Name: Szybkie, skalowalne składanie i ładowanie bioaktywnych białek i immunostymulantów do różnych syntetycznych nanonośników za pomocą nanoprecypitacji błyskawicznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Poznaj metodę błyskawicznej nanoprecypitacji do skalowalnej produkcji nanonośników leków z bioaktywnymi białkami i immunostymulantami. Technika ta umożliwia badaczom nieposiadającym zaawansowanego doświadczenia chemicznego samodzielne tworzenie zaawansowanych systemów dostarczania leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za wsparcie personelu i oprzyrządowania ze strony Zakładu Biologii Strukturalnej Uniwersytetu Northwestern. Dziękujemy za wsparcie ze strony R.H. Lurie Comprehensive Cancer Center Uniwersytetu Northwestern oraz Placówek Biologii Strukturalnej Uniwersytetu Northwestern. Bezpośredni detektor elektronów Gatan K2 został zakupiony za fundusze przekazane przez Chicago Biomedical Consortium przy wsparciu Searle Funds z The Chicago Community Trust. Dziękujemy również następującym obiektom na Uniwersytecie Northwestern: Interdyscyplinarnemu Ośrodku Nauk o Powierzchni Keck, Ośrodkowi Biologii Strukturalnej, Ośrodku Obrazowania Biologicznego, Centrum Zaawansowanego Obrazowania Molekularnego oraz Rdzeniowi Sprzętu Analitycznego Bionanotechnologii. Badania te były wspierane przez grant National Science Foundation 1453576, National Institutes of Health Director's New Innovator Award 1DP2HL132390-01, Center for Regenerative Nanomedicine Catalyst Award oraz McCormick Catalyst Award 2014. SDA było częściowo wspierane przez NIH Predoctoral Biotechnology Training Grant T32GM008449.

