Zdefiniowano warunki hodowli wolnej od ksenotypów i karmówek w celu wytworzenia modeli ludzkich komórek siatkówki pochodzących z iPSC

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytanie dotyczące różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych w polu siatkówki, takich jak wytwarzanie różnych typów komórek siatkówki z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych lub komórek iPS. Główną zaletą tej techniki jest to, że przylegająca ludzka komórka iPS może być bezpośrednio wykorzystana do wytwarzania organoidów siatkówki poprzez przekazywanie zarodka do powstania tylko przez sukcesywną zmianę pożywki hodowlanej. Inżynier laboratoryjny Amelie Slembrouck-Brec zademonstruje metodę generowania i izolowania organoidów siatkówki, a inżynier laboratoryjny Celine Nanteau zademonstruje strategię produkcji barwnikowego nabłonka siatkówki lub komórek RPE.

Rozpocznij różnicowanie komórek iPS zgodnie z tym schematem, który można znaleźć w protokole tekstowym, gdy kolonie osiągną 60 do 70% konfluencji. Przygotuj cztery mililitry podstawowej pożywki iPS na sześciocentymetrowe naczynie i podgrzej podłoże do 37 stopni Celsjusza. Następnie zmień pożywkę komórkową iPS na podstawową pożywkę iPS.

Tym razem należy pamiętać o Dniu Zero. W drugim dniu zmień kultury w podstawowej pożywce iPS na podstawową pożywkę iPS N-2 wcześniej ogrzaną w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zmieniaj podłoże co dwa do trzech dni.

Zidentyfikuj wyłaniające się organoidy siatkówki tworzące komórki za pomocą pąków neuroepithelium. W dniu 28 przygotuj sześciodołkowe płytki zawierające cztery mililitry na studzienkę pożywki Pro B-27, początkowo uzupełnione 10 nanogramami na mililitr FGF2. Ręcznie odzyskaj struktury siatkówki z sześciocentymetrowych szalek.

Aby to zrobić, wyizoluj struktury, wykonując prostopadłe prążki igłą wokół pąka neuroepitelialnego i odłącz organoidy, delikatnie drapiąc je igłą. Odessać od 10 do 15 organoidów za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów i przenieść je do jednego dołka z sześciodołkowej płytki zawierającej pożywkę Pro B-27. Utrzymuj organoidy siatkówki w pływających warunkach hodowli w pożywce Pro B-27 w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla.

Zmieniaj połowę podłoża co dwa do trzech dni. W dniu 28 zmień pożywkę na świeżą pożywkę Pro N-2 wcześniej podgrzaną w temperaturze 37 stopni Celsjusza i kontynuuj wymianę pożywki Pro N-2 co dwa do trzech dni. W dniu 42 przygotuj 24-dołkową płytkę uprzednio pokrytą matrycą zgodnie z opisem w protokole tekstowym i zawierającą jeden mililitr pożywki Pro N-2 na basenik.

Przed użyciem umieść płytkę na 15 minut w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Ręcznie odzyskaj ludzkie plastry iRPE z sześciocentymetrowej czaszy. Aby odizolować plamy, wykonaj prostopadłe prążki igłą wokół pigmentowanego nabłonka i oderwij arkusz, delikatnie drapiąc go igłą.

Odessać 10 pigmentowanych plastrów za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów i przenieść je do jednego dołka na 24-dołkowej płytce. Plastry RPE pochodzące z ludzkiego iPS należy przechowywać w pożywce Pro N-2 w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 48 godzin przed zmianą pożywki. Gdy komórki zlewają się, usuń pożywkę za pomocą systemów aspiracji próżniowej i umyj każdą studzienkę raz jednym mililitrem PBS za pomocą pięciomililitrowej pipety.

Po odrzuceniu PBS za pomocą systemów aspiracji próżniowej, dodaj 200 mikrolitrów na studzienkę 0,25% trypsyny. Inkubuj komórki przez co najmniej 15 minut w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie dodaj 800 mikrolitrów pożywki Pro B-27, aby dezaktywować trypsynę. Teraz oddziel arkusz ludzkich komórek iRPE, pipetując go w górę iw dół.

Umieść zawiesinę komórek w 15-mililitrowej probówce i wiruj przez pięć minut w temperaturze 110 razy g. Usuń supernatant i delikatnie ponownie zawieś osad komórkowy w dwóch mililitrach pożywki Pro N-2 podgrzanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie policz komórki za pomocą licznika komórek. Teraz weź 1,25 miliona komórek i umieść je w pokrytej matrycą kolbie T25 o centymetrze kwadratowym zawierającej pięć mililitrów pożywki Pro N-2, która została wstępnie podgrzana do 37 stopni Celsjusza.

W przypadku całych organoidów siatkówki wybierz od pięciu do 20 organoidów siatkówki za pomocą pipety transferowej i umieść je w fiolce kriogenicznej. Usunąć nadmiar pożywki za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, nie dotykając organoidów na dnie probówki i dodać 250 mikrolitrów zimnej pożywki do kriokonserwacji. Zamrozić fiolki w pojemniku do zamrażania na bazie izopropranolu w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej cztery godziny.

