Name: Różnicowanie, utrzymanie i analiza ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki: model choroby w naczyniu dla mutacji BEST1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Poznaj metodę różnicowania ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z komórek macierzystych w celu badania mutacji BEST1 i mechanizmów bestrofinopatii. Ta technika umożliwia analizę funkcjonalną i potencjalne zastosowania terapeutyczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt został sfinansowany z grantów NIH EY025290, GM127652 i University of Rochester na start-up.

1. Różnicowanie hPSC na RPE
<ol>
	<li>Utrzymuj i przechodź przez hPSC zgodnie z wcześniejszym opisem18. 
	UWAGA: Wszystkie komórki (w tym hPSC i hPSC-RPE) są hodowane w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez cały czas trwania protokołów wzrostu i różnicowania.</li>
	<li>Przed różnicowaniem należy rozdzielić zbiegające się hPSC na wstępnie powlekane płytki 6-dołkowe.
	<ol>
		<li>W celu pokrycia płytek należy rozmrozić matrycę błony podstawnej na lodzie przez około 1 godzinę, zawiesić płynną matrycę w podłożu DMEM o temperaturze 4 °C w rozcieńczeniu 1:50, dodać 800 μl mieszaniny powlekającej do każdego dołka i inkubować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Po zakończeniu powlekania odessać mieszaninę i natychmiast dodać 1,5–2 ml pożywki do studzienek.</li>
		<li>Aby podnieść hPSC ze starych płytek hodowlanych, inkubuj komórki z PBS plus 0,5 mM EDTA przez 5 minut w temperaturze pokojowej, odessaj roztwór i ponownie zawieś komórki w małych grudkach za pomocą pożywki hodowlanej.</li>
		<li>Komórki nasienne o ~20% zbiegu w nowych płytkach. 
		UWAGA: Matrycę błony podstawnej należy przechowywać w podwielokrotnościach o pojemności 100 μl w temperaturze -20 °C i użyć jednej podwielokrotności do pokrycia płytki 6-dołkowej. Czas powlekania można wydłużyć do 4 godzin w temperaturze 37 °C lub przez noc w temperaturze pokojowej. Ważne jest, aby zawiesić i rozsiać hPSC w postaci małych skupisk po 3–5 komórek, a nie pojedynczych komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy komórki osiągną pełną konfluencję, zastąp pożywkę hodowlaną pożywką różnicującą (4 ml / studzienkę) (Tabela 1, bez aktywiny-A). Hodowla przez 14 dni, zmiana pożywki (4 ml / dołek) 3 razy / tydzień. 
	UWAGA: Gęstość płytek hPSC podwaja się mniej więcej co 24 godziny. Po rozpoczęciu procedury różnicowania spodziewana jest znaczna śmierć komórki. Agregaty martwych komórek i szczątków w studzienkach można zobaczyć gołym okiem podczas zmian pożywki.</li>
	<li>Od 15 do 28 dnia uzupełnij pożywkę różnicującą 100 ng / ml ludzkiej aktywiny-A (Tabela 1, ludzką aktywiną A). Zmieniaj pożywkę (4 ml / dołek) 3 razy w tygodniu.</li>
	<li>Przerwij suplementację aktywiny-A począwszy od 29 dnia (Tabela 1, bez ludzkiej aktywiny-A). Kontynuuj hodowlę komórek w pożywce różnicowej przez 8–10 tygodni, aż pojawią się pigmentowane klastry hPSC-RPE (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A-B). 
	UWAGA: Skupiska pigmentowanych komórek mogą być widoczne gołym okiem jako małe ciemne kropki na płytce do hodowli komórkowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A-B, góra). Pojedyncze pigmentowane komórki o charakterystycznym brukowym kształcie można zobaczyć pod mikroskopem 20X (<silna klasa="xfig">Ryc. 1A-B, na dole).</li>
</ol>
2. Izolacja i hodowla zróżnicowanych komórek RPE
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę różnicującą, przemyć raz PBS, dodać 1 ml 0,05% trypsyny plus 1 U/μL kolagenazy do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20–30 minut. Usunąć trypsynę/kolagenazę i delikatnie dodać 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki RPE do każdego dołka płytki 6-dołkowej (Tabela 2). 
	UWAGA: Użyj odwróconego mikroskopu, aby monitorować morfologię komórek hPSC-RPE, które są wielokątne przed leczeniem trypsyną/kolagenazą i stają się okrągłe po wystarczającym trawieniu.</li>
	<li>Użyj palnika Bunsena, aby wyciągnąć szklane pipety Pasteura.
	<ol>
		<li>Obiema rękami trzymaj długą (9 cali) pipetę Pasteura na obu końcach, tak aby znajdowała się poziomo, a nad palnikiem Bunsena około 2/3 długości cienkiej części pipety.</li>
		<li>Gdy szklanka stanie się miękka od płomienia, szybko rozsuń oba końce, tak aby na nowym końcu pipety utworzyła się końcówka przypominająca mikroskrobak (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
		<li>Powtórz kilka razy, aby utworzyć wiele "skrobaków do komórek". Spryskaj wyciągnięte pipety 70% etanolem do sterylizacji i wysusz je na powietrzu w kapturze do hodowli komórkowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pod mikroskopem użyj mikro "skrobaka do komórek", aby delikatnie oddzielić pigmentowane klastry hPSC-RPE od płytki.
	<ol>
		<li>Delikatnie postukaj (nie skrobaj) bezpośrednio w pigmentowane komórki, które uniosą się do pożywki hodowlanej, gdy oddzielą się od dna studzienki.</li>
		<li>Natychmiast użyj mikropipety o pojemności 20 μl, aby delikatnie odessać zdysocjowane komórki hPSC-RPE i przenieś je na wstępnie pokrytą 6-dołkową płytkę z RPE medium24.</li>
		<li>Zbierz ~5 x 103 komórki (~10% konfluencji, jak zaobserwowano pod mikroskopem 20X) w każdym wstępnie pokrytym dołku 12-dołkowej płytki, powtarzając kroki 2.3.1–2.3.2 wiele razy, w razie potrzeby. Doprowadzić końcową objętość podłoża do 2 ml. 
		UWAGA: Aby zapobiec odpływaniu zdysocjowanych komórek hPSC-RPE, należy unikać ruchu płytek podczas procesu dysocjacji, tak aby zdysocjowane komórki unosiły się w pożywce, ale nadal pozostawały lokalnie skoncentrowane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hoduj nowo wyizolowane komórki hPSC-RPE (P0) na 12-dołkowych płytkach w pożywce RPE przez kolejne 6-8 tygodni, aby umożliwić im utworzenie pigmentowanej monowarstwy (<silna klasa = "xfig">Figura 1C).</li>
	<li>Zmieniaj medium 3 razy w tygodniu. Zmieniając pożywkę, pozostaw około 1/3 objętości starego podłoża w każdym dołku i dodaj 2/3 objętości świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki RPE. Na tym etapie użyj 2 ml pożywki RPE na każdą studzienkę w 12-dołkowej płytce (dlatego za każdym razem wymieniaj 1,3 ml pożywki). 