<ol><li>Stano, A., Scott, E. A., Dane, K. Y., Swartz, M. A., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+T+cell+immunity+towards+a+protein+antigen+using+polymersomes+vs.+solid-core+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tunable T cell immunity towards a protein antigen using polymersomes vs. solid-core nanoparticles.</a> Biomaterials. 34 (17), 4339-4346 (2013).</li>
<li>Discher, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymersomes%3A+tough+vesicles+made+from+diblock+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Polymersomes: tough vesicles made from diblock copolymers.</a> Science. 284 (5417), 1143-1146 (1999).</li>
<li>Vasdekis, A. E., Scott, E. A., O'Neil, C. P., Psaltis, D., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+intracellular+delivery+based+on+optofluidic+polymersome+rupture%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Precision intracellular delivery based on optofluidic polymersome rupture.</a> ACS Nano. 6 (9), 7850-7857 (2012).</li>
<li>Yi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+Nanostructure+Morphology+for+Enhanced+Targeting+of+Dendritic+Cells+in+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Tailoring Nanostructure Morphology for Enhanced Targeting of Dendritic Cells in Atherosclerosis.</a> ACS Nano. 10 (12), 11290-11303 (2016).</li>
<li>Shum, H. C., Kim, J. W., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+fabrication+of+monodisperse+biocompatible+and+biodegradable+polymersomes+with+controlled+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Microfluidic fabrication of monodisperse biocompatible and biodegradable polymersomes with controlled permeability.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (29), 9543-9549 (2008).</li>
<li>Pessi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-assisted+engineering+of+polymeric+microcapsules+with+high+encapsulation+efficiency+for+protein+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-assisted engineering of polymeric microcapsules with high encapsulation efficiency for protein drug delivery.</a> International Journal of Pharmaceutics. 472 (1-2), 82-87 (2014).</li>
<li>O'Neil, C. P., Suzuki, T., Demurtas, D., Finka, A., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+encapsulation+of+biomolecules+into+polymersomes+via+direct+hydration%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">A novel method for the encapsulation of biomolecules into polymersomes via direct hydration.</a> Langmuir. 25 (16), 9025-9029 (2009).</li>
<li>Saad, W. S., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1748013215301201">Principles of nanoparticle formation by flash nanoprecipitation.</a> Nano Today. 11 (2), 212-227 (2016).</li>
<li>Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+for+rapid+self-assembly+of+block+copolymer+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Mechanism for rapid self-assembly of block copolymer nanoparticles.</a> Physical Review Letters. 91 (11), 118302(2003).</li>
<li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+confined+impingement+jets+mixer+for+flash+nanoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).</li>
<li>Allen, S., Osorio, O., Liu, Y. G., Scott, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+assembly+and+loading+of+theranostic+polymersomes+via+multi-impingement+flash+nanoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Facile assembly and loading of theranostic polymersomes via multi-impingement flash nanoprecipitation.</a> Journal of Controlled Release. 262, 91-103 (2017).</li>
<li>Bobbala, S., Allen, S. D., Scott, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+nanoprecipitation+permits+versatile+assembly+and+loading+of+polymeric+bicontinuous+cubic+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Flash nanoprecipitation permits versatile assembly and loading of polymeric bicontinuous cubic nanospheres.</a> Nanoscale. 10 (11), 5078-5088 (2018).</li>
<li>Allen, S. D., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s12274-018-2069-x">Polymersomes scalably fabricated via flash nanoprecipitation are non-toxic in non-human primates and associate with leukocytes in the spleen and kidney following intravenous administration.</a> Nano Research. , (2018).</li>
<li>Karabin, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+micellar+delivery+via+inducible+transitions+in+nanostructure+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Sustained micellar delivery via inducible transitions in nanostructure morphology.</a> Nature Communications. 9 (1), 624(2018).</li>
<li>Mascoli, C. C., Weary, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limulus+amebocyte+lysate+%28LAL%29+test+for+detecting+pyrogens+in+parenteral+injectable+products+and+medical+devices%3A+advantages+to+manufacturers+and+regulatory+officials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Parenteral+Drug+Association%22%5BJournal%5D)">Limulus amebocyte lysate (LAL) test for detecting pyrogens in parenteral injectable products and medical devices: advantages to manufacturers and regulatory officials.</a> Journal of the Parenteral Drug Association. 33 (2), 81-95 (1979).</li>
<li>Pustulka, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+nanoprecipitation%3A+particle+structure+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Flash nanoprecipitation: particle structure and stability.</a> Molecular Pharmaceutics. 10 (11), 4367-4377 (2013).</li>
<li>Tang, C., Amin, D., Messersmith, P. B., Anthony, J. E., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+directed+self-assembly+of+pH-responsive+antioxidant+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Polymer directed self-assembly of pH-responsive antioxidant nanoparticles.</a> Langmuir. 31 (12), 3612-3620 (2015).</li>
<li>Gindy, M. E., Panagiotopoulos, A. Z., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composite+block+copolymer+stabilized+nanoparticles%3A+simultaneous+encapsulation+of+organic+actives+and+inorganic+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Composite block copolymer stabilized nanoparticles: simultaneous encapsulation of organic actives and inorganic nanostructures.</a> Langmuir. 24 (1), 83-90 (2008).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Przedstawiliśmy szczegółowe instrukcje dotyczące szybkiego wytwarzania polimerosomów przy użyciu PEG 17-bl-PPS35-SH jako kopolimeru diblokowego. Polimeromy pęcherzykowe są pierwotną morfologią agregatu złożonego w tym stosunku hydrofilowego PEG i hydrofobowego bloku PPS o masie cząsteczkowej. Po wielokrotnym uderzeniu mają średnicę i polidyspersyjność, które odpowiadają polimeromom wytłaczanym przez membranę 200 nm po uformowaniu przez uwodnienie cienkiej warstwy. Protokół ten elim...

