Name: Przebudowa błony gigantycznych pęcherzyków w odpowiedzi na zlokalizowane gradienty jonów wapnia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Poznaj technikę bezdotykowej manipulacji wielkimi pęcherzykami lipidowymi przy użyciu zlokalizowanych gradientów jonów wapnia. Metoda umożliwia bezpośrednią wizualizację przebudowy błony i tworzenie wypustek rurkowatych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Przygotowanie małych pęcherzyków lipidowych
<ol>
	<li>Przygotować roztwór lipidów SPE/DOPS/ATTO488-DOPE w chloroformie o proporcji mieszania masy 79/20/1. Końcowe stężenie lipidów w chloroformie wynosi 1 mg/ml, a masa końcowa wynosi 0,6 mg (zwykle mniej niż 1 mg). Do przygotowania roztworu lipidowego bez etapu czyszczenia wstępnego należy używać jednorazowych szklanych fiolek z okrągłym dnem (szklane probówki z okrągłym dnem, 10 x 75 mm).
	<ol>
		<li>Napełnij i wypłucz szklane strzykawki (25 μl) chloroformem co najmniej 5 razy przed użyciem. Aby napełnić i przepłukać szklaną strzykawkę co najmniej 5 razy, wystarczy 3-4 ml chloroformu. 
		UWAGA: Podczas pracy z chloroformem należy używać szklanych strzykawek i wykonywać wszystkie procedury w dygestorium, nosząc przez cały czas odpowiednie rękawice i okulary ochronne. Nie używaj żadnych plastikowych kolb, strzykawek ani pipet podczas pracy z chloroformem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Owinąć szklaną fiolkę zawierającą mieszaninę lipidów folią metalową w celu ochrony zawartości przed światłem otoczenia i odparować rozpuszczalnik w wyparce obrotowej przez 3 godziny w celu usunięcia chloroformu, pod ciśnieniem osiągającym próżnię 7 kPa przy 80 obr./min. Po odparowaniu na dnie szklanej fiolki tworzy się suchy film lipidowy (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2A). 
	UWAGA: Kilkukrotne zwiększanie skali i użycie większych ilości lipidów może wymagać dłuższego czasu odparowania obrotowego, aby zapewnić pełne usunięcie chloroformu.</li>
	<li>Powoli dodać 600 μl roztworu buforowego soli fizjologicznej (PBS) (pH 7,8, bez rozcieńczania) na wierzch wysuszonego filmu lipidowego. Po dodaniu buforu delikatnie dodać 6 μl glicerolu, aby zabezpieczyć próbkę przed całkowitym odwodnieniem podczas etapów tworzenia GUV-MLV (osiągając końcowe stężenie glicerolu 1% wag.)36. Uszczelnić szklaną fiolkę za pomocą folii parafilmowej i przykryć folią metalową w celu ochrony przed światłem otoczenia. Przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C przez noc. 
	UWAGA: Roztwór buforowy PBS składa się z 0,151 g zasady Trizma, 1,592 gK3PO4, 1,021 g KH2PO4, 0,062 g MgSO4 ·7H2O i 0,0465 g EDTA w 250 ml oczyszczonej wody. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C i ogrzać do temperatury pokojowej przed użyciem. Zamiast roztworu PBS można użyć równoważnej ilości bufora HEPES o pojemności 10 mM. Roztwór buforowy HEPES przygotowuje się przez rozcieńczenie 1 M roztworu podstawowego HEPES oczyszczoną wodą.</li>
	<li>Następnego dnia należy poddać sonikacji szklanej fiolki zawierającej roztwór przez 1 minutę przy użyciu kąpieli ultradźwiękowej o temperaturze pokojowej. Usuń parafilm i pipetę, aż utworzy się wizualnie jednolity roztwór małych pęcherzyków lipidowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Podwielokrotność 30 μl otrzymanego roztworu małych pęcherzyków lipidowych do pojedynczych probówek z tworzywa sztucznego o pojemności 0,5 ml. Porcje te należy przechowywać w temperaturze -18 °C maksymalnie przez 6 miesięcy. 
	UWAGA: Jeśli mały roztwór pęcherzyków lipidowych nie jest wizualnie jednorodny, wiruj roztwór 4 razy przez 1-2 sekundy za pomocą mieszalnika wirowego z maksymalną prędkością.</li>
</ol>
2. Przygotowanie kompleksów GUV-MLV
<ol>
	<li>Rozmrozić do temperatury pokojowej plastikową probówkę zawierającą podwielokrotność zamrożonej zawiesiny małych pęcherzyków lipidowych. Wiruj rurkę 4 razy przez 1-2 sekundy za pomocą miksera wirowego z maksymalną prędkością.</li>
	<li>Umieścić 5 μl zawiesiny małych pęcherzyków lipidowych na powierzchni szklanego szkiełka nakrywkowego (24 x 60 mm), aby utworzyć małą okrągłą kroplę. Użyj szklanego szkiełka nakrywkowego bez żadnych czynności związanych z czyszczeniem wstępnym.</li>
	<li>Umieścić szkiełko nakrywkowe w eksykatorze próżniowym (próżnia <100 kPa) na 20 minut.</li>
	<li>Przechowuj wysuszoną folię lipidową w temperaturze pokojowej przez 4 minuty, a następnie powoli odpipetuj 50 μl 10 mM buforu HEPES na wierzchu suchego filmu lipidowego w celu ponownego nawodnienia. Odczekaj 5 minut, aby wstępnie uformować kompleksy GUV-MLV (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Wyśrodkuj szklane szkiełko nakrywkowe na stoliku mikroskopu, a następnie odpipetuj na nim 300 μl buforu HEPES i umieść środek kropli nad obiektywem (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B).</li>
	<li>Przenieść 50 μl wstępnie uformowanego roztworu GUV-MLV do roztworu HEPES (300 μl). Odczekaj 25 minut, aby słabo uformowane kompleksy GUV-MLV mocno przylegały do powierzchni szkiełka nakrywkowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D). 
	UWAGA: Czasami kompleksy GUV-MLV nie tworzą się na szkiełku nakrywkowym, a zamiast tego obserwuje się plamy lipidowe lub tylko MLV. Można to wytłumaczyć przypadkowym potrząśnięciem próbki podczas etapów 2.4 lub 2.6 lub licznymi cyklami zamrażania i rozmrażania zawiesiny małych pęcherzyków. Powtórzyć kroki 2.1-2.6 lub użyć świeżo przygotowanego podstawowego roztworu lipidów (krok 1.1) w celu uzyskania kompleksów GUV-MLV.</li>
</ol>
3. Przygotowanie mikropipet i mikroiniekcja
<ol>
	<li>Zaokrąglij krawędzie kapilar ze szkła borokrzemianowego, delikatnie umieszczając końce kapilary w płomieniu świecy, aby zapobiec pęknięciu mikropipety podczas mocowania jej do uchwytu mikropipety.</li>
	<li>Pociągnij co najmniej 3 szklane kapilary za pomocą automatycznego ściągacza laserowego za pomocą zestawu programów: Heat = 400, Fil = 4, Vel = 50, Del = 225, Pul = ; Ciepło = 400, Fil = 4, Vel = 60, Del = 150, Pul = 120. Zestaw programów musi być wprowadzony z pierwszą wartością Pul pozostawioną pustą. Zastosowanie kapilar ze szkła borokrzemianowego o średnicy wewnętrznej (I.D.) 1,00 mm i średnicy zewnętrznej (O.D.) 0,78 mm pozwala uzyskać mikropipetę z otworem końcówki o średnicy około 0,3 μm.</li>
	<li>Napełnij każdą mikropipetę 8 μl 5 mM roztworu CaCl2 w buforze HEPES (10 mM) za pomocą mikroładowarki. Przed użyciem przefiltrować roztwór CaCl2 za pomocą filtra strzykawkowego 0,2-0,5 μm, aby uniknąć zatkania końcówki pipety. 
	UWAGA: Upewnij się, że CaCl2 jest całkowicie rozpuszczony w roztworze buforowym HEPES, który jest również używany w krokach 2.4-2.6.</li>
	<li>Podłączyć uchwyt do mikropipet do mikromanipulatora. Zamontuj mikropipetę w uchwycie mikropipety. Podłączyć pompę wtryskową i uchwyt kapilary za pomocą rurki zasilającej.</li>
	<li>Uruchomić pompę wtryskową. Dostosuj ustawienia pompy wtryskowej na 20 hPa (ciśnienie wtrysku) i ustaw ciśnienie kompensacyjne 5 hPa w trybie automatycznym. Pompę iniekcyjną należy wstrzymać do momentu, gdy mikropipeta będzie gotowa do wykonania mikroiniekcji.</li>
	<li>Ustaw mikroskop w trybie jasnego pola. Skonfiguruj go pod kątem różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC). Użyj obiektywów o wysokim współczynniku NA (1,3) 63X lub 100X, aby uzyskać optymalną rozdzielczość krawędzi membrany.</li>
	<li>Za pomocą mikromanipulatora zgrubnego umieścić mikropipetę nad kroplą zawierającą kompleksy GUV-MLV. Umieść końcówkę mikropipety nad obiektywem.</li>
	<li>Ustaw ostrość mikroskopu na środku kompleksu GUV-MLV, a następnie ponownie ustaw ostrość około 50 μm powyżej GUV. Użyj trybu zgrubnego mikromanipulatora, aby delikatnie ustawić ostrość mikropipety.</li>
	<li>Przełącz mikromanipulator w tryb dokładny. Powoli ponownie ustaw ostrość na powierzchni GUV, przesuwając końcówkę mikropipety w dół i utrzymując ostrość końcówki. Umieść końcówkę mikropipety w odległości około 20 μm od powierzchni GUV. Jeśli końcówka mikropipety zostanie uszkodzona w wyniku przypadkowego kontaktu ze szklanym szkiełkiem nakrywkowym (przykład w <silna klasa="xfig">Rysunek 5B), należy ją natychmiast wymienić, aby uniknąć niepotrzebnego uwalniania jonów wapnia do roztworu próbki w masie.</li>
</ol>
4. Tworzenie i translacja MTP przy użyciu źródła jonów wapnia
<ol>
	<li>Ustaw mikroskop w trybie fluorescencji. Ustaw dichroikę na wzbudzenie przy 488 nm i wykryj emisję przy 505-550 nm.</li>
	<li>Włączyć pompę wtryskową i rozpocząć wtrysk jonów wapnia. Użyj trybu precyzyjnego mikromanipulatora i powoli zbliżaj się do GUV z końcówką mikropipety. Umieść końcówkę mikropipety w odległości 3 μm od powierzchni membrany, jednocześnie wstrzykując roztwór CaCl2 z mikropipety, aby umożliwić utworzenie MTP (<silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
	<li>Aby przesunąć MTP wzdłuż powierzchni GUV, powoli przesuwaj końcówkę pipety (z prędkością 0,1-0,3 μm/s) po powierzchni GUV za pomocą precyzyjnego mikromanipulatora (<silna klasa="xfig">Rysunek 6). Zachowaj mniej więcej taką samą odległość (3 μm) między powierzchnią GUV a końcówką mikropipety, kontynuując wstrzykiwanie jonów wapnia. 
	UWAGA: Przy dużych szybkościach translacji końcówki mikropipety (powyżej 0,7 μm/s) MTP nie migrują w synchronizacji z mikropipetą. Zamiast tego ulegną one rozproszeniu i skróceniu, podczas gdy nowe MTP zostaną utworzone w nowym miejscu końcówki mikropipety (<silna klasa="xfig">Rysunek 7).</li>
	<li>Aby zatrzymać mikroiniekcję, należy wyłączyć pompę iniekcyjną i odsunąć mikropipetę od powierzchni GUV.</li>
</ol>

