2009).</li>
<li>Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+in+inferior+colliculus+of+the+GAD67-GFP+knock-in+mouse%3A+electrophysiological+and+morphological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties.</a> Neuroscience Research. 51 (4), 475-492 (2005).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+using+Thy1-GCaMP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice.</a> Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).</li>
<li>Hirai, Y., Nishino, E., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+recording+of+fluorescence+and+electrical+signals+by+photometric+patch+electrode+in+deep+brain+regions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous recording of fluorescence and electrical signals by photometric patch electrode in deep brain regions in vivo.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (10), 3930-3942 (2015).</li>
<li>LeChasseur, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microprobe+for+parallel+optical+and+electrical+recordings+from+single+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microprobe for parallel optical and electrical recordings from single neurons in vivo.</a> Nature Methods. 8 (4), 319-325 (2011).</li>
<li>Abaya, T. V., Blair, S., Tathireddy, P., Rieth, L., Solzbacher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+glass+optrode+array+for+optical+neural+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">A 3D glass optrode array for optical neural stimulation.</a> Biomedical Optics Express. 3 (12), 3087-3104 (2012).</li>
<li>Bittner, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjunctive+input+processing+drives+feature+selectivity+in+hippocampal+CA1+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Conjunctive input processing drives feature selectivity in hippocampal CA1 neurons.</a> Nature Neuroscience. 18 (8), 1133-1142 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Optogenetyka stała się potężnym narzędziem w neurobiologii. Jest on wykorzystywany do identyfikacji określonych typów neuronów in vivo , a także do manipulowania aktywnością określonych ścieżek neuronalnych. Wyjaśnienie aktywności neuronalnej różnych typów neuronów sprzyja zrozumieniu mechanizmu obwodów neuronalnych. Tutaj zademonstrowaliśmy metodę dostarczania światła do miejsca rejestracji przez szklaną elektrodę w układzie scalonym obudzonych myszy VGAT-ChR2.
Opisana metoda składa ...

Ośrodkowy układ nerwowy składa się z różnych typów neuronów, które pełnią różne funkcje. To, jak te różne typy neuronów działają w obwodzie neuronalnym, jest jednym z głównych problemów neurobiologii. Jednak w wielu obszarach mózgu niemożliwe było rozróżnienie typów neuronów w nagraniach aktywności elektrycznej in vivo, ponieważ nie ma wyraźnej różnicy w samym sygnale impulsu elektrycznego, z pewnymi wyjątkami. Ostatnie postępy w optogenetyce dokonały przełomu1,2. Wykorzystując transgeniczne zwierzęta, u których światłoczuła opsyna (np. rodopsyna kanałowa-2) ulega ekspresji w określonych typach neuronów, możliwe stało się skuteczne rozróżnienie typów neuronów w nagraniach in vivo3,4,5,6. U tych zwierząt neurony z światłoczułą opsyną są pobudzane przez dostarczanie bodźców świetlnych podczas nagrań elektrycznych, ale inne neurony nie. Neurony opsynowo-dodatnie można zatem łatwo odróżnić od innych typów neuronów na podstawie ich reakcji na światło.
W eksperymentach optogenetycznych kluczowe jest dostarczenie światła do miejsca rejestracji. Jako metoda nieinwazyjna, światło jest często kierowane z powierzchni mózgu. Ponieważ jednak siła światła zmniejsza się, gdy przechodzi przez tkankę mózgową, trudno jest stymulować głębokie obszary mózgu z powierzchni mózgu. Szczególnie trudno jest światłu stymulującemu dotrzeć do głębokich obszarów mózgu, gdy przezroczystość optyczna powierzchni mózgu jest niska, jak to często ma miejsce w przypadku nagrań z obudzonych zwierząt. Eksperymenty elektrofizjologiczne często przeprowadzano na znieczulonych zwierzętach, ponieważ ruch ciała powoduje hałas w nagraniach. Jednak, jak jest dobrze udokumentowane, znieczulenie jest znane z tego, że zmienia reakcje neuronalne7,8,9,10. Dlatego konieczne jest wykorzystanie obudzonych zwierząt w celu zbadania reakcji neuronalnych bez sztucznych efektów znieczulenia. W przeciwieństwie do eksperymentów na zwierzętach znieczulonych, zapisy elektrofizjologiczne są wykonywane po powrocie do zdrowia po operacji w eksperymentach na przytomnych zwierzętach. W przerwie między operacją a nagraniami wysięk tkankowy często gromadzi się na powierzchni mózgu i sprawia, że przezroczystość optyczna powierzchni mózgu jest niska.
Tutaj opisujemy metodę nagrywania pojedynczych nagrań z przebudzonej myszy za pomocą specjalnie wykonanej szklanej optrody. W tej metodzie światło jest dostarczane przez szklaną elektrodę rejestrującą, dzięki czemu możliwe jest niezawodne stymulowanie zarejestrowanego neuronu światłem w głębokich obszarach mózgu. Ten wykonany na zamówienie system optrodowy składa się z dostępnych i niedrogich materiałów i jest łatwy w montażu.

