Przebudowa błony gigantycznych pęcherzyków w odpowiedzi na zlokalizowane gradienty jonów wapnia
16 lipca 2018
Prezentujemy technikę bezdotykowej mikromanipulacji pęcherzykami, wykorzystując zlokalizowane gradienty jonów wapnia. Mikroiniekcja roztworu jonów wapnia w pobliżu gigantycznego pęcherzyka lipidowego jest wykorzystywana do przebudowy błony lipidowej, w wyniku czego powstają wypukłości rurki błonowe.
Przedstawiamy technikę manipulacji gigantycznymi pęcherzykami z wykorzystaniem zlokalizowanych gradientów jonów wapnia. Główną zaletą tej techniki jest całkowicie bezdotykowa stymulacja powierzchni pęcherzyka i bezpośrednia wizualizacja przebudowy błony lipidowej po interakcji z jonami wapnia. Nasze podejście wprowadza sposób na zajęcie się szczegółami interakcji błony jonowej wapnia, zapewniając nowe miejsca do badania mechanizmów przekształcania błony komórkowej po zmianach w mikrośrodowisku komórki.
Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj roztwór lipidów w chloroformie. Końcowe stężenie lipidów w chloroformie wynosi jeden miligram na mililitr, a końcowa masa to 0,6 miligrama. Owinąć szklaną fiolkę zawierającą mieszaninę lipidów folią metalową w celu ochrony zawartości przed światłem otoczenia.
Umieścić owinięta w metalową folię fiolkę z próbką w szklanej zlewce. Aby usunąć chloroform, należy odparować rozpuszczalnik w wyparce obrotowej przez trzy godziny pod ciśnieniem dochodzącym do siedmiu kilopaskali próżni przy 80 obr./min. Po odparowaniu na dnie szklanej fiolki tworzy się suchy film lipidowy.
Powoli dodaj 600 mikrolitrów buforowanego fosforanem roztworu soli na wysuszony film lipidowy. Po dodaniu buforu delikatnie dodaj sześć mikrolitrów glicerolu, aby chronić próbkę przed całkowitym odwodnieniem podczas tworzenia gigantycznego pęcherzyka jednopłytkowego połączonego z pęcherzykiem wielopłytkowym lub GUV-MLV. Uszczelnić szklaną fiolkę za pomocą Parafilm.
I przykryj metalową folią, aby chronić przed światłem otoczenia. Przechowywać fiolkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia należy poddać sonikacji szklanej fiolki zawierającej roztwór przez jedną minutę przy użyciu kąpieli ultradźwiękowej w temperaturze pokojowej.
Usuń Parafilm i pipetuj pipetą, aż utworzy się wizualnie jednolity roztwór małych pęcherzyków lipidowych. Porcję 30 mikrolitrów otrzymanego roztworu małych pęcherzyków lipidowych do pojedynczych 0,5 mililitrowych plastikowych probówek. Rozmrozić plastikową probówkę zawierającą podwielokrotność zamrożonej zawiesiny małych pęcherzyków lipidowych w temperaturze pokojowej.
Wiruj rurkę cztery razy przez jedną do dwóch sekund za pomocą miksera wirowego z maksymalną prędkością. Umieścić pięć mikrolitrów zawiesiny małych pęcherzyków lipidowych na powierzchni szklanego szkiełka nakrywkowego, aby utworzyć małą, okrągłą kroplę. Użyj szklanego szkiełka nakrywkowego bez żadnych czynności związanych z czyszczeniem wstępnym.
Teraz umieść szklane szkiełko nakrywkowe w eksykatorze próżniowym na 20 minut. Wysuszony film lipidowy należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez cztery minuty. Następnie powoli odpipetuj 50 mikrolitrów 10-milimolowego buforu HEPES na suchy film lipidowy w celu nawodnienia.
Odczekaj pięć minut, aby wstępnie uformować kompleksy GUV-MLV. Wyśrodkuj szklane szkiełko nakrywkowe na stoliku mikroskopu. Następnie należy odpipetować na nim 300 mikrolitrów buforu HEPES i umieścić środek kropli nad obiektywem.
Przenieść 50 mikrolitrów wstępnie uformowanego roztworu GUV-MLV do roztworu HEPES. Odczekaj 25 minut, aby słabo uformowane kompleksy GUV-MLV mocno przylegały do powierzchni szklanego szkiełka nakrywkowego. Zaokrąglij krawędzie kapilar ze szkła borokrzemianowego, delikatnie umieszczając końce kapilary w płomieniu świecy, aby zapobiec pęknięciu mikropipety podczas mocowania jej do uchwytu mikropipety.