<ol><li>Monteith, G. R., McAndrew, D., Faddy, H. M., Roberts-Thomson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+cancer%3A+Targeting+Ca2%2B+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Calcium and cancer: Targeting Ca2+ transport.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (7), 519-530 (2007).</li>
<li>Meldolesi, J., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endoplasmic+reticulum+Ca2%2B+store%3A+A+view+from+the+lumen%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Science%22%5BJournal%5D)">The endoplasmic reticulum Ca2+ store: A view from the lumen.</a> Trends in Biochemical Science. 23 (1), 10-14 (1998).</li>
<li>Bygrave, F. L., Benedetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+concentration+of+calcium+ions+in+the+endoplasmic+reticulum%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">What is the concentration of calcium ions in the endoplasmic reticulum?</a> Cell Calcium. 19 (6), 547-551 (1996).</li>
<li>Mogami, H., Tepikin, A. V., Petersen, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Termination+of+cytosolic+Ca2%2B+signals%3A+Ca2%2B+reuptake+into+intracellular+stores+is+regulated+by+the+free+Ca2%2B+concentration+in+the+store+lumen%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Termination of cytosolic Ca2+ signals: Ca2+ reuptake into intracellular stores is regulated by the free Ca2+ concentration in the store lumen.</a> The EMBO Journal. 17 (2), 435-442 (1998).</li>
<li>SantoDomingo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics+in+bovine+adrenal+medulla+chromaffin+cell+secretory+granules%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics in bovine adrenal medulla chromaffin cell secretory granules.</a> European Journal of Neuroscience. 28 (7), 1265-1274 (2008).</li>
<li>Moreno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics+in+catecholamine-containing+secretory+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics in catecholamine-containing secretory vesicles.</a> Cell Calcium. 37 (6), 555-564 (2005).</li>
<li>Bulenda, D., Gratzl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+free+Ca2%2B+in+isolated+chromaffin+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Matrix free Ca2+ in isolated chromaffin vesicles.</a> Biochemistry. 24 (26), 7760-7765 (1985).</li>
<li>Montero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromaffin-cell+stimulation+triggers+fast+millimolar+mitochondrial+Ca2%2B+transients+that+modulate+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromaffin-cell stimulation triggers fast millimolar mitochondrial Ca2+ transients that modulate secretion.</a> Nature Cell Biology. 2 (2), 57-61 (2000).</li>
<li>Villalobos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redistribution+of+Ca2%2B+among+cytosol+and+organella+during+stimulation+of+bovine+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Redistribution of Ca2+ among cytosol and organella during stimulation of bovine chromaffin cells.</a> The FASEB Journal. 16 (3), 343-353 (2002).</li>
<li>Brown, E. M., Hofer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+calcium+sensing+and+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular calcium sensing and signalling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 530-538 (2003).</li>
<li>Tarafdar, P. K., Chakraborty, H., Dennison, S. M., Lentz, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylserine+inhibits+and+calcium+promotes+model+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylserine inhibits and calcium promotes model membrane fusion.</a> Biophysical Journal. 103 (9), 1880-1889 (2012).</li>
<li>Boettcher, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+view+of+calcium-induced+clustering+of+phosphatidylserine+in+mixed+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Atomic view of calcium-induced clustering of phosphatidylserine in mixed lipid bilayers.</a> Biochemistry. 50, 2264-2273 (2011).</li>
<li>Binder, H., Zschörnig, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+metal+cations+on+the+phase+behavior+and+hydration+characteristics+of+phospholipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Physics+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">The effect of metal cations on the phase behavior and hydration characteristics of phospholipid membranes.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 115, 39-61 (2002).</li>
<li>Sinn, C. G., Antonietti, M., Dimova, R. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0927775705007351">Binding of calcium to phosphatidylcholine-phosphatidylserine membranes.</a> Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 282-283, 410-419 (2006).</li>
<li>Pedersen, U. R., Leidy, C., Westh, P., Peters, G. N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+calcium+on+the+properties+of+charged+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The effect of calcium on the properties of charged phospholipid bilayers.</a> Biochimica et Biophysica Acta. , 573-582 (2006).</li>
<li>Melcrova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+nature+of+calcium+cation+interactions+with+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The complex nature of calcium cation interactions with phospholipid bilayers.</a> Scientific Reports. 6, 38035(2016).</li>
<li>Roux, M., Bloom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B%2C+Mg2%2B%2C+Li%2B%2C+Na%2B%2C+and+K%2B+distributions+in+the+headgroup+region+of+binary+membranes+of+phosphatidylcholine+and+phosphatidylserine+as+seen+by+deuterium+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ca2+, Mg2+, Li+, Na+, and K+ distributions in the headgroup region of binary membranes of phosphatidylcholine and phosphatidylserine as seen by deuterium NMR.</a> Biochemistry. 29 (30), 7077-7089 (1990).</li>
<li>Waldbillig, R. C., Robertson, J. D., McIntosh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Images+of+divalent+cations+in+unstained+symmetric+and+asymmetric+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Act%22%5BJournal%5D)">Images of divalent cations in unstained symmetric and asymmetric lipid bilayers.</a> Biochimica et Biophysica Act. 448 (1), 1-14 (1976).</li>
<li>Kay, J. G., Koivusalo, M., Ma, X., Wohland, T., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylserine+dynamics+in+cellular+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylserine dynamics in cellular membranes.</a> Molecular Biology of the Cell. 23, 2198-2212 (2012).</li>
<li>Vernier, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopore+formation+and+phosphatidylserine+externalization+in+a+phospholipid+bilayer+at+high+transmembrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Nanopore formation and phosphatidylserine externalization in a phospholipid bilayer at high transmembrane potential.</a> Journal of the American Chemical Society. 128, 6288-6289 (2006).</li>
<li>Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Preparation+of+Giant+Unilamellar+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid Preparation of Giant Unilamellar Vesicles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (21), 11443-11447 (1996).</li>
<li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+Vesicles%3A+Preparations+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Giant Vesicles: Preparations and Applications.</a> ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).</li>
<li>Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+a+Transmembrane+Protein%2C+the+Voltage-gated+Ion+Channel%2C+KvAP%2C+into+Giant+Unilamellar+Vesicles+for+Microscopy+and+Patch+Clamp+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52281(2015).</li>
<li>Khalifat, N., Puff, N., Bonneau, S., Fournier, J. B., Angelova, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+deformation+under+local+pH+gradient%3A+mimicking+mitochondrial+cristae+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Membrane deformation under local pH gradient: mimicking mitochondrial cristae dynamics.</a> Biophysical Journal. 95, 4924-4933 (2008).</li>
<li>Ali Doosti, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Tubulation+in+Lipid+Vesicles+Triggered+by+the+Local+Application+of+Calcium+Ions%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Membrane Tubulation in Lipid Vesicles Triggered by the Local Application of Calcium Ions.</a> Langmuir. 33 (41), 11010-11017 (2017).</li>
<li>Barber, M. A. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/pdf/30071878.pdf">A Technic for the Inoculation of Bacteria and Other Substances into Living Cells.</a> The Journal of Infectious Diseases. 8 (3), 348-360 (1911).</li>
<li>Taylor, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+accurately+controllable+micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An accurately controllable micropipette.</a> Science. 1329, 617-618 (1920).</li>
<li>Jesorka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+phospholipid+vesicle-nanotube+networks+and+transport+of+molecules+therein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of phospholipid vesicle-nanotube networks and transport of molecules therein.</a> Nature Protocols. 6 (6), 791-805 (2011).</li>
<li>Lobovkina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tweezer+action+by+self-tightening+knots+in+surfactant+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanical tweezer action by self-tightening knots in surfactant nanotubes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 7949-7953 (2004).</li>
<li>Karlsson, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/35051656">Networks of nanotubes and containers.</a> Nature. 409 (6817), 150(2001).</li>
<li>Wegrzyn, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protrusion+coarsening+and+nanotubulation+within+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Membrane protrusion coarsening and nanotubulation within giant unilamellar vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 133, 18046-18049 (2011).</li>
<li>Mellander, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+exocytosis+in+an+artificial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Two modes of exocytosis in an artificial cell.</a> Scientific Reports. 4, (2014).</li>
<li>Cans, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+Cells%3A+Unique+Insights+into+Exocytosis+Using+Liposomes+and+Lipid+Nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Artificial Cells: Unique Insights into Exocytosis Using Liposomes and Lipid Nanotubes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (2), 400-404 (2003).</li>
<li>Hampton, M. B., Vanags, D. M., Isabella Pörn-Ares, M., Orrenius, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+extracellular+calcium+in+phosphatidylserine+exposure+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Involvement of extracellular calcium in phosphatidylserine exposure during apoptosis.</a> FEBS Letters. 399 (3), 277-282 (1996).</li>
<li>Criado, M., Keller, B. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+membrane+fusion+strategy+for+single-channel+recordings+of+membranes+usually+non-accessible+to+patch-clamp+pipette+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">A membrane fusion strategy for single-channel recordings of membranes usually non-accessible to patch-clamp pipette electrodes.</a> FEBS Letters. 224, 172-176 (1987).</li>
<li>Duzgunes, N. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/bookseries/methods-in-enzymology/vol/464/suppl/C">Methods in Enzymology. Liposomes Part F.</a> Elsevier Science. , (2009).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).</li>
<li>Orwar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-Clamp+Detection+of+Neurotransmitters+in+Capillary+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Patch-Clamp Detection of Neurotransmitters in Capillary Electrophoresis.</a> Science. 272 (5269), 1779-1782 (1996).</li>
<li>Pevost, C., Tsai, F. C., Bassereau, P., Simunovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulling+Membrane+Nanotubes+from+Giant+Unilamellar+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56086(2017).</li>
<li>Graber, Z. T., Shi, Z., Baumgart, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cations+induce+shape+remodeling+of+negatively+charged+phospholipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Chemistry+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Cations induce shape remodeling of negatively charged phospholipid membranes.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 19 (23), 15285-15295 (2017).</li>
<li>Pezeshkian, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Shiga+Toxin+Clustering+on+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Shiga Toxin Clustering on Membranes.</a> ACS Nano. 11 (1), 314-324 (2017).</li>
<li>Angelova, M. I., Tsoneva, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+DNA+with+giant+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Physics+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Interactions of DNA with giant liposomes.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 101 (1), 123-137 (1999).</li>
<li>Liu, Y. G., Agudo-Canalejo, J., Grafmuller, A., Dimova, R., Lipowsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+Flexible+Nanotubes+Formed+by+Liquid-Ordered+and+Liquid-Disordered+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Patterns of Flexible Nanotubes Formed by Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Membranes.</a> ACS Nano. 10 (1), 463-474 (2016).</li>
<li>Stepanyants, N., Jeffries, G. D. M., Orwar, O., Jesorka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+Sizing+of+Lipid+Nanotubes+Using+Membrane+Displacement+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Radial Sizing of Lipid Nanotubes Using Membrane Displacement Analysis.</a> Nano Letters. 12 (3), 1372-1378 (2012).</li>
<li>Billerit, C., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2011/sm/c1sm05444a#!divAbstract">Heat-induced formation of single giant unilamellar vesicles.</a> Soft Matter. (20), (2011).</li>
<li>Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporary+increase+in+plasma+membrane+tension+coordinates+the+activation+of+exocytosis+and+contraction+during+cell+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (35), 14467-14472 (2011).</li>
<li>Garten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.pnas.org/content/114/2/328">Whole-GUV patch-clamping.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (2), 328-333 (2017).</li>
<li>Messina, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+and+Quantifying+the+Passive+Transport+of+Molecules+Through+Patch-Clamp+Suspended+Real+and+Model+Cell+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Monitoring and Quantifying the Passive Transport of Molecules Through Patch-Clamp Suspended Real and Model Cell Membranes.</a> Angewandte Chemie International Edition. 126 (12), 3256(2014).</li>
</ol>