Nanonośniki pozwalają na kontrolowane dostarczanie małych i makromolekularnych ładunków, w tym aktywnych jednostek, które, jeśli nie są zamknięte, byłyby albo wysoce degradowalne i/lub zbyt hydrofobowe do podawania in vivo. Spośród regularnie wytwarzanych morfologii nanonośników, pęcherzyki polimerowe analogiczne do liposomów (zwanych również polimeromami) oferują możliwość jednoczesnego ładowania ładunku hydrofilowego i hydrofobowego 1,2. Pomimo obiecujących zalet, polimeromy są nadal rzadkie w zastosowaniach klinicznych, częściowo ze względu na kilka kluczowych wyzwań związanych z ich produkcją. Do użytku klinicznego preparaty polimerowe muszą być wytwarzane w dużych, sterylnych i spójnych partiach.
Do tworzenia polimeromów z kopolimeru diblokowego można użyć wielu technik, takich jak poli(glikol etylenowy)-blok-poli(siarczek propylenu) (PEG-bl-PPS), które zawierają dyspersję rozpuszczalnika3, thin film rehydration1,4, mikrofluidyka 5,6, oraz bezpośrednie uwodnienie7. Dyspersja rozpuszczalnika wiąże się z długim czasem inkubacji w obecności rozpuszczalników organicznych, które mogą denaturować niektóre ładunki bioaktywne, takie jak białka. Rehydratacja cienkowarstwowa nie zapewnia kontroli nad polidyspersyjnością utworzonych polimeromów, często wymagając kosztownych i czasochłonnych technik wytłaczania w celu uzyskania akceptowalnej monodyspersyjności. Co więcej, zarówno mikropłyny, jak i bezpośrednie uwodnienie są trudne do skalowania w przypadku większych wolumenów produkcji. Spośród różnych metod wytwarzania nanonośników, nanoprecypitacja błyskawiczna (FNP) oferuje możliwość tworzenia wielkoskalowych i powtarzalnych preparatów8,9,10. Podczas gdy FNP był wcześniej zarezerwowany do formułowania nanocząstek z rdzeniem stałym, nasze laboratorium niedawno rozszerzyło zastosowanie FNP o konsekwentne tworzenie różnych morfologii nanostruktur PEG-bl-PPS11,12, w tym polimersomes11 i nanosfery biciągłe12. Odkryliśmy, że FNP był zdolny do tworzenia monodyspersyjnych preparatów polimeromów bez konieczności wytłaczania, co skutkowało lepszymi wartościami wskaźnika polidyspersyjności w porównaniu z nieekstrudowanymi polimeromami utworzonymi przez rehydratację cienkowarstwową i dyspersję rozpuszczalnika11. Dwuciągłe nanosfery, z ich dużymi domenami hydrofobowymi, nie były w stanie powstać przez cienkowarstwowe ponowne uwodnienie, pomimo formowania w wielu warunkach rozpuszczalnikowych z FNP12.
Tutaj podajemy szczegółowy opis syntezy kopolimeru diblokowego PEG-bl-PPS używanego do tworzenia polimeromów, mieszalnika CIJ (Limited Impactment Jets) używanego dla FNP, samego protokołu FNP oraz implementacji zautomatyzowanego systemu w celu zmniejszenia zmienności użytkownika. Zamieszczono informacje o tym, jak wysterylizować system w stopniu wystarczającym do wytworzenia preparatów wolnych od endotoksyn do stosowania in vivo, a także reprezentatywne dane dotyczące charakterystyki polimeromów tworzonych przez FNP. Dzięki tym informacjom czytelnicy zainteresowani wykorzystaniem polimerosomów do prac in vitro i in vivo będą mogli wytwarzać własne sterylne, monodyspersyjne preparaty. Czytelnicy z doświadczeniem w formulacjach nanonośników i posiadający wiedzę specjalistyczną w zakresie syntezy polimerów będą mogli szybko przetestować własne systemy polimerowe przy użyciu FNP jako potencjalnej alternatywy dla obecnych technik formulacji. Dodatkowo, opisane w niniejszym dokumencie protokoły mogą być wykorzystywane jako narzędzia edukacyjne do formułowania nanonośników na kursach laboratoryjnych nanotechnologii.

