Name: Posiew tkanki jajnikowej w celu wizualizacji zjawisk w jajniku myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 30 s
Description: Poznaj technikę posiewu tkanki jajnikowej myszy do badania rozwoju pęcherzyków i atrezji w kontrolowanych warunkach kultury. Ta metoda umożliwia obserwację czasową procesów jajnikowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Naojiro Minami (Uniwersytet w Kioto) za dostarczenie myszy Oog1pro3.9. Badania te były wspierane przez JSPS (KAKENHI #JP15H06275) i Fundację Nitto.

Myszy były trzymane w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze 23 ±1 °C z cyklem 12 godzin światła/12 godzin ciemności. Protokoły opieki nad zwierzętami i eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach na Uniwersytecie Medycznym w Aichi i zostały zatwierdzone przez obecny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania.
1. Przygotowanie podłoża hodowlanego i potraw
<ol>
	<li>Aby przygotować podstawową pożywkę hodowlaną, dodać płodową surowicę bydlęcą (FBS, 5% v/v), FSH (100 mIU/ml), LH (10 mU/ml) i penicylinę-streptomycynę (penicylinę, 100 U/ml; streptomycynę, 100 mg/ml) do minimalnej niezbędnej pożywki alfa (MEM-alfa) i wymieszać w probówkach o pojemności 50 ml. 
	UWAGA: Całkowite objętości wymaganych pożywek hodowlanych różnią się w zależności od eksperymentu, ale 1 ml pożywki hodowlanej jest na ogół wystarczający na 3,5 cm naczynia hodowlane ze szklanym dnem.</li>
	<li>Wlać 1 ml porcji mieszanej pożywki hodowlanej do 3,5 cm naczyń hodowlanych ze szklanym dnem i umieścić w szalkach 30-milimetrowe wkładki do hodowli komórkowych. Wstępnie podgrzej podłoża i naczynia w inkubatorze (5% CO2 i 37 °C).</li>
</ol>
2. Przygotowanie tkanki jajnikowej
<ol>
	<li>Wstępnie podgrzana sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) (−) i MEM-alfa zawierające 5% FBS, 100 U/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny w inkubatorze (5%CO2 i 37 °C). 
	UWAGA: Około 3 ml porcji PBS (−) na jajnik wystarcza do użycia podczas rozwarstwiania jajników, a 1 ml porcji MEM-alfa wystarczają do przejściowego przechowywania pojedynczych jajników w szalkach o średnicy 3,5 cm.</li>
	<li>Wytnij jajniki od 4-tygodniowej samicy myszy ICR (nazwanej tak na cześć Instytutu Badań nad Rakiem) i przytnij tkanki otaczające jajnik za pomocą nożyczek i pęsety pod mikroskopem stereoskopowym. Usunięte jajniki należy zarezerwować w pożywce hodowlanej (patrz krok 2.1) do czasu użycia.
	<ol>
		<li>Umieścić pojedyncze jajniki na bibule filtracyjnej zwilżonej wstępnie podgrzanym PBS (−) (patrz krok 2.1) i pokroić na 4 części za pomocą ostrza mikrotomu pod mikroskopem stereoskopowym. 
		UWAGA: Jajniki 4-tygodniowych myszy ICR mają średnicę około 2 mm. Liczba sztuk zależy od wielkości jajnika; Jednak kawałki o grubości około 500 μm pozwalają na prawidłowe obserwacje pęcherzyków (w kawałkach grubszych niż 500 mm przezroczystość tkanki jest zmniejszona; w kawałkach cieńszych niż 500 mm wiele pęcherzyków antralnych ulega pęknięciu i utracie).</li>
		<li>Po rozbiorzeniu umieść pokrojone próbki jajników we wstępnie podgrzanej pożywce hodowlanej na 3,5 cm szalkach (patrz krok 2.1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Posiew tkankowy jajnika
<ol>
	<li>Upuść około 0,5 μl pożywki hodowlanej na plasterki tkanki jajnika na wkładkę do hodowli komórkowej, w której tkanka jajnika zostanie osadzona za pomocą mikropipety.</li>
	<li>Umieść każdą pokrojoną próbkę w kropli pożywki hodowlanej na wkładkach do hodowli komórkowych za pomocą pęsety.</li>
	<li>Hodowla tkanek jajnika w 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wymieniaj pożywkę na świeżą, wstępnie ogrzaną pożywkę co 2 dni. 