Biomimetyczne systemy komórkowe pozwalają na badanie zachowania błony po ekspozycji na bodźce zewnętrzne, takie jak jony, białka lub nanocząsteczki. GUV, będąc takim modelem, może reagować na zmiany w środowisku chemicznym poprzez dostosowywanie swojego kształtu, co często wiąże się z tworzeniem struktur rurkowych i wgłębień 24,41,42,43.
W tym artykule przedstawiono podejście do generowania MTP w sposób bezkontaktowy poprzez przemodelowanie powierzchni GUV po miejscowym wstrzyknięciu jonów wapnia na powierzchnię GUV. Protokół opisuje przygotowanie kompleksu GUV-MLV, który naśladuje błonę plazmatyczną komórki, a także sposób zastosowania techniki mikroiniekcji do generowania gradientów jonów wapnia w pobliżu powierzchni GUV w celu utworzenia MTP. Większość wcześniejszych badań eksperymentalnych, które dotyczyły interakcji jonów wapnia z błoną, wystawiała pęcherzyki lipidowe na działanie masowego stężenia jonów wapnia14,17. W zależności od warunków doświadczalnych, taka masowa ekspozycja może skutkować inną reakcją błony bez tworzenia się wypukłościrurkowych 25.
Tworzenie kompleksów GUV-MLV jest dość proste i wymaga jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego, takiego jak wyparka obrotowa, łaźnia ultradźwiękowa i eksykator próżniowy. Mimo to istnieje kilka krytycznych kroków, które należy wziąć pod uwagę podczas przygotowywania pęcherzyków. Ważne jest, aby upewnić się, że odwodnienie pęcherzyków jest całkowite (podczas kroku 2.3 protokołu), a na powierzchni szkiełka nakrywkowego tworzy się suchy okrągły film lipidowy zawierający tylko niewielką ilość kryształków soli. Podczas eksperymentu staranne obchodzenie się z roztworem pęcherzykowym, przy użyciu świeżego podstawowego roztworu lipidów w chloroformie, jak również świeżego buforu HEPES, jest niezbędne do pomyślnego przygotowania kompleksów GUV-MLV. Ponadto bezpieczne przymocowanie kompleksu GUV-MLV do powierzchni ślizgu szklanej pokrywy ma kluczowe znaczenie dla mikromanipulacji i mikroiniekcji. Aby potwierdzić odpowiednią przyczepność kompleksu GUV-MLV, za pomocą mikropipety (bez przepływu iniekcyjnego) można delikatnie docisnąć do powierzchni GUV. Mocno przylegający pęcherzyk nie będzie ślizgał się po powierzchni przy bezpośrednim kontakcie fizycznym. Ponieważ doświadczenia przeprowadza się w otwartej kropelce buforowej, która może być badana przez kilka godzin, należy wziąć pod uwagę parowanie. Parowanie z kropelki buforowej zmieni warunki osmotyczne, co może wpływać na pęcherzyki i destabilizować je. Aby przywrócić warunki osmotyczne, okresowe dodawanie czystej wody do próbki w celu przywrócenia pierwotnej objętości przywraca system do homeostazy.
Podczas modyfikacji składu błony lipidowej kluczowe jest, aby pęcherzyki były wytwarzane w postaci kompleksu GUV-MLV, ponieważ MLV pozwala na przeniesienie materiału lipidowego do GUV podczas zmiany kształtu błony. Dotychczasowe badania wykazały, że zastąpienie składników mieszaniny SPE czystymi lipidami, czyli dodanie 5-30% cholesterolu, również pozwala na tworzenie kompleksu GUV-MLV 28,44. Większość przygotowanych GUV to jednolamelarne45.
Ponadto, podczas testowania innych kationów dwuwartościowych, takich jak jony magnezu, tworzenie MTP w dużym stopniu zależy od obecności ujemnie naładowanych DOPS w mieszaninie lipidów. Bez DOPS MTP nie tworzą się w pęcherzykach opisanych w tym protokole. Ponadto kationy jednowartościowe, takie jak potas i sód, nie powodują powstawania MTP, nawet w pęcherzykach zawierających DOPS25.
Oprócz krytycznych etapów związanych z przygotowaniem i manipulacją GUV, istnieje kilka ważnych czynników, które należy wziąć pod uwagę podczas procedury mikroiniekcji. Skuteczna mikroiniekcja jonów wapnia w dużej mierze zależy od prawidłowo działających szklanych mikropipet, które są przygotowywane w dniu eksperymentu. Istnieje kilka czynników, które mogą spowodować nieprawidłowe działanie mikropipety. Częstym powodem jest zatkany otwór końcówki. Małe cząsteczki lipidów, które są produktami ubocznymi preparatu pęcherzykowego, są rozproszone w roztworze i mają tendencję do przylegania do końcówki mikropipety, powodując w ten sposób zatkanie. Czyszczenie końcówki pipety najlepiej wykonać poprzez wyjęcie jej z roztworu pęcherzykowego i umieszczenie z powrotem blisko powierzchni GUV. Należy unikać korzystania z funkcji przedmuchiwania pompy do mikroiniekcji, ponieważ powoduje to masowe wstrzykiwanie jonów wapnia do roztworu masowego. Ponadto małe pęcherzyki powietrza uwięzione wewnątrz mikropipety uniemożliwiają prawidłowe wykonanie mikroiniekcji, w takim przypadku mikropipetę należy wymienić na nową. Pękanie końcówki można znacznie zminimalizować, umieszczając zestaw eksperymentalny na stole tłumiącym drgania, aby zminimalizować oscylacje końcówki.
Ponadto należy zachować ostrożność przy wyborze schematu obserwacji, aby zminimalizować fotowybielanie przy jednoczesnym uzyskaniu najlepszych obrazów w czasie. W tym protokole wykorzystano szerokokątną laserową mikroskopię fluorescencyjną, ponieważ pozwala ona na stosunkowo wysoką szybkość akwizycji obrazu przy obiektywnie ograniczonej głębokości sondy. Ponadto zastosowanie mikroskopii odwróconej pozwala na jednoczesną mikroiniekcję i obserwację pęcherzyków lipidowych i MTP.
Jednym z głównych ograniczeń prezentowanej metody jest wymóg rozległej pracy manualnej i wystarczających umiejętności mikromanipulacji. Ponieważ kompleksy powstają w wyniku spontanicznego procesu pęcznienia, nie można kontrolować wielkości GUV i MLV. Dodatkowo protokół ten nie pozwala na kontrolę napięcia błony przygotowanych kompleksów GUV-MLV, co może być konieczne do zebrania dodatkowych szczegółów dotyczących przebudowy błony. GUV są połączone z MLV, przy czym te ostatnie dostarczają materiał lipidowy do znacznego wzrostu MTP w stopniu, który byłby niemożliwy do osiągnięcia wyłącznie przy użyciu membrany dostępnej w GUV. MLV przyczyniają się również do obniżenia wszelkich bocznych zmian napięcia powierzchniowego w kompleksie GUV-MLV44, co skomplikowałoby próby kontrolowania napięcia pęcherzyka za pomocą aspiracji mikropipetami. Ten model oparty na GUV-MLV zapewnia niższe napięcie, które lepiej naśladuje reżimy napięcia występujące w strukturach błony komórkowej połączonych z rezerwuarami błonowymi, takich jak fałdy błonowe i wgłębienia46. Jednocześnie technika aspiracji mikropipet może być z powodzeniem stosowana do kontrolowania naprężenia membrany w pojedynczych GUV. Na przykład praca Grabera i wsp. dostarczyła szczegółowych informacji na temat tworzenia się wgłębień rurkowych błony w pojedynczych GUV po związaniu jonów wapnia z błoną w warunkach masowych z różnych reżimów napięcia40. Wreszcie, porównanie zachowania membrany zarówno przy miejscowym, jak i masowym narażeniu na wapń wymaga lepszej kontroli przylegania membrany do powierzchni, co wykracza poza zakres tego protokołu.
Podsumowując, proponowana technika pozwala na bezkontaktową przebudowę błony i tworzenie MTP po miejscowej stymulacji jonami wapnia. Przyszłe zastosowania tej metody koncentrują się na translacji z syntetycznych systemów pęcherzykowych na natywne błony biologiczne, takie jak pęcherzyki komórkowe. Proponowana metoda może być łączona z innymi schematami przesłuchań pojedynczych komórek, takimi jak amperometria patch-clamp lub mikroelektroda, lub w połączeniu z miejscowymi strategiami ogrzewania 31,47,48. Testowanie działania innych jonów lub cząsteczek jest proste i polega po prostu na zastąpieniu jonów wapnia interesującymi nas cząsteczkami. Co więcej, złożone syntetyczne pęcherzyki lipidowe mogą być wytwarzane poprzez funkcjonalizację błony białkami transbłonowymi, co może poszerzyć naszą wiedzę na temat biofizyki przekształcania komórek i dynamiki błony komórkowej związanej z wykrywaniem lokalnych gradientów chemicznych. Wreszcie, co nie mniej ważne, bezdotykową stymulację błony lipidowej można również przełożyć na polimerowe systemy miękkiej materii, oferując podstawę dla nowatorskiej platformy do manipulacji bezdotykowej.

