Optogenetyka Identyfikacja typu neuronalnego za pomocą szklanej optrody u obudzonych myszy
28 czerwca 2018
Ta praca wprowadza metodę niezawodnego wykonywania optogenetycznego zapisu pojedynczej jednostki z obudzonej myszy za pomocą specjalnie wykonanej szklanej optrody.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii, takie jak funkcje różnych typów neuronów. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona wiarygodną identyfikację różnych typów neuronów in vivo za pomocą niedrogich i dostępnych materiałów. Będę demonstrował tę procedurę razem z Shinjim Muramoto, naszym technikiem, i Lanlanem Ma, naszym adiunktem z naszego laboratorium.
Aby rozpocząć tę procedurę, delikatnie wyciągnij stalową rurkę do kontroli ciśnienia z lufy uchwytu. Poszerz otwór po stronie gniazda sworznia w lufie uchwytu, wiercąc. Następnie umieść rurkę ze stali nierdzewnej w otworze.
Następnie włóż do otworu ceramiczną dzieloną tuleję współpracującą z tuleją o średnicy 2,5 milimetra. Zrób otwór w króliku w kształcie litery L i przymocuj lufę uchwytu elektrody do królika za pomocą kleju epoksydowego. Następnie przymocuj go do manipulatora za pomocą.
Przygotuj niestandardowy słupek główny, wykonując kolumnową przekładkę płytki drukowanej w kształcie prostopadłościanu za pomocą frezu i przytnij go na dwa słupki głowicy za pomocą piły. Następnie spłaszcz dolną część słupka głowicy za pomocą frezu. Przed zabiegiem należy wysterylizować wszystkie narzędzia chirurgiczne oraz słupek głowy za pomocą autoklawu.
Wyczyść ramkę stereotaktyczną i poduszkę grzewczą 70-procentowym alkoholem. Następnie znieczul mysz i umieść ją w ramce stereotaktycznej na poduszce grzewczej. W tym eksperymencie wykorzystano transgeniczną mysz, w której wykorzystano neurony hamujące eksprymujące rodopsynę kanałową-II.
Umieść zęby w otworze pręta zgryzowego i lekko dokręć zacisk nosowy. Następnie przymocuj obie strony głowy za pomocą nauszników. Gdy głowa jest prawidłowo zamocowana przez nauszniki, dokręć nos clamp.
Nałóż maść okulistyczną na oczy. Przytnij włosy nad głową małymi nożyczkami i oczyść skórę głowy bawełnianym wacikiem z glukonianu chlorheksydyny. Następnie odetnij skórę głowy wzdłuż linii środkowej i odsuń ją na bok.
Usuń okostną bawełnianym wacikiem zamoczonym w 70-procentowym alkoholu i pozostaw czaszkę do wyschnięcia. Następnie przymocuj słupek głowicy do manipulatora. Umieść słupek głowy płasko na czaszce wokół bregmy za pomocą manipulatora.
Wymieszaj cztery krople monomeru, jedną kroplę katalizatora i jedną małą łyżeczkę polimeru na małym naczyniu schłodzonym w lodówce. Nałóż cement dentystyczny na kość czołową i ciemieniową i przymocuj słupek głowy do czaszki. Po stwardnieniu cementu dentystycznego wyjmij mysz z ramy stereotaktycznej.
Nałóż maść z antybiotykiem na odsłoniętą skórę i wstrzyknij koktajl antagonisty medetomidyny i antybiotyku. Następnie umieść mysz na poduszce grzewczej w klatce, aż się obudzi i włóż ją z powrotem do klatki z dodatkami. Aby wykonać kraniotomię nad docelowym obszarem mózgu do nagrania, wyczyść czaszkę bawełnianym wacikiem nasączonym glukonianem chlorheksydyny i 70-procentowym alkoholem.
Ostrożnie zeskrob czaszkę nad miejscem nagrania wiertłem dentystycznym. Gdy kość jest wystarczająco cienka, przetnij ją czubkiem skalpela i usuń. Następnie nałóż cement dentystyczny wokół odsłoniętego obszaru, aby wzmocnić czaszkę.
Przykryj odsłonięty obszar mózgu klejem silikonowym po stwardnieniu cementu dentystycznego. Następnie umieść zwierzę na poduszce grzewczej w klatce, aż się obudzi, i włóż je z powrotem do klatki w pomieszczeniu. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie przez co najmniej jeden dzień po kraniotomii, przed wykonaniem zapisu elektrofizjologicznego.