	UWAGA: Harmonogram zmian pożywki w hodowli wycinków jajników od 4-tygodniowych myszy ICR jest przedstawiony w <silna klasa="xfig">Rysunek 1.
	<ol>
		<li>Aby odtworzyć wyrzut LH, należy traktować jajniki 4-tygodniowych myszy ICR pożywką zawierającą 100 mU / mL FSH i LH przez 12 godzin co 4 dni (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Obrazy mikroskopowe jajników hodowlanych
<ol>
	<li>Obrazowanie hodowanych jajników należy rozpocząć po 1 dniu, kiedy tkanki przylgną do wkładek do hodowli komórkowych i wykonywać analizy mikroskopowe konfokalne lub odwrócone w odstępach 24 godzin, aby umożliwić wystarczający wzrost pęcherzyków między punktami czasowymi. 
	UWAGA: Mikroskopia konfokalna jest lepsza od mikroskopii odwróconej do obserwacji pęcherzyków w całych hodowanych jajnikach.</li>
</ol>
5. Obrazowanie poklatkowe zakulturowanych jajników
<ol>
	<li>Zoptymalizuj warunki obrazowania poklatkowego, w tym intensywność lasera i czasy naświetlania, dla systemu obrazowania (Tabela 1).
	<ol>
		<li>Wybierz sparowane próbki jajników od pojedynczych myszy do wykorzystania jako grupa terapeutyczna i kontrolna. Zmieniaj intensywność lasera i czas naświetlania, aby uzyskać najlepsze obrazy (Tabela 1).</li>
		<li>Porównaj wzrost pęcherzyków w każdych warunkach hodowli, mierząc obszary pęcherzyków na obrazach próbek kontrolnych w odstępach 24-godzinnych oraz w próbkach obrazowania poklatkowego (patrz krok 6). Jednocześnie należy policzyć liczbę owulowanych komórek jajowych w każdym zestawie jajników i wybrać optymalne warunki obrazowania poklatkowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rejestruj obrazy w odstępach 30-minutowych za pomocą systemu obrazowania poklatkowego w określonych warunkach (tabela 1).</li>
</ol>
6. Analiza wzrostu mieszków włosowych
<ol>
	<li>Aby przeanalizować rozwój mieszków włosowych, zmierz obszary mieszków włosowych na przechwyconych obrazach za pomocą oprogramowania ImageJ (http://resbweb.nih.gov/ij/).
	<ol>
		<li>Początkowo ustaw skalę obrazu, klikając "Ustaw skalę" w sekcji "Analizuj" na pasku narzędzi. Wprowadź długości boków przechwyconego obrazu i odpowiadającą im liczbę pikseli w pustych polach odpowiednio "Znana odległość" i "Odległość w pikselach".</li>
		<li>Kliknij "Wolna ręka" na pasku narzędzi i obrysuj mieszki włosowe na przechwyconych obrazach w jasnym polu.</li>
		<li>Kliknij "Zmierz" w sekcji "Analizuj" na pasku narzędzi. 
		UWAGA: Jeśli potrzebne są inne dane pomiarowe, kliknij "Ustaw pomiar" w sekcji "Analizuj" na pasku narzędzi i zaznacz odpowiednie pola na liście.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Analiza rozwoju pęcherzyków przy użyciu myszy transgenicznych
<ol>
	<li>Pobrać jajniki z dni po urodzeniu 0 i 4 (P0 i P4) samic myszy transgenicznych zawierających transgeny Oog1pro3.9 i R26-H2B-mCherr i posiewać je na insertach, jak opisano w krokach 1.1–3.2, z wyjątkiem tego, że nie należy kroić jajników P0 i P4.</li>
	<li>Pożywkę hodowlaną należy zastąpić świeżą, wstępnie podgrzaną pożywką w 3,5 cm szalkach w inkubatorze zawierającym 5% CO2 w temperaturze 37 °C co 2 dni. 
	UWAGA: Stężenie LH w pożywce hodowlanej jajników P0 i P4 może pozostać stałe, ponieważ wyrzuty LH nie występują u myszy P0 i P4.</li>
	<li>Ustawić mikroskop tak, aby uwidocznił tylko pęcherzyki pierwotne AcGFP1-dodatnie w hodowanych jajnikach P4 (Tabela 1). 
	UWAGA: W jajnikach samic myszy P4 obecne są tylko pęcherzyki pierwotne i pierwotne.</li>
	<li>Uchwyć obrazy hodowanych jajników transgenicznych myszy P0 Oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry w odstępach 30-minutowych, korzystając z ustawień stosowanych dla jajników P4 (patrz krok 5.2).</li>
	<li>Śledź i analizuj rozwój pęcherzyków za pomocą sygnałów AcGFP1 i H2B-mCHerry.</li>
</ol>