<table><tbody><tr><td>Uchwyt elektrody</td><td>Urządzenie molekularne</td> Uchwyt na pipetę <td>1-HL-U</td><td>do wzmacniacza mikroelektrod</td></tr><tr><td>Ceramiczna dzielona tuleja współpracująca</td><td>Tuleja Thorlabs</td><td>ADAF1</td><td>f2,5 mm</td></tr><tr><td>Podkładka dystansowa płytki drukowanej</td><td>Teishin Denki</td><td>SPA-320</td><td>f8,0 mm, długość 20,0 mm</td></tr><tr><td>Ramka stereotaktyczna dla myszy</td><td>Narishige</td><td>SR-6M-HT</td><td>Przyrządy stereotaktyczne dla myszy</td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Narishige</td><td>NA</td><td>Manipulator ręczny</td></tr><tr><td>Superbond</td><td>Sun Medical</td><td>M: 204610557</td><td>Cement adhezyjny dentystyczny</td></tr><tr><td>Drukarka 3D</td><td>Form2</td><td>Formlabs</td><td>NA</td></tr><tr><td>Kwik-Sil</td><td>WPI</td><td>KWIK-SIL</td><td>Klej silikonowy o niskiej toksyczności</td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>Narishige</td><td>GD-1,5</td><td>OD 1,5 mm, ID 0,9 mm, długość 90,0 mm</td></tr><tr><td>Patchcord światłowodowy</td><td>Doric Lenses</td><td>MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5</td><td>Patchcord monofiberoptic, OD, 2.5 mm, rdzeń = 960 mm, okładzina = 1000 mm, NA = 0.63</td></tr><tr><td>Połączone</td><td>soczewki LED Doric</td><td>LEDC-1B_FC</td><td>Długość fali centralnej = 465 nm, moc wyjściowa = 45 mW (rdzeń 960 mm 0,63 NA)</td></tr> <tr><td>Sterownik LED</td><td>Soczewki Doric</td><td>LEDRV_1CH_1000</td><td>1-kanałowy sterownik LED, maksymalna moc = 1000 mA</td></tr><tr><td>Ściągacz elektrod</td><td>Narishige</td><td>PB-7</td><td>Dwustopniowy ściągacz do mikropipet szklanych</td></tr><tr><td>Kapilara ze szkła borokrzemianowego</td><td>Narishige</td><td>GD-1.5</td><td>Kapilara ze szkła bolokrzemianowego, OD, 1.5mm, ID, 0.9 mm, 90.0 mm długości</td></tr><tr><td>GENTACIN</td><td>MSD CO., Ltd</td><td>185711173</td><td>Maść antybiotykowa</td></tr><tr><td>Terramycin&reg;-LA</td><td>Zoetis</td><td>G 333</td><td>Oksytetracyklina</td></tr><tr><td>Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J</td><td>Jackson Labs</td><td>#14548</td><td>Myszy VGAT-ChR2</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>2500-0157</td><td>Wzmacniacz mikroelektrod</td></tr></tbody></table>

optogenetyka identyfikacja typu neuronalnego za pomocą szklanej optrody u obudzonych myszy

Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

To jest główny problem w neurobiologii, jak różne typy neuronów działają w obwodach neuronowych. Ostatnie postępy w optogenetyce umożliwiły identyfikację typu neuronalnego w eksperymentach elektrofizjologicznych in vivo w szerokich obszarach mózgu. W eksperymentach optogenetycznych kluczowe znaczenie ma dostarczenie światła do miejsca rejestracji. Jednak często trudno jest dostarczyć światło stymulujące do głębokich obszarów mózgu z powierzchni mózgu. Szczególnie trudno jest światłu stymulującemu dotrzeć do głębokich obszarów mózgu, gdy przezroczystość optyczna powierzchni mózgu jest niska, jak to często ma miejsce w przypadku nagrań z obudzonych zwierząt. W tym miejscu opisujemy metodę rejestrowania reakcji skoków na światło od obudzonej myszy za pomocą niestandardowej szklanej optrody. W tej metodzie światło jest dostarczane przez szklaną elektrodę rejestrującą, dzięki czemu możliwe jest niezawodne stymulowanie zarejestrowanego neuronu światłem w głębokich obszarach mózgu. Ten wykonany na zamówienie system optrodowy składa się z dostępnych i niedrogich materiałów i jest łatwy w montażu.