	UWAGA: Monowarstwa ogniw P0 hPSC-RPE może tworzyć kopuły, co sugeruje, że komórki aktywnie transportują płyny i są zakotwiczone przez ścisłe połączenia25. W związku z tym formacja kopuły jest wskaźnikiem dojrzałego statusu RPE.</li>
</ol>
3. Walidacja losu RPE za pomocą immunoblottingu
<ol>
	<li>Wykonaj lizat komórkowy hPSC-RPE za pomocą buforu do ekstrakcji białek ssaków uzupełnionego koktajlem inhibitorów proteinaz. Inkubować lizat komórkowy na lodzie przez 30 minut, a następnie odwirować w temperaturze 13 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu odrzucenia nierozpuszczonych resztek komórkowych. Zmierz całkowite stężenie białka w lizacie.</li>
	<li>Denaturować 40 μg białka całkowitego w buforze próbki Laemmli SDS w temperaturze 75 °C przez 10 minut. Próbki białek należy rozdzielić na 10% żelu Tris-glycine SDS-PAGE przy stałym napięciu 90 V przez 15 minut, a następnie 150 V, aż czoło barwnika dotrze do dna żelu.</li>
	<li>Przenieść białka na membranę nitrocelulozową we wstępnie schłodzonym buforze tris-glicyny uzupełnionym 10% metanolem przy 100 V przez 1 godzinę.</li>
	<li>Zablokuj membranę w buforowanym roztworze soli fizjologicznej Tris z 0,1% niejonowym detergentem (TBST) i 5% beztłuszczowym mlekiem w proszku na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować błonę z pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w buforze blokującym w temperaturze 4 °C przez noc. Rozcieńczyć przeciwciała skierowane przeciwko białkom markerowym specyficznym dla RPE w następujący sposób: RPE65, 1:1,000; CRALBP, 1:1,000; BEST1, 1:1,000. Rozcieńczyć przeciwciało przeciwko β-aktynie w stosunku 1:10 000, aby wykryć β-aktynę jako kontrolę obciążenia.</li>
	<li>Umyj membranę TBST 3 razy, po 5 minut na każde pranie.</li>
	<li>Inkubować błonę z sprzężonym z fluoroforem kozim przeciwciałem drugorzędowym przeciwko mysim IgG, rozcieńczonym w stosunku 1:10 000 w buforze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj membranę TBST 4 razy, po 10 minut na każde pranie.</li>
	<li>Wykryj białka za pomocą systemu obrazowania w podczerwieni (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
</ol>
4. Sprawdzanie lokalizacji subkomórkowej BEST1 za pomocą barwienia immunologicznego
<ol>
	<li>Umyj komórki hPSC-RPE 2 ml PBS raz i utrwal w 2 ml 4% paraformaldehydu przez 45 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć dwukrotnie 2 ml PBS i inkubować komórki w 2 ml PBS z 0,1% niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym i 2% surowicą osła przez 45 minut, aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania.</li>
	<li>Inkubować komórki z przeciwciałem BEST1 (rozcieńczenie 1:200) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj komórki 2 ml PBS 3 razy. Inkubować z sprzężoną z fluoroforem drugorzędowym IgG (1:1 000) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć 3 razy 2 ml PBS w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała drugorzędowego.</li>
	<li>Obserwuj barwione komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej (<silna klasa="xfig">Ryc. 4).</li>
</ol>
5. Rejestrowanie prądu Ca2+ zależnego od Cl- w hPSC-RPE za pomocą zacisku krosowego całego ogniwa
<ol>
	<li>Na 24–72 godziny przed założeniem plastra należy rozszczepić w pełni zlewającą się studzienkę (na 12-dołkowej płytce) dojrzałych komórek P0 hPSC-RPE (w kształcie kostki brukowej i pigmentowanych). Odessać pożywkę, przemyć raz PBS i dodać 1 ml 0,05% trypsyny plus 1 U/μL kolagenazy do studzienki. 
	UWAGA: Tuż przed użyciem podgrzej trypsynę/kolagenazę do 37 °C.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 8 min. 
	UWAGA: Po tym kroku ogniwa hPSC-RPE są nadal przylegające i połączone.</li>
	<li>Za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml delikatnie zmyj komórki z płytki i przenieś komórki z mieszaniny wytrawiającej do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Umyj studzienkę 1 ml wstępnie podgrzanej trypsyny/kolagenazy, aby zebrać pozostałe komórki i połączyć je w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. 
	UWAGA: Komórki hPSC-RPE są w tym momencie nadal w dużych skupiskach. Nie należy próbować rozbijać grudek komórek przez energiczne pipetowanie. Niektóre grudki mogą przyklejać się do wewnętrznej ścianki końcówki o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Inkubować stożkową rurkę w suchej łaźni o temperaturze 37 °C przez 8 minut.</li>
	<li>Użyj mikropipety o pojemności 1 ml, aby delikatnie pipetować w górę i w dół 10–15 razy więcej niż mieszanka mineralizująca. 
	UWAGA: Grudki komórek stają się znacznie mniejsze, ale nadal widoczne. Należy unikać intensywnego pipetowania.</li>
	<li>Powtórz poprzednie dwa kroki. 
	UWAGA: Większość komórek po pipetowaniu powinna znajdować się w zawiesinie jednokomórkowej. Nadal mogą występować drobne grudki komórek, które są dopuszczalne. Opcjonalnie: Inkubować stożkową rurkę w temperaturze 37 °C przez dodatkowe 5 minut, a następnie delikatnie pipetować. Całkowity czas w trypcynie/kolagenazie w temperaturze 37 °C nie powinien przekraczać 30 minut (8 + 8 + 8 + 5 = 29).</li>
	<li>Dodać 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki RPE do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej strawione komórki. Wirować w 200 x g przez 5 minut, aby zebrać komórki. Ponownie zawiesić i wysiać komórki na wstępnie pokrytych szalkach o średnicy 35 mm przy 10–20% zbiegu (np. 100% zlewającej się studzienki na 12-dołkowej płytce do pięciu 35-milimetrowych szalek w celu uzyskania 10% konfluencji). 
	UWAGA: Przez cały czas należy unikać intensywnego pipetowania, które może spowodować znaczną śmierć komórek, reprezentowaną przez widoczne ciemne resztki komórek w supernatancie po odwirowaniu. Dobrze oddzielone wysiewanie pojedynczych komórek jest niezbędne do nagrywania zacisków krosowych.</li>
	<li>Wykonaj zacisk krosowy całej komórki zgodnie z wcześniejszym opisem18,26,27,28,29,30,31. Pozyskaj ślady prądu z rodziny potencjałów krokowych (od -100 do +100 mV od potencjału podtrzymania 0 mV) (<klasa silna="xfig">Rysunek 5). 
	UWAGA: Receptury roztworów wewnętrznych i zewnętrznych opisano odpowiednio w Tabeli 3 i Tabeli 4.</li>
</ol>