<ol><li>Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+quantifying+follicular+numbers+within+the+mouse+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary.</a> Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).</li>
<li>Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+ovarian+follicular+dynamics+in+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle.</a> Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).</li>
<li>Palma, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+biotechnology+of+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+World+J%22%5BJournal%5D)">Biology and biotechnology of follicle development.</a> Sci World J. , (2012).</li>
<li>Knight, P. G., Glister, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16885529">TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development.</a> Reproduction. 132 (2), 191-206 (2006).</li>
<li>Picton, H. M., Harris, S. E., Muruvi, W., Chambers, E. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19074213">The in vitro growth and maturation of follicles.</a> Reproduction. 136 (6), 703-715 (2008).</li>
<li>Spears, N., de Bruin, J. P., Gosden, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+establishment+of+follicular+dominance+in+co-cultured+mouse+ovarian+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Fertil%22%5BJournal%5D)">The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles.</a> J Reprod Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).</li>
<li>Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+effect+of+follicle-follicle+interactions+and+declining+follicle-stimulating+hormone+on+murine+follicle+health+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro.</a> Biol Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).</li>
<li>Komatsu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Effect+of+Leukemia+Inhibitory+Factor+on+Follicular+Growth+in+Cultured+Murine+Ovarian+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Effect of Leukemia Inhibitory Factor on Follicular Growth in Cultured Murine Ovarian Tissue.</a> Biol Reprod. 93 (1), 18(2015).</li>
<li>Komatsu, K., Masubuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+concentration-dependent+effect+of+progesterone+on+follicle+growth+in+the+mouse+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">The concentration-dependent effect of progesterone on follicle growth in the mouse ovary.</a> J Reprod Dev. 63 (3), 271-277 (2017).</li>
<li>Murase, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicle+dynamics%3A+visualization+and+analysis+of+follicle+growth+and+maturation+using+murine+ovarian+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assist+Reprod+Genet%22%5BJournal%5D)">Follicle dynamics: visualization and analysis of follicle growth and maturation using murine ovarian tissue culture.</a> J Assist Reprod Genet. , 1-5 (2017).</li>
<li>Ishida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promoter+of+the+oocyte-specific+gene%2C+Oog1%2C+functions+in+both+male+and+female+meiotic+germ+cells+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The promoter of the oocyte-specific gene, Oog1, functions in both male and female meiotic germ cells in transgenic mice.</a> PLoS One. 8 (7), 68686(2013).</li>
<li>Minami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesin+is+a+novel+mouse+protein+expressed+in+oocytes+and+early+cleavage-stage+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Oogenesin is a novel mouse protein expressed in oocytes and early cleavage-stage embryos.</a> Biol Reprod. 69 (5), 1736-1742 (2003).</li>
<li>Nilsson, E. E., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+factor-9+stimulates+progression+of+early+primary+but+not+primordial+rat+ovarian+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation factor-9 stimulates progression of early primary but not primordial rat ovarian follicle development.</a> Biol Reprod. 67 (3), 1018-1024 (2002).</li>
<li>Nilsson, E. E., Kezele, P., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia+inhibitory+factor+%28LIF%29+promotes+the+primordial+to+primary+follicle+transition+in+rat+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Leukemia inhibitory factor (LIF) promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries.</a> Mol Cell Endocrinol. 188 (1-2), 65-73 (2002).</li>
<li>Nilsson, E. E., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein-4+acts+as+an+ovarian+follicle+survival+factor+and+promotes+primordial+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein-4 acts as an ovarian follicle survival factor and promotes primordial follicle development.</a> Biol Reprod. 69 (4), 1265-1272 (2003).</li>
<li>Nilsson, E. E., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kit+ligand+and+basic+fibroblast+growth+factor+interactions+in+the+induction+of+ovarian+primordial+to+primary+follicle+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition.</a> Mol Cell Endocrinol. 214 (1-2), 19-25 (2004).</li>
<li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+conditional+reporter+mouse+lines+at+ROSA26+locus+for+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Establishment of conditional reporter mouse lines at ROSA26 locus for live cell imaging.</a> Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).</li>
<li>Lan, Z. J., Xu, X., Cooney, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+oocyte-specific+expression+of+Cre+recombinase+activity+in+GDF-9-iCre%2C+Zp3cre%2C+and+Msx2Cre+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Differential oocyte-specific expression of Cre recombinase activity in GDF-9-iCre, Zp3cre, and Msx2Cre transgenic mice.</a> Biol Reprod. 71 (5), 1469-1474 (2004).</li>
<li>Payer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stella-GFP+transgenic+mice%3A+a+novel+tool+to+study+germ+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Generation of stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development.</a> Genesis. 44 (2), 75-83 (2006).</li>
<li>Ohinata, Y., Sano, M., Shigeta, M., Yamanaka, K., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive%2C+non-invasive+visualization+of+primordial+germ+cell+development+in+mice+by+the+Prdm1-mVenus+and+Dppa3-ECFP+double+transgenic+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">A comprehensive, non-invasive visualization of primordial germ cell development in mice by the Prdm1-mVenus and Dppa3-ECFP double transgenic reporter.</a> Reproduction. 136 (4), 503-514 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym badaniu opracowaliśmy dwie nowe metody badania rozwoju pęcherzyków w jajnikach myszy. Pierwsza metoda polega na hodowli pokrojonych tkanek dorosłych myszy jajnikowych, a następnie analizie rozwoju pęcherzyków, a druga polega na wykorzystaniu obrazowania poklatkowego w celu wizualizacji wczesnego rozwoju pęcherzyków na etapie niezależnym od gonadotropin. Wcześniej stosowaliśmy obecną metodę hodowli tkanki jajnika do oceny wpływu czynnika hamującego białaczkę i progesteronu na rozwój pęcherzyków</su...