Pociągnij co najmniej trzy szklane kapilary za pomocą automatycznego ściągacza laserowego. Użyj kapilar ze szkła borokrzemianowego, o których mowa w tekście, aby uzyskać mikropipetę z otworem końcówki o średnicy około 0,3 mikrona. Aby uniknąć zatkania końcówki pipety, przed użyciem przefiltruj pięciomilimolowy roztwór chlorku wapnia w roztworze buforowym HEPES za pomocą filtra strzykawkowego o wielkości od 0,2 do 0,5 mikrona.
Następnie napełnij każdą mikropipetę ośmioma mikrolitrami roztworu chlorku wapnia za pomocą mikroładowarki. Podłączyć uchwyt do mikropipet do mikromanipulatora. Zamontuj mikropipetę w uchwycie mikropipety.
Następnie podłączyć pompę wtryskową i uchwyt kapilarny za pomocą rurki zasilającej. Po uruchomieniu pompy iniekcyjnej należy dostosować ustawienia pompy iniekcyjnej do ciśnienia wtrysku 20 hektopaskalów. Ustaw również ciśnienie kompensacyjne na pięć hektopaskalów.
Ustaw mikroskop w trybie jasnego pola. Skonfiguruj go pod kątem różnicowego kontrastu interferencyjnego. Za pomocą mikromanipulatora zgrubnego umieścić mikropipetę nad kroplą zawierającą kompleksy GUV-MLV.
Umieść końcówkę mikropipety nad obiektywem i przyłóż pipetę do kropli za pomocą mikromanipulatora zgrubnego. Ustaw mikroskop w trybie fluorescencji. Umieść końcówkę mikropipety w odległości trzech mikronów od powierzchni membrany, jednocześnie wstrzykując roztwór chlorku wapnia z mikropipety, aby umożliwić utworzenie MTP.
Aby przesunąć MTPS wzdłuż powierzchni GUV, powoli przesuwaj końcówkę pipety po powierzchni GUV za pomocą precyzyjnego mikromanipulatora. Zachowaj mniej więcej taką samą odległość między powierzchnią GUV a końcówką mikropipety, kontynuując wstrzykiwanie jonów wapnia. Aby zatrzymać mikroiniekcję, należy wyłączyć pompę wtryskową.
Reprezentatywny obraz z mikroskopii fluorescencyjnej kompleksu GUV-MLV unieruchomionego na powierzchni szklanego szkiełka nakrywkowego jest pokazany tutaj. Na tych obrazach można zobaczyć wypukłości rurkowe błony powstałe w wyniku miejscowego wstrzykiwania jonów wapnia na powierzchnię GUV. Przesunięcie końcówki mikropipety po powierzchni membrany, jak wskazuje strzałka, powoduje ruch wypukłości rurkowych membrany w kierunku źródła jonów wapnia.
Podsumowując, proponujemy technikę, która pozwala na bezkontaktową przebudowę błony gigantycznych pęcherzyków lipidowych, co spowodowało powstanie wypukłości rurkowych błony po miejscowej stymulacji jonami wapnia. Przyszłe zastosowania tej metody obejmują przejście od syntetycznych pęcherzyków lipidowych do natywnych błon biologicznych lub zastosowanie tego podejścia do systemów polimerowych w celu opracowania bezkontaktowych platform mikromanipulacji.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia bezkontaktową technikę mikromanipulacji gigantycznymi pęcherzykami lipidowymi z wykorzystaniem lokalnych gradientów jonów wapnia. Metoda ta umożliwia bezpośrednią wizualizację przebudowy błony lipidowej, prowadzącą do powstania rurkowatych wypustek błonowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biofizyka
- Biologia komórki
Wprowadzenie
- Gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUVs) są ważnymi modelami do badania błon komórkowych.
- Jony wapnia odgrywają kluczową rolę w dynamice i przebudowie błon.
- Bezkontaktowe techniki manipulacji mogą zwiększyć precyzję eksperymentalną.
- Zrozumienie oddziaływań błonowych może dostarczyć informacji o procesach komórkowych.
Cel badania
- Opracowanie metody bezkontaktowego manipulowania pęcherzykami.
- Zbadanie wpływu lokalnych gradientów jonów wapnia na błony lipidowe.
- Zapewnienie wglądu w mechanizmy przekształcania kształtu błon.
Zastosowane metody
- Przygotowanie roztworów lipidowych i tworzenie kompleksów GUV-MLV.
- Zastosowanie mikropipet do lokalnej iniekcji jonów wapnia.
- Mikroskopia fluorescencyjna do wizualizacji zmian błonowych.
- Kontrola parametrów iniekcji w celu zapewnienia skutecznej manipulacji.
Główne wyniki
- Lokalna injekcja jonów wapnia skutecznie indukowała powstawanie tubularnych wypustek błony.
- Technika ta wykazała skuteczność w bezkontaktowej manipulacji pęcherzykami.
- Obrazowanie fluorescencyjne ujawniło dynamiczne zmiany w morfologii błony.
- Wyniki sugerują potencjalne zastosowania w badaniu błon biologicznych.