<ol><li>Allikmets, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Best+disease+gene+in+patients+with+age-related+macular+degeneration+and+other+maculopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies.</a> Hum Genet. 104 (6), 449-453 (1999).</li>
<li>Burgess, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biallelic+mutation+of+BEST1+causes+a+distinct+retinopathy+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans.</a> Am J Hum Genet. 82 (1), 19-31 (2008).</li>
<li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missense+mutations+in+a+retinal+pigment+epithelium+protein%2C+bestrophin-1%2C+cause+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa.</a> Am J Hum Genet. 85 (5), 581-592 (2009).</li>
<li>Kramer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+VMD2+gene+are+associated+with+juvenile-onset+vitelliform+macular+dystrophy+%28Best+disease%29+and+adult+vitelliform+macular+dystrophy+but+not+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration.</a> Eur J Hum Genet. 8 (4), 286-292 (2000).</li>
<li>Marquardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+a+novel+gene%2C+VMD2%2C+encoding+a+protein+of+unknown+properties+cause+juvenile-onset+vitelliform+macular+dystrophy+%28Best%27s+disease%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best's disease).</a> Hum Mol Genet. 7 (9), 1517-1525 (1998).</li>
<li>Petrukhin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+gene+responsible+for+Best+macular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy.</a> Nat Genet. 19 (3), 241-247 (1998).</li>
<li>Yardley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+VMD2+splicing+regulators+cause+nanophthalmos+and+autosomal+dominant+vitreoretinochoroidopathy+%28ADVIRC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC).</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (10), 3683-3689 (2004).</li>
<li>Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEST1%3A+the+Best+Target+for+Gene+and+Cell+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies.</a> Mol Ther. 23 (12), 1805-1809 (2015).</li>
<li>Marmorstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bestrophin%2C+the+product+of+the+Best+vitelliform+macular+dystrophy+gene+%28VMD2%29%2C+localizes+to+the+basolateral+plasma+membrane+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).</li>
<li>Boon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+of+ocular+phenotypes+caused+by+mutations+in+the+BEST1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The spectrum of ocular phenotypes caused by mutations in the BEST1 gene.</a> Prog Retin Eye Res. 28 (3), 187-205 (2009).</li>
<li>Marmorstein, A. D., Cross, H. E., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+bestrophins+in+ocular+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Functional roles of bestrophins in ocular epithelia.</a> Prog Retin Eye Res. 28 (3), 206-226 (2009).</li>
<li>Fujii, S., Gallemore, R. P., Hughes, B. A., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+a+basolateral+membrane+Cl-+conductance+in+toad+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for a basolateral membrane Cl- conductance in toad retinal pigment epithelium.</a> Am J Physiol. 262, C374-C383 (1992).</li>
<li>Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+DIDS+on+the+chick+retinal+pigment+epithelium.+II.+Mechanism+of+the+light+peak+and+other+responses+originating+at+the+basal+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Effects of DIDS on the chick retinal pigment epithelium. II. Mechanism of the light peak and other responses originating at the basal membrane.</a> J Neurosci. 9 (6), 1977-1984 (1989).</li>
<li>Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-evoked+modulation+of+basolateral+membrane+Cl-+conductance+in+chick+retinal+pigment+epithelium%3A+the+light+peak+and+fast+oscillation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation.</a> J Neurophysiol. 70 (4), 1669-1680 (1993).</li>
<li>Li, Y., Nguyen, H. V., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+Biopsy+and+Patient-Specific+Stem+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Skin Biopsy and Patient-Specific Stem Cell Lines.</a> Methods Mol Biol. 1353, 77-88 (2016).</li>
<li>Milenkovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bestrophin+1+is+indispensable+for+volume+regulation+in+human+retinal+pigment+epithelium+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bestrophin 1 is indispensable for volume regulation in human retinal pigment epithelium cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2630-E2639 (2015).</li>
<li>Moshfegh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BESTROPHIN1+mutations+cause+defective+chloride+conductance+in+patient+stem+cell-derived+RPE%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">BESTROPHIN1 mutations cause defective chloride conductance in patient stem cell-derived RPE.</a> Hum Mol Genet. 25 (13), 2672-2680 (2016).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+mutations+impair+BESTROPHIN1%27s+essential+role+in+mediating+Ca2%2B-dependent+Cl-+currents+in+human+RPE%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1's essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Marmorstein, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light+peak+of+the+electroretinogram+is+dependent+on+voltage-gated+calcium+channels+and+antagonized+by+bestrophin+%28best-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1).</a> J Gen Physiol. 127 (5), 577-589 (2006).</li>
<li>Volland, S., Esteve-Rudd, J., Hoo, J., Yee, C., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+some+organizational+characteristics+of+the+mouse+central+retina+and+the+human+macula%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A comparison of some organizational characteristics of the mouse central retina and the human macula.</a> PLoS One. 10 (4), e0125631(2015).</li>
<li>Kamao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+cell+sheets+aiming+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).</li>
<li>Idelson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+retinal+pigment+epithelium+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).</li>
<li>Mandai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+Induced+Stem-Cell-Derived+Retinal+Cells+for+Macular+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Autologous Induced Stem-Cell-Derived Retinal Cells for Macular Degeneration.</a> N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).</li>
<li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li>
<li>Maruotti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+scalable+process+for+the+differentiation+of+retinal+pigment+epithelium+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">A simple and scalable process for the differentiation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Transl Med. 2 (5), 341-354 (2013).</li>
<li>Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-inspired+voltage-dependent+calcium+channel+blockers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers.</a> Nat Commun. 4, 2540(2013).</li>
<li>Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preassociated+apocalmodulin+mediates+Ca2%2B-dependent+sensitization+of+activation+and+inactivation+of+TMEM16A%2F16B+Ca2%2B-gated+Cl-+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), 18213-18218 (2014).</li>
<li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+selectivity+in+bestrophin+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure and selectivity in bestrophin ion channels.</a> Science. 346 (6207), 355-359 (2014).</li>
<li>Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+RGK+GTPases+differentially+use+alpha1-+and+auxiliary+beta-binding-dependent+mechanisms+to+inhibit+CaV1.2%2FCaV2.2+channels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels.</a> PLoS One. 7 (5), e37079(2012).</li>
<li>Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+molecules+for+inducibly+inactivating+CaV+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels.</a> Nat Chem Biol. 3 (12), 795-804 (2007).</li>
<li>Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rem%2C+a+member+of+the+RGK+GTPases%2C+inhibits+recombinant+CaV1.2+channels+using+multiple+mechanisms+that+require+distinct+conformations+of+the+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase.</a> J Physiol. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).</li>
<li>Gong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Human+Protein-Induced+Pluripotent+Stem+Cells+toward+a+Retinal+Pigment+Epithelial+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Human Protein-Induced Pluripotent Stem Cells toward a Retinal Pigment Epithelial Cell Fate.</a> PLoS One. 10 (11), e0143272(2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+activates+bestrophin+ion+channels+through+direct+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">ATP activates bestrophin ion channels through direct interaction.</a> Nat Commun. 9 (1), 3126(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Najważniejszą procedurą w podejściu "choroba w naczyniu" jest różnicowanie hPSC z mutacją powodującą chorobę do właściwej linii komórkowej, którą jest RPE dla BEST1. Tak więc, po każdym eksperymencie różnicowania, powstałe komórki hPSC-RPE powinny być dokładnie zwalidowane pod kątem ich dojrzałości za pomocą morfologii specyficznych dla RPE i markerów białkowych 16,17,18. Aby zminimalizować artefakt klonalny, należy w m...