Jajniki samic myszy zawierają kilka tysięcy pęcherzyków1, a okresowa owulacja dojrzewa około dziesięciu oocytów w każdym cyklu rui. Pęcherzyki dzielą się na kilka etapów rozwojowych: pęcherzyki pierwotne, pierwotne, wtórne, antralne i Graafa, w zależności od formy ziarnistej warstwy komórkowej otaczającej każdy oocyt. Większość pierwotnych mieszków włosowych jest uśpiona, a niektóre z nich są aktywowane i rosną w pęcherzyki pierwotne w każdym cyklu rui2. Po wtórnym etapie folikularnym rozwój pęcherzyków jest regulowany głównie przez gonadotropiny, hormon folikularny (FSH) i hormon luteinizujący (LH). Jednak pierwotny i pierwotny rozwój pęcherzyków jest niezależny od gonadotropiny, a mechanizmy regulacyjne, które rządzą tymi etapami, pozostają słabo uzasadnione3,4,5. Oprócz czynników wzrostu i hormonów, pęcherzyk pierwotny i pierwotny jest regulowany przez interakcje między pęcherzykami6,7. W związku z tym przeprowadziliśmy analizy dynamiki pęcherzyków w tkankach jajnika myszy i zbadaliśmy związane z tym mechanizmy regulacyjne za pomocą kultur tkanek jajnika8,9,10.
Tutaj wprowadzamy dwie metody modelowania hodowli tkanek jajników. Pierwszy służy do analizy rozwoju pęcherzyków poprzez pomiar obszarów pęcherzyków, a drugi służy do badania mechanizmu regulacyjnego podczas wczesnego rozwoju pęcherzyków od pierwotnego do wtórnego etapu pęcherzyka u myszy transgenicznych. Do analizy rozwoju pęcherzyków wykorzystaliśmy głównie jajniki 4-tygodniowych samic myszy, ponieważ pozwalają one na łatwą wizualizację pęcherzyków. Aby wywołać okresową owulację i modelować rozwój pęcherzyków in vivo, odtworzyliśmy wyrzut LH i zaobserwowaliśmy owulację, atrezję pęcherzyków i wydzielanie estradiolu w warunkach hodowli tkankowej. Wykonano obrazy wyhodowanych jajników, a procesy rozwoju pęcherzyków przeanalizowano, śledząc zmiany w obszarze pęcherzyka. Jednak w analizach mikroskopowych w jasnym polu rozróżnienie między pierwotnymi a wczesnymi pęcherzykami pierwotnymi było niejasne. W związku z tym opracowaliśmy metodę wykrywania małych pęcherzyków i rozróżniania pęcherzyków pierwotnych, pierwotnych i wtórnych w hodowanych tkankach jajnika przy użyciu Oogenesin1 (Oog1) pro3.9 i R26-H2B-mJajniki transgenicznych myszy Cherry w dniach 0 i 4 po urodzeniu11. Ekspresja Oog1 jest wykrywalna w oocytach po wejściu w mejozę i stopniowo wzrasta wraz z rozwojem pęcherzyków, co pozwala na obserwację przejścia od pęcherzyków pierwotnych do pierwotnych za pomocą obrazów poklatkowych hodowanej tkanki jajnika11,12. Chociaż do badania czynników aktywujących uśpione pęcherzyki pierwotne zastosowano metody morfologiczne13,14,15,16, fizjologiczny rozwój pęcherzyków w jajnikach jest trudny do zaobserwowania, a wpływ różnych czynników pozostaje niescharakteryzowany. Obecne metody hodowli zostały zaprojektowane w celu rozwiązania tego problemu w analizach czynników docelowych w czasie rzeczywistym.
W obecnym badaniu śledziliśmy rozwój mieszków włosowych za pomocą metody obrazowania poklatkowego i scharakteryzowaliśmy proces rozwoju pęcherzyków. Nasze nowatorskie metody oferują bezprecedensowe narzędzie do badania fizjologii jajników.

