Name: Oczyszczanie i rekonstytucja TRPV1 do analizy spektroskopowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Poznaj metody oczyszczania i rekonstytucji TRPV1 do analizy spektroskopowej EPR i DEER. Protokoły te umożliwiają uzyskanie miligramowych ilości czystego kanału jonowego do badań zmian konformacyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy bardzo wdzięczni dr H. Mchaourabowi za udostępnienie spektrometrów EPR i DEER oraz dr T. Rosenbaumowi za dostarczenie pełnowymiarowego plazmidu TRPV1 bez cysteiny.

<ol><li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504, 107-112 (2013).</li>
<li>Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+structures+in+distinct+conformations+reveal+activation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms.</a> Nature. 504, 113-118 (2013).</li>
<li>Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+structures+in+nanodiscs+reveal+mechanisms+of+ligand+and+lipid+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action.</a> Nature. , (2016).</li>
<li>Yang, F., Xiao, X., Cheng, W., Yang, W., Yu, P., Song, Z., Yarov-Yarovoy, V., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanism+underlying+capsaicin+binding+and+activation+of+the+TRPV1+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural mechanism underlying capsaicin binding and activation of the TRPV1 ion channel.</a> Nat Chem Biol. 11, 518-524 (2015).</li>
<li>Bae, C., Anselmi, C., Kalia, J., Jara-Oseguera, A., Schwieters, C. D., Krepkiy, D., Won Lee, C., Kim, E. H., Kim, J. I., Faraldo-Gomez, J. D., Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+mechanism+of+activation+of+the+TRPV1+channel+by+a+membrane-bound+tarantula+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the mechanism of activation of the TRPV1 channel by a membrane-bound tarantula toxin.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+KvAP+voltage-dependent+K%2B+channel+in+a+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the KvAP voltage-dependent K+ channel in a lipid bilayer.</a> Science. 306, 491-495 (2004).</li>
<li>Cordero-Morales, J. F., Jogini, V., Lewis, A., Vasquez, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+driving+forces+determining+potassium+channel+slow+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular driving forces determining potassium channel slow inactivation.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 1062-1069 (2007).</li>
<li>Cordero-Morales, J. F., Cuello, L. G., Zhao, Y., Jogini, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+gating+at+the+potassium-channel+selectivity+filter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of gating at the potassium-channel selectivity filter.</a> Nat Struct Mol Biol. 13, 311-318 (2006).</li>
<li>Basak, S., Schmandt, N., Gicheru, Y., Chakrapani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+and+dynamics+of+a+lipid-induced+potential+desensitized-state+of+a+pentameric+ligand-gated+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Crystal structure and dynamics of a lipid-induced potential desensitized-state of a pentameric ligand-gated channel.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+mechanism+for+MscS+gating+in+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers.</a> Science. 321, 1210-1214 (2008).</li>
<li>Perozo, E., Kloda, A., Cortes, D. M., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+principles+underlying+the+transduction+of+bilayer+deformation+forces+during+mechanosensitive+channel+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Physical principles underlying the transduction of bilayer deformation forces during mechanosensitive channel gating.</a> Nat Struct Biol. 9, 696-703 (2002).</li>
<li>Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+channel+structure+of+MscL+and+the+gating+mechanism+of+mechanosensitive+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels.</a> Nature. 418, 942-948 (2002).</li>
<li>Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+rearrangements+underlying+K%2B-channel+activation+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating.</a> Science. 285, 73-78 (1999).</li>
<li>Goehring, A., Lee, C. H., Wang, K. H., Michel, J. C., Claxton, D. P., Baconguis, I., Althoff, T., Fischer, S., Garcia, K. C., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nat Protoc. 9, 2574-2585 (2014).</li>
<li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20, 1293-1299 (2012).</li>
<li>Gonzales, E. B., Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pore+architecture+and+ion+sites+in+acid-sensing+ion+channels+and+P2X+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pore architecture and ion sites in acid-sensing ion channels and P2X receptors.</a> Nature. 460, 599-604 (2009).</li>
<li>McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motion+of+spin-labeled+side+chains+in+T4+lysozyme.+Correlation+with+protein+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics.</a> Biochemistry. 35, 7692-7704 (1996).</li>
<li>Columbus, L., Kalai, T., Jeko, J., Hideg, K., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motion+of+spin+labeled+side+chains+in+alpha-helices%3A+analysis+by+variation+of+side+chain+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular motion of spin labeled side chains in alpha-helices: analysis by variation of side chain structure.</a> Biochemistry. 40, 3828-3846 (2001).</li>
<li>Zou, P., McHaourab, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+sensitivity+and+extended+range+of+distance+measurements+in+spin-labeled+membrane+proteins%3A+Q-band+double+electron-electron+resonance+and+nanoscale+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers.</a> Biophys J. 98, L18-L20 (2010).</li>
<li>Vasquez, V., Sotomayor, M., Cortes, D. M., Roux, B., Schulten, K., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+architecture+of+membrane-embedded+MscS+in+the+closed+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional architecture of membrane-embedded MscS in the closed conformation.</a> J Mol Biol. 378, 55-70 (2008).</li>
<li>Autzen, H. E., Myasnikov, A. G., Campbell, M. G., Asarnow, D., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+TRPM4+ion+channel+in+a+lipid+nanodisc%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc.</a> Science. 359, 228-232 (2018).</li>
<li>Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Nanodiscs+as+a+Tool+for+High-Resolution+Structure+Determination+of+Membrane+Proteins+by+Single-Particle+Cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Lipid Nanodiscs as a Tool for High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins by Single-Particle Cryo-EM.</a> Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).</li>
<li>Guo, J., She, J., Zeng, W., Chen, Q., Bai, X. C., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+calcium-activated%2C+non-selective+cation+channel+TRPM4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4.</a> Nature. 552, 205-209 (2017).</li>