<table><tbody><tr><td>Zestaw startowy CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate - 32 GB Edition</td><td>CanaKit</td><td>UPC 682710991511</td><td></td></tr><tr><td>Platforma łożysk liniowych (mała) - średnica 8 mm</td><td>Adafruit</td><td>1179</td><td></td></tr><tr><td>Linear Motion Wałek 8 mm, długość 330 mm, chromowany, utwardzany powierzchniowo, metryczny</td><td>Zestaw VXB11868</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prowadnica/podpora wału szyny liniowej - średnica 8 mm</td><td>Adafruit</td><td>1182</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjna prowadnica w pozycji ręcznej 4,5 cala skok, udźwig 15 funtów</td><td>McMaster-Carr</td><td>5236A16</td><td></td></tr><tr><td>MTPM-P10-1JK43 Silnik prądu stałego Iron</td><td>Horse Iron Horse</td><td>MTPM-P10-1JK43</td><td></td></tr><tr><td>Oficjalny ekran dotykowy Raspberry Pi Foundation 7" Wyświetlacz LCD</td><td>Raspberry Pi</td><td>B0153R2A9I (ASIN)</td><td></td></tr><tr><td>PicoBorg Reverse - Zaawansowane sterowanie silnikiem dla Raspberry Pi</td><td>PiBorg</td><td>BURN-0011</td><td></td></tr><tr><td>Nośnik Pololu z cyfrowym czujnikiem odległości Sharp GP2Y0D810Z0F 10cm</td><td>Pololu</td><td>1134</td><td></td></tr><tr><td>Ruland PSR16-5-4-A Łącznik belki śrubowej dociskowej, polerowane aluminium, cale, 5/16" średnica otworu A, średnica otworu 1/4" B, średnica zewnętrzna 1" OD, długość 1-1/4", 44 lb-in Nominalny moment obrotowy</td><td>Ruland</td><td>PSR16-5-4-A</td><td></td></tr><tr><td>Eter monometylowy glikolu polietylenowego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>202495</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek metanosulfonylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>471259</td><td></td></tr><tr><td>Toluen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>179418</td><td></td></tr><tr><td>Toluen, bezwodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>Trietyloamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>Celite 545 (Ziemia Okrzemkowa)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>419931</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorometan</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>320269</tr><tr><td>Eter dietylowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetyloformamid, bezwodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>Węglan potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>791776</td><td></td></tr><tr><td>Kwas tiooctowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T30805</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran</td><td>Sigma Aldrich</td><td>360589</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium tlenek, obojętny, aktywowany, Brockmann I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>199974</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór mettlenku sodu, 0,5 M w metanolu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>403067</td><td></td></tr><tr><td>Siarczek propylenu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P53209</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320390</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu, roztwór 1,0 N</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2770</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od endotoksyn</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30529.01</td><td></td></tr><tr><td>Papierowe paski pH</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-640-508</td><td></td></tr><tr><td>Bez endotoksyn Dulbecco's PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TMS-012</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki scyntylacyjne ze szkła borokrzemianowego</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-4</td><td></td></tr><tr><td>1 ml strzykawka wykonana w całości z tworzywa sztucznego</td><td>Thermo Scientific</td><td>S75101</td><td></td></tr><tr><td>Sepharose CL-6B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CL6B200</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna do chromatografii cieczowej</td><td>Mieszalnik CIJ Sigma Aldrich</td><td>C4169</td><td></td></tr>, <tr><td>HDPE</td><td>Custom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór nadtlenku wodoru</td><td>Sigma Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>HEK-Blue hTLR4</td><td>InvivoGen</td><td>hkb-htlr4</td><td></td></tr><tr><td>RAW-Blue Cells</td><td>InvivoGen</td><td>raw-sp</td><td></td></tr><tr><td>QUANTI-Blue</td><td>InvivoGen</td><td>rep-qb1</td><td></td></tr><tr><td>PYROGENT Gel Clot LAL Testy LAL</td><td>Lonza</td><td>N183-125</td><td></td></tr></tbody></table>

szybkie, skalowalne składanie i ładowanie bioaktywnych białek i immunostymulantów do różnych syntetycznych nanonośników za pomocą nanoprecypitacji błyskawicznej