<table><tbody><tr><td>Hormon folikulotropowy z ludzkiej przysadki</td><td>SIGMA</td><td>F4021</td><td></td></tr><tr><td>Hormon lutenizujący z przysadki koni</td><td>SIGMA</td><td>L9773</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny i streptomycyny</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>MEM a, GlutaMax, bez nukleotydów</td><td>Thermo Fisher</td><td>32561037</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie ze szklanym dnem</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td>35mm szalka, nr 0 szkiełko nakrywkowe, średnica szkła 10mm</td></tr><tr><td>Wkład do hodowli komórkowych Millicell</td><td>Merck Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td>Średnica: 315 mm, wielkość porów: 0,4 mm, materiał: hydrofilowy PTTE</td></tr><tr><td>3,5 cm naczynia do hodowli komórkowych</td><td>Greiner Bio-ONE</td><td>627160</td><td></td></tr><tr><td>50ml / probówka wirówkowa z potrójną nasadką uszczelniającą</td><td>IWAKI</td><td>2345-050</td><td></td></tr><tr><td>Niskoprofilowe ostrza jednorazowe 819</td><td>Leica</td><td>14035838925</td><td></td></tr><tr><td>LSM 710</td><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Carl Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>CellVoyager, CV1000</td><td>Yokogawa Electric Corporation</td><td></td><td>Obrazowanie poklatkowe</td></tr><tr><td>BZ-X700</td><td>KEYENCE</td><td></td><td>Obrazowanie poklatkowe</td></tr></tbody></table>