Przed wykonaniem zapisu elektrofizjologicznego należy wykonać kilka szklanych pipet z kapilar ze szkła borokrzemianowego za pomocą ściągacza elektrod. Napełnij pipety 10-milimolowym PBS. W niektórych nagraniach do 10-milimolowego PBS dodaje się dwa procent neurobiotyny.
Następnie umieść zwierzę w komorze nagrywającej. Przymocuj napełnioną szklaną pipetę do specjalnie wykonanego uchwytu optrode. Włóż drut pokryty chlorkiem srebra do szklanej pipety.
Następnie podłącz pin do stopnia głównego wzmacniacza nagrywającego. Następnie podłącz patchcord światłowodowy z tuleją cyrkonową do dzielonej tulei współpracującej na uchwycie optrody. Wsuń krosowy do tulei, aż końcówka tulejki zetknie się z tylną częścią szklanej pipety.
Patchcord dostarcza światło z diody LED, która jest sterowana przez jednokanałowy sterownik LED. Następnie usuń klej silikonowy z kraniotomii. Okresowo nakładaj ciepłą sól fizjologiczną na powierzchnię mózgu, aby zapobiec wysuszeniu powierzchni mózgu podczas sesji nagraniowej.
W razie potrzeby usuń oponę twardą za pomocą ostrej pęsety. Tutaj odpowiedzi kolców zarejestrowano w wzgórku dolnym obudzonych myszy VGAT channelrhodopsin-II. W wzgórku dolnym myszy z rodopsyną kanałową VGAT-II neurony GABA-ergiczne specyficznie wyrażają rodopsynę kanałową-II.
U obudzonych myszy zarówno neurony GABA-ergiczne, jak i glutaminergiczne były odpowiednio pobudzone lub stłumione, gdy podawano im bodźce świetlne. Kiedy bodziec świetlny jest dostarczany przez szklaną elektrodę, wywołuje reakcje skokowe w niektórych neuronach. Natomiast w innych neuronach bodźce świetlne tłumiły reakcje kolców wywołane przez bodźce dźwiękowe.
Wyniki te pokazują, że szklana optroda może rejestrować dobrze izolowaną aktywność pojedynczej jednostki i niezawodnie stymulować zarejestrowane neurony za pomocą światła. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny neuronauki do zbadania, w jaki sposób różne typy neuronów działają w zębodole nerwowym w różnych obszarach mózgu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę optogenetycznej rejestracji pojedynczych jednostek u czuwających myszy z wykorzystaniem niestandardowej szklanej optrody. Technika ta ma na celu dostarczenie wiedzy na temat funkcji różnych typów neuronów poprzez umożliwienie niezawodnej identyfikacji i manipulacji in vivo przy użyciu kosteffektywnych materiałów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Optogenetyka
Wstęp
- Metoda koncentruje się na zrozumieniu funkcji neuronów, w szczególności neuronów GABAergicznych i glutaminergicznych.
- Wykorzystuje ona transgeniczny model mysi do ekspresji kanałrodopsyny-II w neuronach hamujących.
- Poprzednie metody charakteryzowały się niską wiarygodnością w identyfikacji typów neuronów in vivo.
- W metodologii zastosowano materiały przystępne i efektywne kosztowo.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej techniki rejestracji pojedynczych jednostek neuronalnych u czuwających myszy.
- Zbadanie funkcjonalnych ról różnych typów neuronów podczas rejestrowanej aktywności.
- Udoskonalenie narzędzi dostępnych do badania dynamiki neuronalnej w różnych obszarach mózgu.
Zastosowane metody
- Podstawowa metoda obejmuje zastosowanie szklanych optrod wykonanych na zamówienie oraz przeprowadzenie kraniotomii nad docelowymi obszarami mózgu.
- Modelem biologicznym są transgeniczne myszy VGAT channelrhodopsin-II.
- Kluczowymi etapami procesu są rejestracje elektrofizjologiczne oraz stymulacja optogenetyczna.
- Kroki obejmują staranne przygotowanie chirurgiczne, zarządzanie znieczuleniem oraz precyzyjne techniki wprowadzania optrody.
- Szczególną uwagę poświęca się protokołom sterylizacji i rekonwalescencji po zabiegu chirurgicznym.
Główne wyniki
- Technika ta umożliwiła dobrze odizolowaną rejestrację aktywności pojedynczych jednostek z konkretnych typów neuronów w kolliculus inferior.
- Bodźce świetlne wywołały zróżnicowane odpowiedzi, pobudzając neurony GABAergiczne i hamując neurony glutaminergiczne.