<li>McGoldrick, L. L., Singh, A. K., Saotome, K., Yelshanskaya, M. V., Twomey, E. C., Grassucci, R. A., Sobolevsky, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opening+of+the+human+epithelial+calcium+channel+TRPV6%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Opening of the human epithelial calcium channel TRPV6.</a> Nature. 553, 233-237 (2018).</li>
<li>Dang, S., Feng, S., Tien, J., Peters, C. J., Bulkley, D., Lolicato, M., Zhao, J., Zuberbuhler, K., Ye, W., Qi, L., Chen, T., Craik, C. S., Nung Jan, Y., Minor, D. L. Jr, Cheng, Y., Yeh Jan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structures+of+the+TMEM16A+calcium-activated+chloride+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structures of the TMEM16A calcium-activated chloride channel.</a> Nature. , (2017).</li>
<li>Velisetty, P., Stein, R. A., Sierra-Valdez, F. J., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+Purification+of+the+Pain+Receptor+TRPV1+for+Spectroscopic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Expression and Purification of the Pain Receptor TRPV1 for Spectroscopic Analysis.</a> Sci Rep. 7, 9861(2017).</li>
<li>Salazar, H., Llorente, I., Jara-Oseguera, A., Garcia-Villegas, R., Munari, M., Gordon, S. E., Islas, L. D., Rosenbaum, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+N-terminal+cysteine+in+TRPV1+determines+activation+by+pungent+compounds+from+onion+and+garlic%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A single N-terminal cysteine in TRPV1 determines activation by pungent compounds from onion and garlic.</a> Nat Neurosci. 11, 255-261 (2008).</li>
<li>Cao, E., Cordero-Morales, J. F., Liu, B., Qin, F., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+channels+are+intrinsically+heat+sensitive+and+negatively+regulated+by+phosphoinositide+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">TRPV1 channels are intrinsically heat sensitive and negatively regulated by phosphoinositide lipids.</a> Neuron. 77, 667-679 (2013).</li>
<li>Braman, J., Papworth, C., Greener, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+using+double-stranded+plasmid+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis using double-stranded plasmid DNA templates.</a> Methods Mol Biol. 57, 31-44 (1996).</li>
<li>Gracheva, E. O., Cordero-Morales, J. F., Gonzalez-Carcacia, J. A., Ingolia, N. T., Manno, C., Aranguren, C. I., Weissman, J. S., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglion-specific+splicing+of+TRPV1+underlies+infrared+sensation+in+vampire+bats%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ganglion-specific splicing of TRPV1 underlies infrared sensation in vampire bats.</a> Nature. 476, 88-91 (2011).</li>
<li>Guan, B., Chen, X., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-electrode+voltage+clamp%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-electrode voltage clamp.</a> Methods Mol Biol. 998, 79-89 (2013).</li>
<li>Jarecki, B. W., Makino, S., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+Shaker+potassium+channels+produced+by+cell-free+translation+upon+injection+into+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Function of Shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into Xenopus oocytes.</a> Sci Rep. 3, 1040(2013).</li>
<li>Jeschke, G., Polyhach, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurements+on+spin-labelled+biomacromolecules+by+pulsed+electron+paramagnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance.</a> Phys Chem Chem Phys. 9, 1895-1910 (2007).</li>
<li>Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dead-time+free+measurement+of+dipole-dipole+interactions+between+electron+spins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins.</a> J Magn Reson. 142, 331-340 (2000).</li>
<li>Mishra, S., Verhalen, B., Stein, R. A., Wen, P. C., Tajkhorshid, E., McHaourab, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+dynamics+of+the+nucleotide+binding+domains+and+the+power+stroke+of+a+heterodimeric+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Conformational dynamics of the nucleotide binding domains and the power stroke of a heterodimeric ABC transporter.</a> Elife. 3, e02740(2014).</li>
<li>Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+labeled+cysteines+as+sensors+for+protein-lipid+interaction+and+conformation+in+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin.</a> Photochem Photobiol. 56, 1019-1033 (1992).</li>
<li>Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+capsaicin+receptor%3A+a+heat-activated+ion+channel+in+the+pain+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway.</a> Nature. 389, 816-824 (1997).</li>
<li>McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+fourth+dimension+of+membrane+protein+structure%3A+insight+into+dynamics+from+spin-labeling+EPR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy.</a> Structure. 19, 1549-1561 (2011).</li>
<li>Jeschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEER+distance+measurements+on+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">DEER distance measurements on proteins.</a> Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).</li>
<li>Jeschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurements+in+the+nanometer+range+by+pulse+EPR%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">Distance measurements in the nanometer range by pulse EPR.</a> Chemphyschem. 3, 927-932 (2002).</li>
<li>Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+determination+of+pair+distance+distributions+by+pulsed+ESR+using+Tikhonov+regularization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization.</a> J Magn Reson. 172, 279-295 (2005).</li>
<li>He, Y., Wang, K., Yan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recombinant+expression+systems+for+structure+determination+of+eukaryotic+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">The recombinant expression systems for structure determination of eukaryotic membrane proteins.</a> Protein Cell. 5, 658-672 (2014).</li>
<li>Ghimire, H., McCarrick, R. M., Budil, D. E., Lorigan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significantly+improved+sensitivity+of+Q-band+PELDOR%2FDEER+experiments+relative+to+X-band+is+observed+in+measuring+the+intercoil+distance+of+a+leucine+zipper+motif+peptide+%28GCN4-LZ%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Significantly improved sensitivity of Q-band PELDOR/DEER experiments relative to X-band is observed in measuring the intercoil distance of a leucine zipper motif peptide (GCN4-LZ).</a> Biochemistry. 48, 5782-5784 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obecne technologie ekspresji i oczyszczania białek błonowych ssaków umożliwiły uzyskanie wystarczającej ilości białka do badań spektroskopowych 14,15,16,42. Tutaj dostosowaliśmy te technologie do ekspresji, oczyszczania, odtwarzania i wykonywania analiz spektroskopowych w TRPV1.
Wśród krytycznych kroków w protokole, poniżej znajdują się te, z którymi rozwiązaliśmy pr...