Udokumentowano, że co najmniej pięć chorób zwyrodnieniowych siatkówki jest spowodowanych mutacjami genetycznymi w genie BEST11,2,3,4,5,6,7,8, przy czym liczba zgłoszonych mutacji przekracza już 200 i wciąż rośnie. Te choroby związane z BEST1, znane również jako bestrofinopatie, powodują postępującą utratę wzroku, a nawet ślepotę, a obecnie nie ma skutecznych metod leczenia. Produkt białkowy BEST1, a mianowicie BESTROPHIN1 (BEST1), jest aktywowanym przez Ca2+ kanałem Cl- (CaCC) specyficznie eksprymowanym w nabłonku barwnikowym siatkówki (RPE) oczu5,6,8,9. Co ważne, fenotypem klinicznym chorób związanych z BEST1 jest zmniejszona reakcja wzrokowa na bodźce świetlne, zwana pikiem świetlnym (LP) mierzona w elektrookulogramie<klasa sup="xref">10,11; Uważa się, że LP jest zapośredniczony przez CaCC w RPE12,13,14. Aby lepiej zrozumieć patologiczne mechanizmy mutacji BEST1 i pracować nad potencjalnymi terapiami, konieczne jest zbadanie zmutowanych kanałów BEST1 ulegających endogennej ekspresji w ludzkich komórkach RPE.
Jednak pobieranie komórek RPE bezpośrednio od żywych pacjentów jest wysoce niepraktyczne. Chociaż natywne komórki RPE mogą być pobierane z biopsji ludzkich zwłok i płodów, utrudniony dostęp do tych źródeł znacznie ogranicza badania naukowe. Dlatego tak ważne jest, aby mieć alternatywne źródła OURE inne niż ludzkie oczy. Odpowiedzią na to wezwanie są ostatnie postępy w technikach komórek macierzystych, ponieważ funkcjonalne komórki RPE można teraz odróżnić od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), w tym embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC), przy czym te ostatnie są generowane przez przeprogramowanie pierwotnych fibroblastów skóry od dawców16,17,18. Co ważne, samoodnawianie się i pluripotencja hPSC stanowią wiarygodne źródło do generowania RPE, podczas gdy specyficzność hiPSC dla pacjenta i potencjał modyfikacji genomu hESC (np. za pomocą CRISPR) oferują wszechstronny model choroby w naczyniu dla pożądanych mutacji BEST1.
hPSC-RPE ma kilka zalet w porównaniu z modelami RPE dla myszy: 1) myszy z nokautem BEST1 nie wykazują żadnych nieprawidłowości siatkówki19, co zwiększa możliwość różnych wymagań genetycznych BEST1 w RPE między myszami a ludźmi; 2) tylko 3% ludzkich komórek RPE jest dwujądrowych, w przeciwieństwie do 35% u myszy20; 3) hiPSC-RPE nasila autologiczny przeszczep w klinicznym leczeniu zaburzeń siatkówki21. Niemniej jednak modele zwierzęce są nadal niezbędne do badania fizjologii i patologii RPE w żywym systemie, a onkogenny potencjał hiPSC nie może być pominięty.
Procedura tutaj opisuje użyteczny i umiarkowanie prosty protokół różnicowania hPSC do RPE, który może być wykorzystany do celów badawczych i klinicznych. Protokół ten wykorzystuje nikotynamid (witaminę B3) w celu zwiększenia różnicowania hPSC do tkanki nerwowej, która jest dalej indukowana do różnicowania się w RPE przez leczenie aktywiną-A. Wykazano, że leczenie nikotynamidem zwiększa liczbę komórek barwnikowych (oznaka różnicowania w RPE), prawdopodobnie poprzez osłabienie aktywności apoptotycznej komórek różnicujących się22. Powstałe w ten sposób komórki hPSC-RPE wykazują te same kluczowe markery, morfologię kostki brukowej i funkcjonalność komórkową, co natywne ludzkie komórki RPE22. W związku z tym, w warunkach badawczych, uzyskane komórki hPSC-RPE nadają się do dalszych analiz funkcjonalnych, w tym immunoblottingu, barwienia immunologicznego i klamry białkowej dla całych komórek, dla których przewidziano również szczegółowe procedury eksperymentalne. Klinicznie, komórki RPE pochodzące z komórek macierzystych wykazały duży potencjał w leczeniu transplantacyjnym zwyrodnienia plamki żółtej zarówno w badaniach na zwierzętach, jak i w badaniach na ludziach23.