Rola jonów wapnia w procesach biologicznych, szczególnie ich udział w sygnalizacji, podziale komórek i fuzji błonowej, jest przedmiotem wielu badań mechanistycznych1. Stężenie wewnątrzkomórkowych cytoplazmatycznych jonów wapnia jest rzędu 100 nM, podczas gdy wapń w organellach, takich jak retikulum endoplazmatyczne, pęcherzyki wydzielnicze i mitochondria, osiąga poziomy do kilkudziesięciu milimoli w stężeniu. Powoduje to stromy gradient stężenia jonów wapnia o rzędy wielkości w poprzek błon wewnątrzkomórkowych2,3,4,5,6,7,8,9. Zewnątrzkomórkowy poziom jonów wapnia wynosi około 2 mM, a zatem zmiany stężenia jonów wapnia występują zarówno na poziomie zewnątrzkomórkowym, jak i wewnątrzkomórkowym. Co więcej, ostatnie badania dostarczają dowodów na to, że wewnątrzkomórkowe zdarzenia sygnalizacyjne jonów wapnia i aktywność neuronalna mogą występować w warunkach lokalnych wahań stężeń zewnątrzkomórkowych jonów wapnia, co wskazuje na znaczenie zsynchronizowanych wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych zmian jonów wapnia<klasa sup = "xref">10.
Dążąc do zrozumienia wzajemnych oddziaływań między jonami wapnia a błonami biologicznymi, z powodzeniem wdrożono syntetyczne podejście, w którym natywne błony komórkowe są zastępowane dwuwarstwowymi pęcherzykami lipidowymi. Wystawienie pęcherzyków na działanie roztworów jonów wapnia prowadzi do zmian w grupach lipidowych i upakowaniu łańcuchów węglowodorowych, zwiększonego napięcia błony i agregacji pęcherzyków, a także segregacji lipidów i przejścia fazowego błony11,12,13,14,15,16. Właściwości błon lipidowych po ekspozycji na jony wapnia zostały zbadane przy użyciu takich technik eksperymentalnych, jak promieniowanie rentgenowskie, 1H-NMR oraz badania spektroskopowe lub termodynamiczne11,16,17,18. W tych badaniach skład błony jest często dostrojony tak, aby przypominał natywne błony komórkowe i zawiera takie fizjologiczne lipidy, jak fosfatydylocholina (PC), fosfatydyloetanoloamina (PE) i fosfatydyloseryna (PS). PS jest szczególnie ważny w przygotowaniu sztucznych pęcherzyków, ponieważ jest niezbędnym składnikiem w wielu procesach komórkowych, w tym w transporcie błon wewnątrzkomórkowych, egzocytozie i apoptozie19,20.
Rozmiar syntetyzowanych pęcherzyków lipidowych często waha się od nanometrów do kilku mikrometrów. Wśród różnych preparatów pęcherzykowych szczególne znaczenie mają gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUV), które mają średnicę od kilku do kilkudziesięciu mikrometrów, ze względu na ich stosunkowo duże rozmiary, bardzo zbliżone do wymiarów poszczególnych komórek21,22,23. Dostępna powierzchnia GUV umożliwia zbadanie wpływu lokalnych gradientów chemicznych na właściwości biofizyczne membrany. Wystawiając tylko część powierzchni błony na bodźce zewnętrzne, można dokładniej zbadać dynamikę błony. Na przykład wykazano, że miejscowe stosowanie gradientów chemicznych lub pH na powierzchni GUV prowadzi do powstawania rurkowatych wypukłości, których nie zaobserwowano przy ekspozycji masowej24,25. Zaobserwowane różnice w zachowaniu błony wymagają dalszego rozwoju metod badania pojedynczych pęcherzyków, aby uzyskać wgląd w mechanizmy przebudowy błony komórkowej.
Opierając się na metodach mikroiniekcji i mikromanipulacji z początku XX wieku26,27, w związku z nowszymi osiągnięciami schematów manipulacji pojedynczymi pęcherzykami z lat 200023,28, ten artykuł przedstawia podejście, w którym remodeling membrany i tworzenie wypukłości rurkowych błony (MTP) w membranie GUV są generowane w odpowiedź na miejscowe stosowanie jonów wapnia.
Nasze podejście wykorzystuje kompleks pęcherzyków składający się z GUV połączonego z wieloblaszkowym pęcherzykiem (MLV) jako biomimetyczny model błony (Rysunek 1A). MLV jest wymagany jako rezerwuar lipidów dla kompleksu do dostarczania materiału lipidowego do GUV podczas ekspozycji na gradient jonów wapnia. To połączenie pozwala kompleksowi kompensować wzrost napięcia błony podczas indukowanej przebudowy i zmiany kształtu błony GUV oraz dostarczać lipidów do wzrostu MTP. Ponadto MLV ułatwia unieruchomienie powierzchni, ponieważ jego masa jest większa w porównaniu z GUV. Kompleksy GUV-MLV, po unieruchomieniu na podłożu stałym, były wcześniej używane do wytwarzania sieci nanorurkowo-pęcherzykowych, badania interakcji polimer-błona i naśladowania późnych etapów egzocytozy29,30,31,32,33.
Poprzednie protokoły wykorzystywały ekstrakt z polarnego lipidu sojowego (SPE) do przygotowania kompleksów GUV-MLV28. SPE składa się z mieszaniny fosfolipidów, które obejmują PC (45,7%), PE (22,1%), fosfatydyloinozytol (PI, 18,4%), kwas fosfatydowy (PA, 6,9%) i mieszaninę innych lipidów (6,9%). W naszym protokole mieszanina SPE jest domieszkowana 20% 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfo-L-seryną (sól sodowa) (DOPS) w celu naśladowania wewnętrznej ulotki błony komórkowej. Dodatkowy 1% ATTO 488-1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy (ATTO488-DOPE) jest używany do barwienia dwuwarstwy lipidowej, aby umożliwić monitorowanie przebudowy błony za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. GUV mają symetryczny skład lipidowy w całej dwuwarstwie i są lokalnie wystawione na działanie stężeń chlorku wapnia 5 mM (CaCl2). Takie warunki eksperymentalne, z podwyższonym stężeniem jonów wapnia, naśladują również zewnętrzną błonę komórkową komórek apoptotycznych, w której cząsteczki PS ulegają ekspresji34. Powstawanie kompleksów GUV-MLV wymaga zastosowania zmodyfikowanej metody hydratacji-odwodnienia, pierwotnie opracowanej przez Criado i Keller35. Protokół przygotowania pęcherzyków obejmuje utworzenie suchej warstwy lipidowej, która jest następnie wykorzystywana do tworzenia małych pęcherzyków w roztworze. Roztwór ten jest następnie odwadniany i ponownie nawadniany, aby utworzyć końcowe kompleksy GUV-MLV. Rysunek 2A-D ilustruje główne etapy przygotowania typowego kompleksu GUV-MLV.
Po zakończeniu przygotowania pęcherzyków i unieruchomieniu kompleksu pęcherzyków na szklanym podłożu, stosuje się technikę mikroiniekcji, aby dostarczyć małe ilości jonów wapnia do zewnętrznej ulotki GUV za pomocą szklanej mikropipety z otwartą końcówką. Przepływ roztworu wapnia z końcówki generuje miejscowy gradient jonów wapnia na powierzchni membrany GUV, co prowadzi do przebudowy błony i generowania MTP. MTP są zorientowane z dala od źródła jonów wapnia i rosną wewnątrz GUV. To powstawanie MTP może być bezpośrednio monitorowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i rejestrowane za pomocą kamery cyfrowej. Rysunek 3 pokazuje eksperymentalną konfigurację użytą do przeprowadzenia przebudowy membrany. Tworzenie MTP (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E i <silna klasa="xfig">Rysunek 4) w tym protokole pokazuje kontrastujący wynik z eksperymentami z ekspozycją na jony wapnia przeprowadzone w warunkach objętości masowej. W warunkach masowych GUV pękają i tworzą łaty membrany, które można zaobserwować, aby przylegały do powierzchni szkła25.
Więcej szczegółów na temat tworzenia kompleksów GUV-MLV, jak również procedury wykonywania mikroiniekcji jonów wapnia, są wyjaśnione w tym artykule. Protokoły w dużej mierze koncentrują się na mikroiniekcji jonów wapnia; Jednak podejście to można łatwo zmodyfikować do wykorzystania w badaniu reakcji błony spowodowanej lokalną ekspozycją na inne jony lub białka. Dodatkowo skład pęcherzyków można dostosować, aby wyizolować role składników lipidowych w procesie przebudowy błony. Prezentowany protokół nie wymaga żadnego wyrafinowanego sprzętu do produkcji kompleksów GUV-MLV i charakteryzuje się wysokim stopniem odtwarzalności.