Dzięki najnowszym postępom w mikroskopii krioelektronowej pojedynczej cząstki (cryo-EM), struktury kanałów jonowych ssaków zostały uzyskane w niezwykłym tempie. W szczególności badania strukturalne polimodalnych kanałów jonowych, takich jak przejściowy potencjał receptora waniloidowego 1 (TRPV1), dostarczyły dalszych informacji na temat mechanizmów jego aktywacji1,2,3,4,5. Jednak dynamiczne informacje o kanałach jonowych osadzonych w środowisku membranowym są niezbędne do zrozumienia ich polimodalnych mechanizmów bramkowania i wiązania leków.
Spektroskopia paramagnetycznego rezonansu elektronowego (EPR) i podwójnego rezonansu elektronowo-elektronowego (DEER) dostarczyły jednych z najbardziej definitywnych modeli mechanistycznych dla kanałów jonowych6,7,8,9,10,11,12,13. Te podejścia ograniczały się głównie do badania prokariotycznych i archealnych kanałów jonowych, które w przypadku nadekspresji w bakteriach wytwarzają dużą ilość białek oczyszczonych detergentem. Wraz z rozwojem produkcji eukariotycznych białek błonowych w komórkach owadów i ssaków w celu charakterystyki funkcjonalnej i strukturalnej14,15,16, możliwe jest teraz uzyskanie biochemicznych ilości białek oczyszczonych detergentem do badań spektroskopowych.
Sygnały EPR i DEER pochodzą z etykiety paramagnetyczno-spinowej (SL) (tj. metanetiosulfonianu) przyłączonej do pojedynczej reszty cysteiny w białku. Etykiety spinowe zawierają trzy typy informacji strukturalnych: ruch, dostępność i odległości. Informacje te pozwalają określić, czy reszty są zakopane w białku, czy też są wystawione na działanie błony lub środowiska wodnego w stanach związanych z apo i ligandem13,17,18,19. W kontekście struktury o wysokiej rozdzielczości (jeśli są dostępne), dane EPR i DEER dostarczają zbioru ograniczeń dla wyprowadzania modeli dynamicznych w ich natywnym środowisku przy jednoczesnym monitorowaniu odwracalnego przejścia bramkowania (tj. zamkniętego, otwartego, uczulonego i odczulonego). Co więcej, elastyczne regiony, które mogą być trudne do określenia za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub cryo-EM, można uzyskać, wykorzystując te zestawy danych środowiskowych do przypisania struktur drugorzędowych, a także lokalizacji w obrębie białka20. Struktury krio-EM uzyskane w nanodyskach lipidowych dostarczyły cennych informacji na temat bramkowania kanałów jonowych3,21,22,23,24,25; jednak podejścia spektroskopowe mogą dostarczyć dynamicznych informacji o stanach konformacyjnych (np. zmianach termicznych), które mogą być trudne do określenia za pomocą cryo-EM.
Wiele trudności musi zostać pokonanych, aby wdrożyć EPR i DEER, w tym brak funkcji białka podczas usuwania wszystkich reszt cysteiny (szczególnie obfite w kanałach ssaków), niska wydajność białka, niestabilność białka podczas oczyszczania i po znakowaniu wirowym, oraz agregacja białek w detergentach lub liposomach. W tym przypadku zaprojektowaliśmy protokoły pozwalające przezwyciężyć te krytyczne bariery i uzyskaliśmy informacje o widmach jeleni i EPR dla receptora czuciowego ssaków. Celem niniejszego artykułu jest opisanie metodologii wyrażania, oczyszczania, etykietowania i rekonstytucji funkcjonalnego minimalnego konstruktu TRPV1 szczura bez cysteiny (eTRPV1) do analiz spektroskopowych. Metodologia ta jest odpowiednia dla tych białek błonowych, które zachowują swoją funkcję pomimo usunięcia reszt cysteiny lub które zawierają cysteinę tworzącą wiązania dwusiarczkowe. Ten zbiór protokołów może zostać zaadaptowany do analizy spektroskopowej kanałów jonowych innych ssaków.