Rapid, Scalable Assembly and Loading of Bioactive Proteins and Immunostimulants into Diverse Synthetic Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

Nanomateriały oferują szeroki zakres opcji dostosowywania kontrolowanego dostarczania pojedynczych i połączonych ładunków molekularnych do zastosowań terapeutycznych i obrazowania. Ta zwiększona specyficzność może mieć znaczące implikacje kliniczne, w tym zmniejszone skutki uboczne i niższe dawki o większej sile działania. Co więcej, celowanie in situ i kontrolowana modulacja określonych podzbiorów komórek może usprawnić badania in vitro i in vivo podstawowych zjawisk biologicznych i funkcji komórek sondujących. Niestety, wymagana wiedza specjalistyczna w dziedzinie nauki, chemii i inżynierii w nanoskali często uniemożliwia laboratoriom nieposiadającym doświadczenia w tych dziedzinach wytwarzanie i dostosowywanie nanomateriałów jako narzędzi do swoich badań lub nośników ich strategii terapeutycznych. W tym miejscu udostępniamy protokoły syntezy i skalowalnego montażu wszechstronnego nietoksycznego systemu kopolimerów blokowych, który można łatwo formować i ładować nośniki w skali nano do zastosowań biomedycznych. Nanoprecypitacja błyskawiczna jest przedstawiana jako metodologia szybkiego wytwarzania różnych nanonośników z kopolimerów poli(glikolu etylenowego)-bl-poli(siarczku propylenu). Protokoły te umożliwią laboratoriom dysponującym szeroką wiedzą specjalistyczną i zasobami łatwe i powtarzalne wytwarzanie zaawansowanych systemów dostarczania nanonośników do swoich zastosowań. Opisano projekt i budowę zautomatyzowanego przyrządu, który wykorzystuje wysokoobrotową pompę strzykawkową w celu ułatwienia procesu nanoprecypitacji błyskawicznej i umożliwienia lepszej kontroli nad jednorodnością, rozmiarem, morfologią i obciążeniem nanonośników polimerowych.

W niniejszej pracy przedstawiliśmy prosty protokół formulacji nanonośników zdolnych do ładowania ładunku hydrofilowego i hydrofobowego, które są bezpieczne do podawania in vivo myszom oraz naczelnym spoza gatunku ludzkiego11,13. Zamieściliśmy również szczegółowy protokół syntezy polimeru wykorzystanego w naszych reprezentatywnych wynikach, wraz z opisem wykonania niestandardowego urządzenia do mechanicznie kontrolowanego ...

Nanomateriały zapewniają wszechstronne mechanizmy kontrolowanego dostarczania terapeutycznego zarówno dla nauk podstawowych, jak i zastosowań translacyjnych, ale ich wytwarzanie często wymaga specjalistycznej wiedzy, która jest niedostępna w większości laboratoriów biomedycznych. W tym miejscu przedstawiamy protokoły skalowalnego wytwarzania i ładowania terapeutycznego różnorodnych, samoorganizujących się nanonośników za pomocą nanoprecypitacji błyskawicznej.

Szybkie, skalowalne składanie i ładowanie bioaktywnych białek i immunostymulantów do różnych syntetycznych nanonośników za pomocą nanoprecypitacji błyskawicznej

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging ...