Na Rysunku 2 zbadaliśmy wpływ wielkości końcówki oraz długości szklanych pipet na moc światła na końcówce pipet (Rysunek 2A-B). Moc światła mierzono za pomocą watomierza optycznego umieszczonego 1 mm od końcówki. Przy zmiennej wielkości końcówki całkowita długość wynosiła 50 ± 2 mm, natomiast przy zmiennej długości całkowitej wielkość końcówki wynosiła 2.5 µm. Długość trzonu szklanej pipety ustalono na 8 mm. Moc ...

Ta praca wprowadza metodę niezawodnego wykonywania optogenetycznego zapisu pojedynczej jednostki z obudzonej myszy za pomocą specjalnie wykonanej szklanej optrody.

Optogenetyka Identyfikacja typu neuronalnego za pomocą szklanej optrody u obudzonych myszy

It is a major concern in neuroscience how different types of neurons work in neural circuits. Recent advances in optogenetics have enabled the ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii, takie jak funkcje różnych typów neuronów. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona wiarygodną identyfikację różnych typów neuronów in vivo za pomocą niedrogich i dostępnych materiałów. Będę demonstrował tę procedurę razem z Shinjim Muramoto, naszym technikiem, i Lanlanem Ma, naszym adiunktem z naszego laboratorium.Aby rozpocząć tę procedurę, delikatnie wyciągnij stalową rurkę do kontroli ciśnienia z lufy uchwytu. Poszerz otwór po stronie gniazda sworznia w lufie uchwytu, wiercąc. Następnie umieść rurkę ze stali nierdzewnej w otworze.Następnie włóż do otworu ceramiczną dzieloną tuleję współpracującą z tuleją o średnicy 2,5 milimetra. Zrób otwór w króliku w kształcie litery L i przymocuj lufę uchwytu elektrody do królika za pomocą kleju epoksydowego. Następnie przymocuj go do manipulatora za pomocą.Przygotuj niestandardowy słupek główny, wykonując kolumnową przekładkę płytki drukowanej w kształcie prostopadłościanu za pomocą frezu i przytnij go na dwa słupki głowicy za pomocą piły. Następnie spłaszcz dolną część słupka głowicy za pomocą frezu. Przed zabiegiem należy wysterylizować wszystkie narzędzia chirurgiczne oraz słupek głowy za pomocą autoklawu.Wyczyść ramkę stereotaktyczną i poduszkę grzewczą 70-procentowym alkoholem. Następnie znieczul mysz i umieść ją w ramce stereotaktycznej na poduszce grzewczej. W tym eksperymencie wykorzystano transgeniczną mysz, w której wykorzystano neurony hamujące eksprymujące rodopsynę kanałową-II.Umieść zęby w otworze pręta zgryzowego i lekko dokręć zacisk nosowy. Następnie przymocuj obie strony głowy za pomocą nauszników. Gdy głowa jest prawidłowo zamocowana przez nauszniki, dokręć nos clamp.Nałóż maść okulistyczną na oczy. Przytnij włosy nad głową małymi nożyczkami i oczyść skórę głowy bawełnianym wacikiem z glukonianu chlorheksydyny. Następnie odetnij skórę głowy wzdłuż linii środkowej i odsuń ją na bok.Usuń okostną bawełnianym wacikiem zamoczonym w 70-procentowym alkoholu i pozostaw czaszkę do wyschnięcia. Następnie przymocuj słupek głowicy do manipulatora. Umieść słupek głowy płasko na czaszce wokół bregmy za pomocą manipulatora.Wymieszaj cztery krople monomeru, jedną kroplę katalizatora i jedną małą łyżeczkę polimeru na małym naczyniu schłodzonym w lodówce. Nałóż