<table><tbody><tr><td>QuikChange Lightning Zestaw mutagenezy skierowanej na miejsce</td><td>Agilent Technologies</td><td>210519-5</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol (izopropanol)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>GoldBio.com</td><td>A-420-10</td><td></td></tr><tr><td>Żywica amyloza</td><td>NEB</td><td>E8021L</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>GoldBio.com</td><td>A-655-25</td><td></td></tr><tr><td>Asolektyna z soi</td><td>Sigma</td><td>11145</td><td></td></tr><tr><td>System ekspresji bakulowirusa Bac-to-Bac</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10359016</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads SM-2 Adsorbenty&nbsp;</td>Pipety ze szkła borokrzemianowego <td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>(3,5'') (inekcja oocytów)</td><td>Pipety</td> ze szkła borokrzemianowego <td>Drummond Scientific 3-000-203 G/X</td><td></td></tr><tr><td>(zapisy oocytów)</td><td>Sutter Instrument</td><td>B150-110-10HP</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>Karbenicylina (disodowa)</td><td>GoldBio.com</td><td>C-103-5</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do Cellfectin</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10362-010</td><td></td></tr><tr><td>cellSens</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C606SK</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza Typ 1</td><td>Worthington-Biochem</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>Critiseal</td><td>VWR</td><td>18000-299</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-monohydrat maltozy</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP684</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside)</td><td>Anatrace</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka o wysokiej zawartości glukozy (Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średni)</td><td>Sigma</td><td>D0572&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe kolumny odsalające PD-10</td><td>GE Healthcare</td><td>45-000-148</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>O2783</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Invitrogen Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep Kit</td><td>Epoch Life Science, Inc</td><td>2160250</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do czyszczenia GenCatch PCR</td><td>Epoch Life Science, Inc</td><td>2360050</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan gentamycyny</td><td>Lonza</td><td>17-518Z</td><td></td></tr><tr><td>Kapilara szklana (25 &mikro; l)</td> <td>VWR</td><td>53432-761</td><td></td></tr><tr><td>Szklana kolba 2800 ml</td><td>Pyrex USA</td><td>4423-2XL</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>HEK293S GnTl-ATCC</td><td></td> <td>CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (izopropylo-tio-B-galaktozyd)</td><td>GoldBio.com</td><td>I2481C25</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan kanamycyny</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth,</td><td>Miller Fisher bioOdczynniki</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Hemisulfan leupeptyny</td><td>GoldBio.com</td><td>L-010-5</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 7H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1344</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher bioReagents</td><td>BP2936</td><td></td></tr><tr><td>MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Metyl Metanetynosulfonian</td><td>Toronto Research Chemicals, Inc</td><td>O873900</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatyna A</td><td>GoldBio.com</td><td>P-020-5</td><td></td></tr><tr><td>Kwas pluronowy F-127 (20%)</td><td>PromoKine&nbsp; &nbsp;</td><td>CA707-59004</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>GoldBio.com</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór poli-L-lizyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelniona kapilara</td><td>VitroCom</td><td>na specjalne zamówienie</td><td></td></tr><tr><td>SF-900 II SFM (podłoże dla komórek owadzich)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>10902-088</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 Komórki (przystosowane do SFM)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11496-015</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z polarnych lipidów sojowych</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc</td><td>541602C</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25590</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>29091596</td><td></td></tr><tr><td>TCEP HCl</td><td>GoldBio.com</td><td>TCEP1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek tetracykliny</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Difco</td><td>0123-01</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>GoldBio.com</td><td>X4281C</td><td></td></tr><tr><td>Oocyty Xenopus</td><td>Nasco</td><td>LM00935M</td><td></td></tr><tr><td>XL1 - Blue Competent Cells</td><td>Agilent Technologies, Inc</td><td>200249</td><td></td></tr><tr><td>Drożdże Ekstrakt</td><td>Difco</td><td>0127-01-7</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pack kolumna chromatograficzna</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Bezplamiste żele prefabrykowane</td><td>Bio-Rad</td><td>17000436</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac1 Wektor ekspresji</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10360-014</td><td></td></tr><tr><td>DH10Bac Kompetentne komórki</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelniacz do rurek kapilarnych Critiseal</td><td>Leica Microsystems</td><td>02-676-20</td><td></td></tr><tr><td>ABI Model 3130XL Analizatory genetyczne</td><td>Applied Biosystems</td><td>4359571</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa</td><td>Fishebrand</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr></tbody></table>

