Szybkie, skalowalne składanie i ładowanie bioaktywnych białek i immunostymulantów do różnych syntetycznych nanonośników za pomocą nanoprecypitacji błyskawicznej

Wierzymy, że zastosowanie nanoprecypitacji błyskawicznej do składania złożonych nanostruktur pozwoli naukowcom, którzy nie mają dużego doświadczenia w chemii, inżynierii lub nauce o nanomateriałach, na samodzielne wytwarzanie zaawansowanych systemów dostarczania leków dla ich własnych specyficznych zastosowań i potrzeb. Główną zaletą tej techniki jest generowanie dużych objętości różnorodnych nanostruktur o wysokim stężeniu, niskiej polidyspersyjności i załadowanych bioaktywnymi cząsteczkami, w tym lekami małocząsteczkowymi i białkami, które powstają w sterylnych warunkach. Ogólnie rzecz biorąc, osoby początkujące w syntezie polimerów mogą mieć problemy, ponieważ składnik siarczku polipropylenu jest bardzo wrażliwy na utlenianie pod wpływem powietrza.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ wiele etapów uderzenia jest trudnych do nauczenia, ponieważ muszą być wykonywane bardzo szybko po sobie. Aby wysterylizować ograniczone dysze uderzeniowe lub mieszalnik CIJ, pracuj w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zanurzyć mieszalnik ze wszystkimi częściami zdemontowanymi w punkcie zerowym jednomolowego wodorotlenku sodu na noc. Ponownie zmontuj mieszalnik CIJ i przepuść przez niego wodę wolną od endotoksyn za pomocą strzykawek typu luerlock, przetestuj pH wody i kontynuuj przepływanie wody, aż pH zarejestruje się jako neutralne.

Aby przygotować pierwszy roztwór uderzeniowy, najpierw odważ 20 miligramów zsyntetyzowanego polimeru do jednopunktowej pięciomililitrowej probówki. Następnie dodaj barwniki hydrofobowe, leki lub inny ładunek. Na koniec dodaj 500 mikrolitrów 100% tetrahydrofuranu do polimeru i ładunku, energicznie wiruj, aby się rozpuścić.

Aby przygotować drugi roztwór uderzeniowy, rozpuść ładunek hydrofilowy, który ma być załadowany do pęcherzyków polimerowych, w 500 mikrolitrach buforu wodnego. Dodaj 2,5 mililitra wybranego buforu wodnego do zbiornika o odpowiedniej wielkości. Teraz umieść zbiornik pod mieszaczem CIJ tak, aby odpływ z mieszalnika bezpośrednio wchodził do zbiornika.

Załaduj roztwory uderzeniowe do oddzielnych jednorazowych strzykawek z tworzywa sztucznego o pojemności jednego mililitra, uderzając roztworami o siebie, aby jednocześnie utworzyć nanostruktury, wkładając strzykawki do adapterów luerlock w górnej części miksera CIJ. Jednym, płynnym i szybkim ruchem wciśnij obie strzykawki jednocześnie i z równą siłą. Jeśli ma być wykonywanych wiele uderzeń, bardzo ważne jest, aby zostały one wykonane tak szybko, jak to możliwe, aby zmniejszyć straty rozpuszczalnika organicznego Valtower.

Aby wykonać wielokrotne uderzenia, podziel powstający roztwór nanostruktury na dwie strzykawki i powtórz ten krok do czterech razy. Zebrać odpływ w wodnym zbiorniku wypełnionym buforem i delikatnie wymieszać, aby zapewnić wymieszanie. Istnieje kilka możliwości usunięcia rozładowanego ładunku i rozpuszczalnika organicznego.

Preparat nanonośnika można usunąć poprzez wyłączenie z akcyzy lub kolumnę odsalającą, przez system filtracji o przepływie stycznym, przez suszenie próżniowe lub przez dializę, jak pokazano tutaj. Preparat nanonośnika należy dializować w tym samym wodnym buforze i zbiorniku, które są używane do uderzenia. Używać przewodów o odpowiedniej granicy masy cząsteczkowej przez co najmniej 24 godziny, z co najmniej dwiema wymianami buforu.

Po usunięciu rozładowanego ładunku z rozpuszczalnika organicznego należy skoncentrować preparat nanonośnika za pomocą koncentratora wirowego zgodnie z instrukcjami producenta. Nanonośniki mogą być przechowywane w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez tygodnie lub miesiące. Przed użyciem po przechowywaniu, preparaty nanonośników należy krótko zawirować.

Wykonać wykonanie wysokoobrotowej pompy strzykawkowej zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby użyć trybu automatycznego uruchamiania, wybierz automatyczne uruchamianie z menu głównego. System poprosi użytkowników, aby zezwolili silnikowi na automatyczne ustawienie platformy wypychania strzykawki na początku precyzyjnego suwaka.

Przed kontynuowaniem upewnij się, że ścieżka przed i za metalową płytą jest wolna. Załaduj mieszalnik CIJ do prostokątnego otworu tylnego wózka wypędzającego. Następnie załaduj jednomililitrowe plastikowe strzykawki, tak jak poprzednio, i zamontuj strzykawki na żeńskich łącznikach przynęty mieszalnika CIJ.

Przed uruchomieniem przyrządu ustaw żądaną prędkość silnika i sprawdź, czy system jest czysty, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby usunąć reagenty ze strzykawek i do mieszalnika CIJ, naciśnij przycisk uruchamiania w interfejsie oprogramowania. Reprezentatywne mikrografie elektronów z transmisją kriogeniczną wykazują mniejsze i bardziej monodyspersyjne polimerosomy po wielokrotnych uderzeniach.

Analiza dynamicznego rozpraszania światła potwierdziła przesunięcie w lewo rozkładu wielkości polimeromów po powtarzających się uderzeniach. Po pięciu powtarzających się uderzeniach średnia średnica i polidyspersyjność polimeromów odpowiadają średniej średnicy i polidyspersyjności wytłaczanych próbek utworzonych przez rehydratację cienkich warstw. Nanoprecypitacja błyskawiczna może być stosowana do ładowania różnych hydrofobowych i hydrofilowych małych cząsteczek i makrocząsteczek do polimeromów.

Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat funkcjonowania immunoterapii i szczepionek, można ją również zastosować do badania tego, w jaki sposób polimery samoorganizują się w skomplikowane nanostruktury. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak podawanie dożylne lub podskórne modelom zwierzęcym, w celu określenia, które podzbiory komórek internalizują nanocząstki lub jaka jest droga klirensu dla różnych nanostruktur. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię chorób serca i raka, a także na rozwój szczepionek przeciwko chorobom zakaźnym, ponieważ te nanonośniki mogą kierować wiele leków do bardzo specyficznych komórek odpornościowych.