Wierzymy, że zastosowanie nanoprecypitacji błyskawicznej do składania złożonych nanostruktur pozwoli naukowcom, którzy nie mają dużego doświadczenia w chemii, inżynierii lub nauce o nanomateriałach, na samodzielne wytwarzanie zaawansowanych systemów dostarczania leków dla ich własnych specyficznych zastosowań i potrzeb. Główną zaletą tej techniki jest generowanie dużych objętości różnorodnych nanostruktur o wysokim stężeniu, niskiej polidyspersyjności i załadowanych bioaktywnymi cząsteczkami, w tym lekami małocząsteczkowymi i białkami, które powstają w sterylnych warunkach. Ogólnie rzecz biorąc, osoby początkujące w syntezie polimerów mogą mieć problemy, ponieważ składnik siarczku polipropylenu jest bardzo wrażliwy na utlenianie pod wpływem powietrza.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ wiele etapów uderzenia jest trudnych do nauczenia, ponieważ muszą być wykonywane bardzo szybko po sobie. Aby wysterylizować ograniczone dysze uderzeniowe lub mieszalnik CIJ, pracuj w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zanurzyć mieszalnik ze wszystkimi częściami zdemontowanymi w punkcie zerowym jednomolowego wodorotlenku sodu na noc. Ponownie zmontuj mieszalnik CIJ i przepuść przez niego wodę wolną od endotoksyn za pomocą strzykawek typu luerlock, przetestuj pH wody i kontynuuj przepływanie wody, aż pH zarejestruje się jako neutralne.Aby przygotować pierwszy roztwór uderzeniowy, najpierw odważ 20 miligramów zsyntetyzowanego polimeru do jednopunktowej pięciomililitrowej probówki. Następnie dodaj barwniki hydrofobowe, leki lub inny ładunek. Na koniec dodaj 500 mikrolitrów 100% tetrahydrofuranu do polimeru i ładunku, energicznie wiruj, aby się rozpuścić.Aby przygotować drugi roztwór uderzeniowy, rozpuść ładunek hydrofilowy, który ma być załadowany do pęcherzyków polimerowych, w 500 mikrolitrach buforu wodnego. Dodaj 2,5 mililitra wybranego buforu wodnego do zbiornika o odpowiedniej wielkości. Teraz umieść zbiornik pod mieszaczem CIJ tak, aby odpływ z mieszalnika bezpośrednio wchodził do zbiornika.Załaduj roztwory uderzeniowe do oddzielnych jednorazowych strzykawek z tworzywa sztucznego o pojemności jednego mililitra, uderzając roztworami o siebie, aby jednocześnie utworzyć nanostruktury, wkładając strzykawki do adapterów luerlock w górnej części miksera CIJ. Jednym, płynnym i szybkim ruchem wciśnij obie strzykawki jednocześnie i z równą siłą. Jeśli ma być wykonywanych wiele uderzeń, bardzo ważne jest, aby zostały one wykonane tak szybko, jak to możliwe, aby zmniejszyć straty rozpuszczalnika organicznego Valtower.Aby wykonać wielokrotne uderzenia, podziel powstający roztwór nanostruktury na dwie strzykawki i powtórz ten krok do czterech razy. Zebrać odpływ w wodnym zbiorniku wypełnionym buforem i delikatnie wymieszać, aby zapewnić wymieszanie. Istnieje kilka możliwości usunięcia rozładowanego ładunku i rozpuszczalnika organicznego.Preparat nanonośnika można usunąć poprzez wyłączenie z akcyzy lub kolumnę odsalającą, przez system filtracji o przepływie stycznym, przez suszenie próżniowe lub przez dializę, jak pokazano tutaj. Preparat nanonośnika należy dializować w tym samym wodnym buforze i zbiorniku, które są używane do uderzenia. Używać przewodów o odpowiedniej granicy masy cząsteczkowej przez co najmniej 24 godziny, z co najmniej dwiema wymianami buforu.Po usunięciu rozładowanego ładunku z rozpuszczalnika organicznego należy skoncentrować preparat nanonośnika za pomocą koncentratora wirowego zgodnie z instrukcjami producenta. Nanonośniki mogą być przechowywane w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez tygodnie lub miesiące. Przed użyciem po przechowywaniu, preparaty nanonośników należy krótko zawirować.Wykonać wykonanie wysokoobrotowej pompy strzykawkowej zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby użyć trybu automatycznego uruchamiania, wybierz automatyczne uruchamianie z menu głównego. System poprosi użytkowników, aby zezwolili silnikowi na automatyczne ustawienie platformy wypychania strzykawki na początku precyzyjnego suwaka.Przed kontynuowaniem upewnij się, że ścieżka przed i za metalową płytą jest wolna. Załaduj mieszalnik CIJ do prostokątnego otworu tylnego wózka wypędzającego. Następnie załaduj jednomililitrowe plastikowe strzykawki, tak jak poprzednio, i zamontuj strzykawki na żeńskich łącznikach przynęty mieszalnika CIJ.Przed uruchomieniem przyrządu ustaw żądaną prędkość silnika i sprawdź, czy system jest czysty, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby usunąć reagenty ze strzykawek i do mieszalnika CIJ, naciśnij przycisk uruchamiania w interfejsie oprogramowania. Reprezentatywne mikrografie elektronów z transmisją kriogeniczną wykazują mniejsze i bardziej monodyspersyjne polimerosomy po wielokrotnych uderzeniach.Analiza dynamicznego rozpraszania światła potwierdziła przesunięcie w lewo rozkładu wielkości polimeromów po powtarzających się uderzeniach. Po pięciu powtarzających się uderzeniach średnia średnica i polidyspersyjność polimeromów odpowiadają średniej średnicy i polidyspersyjności wytłaczanych próbek utworzonych przez rehydratację cienkich warstw. Nanoprecypitacja błyskawiczna może być stosowana do ładowania różnych hydrofobowych i hydrofilowych małych cząsteczek i makrocząsteczek do polimeromów.Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat funkcjonowania immunoterapii i szczepionek, można ją również zastosować do badania tego, w jaki sposób polimery samoorganizują się w skomplikowane nanostruktury. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak podawanie dożylne lub podskórne modelom zwierzęcym, w celu określenia, które podzbiory komórek internalizują nanocząstki lub jaka jest droga klirensu dla różnych nanostruktur. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię chorób serca i raka, a także na rozwój szczepionek przeciwko chorobom zakaźnym, ponieważ te nanonośniki mogą kierować wiele leków do bardzo specyficznych komórek odpornościowych.