oczyszczanie i rekonstytucja trpv1 do analizy spektroskopowej

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Polimodalne kanały jonowe przekształcają wiele bodźców o różnym charakterze w zmiany allosteryczne; te dynamiczne konformacje są trudne do określenia i pozostają w dużej mierze nieznane. Dzięki niedawnym postępom w dziedzinie kriomikroskopii elektronowej pojedynczej cząstki (cryo-EM), które rzucają światło na cechy strukturalne agonistycznych miejsc wiązania i mechanizm aktywacji kilku kanałów jonowych, przygotowano grunt pod dogłębną dynamiczną analizę ich mechanizmów bramkowania przy użyciu podejść spektroskopowych. Techniki spektroskopowe, takie jak paramagnetyczny rezonans elektronowy (EPR) i podwójny rezonans elektronowo-elektronowy (DEER), ograniczają się głównie do badania prokariotycznych kanałów jonowych, które można oczyścić w dużych ilościach. Zapotrzebowanie na duże ilości funkcjonalnych i stabilnych białek błonowych utrudniło badanie kanałów jonowych ssaków przy użyciu tych metod. EPR i DEER oferują wiele korzyści, w tym określenie struktury i dynamicznych zmian ruchomych regionów białka, choć w niskiej rozdzielczości, które mogą być trudne do uzyskania za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub cryo-EM, oraz monitorowanie odwracalnego przejścia bramkowania (tj. zamkniętego, otwartego, uczulonego i odczulonego). W tym miejscu udostępniamy protokoły uzyskiwania miligramów funkcjonalnych, rozpuszczonych w detergentach przejściowych kanałów kationowych potencjału receptora V członka 1 (TRPV1), które można oznaczyć do spektroskopii EPR i DEER.

Charakterystyka funkcjonalna minimalnego konstruktu TRPV1 pozbawionego cystein (eTRPV1) oraz mutantów z pojedynczą cysteiną
Pierwszym krokiem w badaniach spektroskopowych jest zaprojektowanie i charakterystyka konstruktów białek pozbawionych cystein (Rysunek 2A), które są funkcjonalne i pozwalają na uzyskanie biochemicznych ilości białka. Funkcjonalność eTRPV1 została potwierdzona za pomocą obrazowania...

Ten artykuł opisuje konkretne metody uzyskiwania biochemicznych ilości TRPV1 rozpuszczonego w detergentach do analizy spektroskopowej. Połączone protokoły zapewniają narzędzia biochemiczne i biofizyczne, które można dostosować w celu ułatwienia badań strukturalnych i funkcjonalnych kanałów jonowych ssaków w środowisku kontrolowanym przez błonę.