cement dentystyczny na kość czołową i ciemieniową i przymocuj słupek głowy do czaszki. Po stwardnieniu cementu dentystycznego wyjmij mysz z ramy stereotaktycznej.Nałóż maść z antybiotykiem na odsłoniętą skórę i wstrzyknij koktajl antagonisty medetomidyny i antybiotyku. Następnie umieść mysz na poduszce grzewczej w klatce, aż się obudzi i włóż ją z powrotem do klatki z dodatkami. Aby wykonać kraniotomię nad docelowym obszarem mózgu do nagrania, wyczyść czaszkę bawełnianym wacikiem nasączonym glukonianem chlorheksydyny i 70-procentowym alkoholem.Ostrożnie zeskrob czaszkę nad miejscem nagrania wiertłem dentystycznym. Gdy kość jest wystarczająco cienka, przetnij ją czubkiem skalpela i usuń. Następnie nałóż cement dentystyczny wokół odsłoniętego obszaru, aby wzmocnić czaszkę.Przykryj odsłonięty obszar mózgu klejem silikonowym po stwardnieniu cementu dentystycznego. Następnie umieść zwierzę na poduszce grzewczej w klatce, aż się obudzi, i włóż je z powrotem do klatki w pomieszczeniu. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie przez co najmniej jeden dzień po kraniotomii, przed wykonaniem zapisu elektrofizjologicznego.Przed wykonaniem zapisu elektrofizjologicznego należy wykonać kilka szklanych pipet z kapilar ze szkła borokrzemianowego za pomocą ściągacza elektrod. Napełnij pipety 10-milimolowym PBS. W niektórych nagraniach do 10-milimolowego PBS dodaje się dwa procent neurobiotyny.Następnie umieść zwierzę w komorze nagrywającej. Przymocuj napełnioną szklaną pipetę do specjalnie wykonanego uchwytu optrode. Włóż drut pokryty chlorkiem srebra do szklanej pipety.Następnie podłącz pin do stopnia głównego wzmacniacza nagrywającego. Następnie podłącz patchcord światłowodowy z tuleją cyrkonową do dzielonej tulei współpracującej na uchwycie optrody. Wsuń krosowy do tulei, aż końcówka tulejki zetknie się z tylną częścią szklanej pipety.Patchcord dostarcza światło z diody LED, która jest sterowana przez jednokanałowy sterownik LED. Następnie usuń klej silikonowy z kraniotomii. Okresowo nakładaj ciepłą sól fizjologiczną na powierzchnię mózgu, aby zapobiec wysuszeniu powierzchni mózgu podczas sesji nagraniowej.W razie potrzeby usuń oponę twardą za pomocą ostrej pęsety. Tutaj odpowiedzi kolców zarejestrowano w wzgórku dolnym obudzonych myszy VGAT channelrhodopsin-II. W wzgórku dolnym myszy z rodopsyną kanałową VGAT-II neurony GABA-ergiczne specyficznie wyrażają rodopsynę kanałową-II.U obudzonych myszy zarówno neurony GABA-ergiczne, jak i glutaminergiczne były odpowiednio pobudzone lub stłumione, gdy podawano im bodźce świetlne. Kiedy bodziec świetlny jest dostarczany przez szklaną elektrodę, wywołuje reakcje skokowe w niektórych neuronach. Natomiast w innych neuronach bodźce świetlne tłumiły reakcje kolców wywołane przez bodźce dźwiękowe.Wyniki te pokazują, że szklana optroda może rejestrować dobrze izolowaną aktywność pojedynczej jednostki i niezawodnie stymulować zarejestrowane neurony za pomocą światła. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny neuronauki do zbadania, w jaki sposób różne typy neuronów działają w zębodole nerwowym w różnych obszarach mózgu.