Wnioski
- Proponowana technika umożliwia zastosowanie innowacyjnych podejść w badaniach nad błonami.
- Przyszłe zastosowania mogą objąć natywne błony biologiczne oraz układy polimerowe.
- Metoda ta otwiera nowe możliwości badawcze w zakresie dynamiki błon komórkowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta bezkontaktowa technika przebudowy błon umożliwia precyzyjne badanie dynamiki lipidów zapśredniczonej przez jony wapnia, która jest kluczowym mechanizmem w transporcie błonowym i apoptozie, istotnym z punktu widzenia ograniczania ryzyka związanego z celem terapeutycznym. Dzięki zastosowaniu systemu biomimetycznego do izolacji wpływu gradientu wapnia na morfologię błony, metoda ta wspiera mechanistyczne zrozumienie oddziaływań białko-lipid w szlakach chorobowych. Podejście to oferuje skalowalną i powtarzalną platformę do badania biofizyki błon na wczesnym etapie odkrywania leków, co pozwala na optymalizację projektowania testów oraz modelowanie prognostyczne wpływu związków na integralność błony.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie zależnego od wapnia przekształcania błon jako funkcjonalnego odczytu służącego do walidacji celów w szlakach sygnalizacyjnych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia bezkontaktowy, kontrolowany system do izolowania efektów jonów wapnia bez złożoności komórkowej, co redukuje zmienne zakłócające w badaniach mechanistycznych.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Umożliwia generowanie mierzalnych wyników w postaci tworzenia tubularnych wypustek błonowych jako dynamicznego wyniku analizy obrazowej do przesiewania związków.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje zestandaryzowane kompleksy GUV-MLV oraz mikroskopię fluorescencyjną w celu uzyskania powtarzalnych i skalowalnych odczytów dla bibliotek związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy syntetyczne modele błon z biologią natywną poprzez badanie odpowiedzi lipidów na fizjologicznie istotne gradienty wapnia.
- Wartość operacyjna: Wspiera ciągłość od odkryć mechanistycznych do walidacji przedklinicznej poprzez ustanowienie związków przyczynowo-skutkowych w przebudowie błon.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesne etapy procesów odkrywania leków, w których kluczowe jest mechanistyczne ograniczanie ryzyka w przypadku celów związanych z błonami komórkowymi, szczególnie w obszarach terapeutycznych obejmujących sygnalizację wapniową, takich jak neuronauka i onkologia.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących celów wrażliwych na wapń poprzez bezpośrednią wizualizację przebudowy błon lipidowych pod wpływem gradientu.
- Screening: Umożliwia przygotowanie testów dzięki standaryzowanej formacji pęcherzyków i mierzalnym parametrom wypustek w celu identyfikacji trafień (hits).
- Analityka: Dostarcza przestrzennych i czasowych danych dotyczących morfologii błon za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w celu porównania warunków gradientowych lub wpływu związków.
- Badania translacyjne: Jest zgodne z systemami istotnymi dla chorób poprzez naśladowanie lokalnych fluktuacji wapnia obserwowanych w mikrośrodowiskach komórkowych.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Tworzy wielokrotnego użytku platformę biomimetyczną, którą można dostosować do różnych składów lipidowych i paradygmatów stymulacji w różnych projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję ryzyka związanego z niejednoznacznością mechanistyczną oddziaływań wapń-błona.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanemu przygotowaniu lipidów, kontrolowanej mikroiniekcji oraz protokołom obrazowania.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go, dostarczając wczesnych, opartych na mechanizmach informacji o wpływie związków na stabilność błony.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie zwalidowanych fenotypów przebudowy błony.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga doświadczenia w przygotowaniu pęcherzyków lipidowych, mikromanipulacji oraz mikroskopii fluorescencyjnej.
- Zależy od zastosowania kapilar szklanych formowanych laserowo, filtrów strzykawkowych oraz precyzyjnych systemów wstrzykiwania sterowanych ciśnieniem.
- Wymaga standaryzacji składu lipidów, wielkości pęcherzyków oraz stężenia wapnia w celu zapewnienia spójności między eksperymentami.
- Adaptacja do natywnych błon lub systemów polimerowych może wymagać optymalizacji warunków buforu i parametrów stymulacji.
- Ograniczenia praktyczne obejmują stabilność pęcherzyków w czasie oraz potencjalną zmienność wydajności tworzenia wypustek.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:41
Preparation of Small Lipid Vesicles
2:38
Preparation of GUV-MLV Complexes
4:12
Micropipette Preparation and Microinjection
6:09
Formation and Translation of Membrane Tubular Protrusions (MTPs) using the Calcium Ion Source
6:57
Results: Formation of Membrane Tubular Protrusions in Giant Vesicles Upon Localized Application of Calcium Ion Gradients
7:37
Conclusion