Oczyszczanie i rekonstytucja TRPV1 do analizy spektroskopowej

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Tutaj, w laboratorium, uważamy, że zastosowanie podejścia spektroskopowego może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące rodziny kanałów jonowych o potencjale receptora przejściowego. Takich jak określenie dynamicznych zmian informacyjnych związanych z aktywacją polimodalną. Główną zaletą tego protokołu jest to, że umożliwia miligram czystego i funkcjonalnego pozostałego kanału jonowego do epitroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznego i epitroskopii podwójnego elektronowego rezonansu elektronowego.Metoda ta może dostarczyć informacji na temat zmian konformacyjnych zgodnych z termicznym i niezależnym od światła bramkowaniem 3B1. Można go również zastosować do innych kanałów podróży, takich jak na przykład 3B2. Rozpocznij tę procedurę od zaprojektowania starterów mutagenezy za pomocą narzędzi online.Przygotować reakcję PCR zgodnie z opisem w protokole tekstowym i odwirować mieszaninę. Umieść probówki w termocyklerze i przeprowadź mutagenezę PCR, korzystając z parametrów PCR wymienionych w protokole tekstowym. Następnie dodaj dwa mikrolitry enzymu DPN1 do reakcji i wymieszaj.Inkubować reakcje w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie przeprowadź transformację, dodając 75 mikrolitrów rozmrożonych komórek kompetentnych E.Coli i 10 mikrolitrów mieszaniny PCR poddanej działaniu DPN1 do wstępnie schłodzonej sterylnej probówki o pojemności 14 mililitrów. Po delikatnym wymieszaniu inkubować reakcję na lodzie przez 30 minut.Utrzymuj probówkę w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 45 sekund, a następnie natychmiast umieść ją na lodzie na dwie minuty. Umieść mieszaninę na płytce agarowej LB zawierającej karbenicylinę i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po zebraniu pojedynczych kolonii i przygotowaniu noclegów zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy odwirowywać kultury przez noc w temperaturze 8000 razy G przez 10 minut.Następnie wyekstrahuj DNA zgodnie z instrukcjami dostępnymi na rynku mini zestawach przygotowawczych. Aby wytworzyć rekombinowaną bakterię, przekształć 100 mikrolitrów komórek DH10bac E.Coli z 7,5 nanogramami rekombinowanego wektora dawcy. Wektory zawierają funkcjonalny minimalny szczur bez cysteiny TRPV1, w skrócie eTRPV1 i/lub pojedyncze mutanty cysteiny.Po wysianiu i inkubacji komórek, jak opisano w protokole tekstowym, wybierz białe kolonie o średnicy dwóch milimetrów, ponieważ niebieskie kolonie nie mają interesującej ich wkładki. Użyj mikroskopu stereoskopowego, aby sprawdzić, czy białe kolonie nie zawierają żadnych niebieskich plam. Zbierz co najmniej trzy pojedyncze kolonie i przenieś je do 14-mililitrowej sterylnej probówki zawierającej cztery mililitry uzupełnionej pożywki LB.Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 250 obr./min. Weź 1,5 mililitra nocnych kultur i wyizoluj rekombinowane DNA bakmidów. Aby wygenerować rekombinowanego bakulowirusa, umieść milion komórek SF9 w dwumilimetrowym pożywce komórkowej owadów.Pozwól komórkom przyczepić się przez co najmniej 45 minut. Po jednokrotnym umyciu jednym mililitrem świeżej pożywki, usuń pożywkę myjącą i dodaj mieszaninę odczynników do transfekcji DNA do komórek. Inkubować komórki w temperaturze 27 stopni Celsjusza przez pięć godzin bez mieszania.Po inkubacji usunąć mieszaninę transfekcji i zastąpić ją dwoma mililitrami pożywki z komórek owadów zawierającej 0,5% płodowej surowicy bydlęcej. Następnie inkubuj komórki w temperaturze 27 stopni Celsjusza przez pięć dni. Przenieś pożywkę do hodowli komórkowej do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.Wyizoluj pierwsze przejście wirusa, obracając probówkę pod ciśnieniem 8000 razy G przez 15 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Przenieść supernatant do czystej 15-mililitrowej probówki wirówkowej i natychmiast przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Z drugiej generacji wirusa, odpipetować 25-mililitrową kulturę zawiesinową pożywki z komórek owadów w ilości miliona komórek SF9 na mililitr zawierającej 2% FBS do kolby o pojemności 125 mililitrów.Dodaj 25 mikrolitrów wirusa P1 do 25 mililitrowej hodowli. Następnie inkubuj kulturę w temperaturze 27 stopni Celsjusza przez 72 godziny. Aby zebrać szczep wirusa P2, przenieś kulturę do nowej 50-mililitrowej probówki i odwiruj ją w temperaturze 8000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Przenieś supernatant do nowej 50-mililitrowej probówki i natychmiast przechowuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodaj jeden mililitr zapasu wirusa P2 do litrowej kultury i inkubuj ją w temperaturze 27 stopni Celsjusza przez 72 godziny. Zbierz jednolitrową kulturę zawiesiny komórek owadów, wirując z prędkością 4500 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Zważyć osad komórkowy. Oczekuje się, że będzie to około sześciu do dziewięciu gramów. Zawiesić osad komórkowy w 25 mililitrach lodowatego buforu A w obecności inhibitorów proteazy.Zdezagregować zbrylenia komórek, aby uzyskać jednorodną zawiesinę i