<table><tbody><tr><td>Ekstrakt lipidowy z nasion soi</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)</td><td>541602C</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfo-L-seryna (sól sodowa) DOPS</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)</td><td>840035C</td><td>1x25 mg</td></tr><tr><td>ATTO 488- 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina (DOPE)</td><td>ATTO-TEC (Niemcy)</td><td>AD 488-31</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>Hamilton&nbsp; strzykawka, seria 700, stała igła, 702N, pojemność 25&nbsp; &mu; L, nr igły 22s ga (końcówka skośna), igła L 51&nbsp; mm (2&nbsp; w.)</td><td>Sigma Aldrich (Missouri, Stany Zjednoczone)</td><td>20735&nbsp; SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex Tube, kultura, jednorazowe, bez oprawek, 10x75 mm, szkło borokrzemianowe 250/opakowanie</td><td>Corning Incorporated (Corning, NY 14831)</td><td>99445-10</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform&nbsp; CHROMASOLV&nbsp; Dodatkowo, dla HPLC, &ge; 99,9%, zawiera amyleny jako stabilizator</td><td>Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td><td>650498-1L-D</td><td></td></tr><tr><td>Parownik obrotowy</td><td>B&uuml; Chi Rotavapor R-144 Szwajcaria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mm</td><td>KEBO lab (Szwecja)</td><td>MA00360500</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik sześciowodny chlorku magnezu klasy ACS, ISO</td><td>Sharlau Chemie S.A. (Hiszpania)</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu, SigmaUltra, minimum 99.0%</td><td>Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu, SigmaUltra, minimum 99,5%</td><td>Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td><td>G5516-1L</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol, do biologii molekularnej, minimum 99%</td><td>Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td><td>T-1503 2050 g</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td><td>P5629-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu trójzasadowy (K3PO4)</td><td>Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)</td><td>Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td><td>5886</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merck (USA)</td><td>34549-100 g</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td><td>H0887 Sigma&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rozwiązanie HEPES 1&nbsp; M, pH 7,0-7,6, sterylnie filtrowany, BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych</td><td>Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td><td>Z260282-1PAK</td><td>24x60 mm</td></tr><tr><td>Acrodisc&nbsp; filtry strzykawkowe,&nbsp; Membrana PVDF, średnica 13&nbsp; mm, wielkość porów 0,2&nbsp; &mu; m</td><td>Sigma Aldrich (Missouri, Stany Zjednoczone)</td><td>631-1339&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Menzel Gl&auml; zer #1, szkiełko nakrywkowe</td><td>VWR (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membranowa pompa próżniowa do eksykatora</td><td>Vacuubrand (Niemcy)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel ultradźwiękowa</td><td>Bandelin Sonolex (Niemcy)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VX-100 Laboratoryjny mieszalnik wirowy</td><td>Labnet International (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Linia laserowa 488 nm&nbsp;</td><td>Cobolt MLD-488 nm (Solna, Szwecja)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Microsystems&nbsp; olejek immersyjny do mikroskopów</td><td>Leica (Niemcy)</td><td>12847995&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>System odwróconej mikroskopii fluorescencyjnej&nbsp;</td><td>Leica DM IRB (Wetzlar, Niemcy)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aparat fotograficzny (Prosilica ex 1920, Allied Vision)</td><td>Technologies GmbH (Turyngia, Niemcy)</td><td>300038</td><td></td></tr><tr><td>PatchStar Micromanipulator</td><td>Scientifica (Uckfield, Wielka Brytania)</td><td>612-7933</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego, GC100TF-10,&nbsp; 1,00 mm średnica zewnętrzna X 0,78 mm średnica wewnętrzna&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus Wielka Brytania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroładowarka Eppendorf (końcówki do pipet)</td><td>VWR (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz laserowy CO2 P-2000&nbsp;</td><td>Sutter Instruments (Novato, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatyczna pompa wtryskowa Femtolitr, Eppendorf Femtojet</td><td>Eppendorf (Niemcy)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przebudowa błony gigantycznych pęcherzyków w odpowiedzi na zlokalizowane gradienty jonów wapnia

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

W wielu podstawowych procesach komórkowych, takich jak transport błonowy i apoptoza, zmiany kształtu błony komórkowej występują równolegle z lokalnymi zmianami stężenia jonów wapnia. Zidentyfikowano główne składniki molekularne biorące udział w tych procesach; Jednak specyficzne oddziaływanie między gradientami jonów wapnia a lipidami w błonie komórkowej jest znacznie mniej znane, głównie ze względu na złożoną naturę komórek biologicznych i trudności schematów obserwacji. Aby wypełnić tę lukę, z powodzeniem wdrożono podejście syntetyczne, aby ujawnić miejscowy wpływ jonów wapnia na mimikę błony komórkowej. Ustalenie mimiki, która przypominałaby warunki panujące w komórce, jest kilkukrotnym problemem. Po pierwsze, wymagany jest odpowiedni model biomimetyczny o odpowiednich wymiarach i składzie błony, aby uchwycić właściwości fizyczne komórek. Po drugie, potrzebna jest konfiguracja do mikromanipulacji, aby dostarczyć niewielką ilość jonów wapnia do określonego miejsca membrany. Wreszcie, wymagany jest schemat obserwacji, aby wykryć i zarejestrować reakcję błony lipidowej na stymulację zewnętrzną. W artykule przedstawiono szczegółowe podejście biomimetyczne do badania interakcji jonów wapnia z błoną, w której system pęcherzyków lipidowych, składający się z gigantycznego pęcherzyka jednowarstwowego (GUV) połączonego z pęcherzykiem wielopłytkowym (MLV), jest wystawiony na działanie zlokalizowanego gradientu wapnia utworzonego za pomocą systemu mikroiniekcji. Dynamikę wpływu jonów na błonę obserwowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i rejestrowano z szybkością klatek wideo. W wyniku stymulacji membrany wewnątrz GUV utworzyły się wysoce zakrzywione wypukłości rurkowe membrany (MTP), zorientowane od membrany. Opisane podejście indukuje przebudowę błony lipidowej i produkcję MTP w całkowicie bezkontaktowy i kontrolowany sposób. Podejście to wprowadza sposób na zajęcie się szczegółami interakcji jonów wapnia z błoną, zapewniając nowe możliwości badania mechanizmów przekształcania błony komórkowej.