<table><tbody><tr><td>Nokaut (KO) DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>zamiennik surowicy KO</td><td>ThermoFisher</td><td>10829028</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>ThermoFisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>ThermoFisher</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka aktywina-A</td><td>PeproTech</td><td>120-14</td><td></td></tr><tr><td>MEM (modyfikacja)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4526</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6530</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina-penicylina-streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1146</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7156</td><td></td></tr><tr><td>Tauryna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0386</td><td></td></tr><tr><td>Trijodo-tyronina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR-1 medium</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>VWR</td><td>45000-664</td><td></td></tr><tr><td>M-PER odczynnik do ekstrakcji białek ssaków</td><td>Koktajl</td> inhibitorów proteinaz Pierce <td>78501</td><td></td></tr> Przeciwciało <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>RPE65</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-355</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało</td> <td>CRALBPAbcam</td><td>ab15051</td><td></td></tr><tr><td>BEST1 przeciwciało Novus</td><td>Biologicals</td><td>NB300-164</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało beta aktyny</td><td>ThermoFisher</td><td>MA5-15739</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-sprzężony osł anty-mysie IgG</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-mysia IgG</td><td>ThermoFisher</td><td>SA5-35521</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-68071</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz zaciskowy HEKA EPC10</td><td>Warner Instruments</td><td>895000</td><td></td></tr><tr><td>Patchmaster</td><td>Warner Instruments</td><td>895040</td><td></td></tr></tbody></table>