posiew tkanki jajnikowej w celu wizualizacji zjawisk w jajniku myszy

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Samice ssaków okresowo owulują prawie stałą liczbę oocytów podczas każdego cyklu rui. Aby utrzymać taką regularność i okresowość, regulacja zachodzi na poziomie osi podwzgórze-przysadka-gonady oraz na rozwijających się pęcherzykach w jajniku. Pomimo aktywnych badań, mechanizmy rozwoju pęcherzyków nie są jasne ze względu na kilka etapów od uśpionej pierwotnej aktywacji pęcherzyka do owulacji, a także ze względu na złożoność regulacji, która różni się na każdym etapie pęcherzyka. Aby zbadać mechanizmy rozwoju pęcherzyków i dynamikę pęcherzyków w całym cyklu rui, opracowaliśmy model hodowli tkanki jajnikowej myszy, który można wykorzystać do obserwacji rozwoju pęcherzyków za pomocą mikroskopu. Systematyczny rozwój pęcherzyków, okresowa owulacja i atrezja pęcherzyków mogą być odtwarzane w modelu hodowli jajników, a warunki hodowli można eksperymentalnie modulować. W tym miejscu pokazujemy przydatność tej metody w badaniu mechanizmów regulacyjnych rozwoju pęcherzyków jajnikowych i innych zjawisk jajnikowych.

Rysunek 1 przedstawia protokół wymiany mediów podczas hodowli tkanki jajnika. Zgodnie z tym programem, jajniki 4-tygodniowych myszy ICR były hodowane i obrazowane w odstępach 24-godzinnych przy użyciu mikroskopii konfokalnej (Rysunek 2). Podczas 3-tygodniowej hodowli tkanek jajnika większość pęcherzyków antralnych i wtórnych uległa degeneracji w wyniku atrezji pęcherzyków, a niektóre z nich owulowały (Rysunek...

Hodowle tkanek jajnikowych mogą być używane jako modele rozwoju pęcherzyków, owulacji i atrezji pęcherzyków oraz wskazują mechanizmy regulacyjne dynamicznych procesów jajnikowych.