- Wyniki te sugerują skuteczność metody w analizie obwodów neuronalnych oraz odpowiedzi specyficznych dla danego typu neuronów.
- Kluczowe jest to, że metoda ta umożliwia szczegółowe badanie dynamiki neuronów u czuwających myszy podczas wykonywania określonych zadań.
Wnioski
- Niniejsze badanie ustanawia niezawodną metodę rejestracji optogenetycznej, która zwiększa możliwości badawcze w dziedzinie neuronauki.
- Technika ta znacząco pomaga w zrozumieniu interakcji i funkcji różnych neuronów.
- Ogólnie otwiera ona nowe możliwości głębszej eksploracji mechanizmów działania neuronów i ich interakcji w różnych obszarach mózgu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia niezawodną identyfikację typów neuronów in vivo u czuwających myszy, rozwiązując kluczowy problem w neuronauce związany z walidacją celu i ograniczaniem ryzyka mechanistycznego. Dzięki połączeniu stymulacji optogenetycznej z rejestracją elektrofizjologiczną za pomocą szklanej optrody, metoda ta wspiera testowanie hipotez dotyczących funkcji neuronów w głębokich obszarach mózgu. Podejście to wykorzystuje łatwo dostępne materiały, oferując skalowalne narzędzie dla wczesnych procesów odkrywczych skoncentrowanych na analizie obwodów neuronalnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez powiązanie stymulacji światłem z odpowiedziami w postaci kolców w określonych populacjach neuronów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny system izolowania typów neuronów in vivo przy użyciu kosztowo efektywnych i łatwo dostępnych komponentów.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność co do wybranego celu poprzez walidację tożsamości i funkcji neuronów w obszarach mózgu istotnych dla danej choroby.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe odczyty elektrofizjologiczne, które umożliwiają ocenę pobudliwości lub hamowania neuronów pod wpływem kontrolowanej stymulacji światłem.
- Wartość operacyjna: Dostarcza zestandaryzowane pomiary aktywności pojedynczych jednostek izolowanych, odpowiednie do optymalizacji i replikacji testów.
- Wartość strategiczna: Ułatwia przygotowanie do screeningu poprzez ustanowienie niezawodnej platformy do oceny odpowiedzi neuronów na zaburzenia farmakologiczne lub genetyczne.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera modelowanie systemów istotnych dla przebiegu chorób, umożliwiając manipulacje specyficzne dla typu komórek u budzących się, zachowujących naturalną aktywność zwierząt.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej dzięki spójnej identyfikacji i stymulacji neuronów.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności w przypisywaniu mechanizmów neuronalnych podczas walidacji celu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, zapewniając mechanizm walidacji celów neuronalnych przed identyfikacją związku wiodącego, szczególnie w obwodach wymagających analizy specyficznej dla konkretnego typu komórek.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie precyzyjnej stymulacji i rejestracji neuronów in vivo.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych, powtarzalnych wyników elektrofizjologicznych, które pozwalają na porównanie odpowiedzi neuronów w różnych warunkach.
- Analityka: Zapewnia pomiary odpowiedzi impulsowej oraz zmian aktywności wywołanej światłem, co umożliwia analizę statystyczną funkcji neuronów.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez umożliwienie walidacji celów neuronalnych w modelach zwierząt budzących się i wykazujących zachowania istotne dla ludzkich schorzeń.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi platformę wielokrotnego użytku do charakteryzacji neuronów w wielu obszarach mózgu i paradygmatach eksperymentalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów neuronalnych dzięki bezpośrednim, wywołanym światłem odczytom funkcjonalnym.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność dzięki konfigurowalnemu i dostępnemu systemowi optrod.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w funkcji neuronów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zwalidowaną tożsamość neuronalną i profile odpowiedzi.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie chirurgii stereotaktycznej, elektrofizjologii i stymulacji optogenetycznej.
- Zależy od dostępu do wyciągaczy elektrod, manipulatorów, sterowników LED i komponentów światłowodowych.
- Wymaga standaryzacji przygotowania chirurgicznego, fiksacji trzpienia głownego oraz procedur kraniotomii pomiędzy użytkownikami.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody do różnych obszarów mózgu i typów komórek neuronalnych poza wzgórzem dolnym.
- Opiera się na prawidłowej rekonwalescencji pooperacyjnej i habituacji w celu zapewnienia stabilnych zapisów u zwierząt w stanie czuwania.