optogenetics-identification-neuronal-type-with-glass-optrode-awake

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy artykuł przedstawia rejestrację sygnałów z pojedynczych komórek pochodzących z fluorescencyjnie znakowanych populacji neuronów w nienaruszonej siatkówce myszy. Dzięki zastosowaniu dwufotonowego wzbudzenia w podczerwieni, transgenicznie znakowane komórki zostały wytypowane do rejestracji metodą patch-clamp w celu zbadania ich reakcji na światło, właściwości pól recepcyjnych oraz morfologii.

Charakterystyka elektrofizjologiczna populacji komórek wykazujących ekspresję GFP w nienaruszonej siatkówce

Źródło: Kodani, S., et.al. Manipulacja optogenetyczna obwodów neuronalnych podczas monitorowania stanów snu/czuwania u myszy. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film pokazuje optogenetyczną manipulację obwodami neuronalnymi zaangażowanymi w przejście ze snu do czuwania u myszy. Zabieg polega na chirurgicznym wszczepieniu światłowodu i elektrod do mózgu i mięśni, aby umożliwić stymulację światłem i zapis elektrofizjologiczny. Dostarczając światło w celu aktywacji światłoczułych kanałów kationowych w...

Manipulacja optogenetyczna obwodów neuronowych w celu przejścia ze snu do czuwania u myszy

Ten film demonstruje rejestrację aktywności neuronalnej mózgu przez okno optyczne u myszy transgenicznych. Myszy wyrażają białko fluorescencyjne, które umożliwia wykrywanie aktywności neuronalnej. Niewielka część czaszki jest ostrożnie usuwana w celu zainstalowania okna optycznego, a następnie czaszka jest pokrywana czarnym cementem, aby zablokować światło przed obrazowaniem.

Instalacja okien optycznych w mózgu myszy transgenicznych w celu zobrazowania aktywności neuronalnej

Źródło: Laboissonniere, et. al. Jednokomórkowy sekwencjoner RNA zdefiniowanych podzbiorów komórek zwojowych siatkówki. J. Vis. exp. (2017).  Ten film demonstruje technikę fluorescencyjnego śledzenia w celu identyfikacji podtypów komórek zwojowych siatkówki (RGC) w transgenicznej siatkówce myszy. Proces ten polega na zabezpieczeniu izolowanej siatkówki w komorze rejestracyjnej, utrzymaniu żywotności komórek za pomocą natlenionej perfuzji i celowaniu w znakowane fluorescencyjnie RGC za pomocą...

Identyfikacja podtypów komórek zwojowych siatkówki myszy za pomocą śledzenia fluorescencyjnego

Opisujemy metodę charakteryzowania funkcjonalnej topografii i właściwości synaptycznych obwodów przodomózgowia za pomocą podejścia optogenetycznego do fotostymulacji populacji neuronów in vitro.

Fotostymulacja optogenetycznie ukierunkowana obwodów przodomózgowia ze skaningiem laserowym

Optogenetyka stała się potężnym narzędziem do wykorzystania w eksperymentach neuronauki behawioralnej. Protokół ten oferuje przewodnik krok po kroku po projektowaniu i konfiguracji systemów laserowych oraz zapewnia pełny protokół przeprowadzania wielokrotnych i jednoczesnych stymulacji optogenetycznych in vivo zgodnych z większością paradygmatów testów behawioralnych gryzoni.

In vivo (in vivo) Stymulacja optogenetyczna ośrodkowego układu nerwowego gryzoni

Tutaj opisujemy naszą strategię uzyskiwania stabilnych, dobrze izolowanych pojedynczych nagrań jednostkowych ze zidentyfikowanych interneuronów hamujących w znieczulonej korze myszy. Neurony wyrażające ChR2 są identyfikowane na podstawie ich reakcji na niebieskie światło. Metoda wykorzystuje standardowy zewnątrzkomórkowy sprzęt rejestrujący i służy jako niedroga alternatywa dla obrazowania wapnia lub wizualnie sterowanego łatania.

Przewodnik po jednojednostkowym zapisie in vivo z optogenetycznie zidentyfikowanych korowych interneuronów hamujących

Tutaj opisujemy metody optogenetycznej manipulacji poszczególnych typów neuronów podczas monitorowania stanów snu/czuwania u myszy, przedstawiając jako przykład naszą niedawną pracę nad jądrem łożyska prążka końcowego.

Manipulacja optogenetyczna obwodów nerwowych podczas monitorowania stanów snu/czuwania u myszy

Dzięki optogenetycznej manipulacji określonych populacji neuronów lub obszarów mózgu, zachowanie może być modyfikowane z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną u swobodnie poruszających się zwierząt. Stosując różne narzędzia optogenetyczne w połączeniu z przewlekle wszczepionymi światłowodami, można przeprowadzić różnorodne modulacje neuronalne i testy behawioralne.

Optogenetyczna manipulacja aktywnością neuronalną w celu modulacji zachowania u swobodnie poruszających się myszy

Tutaj prezentujemy metodę wytwarzania systemu optycznego ze światłowodami do dostarczania światła i matrycą elektrod do rejestracji neuronowej. Eksperymenty in vivo na transgenicznych myszach z ekspresją rodopsyny-2 pokazują wykonalność systemu do jednoczesnej stymulacji optogenetycznej i zapisu elektrofizjologicznego.

Matryca optrodowa do jednoczesnej modulacji optogenetycznej i elektrycznego zapisu neuronowego

Poznaj metodę optogenetycznego rejestrowania jednostkowego aktywności neuronów u przebudzonych myszy za pomocą szklanej optrody. Technika umożliwia niezawodną identyfikację typów neuronów in vivo w badaniach neurobiologicznych.

Optogenetyka Identyfikacja typu neuronalnego za pomocą szklanej optrody u obudzonych myszy

Przeglądaj więcej filmów