Różnicowanie, utrzymanie i analiza ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki: model choroby w naczyniu dla mutacji BEST1

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chorób siatkówki związanych z kanałami jonowymi, dotyczące molekularnych mechanizmów mutacji BEST1 i patologii bestrofinopatii. Główną zaletą tej techniki jest to, że omija ona trudność bezpośredniego pozyskiwania komórek RPE od ludzi. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii bestrofinopatii, w tym choroby Besta, ponieważ komórki RPE mogą być wykorzystywane zarówno do celów badawczych, jak i terapii zastępczych komórek.

Gdy kultura hPSC osiągnie zbieg, zastąp pożywkę hodowlaną czterema mililitrami pożywki różnicującej na dołek sześciodołkowej płytki. Po dwóch tygodniach hodowli należy uzupełnić pożywkę różnicującą o 100 nanogramów na mililitr ludzkiej aktywiny-A, zmieniając uzupełnione pożywki trzy razy w tygodniu przez kolejne 14 dni. W 29 dniu przełącz się na nieuzupełnioną pożywkę różnicującą na kolejne osiem do 10 tygodni, aż pojawią się pigmentowane skupiska komórek RPE.

Aby wyizolować pigmentowane komórki RPE, najpierw trzymaj pojedyncze dziewięciocalowe szklane pipety Pasteura poziomo nad płomieniem palnika Bunsena, około dwóch trzecich długości cienkiej części pipety. Gdy podgrzana szklanka stanie się miękka, szybko rozsuń oba końce, aby na nowym końcu pipety utworzyć końcówkę przypominającą mikroskrobak. Spryskaj wyciągnięte pipety 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w kapturze do hodowli komórkowych.

Gdy pipety są gotowe, przemyj każdą studzienkę kultury różnicującej PBS i dodaj jeden mililitr 0,05% trypsyny uzupełnionej jedną jednostką na mikrolitr kolagenazy do każdej studzienki. Po 20 do 30 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza przerwij trawienie dwoma mililitrami pożywki RPE o temperaturze 37 stopni Celsjusza na dołek sześciodołkowej płytki i umieść płytkę na stoliku mikroskopowym. Za pomocą wyciągniętej pipety delikatnie postukaj w pigmentowane klastry RPE.

Jak tylko komórki oderwą się od dna studzienki, użyj mikropipety o pojemności 20 mikrolitrów, aby przenieść zdysocjowane komórki do pojedynczych dołków nowej płytki do hodowli komórkowej zawierającej pożywkę RPE. Po dodaniu około 5 000 komórek RPE do każdej studzienki 12-dołkowej płytki, zwiększ końcową objętość do dwóch mililitrów świeżą pożywką RPE i hoduj izolowane komórki hPSC-RPE przez kolejne sześć do ośmiu tygodni, aż zaobserwuje się monowarstwę pigmentowanych i dojrzałych komórek RPE w kształcie kostki brukowej. 24 do 72 godzin przed zaciskiem łaty przemyj pigmentowane komórki jednowarstwowe dwoma mililitrami PBS, a następnie, po usunięciu PBS, dodaj jeden mililitr 0,05% trypsyny plus jedną jednostkę na mikrolitr kolagenazy do komórek w każdym dołku 12-dołkowej płytki przez ośmiominutowy okres inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Kiedy komórki zaczną się odłączać, użyj mikropipety o pojemności jednego mililitra, aby delikatnie umyć komórki z dna studzienki i złóż zawiesinę komórek w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów. Dodaj jeden mililitr roztworu trypsyny i kolagenazy o temperaturze 37 stopni Celsjusza do studzienki. Inkubować przez kolejne osiem minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie umyć wszelkie pozostałe komórki z dna studzienki i połączyć zawiesinę komórek z tą samą stożkową probówką o pojemności 15 mililitrów.

Inkubuj komórki w suchej kąpieli o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez osiem minut, a następnie użyj mikropipety o pojemności jednego mililitra, aby delikatnie rozcierać komórki od 10 do 15 razy. Po dwukrotnej inkubacji i rozkrzewieniu komórek, dodaj pięć mililitrów pożywki RPE o temperaturze 37 stopni Celsjusza do zawiesiny pojedynczej komórki i osadź komórki przez odwirowanie. Zawiesić granulat w odpowiedniej objętości do wysiewu na wstępnie powlekanych płytkach z szkiełkami nakrywkowymi przy zbiegu od 10 do 20% i wykonać zacisk krosowy dla całych komórek zgodnie ze standardowymi protokołami.

Po udanej izolacji, ponad 90% komórek w populacji pasażowej zero powinno dojrzeć, aby wykazywać charakterystyczną morfologię komórek RPE. Dzięki podejściu opartemu na chorobie w naczyniu opartemu na hPSC-RPE, każdą specyficzną dla pacjenta mutację BEST1 można kompleksowo scharakteryzować pod kątem ekspresji białka, transportu błonowego i funkcji kanału jonowego, aby uzyskać kluczowe informacje do wyjaśnienia mechanizmów patologicznych RPE. Należy zauważyć, że niektóre mutacje BEST1 mogą wpływać na ekspresję białka, dlatego należy również sprawdzić inne dobrze znane markery RPE.

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych RPE trwa od trzech do sześciu miesięcy, w zależności od linii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i typu mutacji, a izolacja zróżnicowanych ludzkich komórek pluripotencjalnych może zostać zakończona w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując podzielić komórki na zacisk łatowy, ważne jest, aby pamiętać o bardzo delikatnym rozcieraniu komórek, aby uniknąć nadmiernej śmierci komórek. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak hodowla komórek 3D RPE, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób mutacje BEST1 wpływają na transport jonów na błonach wierzchołkowych i podstawnych komórek RPE.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się chorobami zwyrodnieniowymi siatkówki do zbadania fizjologicznych fenotypów i patologicznych mechanizmów komórek RPE pochodzących od pacjentów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak różnicować pluripotencjalne komórki macierzyste w komórki nabłonka barwnikowego siatkówki i jak przygotować komórki RPE do klamry całokomórkowej.