W niniejszej pracy demonstrujemy tworzenie kompleksów GUV-MLV oraz sposób ich wykorzystania do wyjaśnienia wpływu gradientów jonów wapnia na dynamikę błony komórkowej. W eksperymentach tych wymagane są kompleksy GUV-MLV przytwierdzone do powierzchni, co pozwala na zastosowanie stałego modelu o rozmiarach komórki przy jednoczesnym wytworzeniu gradientu jonów poprzez mikroiniekcję. Błona GUV reaguje na lokalne stężenie wapnia poprzez tworzenie MTP skierowanych w stronę przeciwną do źródła jonów wapnia. Co więcej, MTP mogą być przemieszczane wokół GUV w sposób bezkontaktowy poprzez przesuwanie końcówki mikropipety wokół powierzchni błony.
Schematyczny rysunek procedury przygotowania GUV-MLV przedstawiono na Rysunku 2. Chociaż w przedstawionym protokole kompleksy GUV-MLV są już wstępnie uformowane podczas kroku 2.4 (Rysunek 2C), przeniesienie roztworu pęcherzyków do drugiej kropli buforu o objętości 300 µL (krok 2.6 protokołu) pozwala rzadko uformowanym kompleksom GUV-MLV na wystarczające przyleganie do szklanego podłoża. W ten sposób powstaje odpowiedni kompleks do mikromanipulacji i mikroiniekcji (Rysunek 2D). Okazyjnie GUV zawierają jeden lub kilka uwięzionych pęcherzyków lipidowych, co nie wpływa na tworzenie MTP, jak pokazano na Rysunku 4A. Te GUV wytwarzają MTP; jednakże obrazowanie może być utrudnione, jeśli uwięzione pęcherzyki są duże. Większość przygotowanych GUV (do 75%) ma kształt półkolisty i jest przyłączona do MLV, co pokazano na Rysunku 1A. Pęcherzyki te są głównym przedmiotem tego protokołu i nadają się do procedury mikroiniekcji. Około 25% pozostałych GUV ma charakter falisty (Rysunek 1B), co wskazuje na niższy reżim napięcia błony. Te faliste pęcherzyki również umożliwiają tworzenie wypustek rurkowych; wykazują one jednak inną kinetykę i inną morfologię utworzonych MTP, co wykracza poza zakres niniejszego protokołu25. Typowa średnica przygotowanych pęcherzyków waha się od 2 do 15 µm dla MLV oraz od 2 do 40 µm dla GUV. Optymalny rozmiar GUV do ekspozycji na jony wapnia to 5 µm lub więcej.
Mikropipety są wykorzystywane od kilku dekad w schematach badania pojedynczych komórek, a także w procedurach wymagających manipulacji syntetycznymi GUV37,38. Większość tych zastosowań wiązała się z bezpośrednim kontaktem fizycznym między mikropipetą a powierzchnią komórek lub pęcherzyków. Przykłady obejmują technikę patch-clamp lub wyciąganie teter membranowych z membrany GUV, a także budowanie sieci nanotubule-pęcherzyk23,28,39. Niedawno mikropipety zaczęto stosować również do generowania lokalnych gradientów jonów i cząsteczek wokół GUV w celu rekonstrukcji heterogenicznych mikrośrodowisk komórkowych24,25. W przedstawionym protokole prawidłowo funkcjonująca mikropipeta (Rysunek 5A) jest kluczowym czynnikiem dla ustanowienia gradientu jonów wapnia na powierzchni GUV poprzez uwalnianie zawartego w niej roztworu. Prawidłowe ustawienie mikropipety przy powierzchni GUV oraz unikanie kontaktu z membraną lipidową są niezbędne do pomyślnej mikroiniekcji. Końcówka mikropipety jest utrzymywana w odległości około 3 µm od powierzchni GUV, co jest optymalną odległością do generowania MTP przy jednoczesnym naśladowaniu wahań stężenia wapnia w pobliżu membrany komórkowej. Jeśli końcówka mikropipety zostanie przypadkowo uszkodzona (Rysunek 5B), konieczna jest jej wymiana. Wcześniej przetestowany zakres stężeń CaCl2 wewnątrz mikropipety, który umożliwia tworzenie MTP, wynosi od 2 do 5 mM25, co odpowiada pozakomórkowym stężeniom wapnia. Przy niższych stężeniach CaCl2 , i.e., 1 mM, nie obserwuje się MTP.
Tworzenie się MTP po mikroiniekcji wapnia rozpoczyna się od formowania małych wywrotów błonowych, które rozrastają się w MTP w miejscu ekspozycji (Rycina 4B). MTP nadal rosną, dopóki błona GUV pozostaje narażona na działanie jonów wapnia. Fluktuują one i są skierowane w stronę przeciwną do źródła jonów wapnia (Rycina 4C, Film uzupełniający 1). Po zaprzestaniu dostarczania jonów wapnia MTP rozpraszają się po powierzchni GUV, co utrudnia rozstrzygnięcie, czy MTP utrzymują się, czy ostatecznie znikają.
Powstawanie MTP można wyjaśnić lokalnym wiązaniem jonów wapnia z odsłoniętą zewnętrzną warstwą błony GUV i wywołaniem spontanicznej krzywizny (m), która jest bezpośrednio powiązana z powstaniem spontanicznego napięcia σ = 2κm2 (κ to sztywność na zginanie), co indukuje zginanie błony i tworzenie wewnątrzkomórkowych MTP. Wcześniejsze doniesienia wykazały, że deformację błony można wyjaśnić kondensacją i/lub klastrowaniem ujemnie naładowanych lipidów po związaniu jonów wapnia z błoną, co skutkuje ujemną spontaniczną krzywizną40. Alternatywnie, silne wiązanie Ca2+ z powierzchnią ujemnie naładowanej dwuwarstwy neutralizuje gęstość ładunku powierzchniowego odsłoniętej warstwy lipidowej. Prowadzi to do różnicy gęstości ładunku w obrębie dwuwarstwy, co skutkuje niezerową spontaniczną krzywizną, wystarczającą do zgięcia błony25.
Obserwowany proces tworzenia MTP wykazuje wrażliwość błon lipidowych na jony wapnia i oferuje nowatorską, bezkontaktową metodę wytwarzania cewkowatych struktur błonowych. Wyjaśnienie mechanizmu powstawania tych cewek może mieć istotne znaczenie dla zrozumienia dynamiki zmian kształtu błon podczas różnych funkcji komórkowych oraz procesów przebudowy komórki, a także pomóc w uzyskaniu wiedzy na temat organizacji lipidów w błonach komórkowych.
Zaobserwowane MTP są zawsze generowane w miejscu na membranie poddanym działaniu jonów wapnia. Dzięki temu, poprzez wybór położenia końcówki mikropipety, możliwe jest zdefiniowanie obszaru powierzchni GUV, w którym nastąpi wzrost wypustki. Następnie, jeśli mikropipeta jest powoli (0,1-0,3 µm/s) przesuwana wzdłuż powierzchni GUV, przy zachowaniu odległości od membrany, MTP przemieszczają się wraz z mikropipetą. Rysunek 6 oraz odpowiadający mu Film uzupełniający 2 demonstrują taką migrację MTP po powierzchni GUV. Proces ten jest prawdopodobnie któremu towarzyszy tworzenie nowych MTP podczas ciągłego wstrzykiwania jonów wapnia25. Przy wysokich prędkościach przesunięcia (powyżej 0,7 µm/s) MTP nie są w stanie nadążyć za końcówką mikropipety. Zamiast tego, w nowym położeniu końcówki mikropipety powstają nowe wypustki (Rysunek 7).