Posiew tkanki jajnikowej w celu wizualizacji zjawisk w jajniku myszy

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad jajnikami dotyczące rozwoju pęcherzyków, atrezji mieszków włosowych i operacji. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy odtworzyć zjawiska jajnikowe w kontrolowanych warunkach hodowli w celu obserwacji w czasie rzeczywistym. Aby przygotować jajniki z czterotygodniowej myszy Instytutu Badań nad Rakiem do hodowli: Użyj nożyczek i pęsety, aby przyciąć otaczającą tkankę z jajników pod mikroskopem stereoskopowym i umieść oczyszczone jajniki w naczyniu ze świeżą pożywką hodowlaną.Kiedy wszystkie jajniki zostaną przycięte, przenieś poszczególne jajniki na kawałek bibuły filtracyjnej zwilżony PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza i użyj ostrza mikrotomu, aby pokroić każdy jajnik na cztery części. Przenieś plastry do 3,5-centymetrowego naczynia z pożywką hodowlaną o temperaturze 37 stopni Celsjusza i za pomocą mikropipety dodaj około 0,5 mikrometra kropelki pożywki hodowlanej do jednej wkładki do hodowli komórkowej na wycinek tkanki jajnika. W drugim 3,5-centymetrowym szklanym naczyniu do hodowli komórek zawierających jeden milimetr pożywki: Za pomocą pęsety przenieś jedną próbkę tkanki do każdej kropli i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych.Zastąp supernatant w naczyniu świeżą pożywką hodowlaną o temperaturze 37 stopni Celsjusza co dwa dni i traktuj jajniki 100 milijednostkami na mililitr FSH i LH przez 12 godzin co czwarty dzień. Rozpocznij obrazowanie wyhodowanych jajników co 24 godziny po jednym dniu posiewu, aby umożliwić wystarczający wzrost pęcherzyków między sesjami obrazowania; Wykonywanie obrazów w odstępach 30-minutowych przy użyciu systemu obrazowania poklatkowego w odpowiednich warunkach eksperymentalnych. Aby przeanalizować rozwój pęcherzyków jajnikowych:Otwórz obrazy w ImageJ i otwórz menu analizy, aby wybrać ustawioną skalę.Wprowadź długości boków przechwyconych obrazów i odpowiadającą im liczbę pikseli odpowiednio w znanej odległości i odległości w pikselach. Następnie użyj narzędzia wolnej ręki, aby obrysować mieszki włosowe i kliknij zmierz. Podczas trzytygodniowego okresu hodowli plastrów tkanki jajnikowej większość pęcherzyków antralnych i wtórnych ulega degeneracji w wyniku atrezji pęcherzyków, a niektóre są owulowane.Niektóre pęcherzyki rozwijają się w grupach podczas każdego cyklu wyrzutu LH. Podczas gdy czas owulacji i liczba owulowanych oocytów różnią się w zależności od jajnika myszy, owulacja z hodowanych jajników występuje głównie w ciągu 48 godzin od każdego wyrzutu LH. Należy pamiętać, że nie wszystkie owulowane oocyty uwalniają pierwsze ciała polarne po owulacji.Pęcherzyki pierwotne i pierwotne są obecne jednocześnie w jajnikach myszy w czwartej dobie pourodzeniowej. Natomiast w jajnikach po porodzie zero obecne są tylko pęcherzyki pierwotne. Jednak pęcherzyki pierwotne stają się wykrywalne w jajnikach z hodowli po urodzeniu w dniu zero po 30 do 40 godzinach posiewu, jak wykazano.Pęcherzyki pierwotne i pierwotne można również rozróżnić w hodowanych jajnikach wyizolowanych od zwierząt transgenicznych mCherry przez jądra mCherry-dodatnie komórek ziarnistych; Umożliwienie śledzenia etapów pęcherzyka w kulturach plastrów jajnika. Mam nadzieję, że ta technika utoruje drogę naukowcom zajmującym się technologią rozrodu do zbadania nowych technik leczenia niepłodności.

ovarian-tissue-culture-to-visualize-phenomena-in-mouse-ovary

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Hodowla prawidłowych komórek w kontekście trójwymiarowym stanowi alternatywną metodę badania wczesnych zdarzeń niezbędnych do transformacji komórkowej i tumorigenezji. Metoda ta jest wykorzystywana do hodowli prawidłowych komórek jajnika i jajowodów w celu zbadania wczesnych etapów powstawania raka jajnika.

Hydrożele alginianowe do trójwymiarowej hodowli organów jajników i jajowodów

Ten protokół opisuje pierwotną hodowlę/kokulturę tkanki jajnikowej myszy, używając jajników od noworodków myszy i indywidualnych pęcherzyków jajnikowych od myszy przed okresem dojrzewania. Techniki hodowli wspomagają rozwój w wysoce fizjologiczny sposób, umożliwiając badanie wpływu czynników zewnętrznych na jajnik oraz interakcji między pęcherzykami jajnikowymi.

Hodowla i kokultura jajników myszy i pęcherzyków jajnikowych

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego oznaczania pęcherzyków w hodowanych jajnikach młodych myszy bez seryjnego cięcia. Stosując immunofluorescencję całego narządu i oczyszczanie tkanek, cięcie fizyczne zastępuje się cięciem optycznym. Ta metoda przygotowania i wizualizacji próbek utrzymuje integralność narządów i ułatwia automatyczną ocenę ilościową określonych komórek.