różnicowanie, utrzymanie i analiza ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki: model choroby w naczyniu dla mutacji best1

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Chociaż zidentyfikowano ponad 200 mutacji genetycznych w ludzkim genie BEST1 i powiązano je z chorobami zwyrodnieniowymi siatkówki, patologiczne mechanizmy pozostają nieuchwytne, głównie z powodu braku dobrego modelu in vivo do badania BEST1 i jego mutacji w warunkach fizjologicznych. BEST1 koduje kanał jonowy, a mianowicie BESTROPHIN1 (BEST1), który działa w nabłonku barwnikowym siatkówki (RPE); jednak niezwykle ograniczony dostęp do natywnych ludzkich komórek RPE stanowi poważne wyzwanie dla badań naukowych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób generować ludzkie RPE z mutacjami powodującymi chorobę BEST1 poprzez indukowane różnicowanie z ludzkimi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi (hPSC). Ponieważ hPSC są samoodnawialne, takie podejście pozwala naukowcom na stałe źródło hPSC-RPE do różnych analiz eksperymentalnych, takich jak immunoblotting, immunofluorescencja i patch clamp, a tym samym zapewnia bardzo potężny model choroby w naczyniu dla chorób siatkówki związanych z BEST1. Warto zauważyć, że strategia ta może być zastosowana do badania (pato)fizjologii RPE i innych interesujących genów natywnie wyrażanych w RPE.

Najbardziej wymagającym technicznie etapem jest izolacja ręczna, której celem jest uzyskanie wysokiej czystości zróżnicowanej populacji P0 hPSC-RPE. Po pomyślnej izolacji &gt;90% komórek w populacji P0 będzie rosło i dojrzewało, wykazując charakterystyczną morfologię RPE (Rycina 1C). Obecność niewielkiej frakcji komórek niebędących RPE lub niedojrzałych komórek RPE w populacji P0 jest niemal nieunikniona, ale nie będzie ona za...

Tutaj prezentujemy protokół różnicowania komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych posiadających mutacje pochodzące od pacjenta. Zmutowane linie komórkowe mogą być wykorzystywane do analiz funkcjonalnych, w tym immunoblottingu, immunofluorescencji i patch clamp. To podejście typu "choroba w naczyniu" pozwala uniknąć trudności związanych z uzyskaniem natywnych ludzkich komórek RPE.