Obserwowany bezkontaktowy transport MTP sterowany jonami wapnia wokół powierzchni GUV może poszerzyć naszą wiedzę na temat sił napędzających dynamikę cewkowatych struktur błonowych wewnątrz komórek. Co więcej, podejście to oferuje nowatorski, bezkontaktowy sposób kontrolowania transportu materiałów w systemach materii miękkiej z wykorzystaniem gradientów chemicznych.
<img alt="Schemat oddziaływania GUV i MLV przedstawiający proces fuzji pęcherzyków." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Reprezentatywne obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej kompleksów GUV-MLV unieruchomionych na powierzchni szklanego szkiełka podstawowego. (A). Przykład sferycznego GUV. GUV występuje w formie półsfery przytwierdzonej do MLV. (B). Przykład falistego GUV. Czarne strzałki wskazują zdeformowane obszary błony. Obrazy zostały wzmocnione i odwrócone w celu poprawy wizualizacji znakowanych fluorescencyjnie błon GUV. Pasek skali reprezentuje 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces tworzenia pęcherzyków; sonikacja, rehydratacja; schemat kompleksu GUV-MLV; wapń z mikropipety." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schematy przygotowania GUV-MLV oraz schematy mikrowstrzykiwania. (A). Sucha warstwa lipidów tworzy się na dnie szklanej fiolki w wyniku odparowania rotacyjnego chloroformu z roztworu lipidów. (B). Rehydratowana warstwa lipidów jest poddawana sonikacji, w wyniku czego powstają małe pęcherzyki lipidowe. (C). Mała kropla roztworu pęcherzyków (5 µL) jest umieszczana na powierzchni szklanego szkiełka podstawowego i przenoszona do eksykatora na 20 min w celu odwodnienia roztworu lipidów i utworzenia suchej błony lipidowej (krok ten nie jest pokazany). Rehydratacja suchej błony lipidowej za pomocą 50 µL roztworu buforowego prowadzi do powstania wstępnie uformowanych kompleksów GUV-MLV. (D). Przeniesienie wstępnie uformowanych kompleksów do większej objętości buforu skutkuje powstaniem rzadko rozmieszczonych GUV-MLV przytwierdzonych do powierzchni szklanego szkiełka podstawowego. (E). Umieszczenie mikropipety w pobliżu powierzchni GUV i uwolnienie jonów wapnia inicjuje tworzenie MTP. Ilustracje nie są narysowane w skali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Układ optycznej mikroskopii fluorescencyjnej z mikromanipulatorem i systemem mikroiniekcji do analizy komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Układ doświadczalny do mikroiniekcji jonów wapnia. (A). Komponenty układu doświadczalnego niezbędne do generowania MTP w GUV. (B). Szczegóły układu do mikroiniekcji. Szklana lamelka z roztworem kompleksów GUV-MLV umieszczona na stoliku mikroskopu. Kąt między mikropipetą a powierzchnią szklanej lamelki wynosi 30° (zaznaczony na biało). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Sekwencja oddziaływań GUV-MLV; eksperyment mikroskopowy; obserwacja fuzji błon; pokreślone w czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Tworzenie się MTP po mikroiniekcji jonów wapnia na powierzchni GUV. (A). Kompleks GUV-MLV przed wystawieniem na gradient jonów wapnia. Strzałka wskazuje pęcherzyk lipidowy uwięziony wewnątrz GUV, który nie utrudnia obserwacji MTP. (B). Małe MTP tworzą się po mikroiniekcji jonów wapnia (stężenie 5 mM CaCl2 w mikropipecie). (C). Wzrost MTP podczas ciągłej ekspozycji na jony wapnia. Obrazy fluorescencyjne zostały wzmocnione i odwrócone w celu lepszej wizualizacji. Pasek skali reprezentuje 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz mikropipety przedstawiający wzory przepływu cieczy; eksperyment mikroskopowy badający działanie kapilarne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Szklane mikropipety używane do mikroiniekcji jonów wapnia. (A). Przykład prawidłowo działającej mikropipety. (B). Przykład mikropipety z uszkodzoną końcówką (obszar uszkodzenia wskazano czarną strzałką). Oba obrazy zostały wzmocnione i odwrócone w celu lepszej wizualizacji. Pasek skali reprezentuje 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Sekwencja fuzji GUV i MLV, mikroskopia time-lapse, oddziaływanie lipidów, analiza dynamiki błon." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Sterowana jonami wapnia translacja MTP wokół powierzchni GUV. (A). MTP tworzą się na powierzchni GUV po mikroiniekcji roztworu 5 mM CaCl2. (B-C). Translacja końcówki mikropipety (0,2-0,3 μm/s) wokół powierzchni błony wywołuje ruch MTP w kierunku źródła jonów wapnia. Czarne strzałki wskazują kierunek ruchu mikropipety. Obrazy zostały poddane wzmocnieniu i inwersji w celu lepszej wizualizacji błony. Pasek skali odpowiada 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Sekwencja mikroskopii poklatkowej fuzji błon w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych (GUVs)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: MTP przy wysokiej prędkości translacji końcówki mikropipety. (A). MTP formują się na powierzchni GUV po mikroiniekcji roztworu 5 mM CaCl2 (biała linia). (B-C). Wysoka prędkość translacji mikropipety wokół powierzchni GUV (1 μm/s) skutkuje formowaniem nowych MTP w nowej lokalizacji końcówki mikropipety (magenta linia), a także rozproszeniem wcześniej utworzonych MTP (biała linia). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat efektu cieniowania w równowadze statycznej, ilustrujący wzorce absorpcji światła i wzbudzenia optycznego." src="/files/ftp_upload/57789/57789mov1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Film 1"> 
Film uzupełniający 1: Tworzenie się MTP w GUV pod wpływem miejscowej ekspozycji na gradient Ca2+ . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/Lobovkina_Movie_1.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
<img alt="Równowaga statyczna, ΣFx=0, diagram przedstawiający rozkład sił, analiza koncepcji fizyki mechanicznej." src="/files/ftp_upload/57789/57789mov2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Film 2"> 
Dodatkowy film 2: Migracja MTP sterowana jonami wapnia wokół powierzchni GUV.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/Lobovkina_Movie_2.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>