obracać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Rozbij komórki za pomocą homogenizatora ręcznego lub wysokociśnieniowego. Po usunięciu resztek komórek przez odwirowanie w temperaturze 8000 razy G przez 20 minut w czterech stopniach Celsjusza, zebrać supernatant i ponownie odwirować w temperaturze 100 000 razy G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po odwirowaniu odrzucić supernatant i zawiesić osad membranowy w łącznej objętości 20 mililitrów lodowatego buforu B uzupełnionego inhibitorami proteazy. Porcja 20 mililitrów zawiesiny membranowej na 50 mililitrowych probówek. Aby przeprowadzić oczyszczanie białka, dodaj trzy mililitry DDM na probówkę.Obracaj probówki przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu próbki w temperaturze 100 000 razy G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, zebrać supernatant i dodać jeden mililitr czystej, mokrej żywicy amylozy. Obracaj mieszaninę przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie załadować mieszaninę białek amylozy do kolumn chromatografii grawitacyjnej. Przemyj żywicę amylozy związaną z białkami 10-krotnością objętości złoża lodowatego buforu C, a następnie 10 objętościami złoża lodowatego buforu D. Elute białko eTRPV1 frakcjami 0,5 mililitra do pięciu mililitrów lodowatego odgazowanego buforu D uzupełnionego 20-milimolową maltozą. Płucz i elucję w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Używając odśrodkowego filtra odśrodkowego o mocy 100 kilodaltonów, skoncentruj frakcje zawierające eTRPV1 do 2,5 miligrama na mililitr w celu etykietowania. Następnie dodaj dziesięciokrotny molowy nadmiar znacznika spinowego MTSSL ze 100-milimolowego roztworu podstawowego w DMSO do skoncentrowanego białka. Powtarzaj to dwa razy co 30 minut.Utrzymuj reakcję w ciemności w temperaturze pokojowej przez godzinę i 30 minut, a następnie przez noc inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie załadować etykietę spinową do eTRPV1 na kolumnę chromatograficzną z wykluczeniem wielkości, zrównoważoną w buforze E, kontrolowaną przez system szybkiej chromatografii cieczowej białek. Zebrać frakcje zawierające tetramer eTRPV1.Suszyć 10 miligramów izolektyny za pomocą obrotowej parownika pod próżnią przez godzinę w temperaturze 40 stopni Celsjusza. Aby wytworzyć liposomy asolektyny, dodaj jeden mililitr buforu F i sonikuj mieszaninę przez 15 minut lub do momentu, gdy próbka będzie jednorodna. Zdestabilizuj liposomy, dodając DDM do końcowego stężenia dwóch milimolowców i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Po dostosowaniu mieszaniny do krytycznego stężenia chlopli DDM, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy podwoić objętość mieszaniny liposomów białkowych za pomocą buforu F. Usunąć detergent, dodając kolejno trzy podwielokrotności niepolarnych kulek chłonnych polistyrenu w odstępach godzinnych z delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej. Załaduj mieszaninę na filtr kolumnowy, aby usunąć kulki i przenieś mieszaninę proteoliposomów do probówki ultrawirówkowej. Odwirować próbki w temperaturze 100 000 razy G przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 30 mikrolitrach buforu F, a następnie przeprowadzić pomiary spektroskopowe i analizę. Pierwszym punktem kontrolnym jest analiza funkcjonalna mutantów pojedynczej cysteiny przed podjęciem protokołów ekspresji i oczyszczania. Tutaj komórki hek293 eksprymujące TRPV1, eTRPV1 i mutanty typu dzikiego analizowano pod kątem odpowiedzi wywołanych kapsaicyną za pomocą obrazowania fluorescencji wapnia.Drugim punktem kontrolnym jest charakterystyka biochemiczna mutantów pojedynczej cysteiny znakowanych spinem za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar przed przystąpieniem do rekonstytucji i analizy spektroskopowej. Trzecim punktem kontrolnym jest funkcjonalna charakterystyka odtworzonych mutantów pojedynczej cysteiny znakowanych spinem przed podjęciem analizy spektroskopowej. Zależności napięcia prądowego wyznaczone za pomocą dwóch zacisków napięciowych elektrod z oocytów Xenopus mikroiniekowanych proteoliposomami zawierającymi spin znakowany A702C poddano próbie pH5 i zablokowano kapsazepiną.Wreszcie, możliwe jest uzyskanie ruchliwości mutantów eTRPV1 znakowanych spinem określonych za pomocą EPR o fali ciągłej. Pierwsze widma pochodne pokazano dla znakowanych spinowo mutantów cysteiny w roztworze DDM i odtworzonych w liposomach asolektyny. Odległości i ruchliwość mutantów eTRPV1 znakowanych spinem w detergencie zostały również określone przez DEER.Pokazano echo jelenia i rozkład odległości spinu oznaczonego jako mutant E651C. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyrażać, upiększać i rekonstruować kanał jonowy ssaków do analizy spektroskopowej. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą zmagać się z brakiem funkcji białka podczas usuwania reszt cysteiny, niską wydajnością białka i niestabilnością białka zarówno podczas oczyszczania, jak i po znakowaniu wirowym oraz agregacją białek w detergentach lub liposomach.Po jego opracowaniu, protokoły te pozwolą na uzyskanie odległości i dynamicznych zmian w celu zbadania modeli mechanistycznych dla bramkowania polimodalnego TRPV1.