Różnicowanie, utrzymanie i analiza ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki: model choroby w naczyniu dla mutacji BEST1

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chorób siatkówki związanych z kanałami jonowymi, dotyczące molekularnych mechanizmów mutacji BEST1 i patologii bestrofinopatii. Główną zaletą tej techniki jest to, że omija ona trudność bezpośredniego pozyskiwania komórek RPE od ludzi. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii bestrofinopatii, w tym choroby Besta, ponieważ komórki RPE mogą być wykorzystywane zarówno do celów badawczych, jak i terapii zastępczych komórek.Gdy kultura hPSC osiągnie zbieg, zastąp pożywkę hodowlaną czterema mililitrami pożywki różnicującej na dołek sześciodołkowej płytki. Po dwóch tygodniach hodowli należy uzupełnić pożywkę różnicującą o 100 nanogramów na mililitr ludzkiej aktywiny-A, zmieniając uzupełnione pożywki trzy razy w tygodniu przez kolejne 14 dni. W 29 dniu przełącz się na nieuzupełnioną pożywkę różnicującą na kolejne osiem do 10 tygodni, aż pojawią się pigmentowane skupiska komórek RPE.Aby wyizolować pigmentowane komórki RPE, najpierw trzymaj pojedyncze dziewięciocalowe szklane pipety Pasteura poziomo nad płomieniem palnika Bunsena, około dwóch trzecich długości cienkiej części pipety. Gdy podgrzana szklanka stanie się miękka, szybko rozsuń oba końce, aby na nowym końcu pipety utworzyć końcówkę przypominającą mikroskrobak. Spryskaj wyciągnięte pipety 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w kapturze do hodowli komórkowych.Gdy pipety są gotowe, przemyj każdą studzienkę kultury różnicującej PBS i dodaj jeden mililitr 0,05% trypsyny uzupełnionej jedną jednostką na mikrolitr kolagenazy do każdej studzienki. Po 20 do 30 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza przerwij trawienie dwoma mililitrami pożywki RPE o temperaturze 37 stopni Celsjusza na dołek sześciodołkowej płytki i umieść płytkę na stoliku mikroskopowym. Za pomocą wyciągniętej pipety delikatnie postukaj w pigmentowane klastry RPE.Jak tylko komórki oderwą się od dna studzienki, użyj mikropipety o pojemności 20 mikrolitrów, aby przenieść zdysocjowane komórki do pojedynczych dołków nowej płytki do hodowli komórkowej zawierającej pożywkę RPE. Po dodaniu około 5 000 komórek RPE do każdej studzienki 12-dołkowej płytki, zwiększ końcową objętość do dwóch mililitrów świeżą pożywką RPE i hoduj izolowane komórki hPSC-RPE przez kolejne sześć do ośmiu tygodni, aż zaobserwuje się monowarstwę pigmentowanych i dojrzałych komórek RPE w kształcie kostki brukowej. 24 do 72 godzin przed zaciskiem łaty przemyj pigmentowane komórki jednowarstwowe dwoma mililitrami PBS, a następnie, po usunięciu PBS, dodaj jeden mililitr 0,05% trypsyny plus jedną jednostkę na mikrolitr kolagenazy do komórek w każdym dołku 12-dołkowej płytki przez ośmiominutowy okres inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Kiedy komórki zaczną się odłączać, użyj mikropipety o pojemności jednego mililitra, aby delikatnie umyć komórki z dna studzienki i złóż zawiesinę komórek w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów. Dodaj jeden mililitr roztworu trypsyny i kolagenazy o temperaturze 37 stopni Celsjusza do studzienki. Inkubować przez kolejne osiem minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie umyć wszelkie pozostałe komórki z dna studzienki i połączyć zawiesinę komórek z tą samą stożkową probówką o pojemności 15 mililitrów.Inkubuj komórki w suchej kąpieli o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez osiem minut, a następnie użyj mikropipety o pojemności jednego mililitra, aby delikatnie rozcierać komórki od 10 do 15 razy. Po dwukrotnej inkubacji i rozkrzewieniu komórek, dodaj pięć mililitrów pożywki RPE o temperaturze 37 stopni Celsjusza do zawiesiny pojedynczej komórki i osadź komórki przez odwirowanie. Zawiesić granulat w odpowiedniej objętości do wysiewu na wstępnie powlekanych płytkach z szkiełkami nakrywkowymi przy zbiegu od 10 do 20% i wykonać zacisk krosowy dla całych komórek zgodnie ze standardowymi protokołami.Po udanej izolacji, ponad 90% komórek w populacji pasażowej zero powinno dojrzeć, aby wykazywać charakterystyczną morfologię komórek RPE. Dzięki podejściu opartemu na chorobie w naczyniu opartemu na hPSC-RPE, każdą specyficzną dla pacjenta mutację BEST1 można kompleksowo scharakteryzować pod kątem ekspresji białka, transportu błonowego i funkcji kanału jonowego, aby uzyskać kluczowe informacje do wyjaśnienia mechanizmów patologicznych RPE. Należy zauważyć, że niektóre mutacje BEST1 mogą wpływać na ekspresję białka, dlatego należy również sprawdzić inne dobrze znane markery RPE.Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych RPE trwa od trzech do sześciu miesięcy, w zależności od linii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i typu mutacji, a izolacja zróżnicowanych ludzkich komórek pluripotencjalnych może zostać zakończona w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując podzielić komórki na zacisk łatowy, ważne jest, aby pamiętać o bardzo delikatnym rozcieraniu komórek, aby uniknąć nadmiernej śmierci komórek. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak hodowla komórek 3D RPE, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób mutacje BEST1 wpływają na transport jonów na błonach wierzchołkowych i podstawnych komórek RPE.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się chorobami zwyrodnieniowymi siatkówki do zbadania fizjologicznych fenotypów i patologicznych mechanizmów komórek RPE pochodzących od pacjentów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak różnicować pluripotencjalne komórki macierzyste w komórki nabłonka barwnikowego siatkówki i jak przygotować komórki RPE do klamry całokomórkowej.

differentiation-maintenance-analysis-human-retinal-pigment-epithelium

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Przedstawiamy powtarzalną metodę hodowli konfluentnych monowarstw ludzkich płodowych komórek nabłonka pigmentowego siatkówki (hfRPE), które wykazują morfologię, fizjologię, polarność oraz wzorce ekspresji białek i genów charakterystyczne dla natywnej tkanki dorosłego organizmu. Praca ta została rozszerzona o model zwierzęcy kilku chorób oczu.