Immunofluorescencja całej góry i kwantyfikacja pęcherzyków w hodowanych jajnikach myszy

Przedstawiono hodowlę in vitro kory jajników bydła oraz wpływ żywieniowej diety Stair-step na mikrośrodowisko jajników. Fragmenty kory jajnikowej hodowano przez siedem dni i oceniano steroidy, cytokiny i stadia pęcherzyków. Leczenie dietą Stair-Step miało zwiększoną steroidogenezę, co spowodowało progresję pęcherzyków w hodowli.

Posiewy tkankowe kory jajników bydła

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół obrazowania całych jajników do analiz ilościowych i jakościowych przy użyciu barwienia immunologicznego z całą mocą, mikroskopii wielofotonowej oraz wizualizacji i analizy 3D. Protokół ten umożliwia wysokowydajne, niezawodne i powtarzalne przetwarzanie, które ma zastosowanie w toksykologii, diagnostyce klinicznej i testach genomowych funkcji jajników.

Immunofluorescencja, oczyszczanie i mikroskopia wielofotonowa całego jajnika do ilościowej analizy 3D rozwijającej się rezerwy jajnikowej u myszy

Opisujemy metody izolowywania komórek somatycznych jajnika mysiego z frakcji stromy wzbogaconej jajnika oraz generowania organoidów somatycznych jajnika mysiego przy użyciu podejścia bez scaffoldu.

Badanie mikrośrodowiska jajnika: metody izolacji, hodowli 2D i hodowli organoidalnej komórek somatycznych jajnika mysiego

Tutaj prezentujemy protokół dostarczający narzędzie do badania mechanizmów regulacyjnych określonych genów podczas rozwoju hipokampa. Zastosowanie elektroporacji ex utero i organotypowej hodowli plastrów pozwala na regulację w górę i w dół ekspresji interesujących genów w pojedynczych komórkach i śledzenie ich losów podczas rozwoju.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowa hodowla warstwowa tkanki hipokampa myszy

Celem tego protokołu jest opisanie metody funkcji utraty i zysku, która ma zastosowanie do identyfikacji neogeniny jako specyficznego dla etapu receptora, który prowadzi do trofektodermy i różnicowania wewnętrznej masy komórkowej w preimplantacyjnych zarodkach myszy.

Podejście oparte na utracie i wzmocnieniu funkcji w celu zbadania determinantów wczesnego losu komórek w preimplantacyjnych zarodkach myszy

Ta praca demonstruje nowatorskie podejście do oceny proliferacji, różnicowania i potencjału tworzenia naczyń krwionośnych komórek macierzystych śródbłonka (VESCs) poprzez przeszczep poduszeczki tłuszczowej sutka, a następnie przygotowanie całej tkanki do obserwacji mikroskopowej. Przedstawiono również strategię śledzenia linii w celu zbadania zachowania VESC in vivo.

Nowatorska technika przeszczepu poduszeczki tłuszczowej sutka w celu wizualizacji wytwarzania naczyń krwionośnych śródbłonka

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania na żywo fuzji wtórnego podniebienia myszy za pomocą mikroskopii konfokalnej. Protokół ten może być stosowany w połączeniu z różnymi fluorescencyjnymi liniami myszy reporterowych oraz z inhibitorami szlaków w celu uzyskania wglądu mechanistycznego. Protokół ten może być zaadaptowany do obrazowania na żywo w innych systemach rozwojowych.

Obrazowanie na żywo fuzji wtórnego podniebienia myszy

Poznaj technikę posiewu tkanki jajnikowej myszy do badania rozwoju pęcherzyków i atrezji w kontrolowanych warunkach kultury. Ta metoda umożliwia obserwację czasową procesów jajnikowych.

Posiew tkanki jajnikowej w celu wizualizacji zjawisk w jajniku myszy

Przeglądaj więcej filmów