Prezentujemy technikę bezdotykowej mikromanipulacji pęcherzykami, wykorzystując zlokalizowane gradienty jonów wapnia. Mikroiniekcja roztworu jonów wapnia w pobliżu gigantycznego pęcherzyka lipidowego jest wykorzystywana do przebudowy błony lipidowej, w wyniku czego powstają wypukłości rurki błonowe.

Przebudowa błony gigantycznych pęcherzyków w odpowiedzi na zlokalizowane gradienty jonów wapnia

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

Przedstawiamy technikę manipulacji gigantycznymi pęcherzykami z wykorzystaniem zlokalizowanych gradientów jonów wapnia. Główną zaletą tej techniki jest całkowicie bezdotykowa stymulacja powierzchni pęcherzyka i bezpośrednia wizualizacja przebudowy błony lipidowej po interakcji z jonami wapnia. Nasze podejście wprowadza sposób na zajęcie się szczegółami interakcji błony jonowej wapnia, zapewniając nowe miejsca do badania mechanizmów przekształcania błony komórkowej po zmianach w mikrośrodowisku komórki.Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj roztwór lipidów w chloroformie. Końcowe stężenie lipidów w chloroformie wynosi jeden miligram na mililitr, a końcowa masa to 0,6 miligrama. Owinąć szklaną fiolkę zawierającą mieszaninę lipidów folią metalową w celu ochrony zawartości przed światłem otoczenia.Umieścić owinięta w metalową folię fiolkę z próbką w szklanej zlewce. Aby usunąć chloroform, należy odparować rozpuszczalnik w wyparce obrotowej przez trzy godziny pod ciśnieniem dochodzącym do siedmiu kilopaskali próżni przy 80 obr./min. Po odparowaniu na dnie szklanej fiolki tworzy się suchy film lipidowy.Powoli dodaj 600 mikrolitrów buforowanego fosforanem roztworu soli na wysuszony film lipidowy. Po dodaniu buforu delikatnie dodaj sześć mikrolitrów glicerolu, aby chronić próbkę przed całkowitym odwodnieniem podczas tworzenia gigantycznego pęcherzyka jednopłytkowego połączonego z pęcherzykiem wielopłytkowym lub GUV-MLV. Uszczelnić szklaną fiolkę za pomocą Parafilm.I przykryj metalową folią, aby chronić przed światłem otoczenia. Przechowywać fiolkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia należy poddać sonikacji szklanej fiolki zawierającej roztwór przez jedną minutę przy użyciu kąpieli ultradźwiękowej w temperaturze pokojowej.Usuń Parafilm i pipetuj pipetą, aż utworzy się wizualnie jednolity roztwór małych pęcherzyków lipidowych. Porcję 30 mikrolitrów otrzymanego roztworu małych pęcherzyków lipidowych do pojedynczych 0,5 mililitrowych plastikowych probówek. Rozmrozić plastikową probówkę zawierającą podwielokrotność zamrożonej zawiesiny małych pęcherzyków lipidowych w temperaturze pokojowej.Wiruj rurkę cztery razy przez jedną do dwóch sekund za pomocą miksera wirowego z maksymalną prędkością. Umieścić pięć mikrolitrów zawiesiny małych pęcherzyków lipidowych na powierzchni szklanego szkiełka nakrywkowego, aby utworzyć małą, okrągłą kroplę. Użyj szklanego szkiełka nakrywkowego bez żadnych czynności związanych z czyszczeniem wstępnym.Teraz umieść szklane szkiełko nakrywkowe w eksykatorze próżniowym na 20 minut. Wysuszony film lipidowy należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez cztery minuty. Następnie powoli odpipetuj 50 mikrolitrów 10-milimolowego buforu HEPES na suchy film lipidowy w celu nawodnienia.Odczekaj pięć minut, aby wstępnie uformować kompleksy GUV-MLV. Wyśrodkuj szklane szkiełko nakrywkowe na stoliku mikroskopu. Następnie należy odpipetować na nim 300 mikrolitrów buforu HEPES i umieścić środek kropli nad obiektywem.Przenieść 50 mikrolitrów wstępnie uformowanego roztworu GUV-MLV do roztworu HEPES. Odczekaj 25 minut, aby słabo uformowane kompleksy GUV-MLV mocno przylegały do powierzchni szklanego szkiełka nakrywkowego. Zaokrąglij krawędzie kapilar ze szkła borokrzemianowego, delikatnie umieszczając końce kapilary w płomieniu świecy, aby zapobiec pęknięciu mikropipety podczas mocowania jej do uchwytu mikropipety.Pociągnij co najmniej trzy szklane kapilary za pomocą automatycznego ściągacza laserowego. Użyj kapilar ze szkła borokrzemianowego, o których mowa w tekście, aby uzyskać mikropipetę z otworem końcówki o średnicy około 0,3 mikrona. Aby uniknąć zatkania końcówki pipety, przed użyciem przefiltruj pięciomilimolowy roztwór chlorku wapnia w roztworze buforowym HEPES za pomocą filtra strzykawkowego o wielkości od 0,2 do 0,5 mikrona.Następnie napełnij każdą mikropipetę ośmioma mikrolitrami roztworu chlorku wapnia za pomocą mikroładowarki. Podłączyć uchwyt do mikropipet do mikromanipulatora. Zamontuj mikropipetę w uchwycie mikropipety.Następnie podłączyć pompę wtryskową i uchwyt kapilarny za pomocą rurki zasilającej. Po uruchomieniu pompy iniekcyjnej należy dostosować ustawienia pompy iniekcyjnej do ciśnienia wtrysku 20 hektopaskalów. Ustaw również ciśnienie kompensacyjne na pięć hektopaskalów.Ustaw mikroskop w trybie jasnego pola. Skonfiguruj go pod kątem różnicowego kontrastu interferencyjnego. Za pomocą mikromanipulatora zgrubnego umieścić mikropipetę nad kroplą zawierającą kompleksy GUV-MLV.Umieść końcówkę mikropipety nad obiektywem i przyłóż pipetę do kropli za pomocą mikromanipulatora zgrubnego. Ustaw mikroskop w trybie fluorescencji. Umieść końcówkę mikropipety w odległości trzech mikronów od powierzchni membrany, jednocześnie wstrzykując roztwór chlorku wapnia z mikropipety, aby umożliwić utworzenie MTP.Aby przesunąć MTPS wzdłuż powierzchni GUV, powoli przesuwaj końcówkę pipety po powierzchni GUV za pomocą precyzyjnego mikromanipulatora. Zachowaj mniej więcej taką samą odległość między powierzchnią GUV a końcówką mikropipety, kontynuując wstrzykiwanie jonów wapnia. Aby zatrzymać mikroiniekcję, należy wyłączyć pompę wtryskową.Reprezentatywny obraz z mikroskopii fluorescencyjnej kompleksu GUV-MLV unieruchomionego na powierzchni szklanego szkiełka nakrywkowego jest pokazany tutaj. Na tych obrazach można zobaczyć wypukłości rurkowe błony powstałe w wyniku miejscowego wstrzykiwania jonów wapnia na powierzchnię GUV. Przesunięcie końcówki mikropipety po powierzchni membrany, jak wskazuje strzałka, powoduje ruch wypukłości rurkowych membrany w kierunku źródła jonów wapnia.Podsumowując, proponujemy technikę, która pozwala na bezkontaktową przebudowę błony gigantycznych pęcherzyków lipidowych, co spowodowało powstanie wypukłości rurkowych błony po miejscowej stymulacji jonami wapnia. Przyszłe zastosowania tej metody obejmują przejście od syntetycznych pęcherzyków lipidowych do natywnych błon biologicznych lub zastosowanie tego podejścia do systemów polimerowych w celu opracowania bezkontaktowych platform mikromanipulacji.

membrane-remodeling-giant-vesicles-response-to-localized-calcium-ion

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Siatkowka śródplazmatyczna odgrywa kluczową rolę w biogenezie białek oraz w homeostazie wapnia. Opracowaliśmy system eksperymentalny, który pozwala nam zbadać rolę kanałów przecieku Ca2+ oraz scharakteryzować ich domniemane mechanizmy regulacyjne. System ten obejmuje wyciszanie genów za pomocą siRNA oraz obrazowanie Ca2+ w żywych komórkach.

Obrazowanie poziomu wapnia w żywych komórkach połączone z wyciszaniem genów za pomocą siRNA identyfikuje kanały przecieku Ca2+ w błonie ER i ich mechanizmy regulacyjne

Ładowanie barwnikiem indukowane przez esterazy celowane (TED) wspiera analizę dynamiki wewnątrzkomórkowego magazynowania wapnia za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Metoda opiera się na ukierunkowaniu rekombinowanej karboksylesterazy na retikulum endoplazmatyczne (ER), gdzie poprawia miejscowe demaskowanie syntetycznych barwników wskaźnikowych Ca2+ o niskim powinowactwie w świetle ER.

Bezpośrednie obrazowanie wapnia ER z ładunkiem barwnika indukowanym przez celowaną esterazy (TED)

Rekonstytucja białka transbłonowego, KvAP, w gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUVs) jest demonstrowana dla dwóch metod odwodnienia i ponownego nawodnienia — elektroformacji i pęcznienia wspomaganego żelem. W obu metodach małe jednowarstwowe pęcherzyki zawierające białko są łączone ze sobą, tworząc GUV, które można następnie badać za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i elektrofizjologii patch-clamp.

Rekonstytucja białka transbłonowego, kanału jonowego bramkowanego napięciem, KvAP, w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych do badań mikroskopowych i patch clamp

Wiele białek w sensie komórkowym i indukuje krzywiznę błony. Opisujemy metodę wyciągania nanorurek błonowych z pęcherzyków lipidowych w celu zbadania interakcji białek lub dowolnej cząsteczki aktywnej pod kątem krzywizny z zakrzywionymi błonami in vitro.

Wyciąganie nanorurek membranowych z gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych

Dwuwarstwowe membrany fosfolipidowe (DLBM) z solidnym wsparciem, wolne od białek, mogą być przekształcane w złożone i dynamiczne sieci nanorurek lipidowych i mogą służyć jako oddolne modele 2D retikulum endoplazmatycznego.

Spontaniczne powstawanie i rearanżacja sztucznych sieci nanorurek lipidowych jako model oddolny retikulum endoplazmatycznego

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania Ca2+ w neuronach i komórkach glejowych, który umożliwia analizę sygnałów Ca2+ w rozdzielczości subkomórkowej. Proces ten ma zastosowanie do wszystkich typów komórek, które umożliwiają ekspresję genetycznie kodowanych wskaźników Ca2 +.

Analiza lokalnych sygnałów Ca2 + w hodowanych komórkach za pomocą ukierunkowanych na błonę wskaźników Ca2 +

Rekonstytucja bez komórek była kluczowym narzędziem do zrozumienia montażu cytoszkieletu, a prace w ostatniej dekadzie ustaliły podejścia do badania dynamiki septyny w systemach minimalnych. Przedstawiono tutaj trzy uzupełniające się metody obserwacji montażu septyny w różnych kontekstach membranowych: dwuwarstwy płaskie, podpory sferyczne i podpory prętowe.

Rekonstrukcja zespołu septyny na błonach w celu zbadania właściwości i funkcji biofizycznych

Ten artykuł przedstawia metodę przygotowywania złożonych wielowarstwowo-jednowarstwowych pęcherzyków (cGUVs) o strukturze pęcherzyka w pęcherzyku, z dostosowaną przewodnością elektryczną w regionach wewnętrznym, pierścieniowym i zewnętrznym. Elektroformacja syntetyzuje proste GUV, które są przekształcane w stomatocyty i cGUV za pomocą wstrząsu osmotycznego, zapewniając wartościowy model do badania biofizyki komórek z jądrami.

Synteza złożonych gigantycznych jednowarstwowych pęcherzyków: Biomimetyczny model komórek z jądrem

Kanały transportu cząsteczek wody w enzymach wpływają na solwatację i katalizę miejsca aktywnego. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół inżynierii tych dodatkowych motywów katalitycznych w oparciu o modelowanie komputerowe i eksperymenty in silico. Pozwoli to lepiej zrozumieć wpływ dynamiki rozpuszczalnika na katalizę enzymatyczną.

Odkrywanie przyspieszenia entropii wywołanego dynamiką rozpuszczalnika w enzymach błonowych

β-beczkowate białka błony zewnętrznej (OMP) pełnią wiele funkcji w zewnętrznych błonach bakterii Gram-ujemnych, mitochondriów i chloroplastów. W tym miejscu mamy nadzieję złagodzić znane wąskie gardło w badaniach strukturalnych poprzez przedstawienie protokołów produkcji β-beczkowych OMP w ilościach wystarczających do określenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub spektroskopii NMR.

Od konstruktów do kryształów – w kierunku określania struktury β-baryłkowych białek błony zewnętrznej

Poznaj technikę bezdotykowej manipulacji wielkimi pęcherzykami lipidowymi przy użyciu zlokalizowanych gradientów jonów wapnia. Metoda umożliwia bezpośrednią wizualizację przebudowy błony i tworzenie wypustek rurkowatych.

Przebudowa błony gigantycznych pęcherzyków w odpowiedzi na zlokalizowane gradienty jonów wapnia

Przeglądaj więcej filmów