Modele eksperymentalne do badania fizjologii i patofizjologii nabłonka pigmentowego siatkówki

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) pochodzące z komórek macierzystych mogą być wykorzystywane do wielu zastosowań, w tym do terapii komórkowych w celu zwyrodnienia siatkówki, modelowania chorób i badań nad lekami. Poniżej przedstawiamy prosty protokół umożliwiający powtarzalne pozyskiwanie RPE z komórek macierzystych.

Efektywne pozyskiwanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z komórek macierzystych

Ten protokół opisuje, jak wytwarzać komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Metoda wykorzystuje kombinację czynników wzrostu i małych cząsteczek do skierowania różnicowania komórek macierzystych w niedojrzałe RPE w ciągu czternastu dni i dojrzałe, funkcjonalne RPE po trzech miesiącach.

Szybkie, ukierunkowane różnicowanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z ludzkich embrionalnych lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Celem tego protokołu jest pokazanie hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) na starzejącej się i/lub chorej ludzkiej błonie Brucha. Ta metoda jest odpowiednia do badania zachowania komórek RPE na uszkodzonej macierzy zewnątrzkomórkowej.

Hodowla komórek nabłonka barwnikowego siatkówki na modelu ex vivo starzejącej się błony błony mięśniowej człowieka

Ten protokół, który pierwotnie został zgłoszony przez Fernandez-Godino et al. w 2016 roku1, opisuje metodę efektywnego izolowania i hodowli mysich komórek RPE, które tworzą funkcjonalną i spolaryzowaną monowarstwę RPE w ciągu jednego tygodnia na płytkach Transwell. Zabieg trwa około 3 godzin.

Skuteczna dyssekcja i hodowla pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

Naczelny (NHP) jest idealnym modelem do badania terapii komórkowej ludzkiej siatkówki ze względu na podobieństwa anatomiczne i genetyczne. W artykule opisano metodę podplamkowego przeszczepu komórek nabłonka barwnikowego siatkówki w oku NHP oraz strategie zapobiegania powikłaniom śródoperacyjnym związanym z manipulacją plamki żółtej.

Przeszczep nabłonka barwnikowego siatkówki w modelu naczelnych innych niż człowiek w chorobach zwyrodnieniowych siatkówki

Ten manuskrypt opisuje uproszczony protokół stopniowej izolacji komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z oczu myszy. Protokół obejmuje wyłuszczenie i sekcję oczu myszy, a następnie izolację, wysiew i hodowlę komórek RPE.

Izolacja pierwotnych komórek barwnikowego nabłonka siatkówki myszy

Ten protokół opisuje efektywną metodę różnicowania hiPSC w klastry pola gałkowego i generowania organoidów neuro-siatkówkowych przy użyciu uproszczonych warunków hodowli obejmujących zarówno systemy hodowli adherentnych, jak i zawiesinowych. Inne typy komórek oka, takie jak RPE i nabłonek rogówki, można również wyizolować z dojrzałych pól ocznych w hodowlach siatkówki.

Wytwarzanie organoidów siatkówki ze zdrowych i specyficznych dla choroby siatkówki pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka

Modele myszy mogą być użytecznymi narzędziami do badania biologii nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Ustalono, że u myszy może rozwinąć się szereg patologii RPE. W tym miejscu opisujemy protokół fenotypowania w celu wyjaśnienia i ilościowego określenia patologii RPE u myszy za pomocą światła, elektronów transmisyjnych i mikroskopii konfokalnej.

Protokół oceny i ilościowego określenia patologii barwnikowego nabłonka siatkówki w mysich modelach zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli komórek ludzkich do analizy czynników inicjacji translacji, które wiążą 5' czapeczkę mRNA podczas fizjologicznych warunków tlenowych. Metoda ta wykorzystuje analog kapu m7GTP sprzężonego z agarozą i jest odpowiednia do badania czynników wiążących kap i ich oddziałujących partnerów.

Analiza białek wiążących czapeczki w komórkach ludzkich wystawionych na fizjologiczne warunki tlenowe

Poznaj metodę różnicowania ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z komórek macierzystych w celu badania mutacji BEST1 i mechanizmów bestrofinopatii. Ta technika umożliwia analizę funkcjonalną i potencjalne zastosowania terapeutyczne.

Różnicowanie, utrzymanie i analiza ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki: model choroby w naczyniu dla mutacji BEST1

Przeglądaj więcej filmów