rapid-scalable-assembly-loading-bioactive-proteins-immunostimulants

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejszy artykuł opisuje metodę nanoprecypitacji do syntezy nanocząsteczek polimerowych z wykorzystaniem kopolimerów diblokowych. Omówimy syntezę kopolimerów diblokowych, technikę nanoprecypitacji oraz potencjalne zastosowania.

Formułowanie diblokowych nanocząstek polimerowych za pomocą techniki nanoprecypitacji

W niniejszym artykule przedstawiono wysokoprzepustową metodę syntezy oligosacharydów oraz ich przyłączania do powierzchni nanocząsteczek polianhydrydu w celu ich dalszego wykorzystania w celowaniu w specyficzne receptory na komórkach prezentujących antygen.

Wysokoprzepustowa synteza węglowodanów i funkcjonalizacja nanocząstek polianhydrydu

Opisujemy obrazowanie całego zwierzęcia i techniki oparte na cytometrii przepływowej do monitorowania ekspansji limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu w odpowiedzi na immunizację nanocząstkami w mysim modelu szczepienia.

Obrazowanie całych zwierząt i techniki cytometrii przepływowej do analizy odpowiedzi limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu po szczepieniu nanocząstkami

Prosta homogenizacja została wykorzystana do przygotowania nowatorskich, wysokiej gęstości, naśladujących lipoproteiny nanocząsteczek do enkapsulacji czynnika wzrostu nerwów. W artykule opisano wyzwania, szczegółowe protokoły przygotowania nanocząstek, charakterystyki in vitro oraz badań in vivo.

Przygotowanie i charakterystyka nowych nanocząstek naśladujących HDL do enkapsulacji czynnika wzrostu nerwów

Tutaj prezentujemy protokół szybkiego i powtarzalnego generowania biologicznie inspirowanych, biodegradowalnych komórek prezentujących antygen sztuczny (aAPC) o regulowanym rozmiarze, kształcie i prezentacji białka powierzchniowego do ekspansji limfocytów T ex vivo lub in vivo.