W przypadku ludzkich komórek iRPE należy rozdzielić komórki, gdy zbiegają się w pasażu 1. Odessać pożywkę z kolby T25 o centymetrach kwadratowych za pomocą systemów aspiracji próżniowej i przemyć ją raz trzema mililitrami PBS za pomocą pięciomililitrowej pipety. Po usunięciu PBS dodaj jeden mililitr 0,25% trypsyny, a następnie inkubuj komórki przez co najmniej 15 minut w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po inkubacji dodaj pięć mililitrów pożywki Pro B-27, aby zatrzymać aktywność trypsyny. Oddziel arkusz ludzkich komórek iRPE, pipetując je w górę iw dół za pomocą 10-mililitrowej pipety. Umieść zawiesinę komórkową w 15-mililitrowej probówce i odwiruj ją przez pięć minut w temperaturze 110 razy g.

Odessać supernatant za pomocą aspiracji próżniowej i delikatnie ponownie zawiesić komórki, aby uzyskać dwa miliony komórek w 250 mikrolitrach pożywki do kriokonserwacji. Przenieść 250 mikrolitrów zawiesiny komórek na fiolkę kriogeniczną, a następnie zamrozić fiolki w pojemniku do zamrażania na bazie izopropranolu w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej cztery godziny. Ze zbiornika ciekłego azotu lub zamrażarki o temperaturze minus 150 stopni Celsjusza rozmrażaj fiolkę kriogeniczną zawierającą organoidy siatkówki w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 sekund.

Ostrożnie zdezynfekować fiolkę kriogeniczną za pomocą sprayu z roztworem dezynfekującym. Otwórz fiolkę i dodaj jeden mililitr podgrzanej pożywki Pro B-27. Teraz przenieś organoidy do 1,5-mililitrowej probówki za pomocą pipety transferowej.

Delikatnie usunąć pożywkę, pipetując ją bez dotykania struktur siatkówki na dnie probówki. Następnie jeszcze raz umyj organoidy jednym mililitrem podgrzanego podłoża Pro B-27. Odessać organoidy pipetą transferową i umieścić je w jednym dołku sześciodołkowej płytki zawierającej pożywkę Pro B-27, wstępnie podgrzaną i zrównoważoną w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Aby rozmrozić ludzkie komórki iRPE, podgrzej pożywkę Pro N-2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ze zbiornika ciekłego azotu lub zamrażarki o temperaturze minus 150 stopni Celsjusza rozmrozić kriogeniczną próbkę ludzkich komórek iRPE Passage 1, inkubując je w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 sekund. Po zdezynfekowaniu fiolki kriogenicznej jak poprzednio, otwórz probówkę i dodaj jeden mililitr podgrzanej pożywki Pro N-2, a następnie przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki zawierającej dwa mililitry podgrzanej pożywki Pro N-2.

Po odwirowaniu przez pięć minut w temperaturze 110 razy g, usunąć supernatant i delikatnie ponownie zawiesić osad komórkowy w dwóch mililitrach pożywki Pro N-2 podgrzanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Struktury neurosiatkówkowe tworzące komórki można wyizolować za pomocą igły i przenieść na płytki hodowlane, aby umożliwić dojrzewanie organoidów siatkówki w warunkach hodowli pływającej. Powstające struktury siatkówki zawierają głównie komórki progenitorowe siatkówki, które dają początek siedmiu głównym klasom typów komórek siatkówki, co jest uwidocznione przez fale wczesnych i późno urodzonych generacji komórek siatkówki podczas procesu dojrzewania in vitro.

W ten sposób czas hodowli określa typy komórek obecnych w organoidach. W zależności od klonu ludzkich komórek iPS, plamy barwnikowe można wykryć przed lub po utworzeniu komórek struktur siatkówki, zwykle jeden lub dwa tygodnie po użyciu pożywki Pro N-2 w 28 dniu. Pokazano reprezentatywny obraz w jasnym polu ludzkich komórek iRPE rozszerzonych z izolowanych plam w Pasażu 0.

Długotrwałe hodowle skutkują dojrzałym i funkcjonalnym nabłonkiem. Pokazano tutaj dojrzałe ludzkie komórki iRPE Passage 2 w 52. tygodniu, charakteryzujące się klasyczną prostopadłościenną morfologią bruku. Podejmując próbę wykonania tej procedury, należy pamiętać, że skuteczność przedstawionej tutaj metody w dużej mierze zależy od jakości hodowli ludzkich komórek iPS.

Po tej procedurze wszystkie typy komórek siatkówki można wygenerować z komórek progenitorowych siatkówki obecnych w organoidach na wczesnym etapie. Stanowią one potężne narzędzia do leczenia i modelowania różnych chorób siatkówki. Specyficzne dla pacjenta komórki iPS mogą być wykorzystane do lepszego zrozumienia etiologii chorób złożonych lub genetycznych poprzez badanie mechanizmu molekularnego i komórkowego leżącego u podstaw tych patologii.

Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się rozwojem siatkówki do zbadania medycyny regeneracyjnej u ludzi. Nie zapominaj, że praca z ludzką komórką iPS wymaga ważnych środków ostrożności, takich jak specyficzne zamknięcie hodowli komórkowej.