Wytwarzanie anizotropowych polimerowych sztucznych komórek prezentujących antygen do aktywacji limfocytów T CD8 +

Flash NanoPrecipitation (FNP) to skalowalne podejście do produkcji polimerowych nanocząstek typu rdzeń-powłoka. Opisano preparaty na skalę laboratoryjną do kapsułkowania terapii hydrofobowych lub hydrofilowych.

Nanoprecypitacja błyskawiczna do enkapsulacji związków hydrofobowych i hydrofilowych w nanocząstkach polimerowych

Na styku rozpuszczalników organicznych i wodnych, dostosowane do potrzeb amfifilowe białka podobne do elastyny łączą się w złożone struktury supramolekularne, takie jak pęcherzyki, włókna i koacerwaty wywołane parametrami środowiskowymi. Opisane protokoły montażu pozwalają uzyskać kompartmenty oparte na błonach białkowych (PMBC) o przestrajalnych właściwościach, umożliwiające enkapsulację różnych ładunków.

Ukierunkowane składanie białek podobnych do elastyny w zdefiniowane struktury supramolekularne i enkapsulacja ładunku in vitro

Nanocząsteczki lipidowe są opracowywane przy użyciu mikroprzepływowej platformy mieszania do enkapsulacji mRNA i DNA.

Formułowanie i charakteryzowanie nanocząstek lipidowych do dostarczania genów przy użyciu platformy mieszania mikroprzepływowego

Tutaj przedstawiono prosty protokół produkcji nanocząsteczek mRNA opartych na polimerach poli(beta aminoestrowych), który można łatwo dostosować poprzez zmianę kapsułkowanego mRNA. Opisano również przebieg syntezy polimerów, nanocząstek oraz ich niezbędną charakterystykę in vitro. Dodano również dowód słuszności koncepcji dotyczący szczepień.

Synteza i charakterystyka nanocząstek poli(beta-aminoestrów) obciążonych mRNA do celów szczepień

Nanożele są doskonałą i wszechstronną platformą nanocząsteczek do dostarczania leków biologicznych. Reagujące na bodźce polimerowe nanożele na bazie glikolu poli(etylenowego), zdolne do kapsułkowania ładunków opartych na białkach, zsyntetyzowano przy użyciu jednoetapowej strategii sieciowania ko-nanopolimeryzacji w warunkach wodnych. Przedstawiono tutaj optymalne wytwarzanie i charakterystykę tych nowych nanocząstek.

Synteza nanożeli reagujących na bodźce przy użyciu wodnego jednoetapowego sieciowania i konanopolimeryzacji

Szczegółowy protokół syntezy nanocząsteczek lipidowych (LNP) przy użyciu technologii mieszalnika CIJ (Limited Impinging Jet), w tym dwustrumieniowego CIJ i czterostrumieniowego mieszalnika wirowego z wieloma wlotami (μMIVM), jest zademonstrowany. Mieszalniki CIJ generują powtarzalne, turbulentne środowiska mikromieszania, co skutkuje produkcją monodyspersyjnych LNP.

Synteza nanocząstek lipidowych przez przepływ turbulentny w ograniczonych mieszalnikach strumieniowych z uderzeniem

Poznaj metodę błyskawicznej nanoprecypitacji do skalowalnej produkcji nanonośników leków z bioaktywnymi białkami i immunostymulantami. Technika ta umożliwia badaczom nieposiadającym zaawansowanego doświadczenia chemicznego samodzielne tworzenie zaawansowanych systemów dostarczania leków.

Szybkie, skalowalne składanie i ładowanie bioaktywnych białek i immunostymulantów do różnych syntetycznych nanonośników za pomocą nanoprecypitacji błyskawicznej (Wideo) | JoVE Journal

Szybkie, skalowalne składanie i ładowanie bioaktywnych białek i immunostymulantów do różnych syntetycznych nanonośników za pomocą nanoprecypitacji błyskawicznej

Przeglądaj więcej filmów