purification-and-reconstitution-of-trpv1-for-spectroscopic-analysis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisujemy prosty protokół służący do identyfikacji białek mózgowych wiążących się z pełną sekwencją końca C receptorów P2X2 bramkowanych przez ATP. Przewiduje się, że rozszerzenie i systematyczne zastosowanie tego podejścia do wszystkich receptorów P2X doprowadzi do lepszego zrozumienia sygnalizacji receptorów P2X.

Proteomika w celu identyfikacji białek oddziałujących z ligandowo-bramkowanymi kanałami kationowymi P2X2

Izotachforeza (ITP) jest wydajną elektrokinetyczną techniką rozdziału i prekonecentracji, znajdującą zastosowanie w wielu obszarach, od detekcji toksyn po przygotowanie próbek. W niniejszym opracowaniu omawiamy zasady fizyczne ITP oraz metodologię zastosowania tej techniki w dwóch konkretnych przykładach: rozdziału i detekcji małych cząsteczek oraz oczyszczaniu kwasów nukleowych z lizatu kultur komórkowych.

Izotachoforeza na chipie do rozdzielania jonów i oczyszczania kwasów nukleinowych

Termoforeza w mikroskali (MST) może być szeroko stosowana do określania powinowactwa do wiązania bez oczyszczania docelowego białka z lizatów komórkowych. Protokół obejmuje nadekspresję białka połączonego z GFP, lizę komórek w warunkach niedenaturujących oraz wykrywanie sygnału MST w obecności różnych stężeń liganda.

Metoda oznaczania powinowactwa do wiązań bez oczyszczania białek za pomocą termoforezy w mikroskali

Aby uzupełnić powszechnie stosowane metody badania TRPV4, opisano dwie metody: Jego mechanowrażliwość może być badana za pomocą luminometrii Ca2+-aequorin w transgenicznych drożdżach po prowokacji hypo-osmotycznej.  Można go również badać w oocytach Xenopus z wstrzyknięciem TRPV4-RNA za pomocą dwuelektrodowego zacisku napięciowego całej komórki lub zacisku krosowego w trybie on-cell lub wyciętym.

Luminometryczne badania elektrofizjologiczne oocytów drożdży i oocytów Xenopus molekularnej mechanowrażliwości TRPV4

Kluczowe etapy funkcjonowania białka, w szczególności zmiany konformacyjne szkieletu i reakcje transferu protonów, często odbywają się w skali od mikrosekund do milisekund. Te dynamiczne procesy można badać za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera ze skanowaniem czasowo-rozdzielczym, w szczególności w przypadku białek, których funkcja jest wyzwalana przez światło.

Transfer protonów i dynamika konformacji białek w białkach światłoczułych za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera ze skanowaniem czasowym i transformacją Fouriera

Rekonstytucja białka transbłonowego, KvAP, w gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUVs) jest demonstrowana dla dwóch metod odwodnienia i ponownego nawodnienia — elektroformacji i pęcznienia wspomaganego żelem. W obu metodach małe jednowarstwowe pęcherzyki zawierające białko są łączone ze sobą, tworząc GUV, które można następnie badać za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i elektrofizjologii patch-clamp.

Rekonstytucja białka transbłonowego, kanału jonowego bramkowanego napięciem, KvAP, w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych do badań mikroskopowych i patch clamp

Ten manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić (pojedyncze cząsteczki) testy oparte na transferze energii rezonansu Förstera (FRET) w celu zmierzenia dynamiki wiązania między receptorem antygenu limfocytów T (TCR) a cząsteczkami MHC naładowanymi peptydami antygenowymi, które występują w synapsie immunologicznej limfocytu T w kontakcie z funkcjonalizowaną dwuwarstwą lipidową podpartą planarnie.

Pomiar wiązania TCR-pMHC in situ za pomocą testu mikroskopowego opartego na FRET

Badanie kanałów jonowych za pomocą heterologicznie wyrażającego systemu stało się podstawową techniką w badaniach biomedycznych. W tym manuskrypcie przedstawiamy efektywną czasowo metodę osiągania ściśle kontrolowanej ekspresji kanału jonowego poprzez przeprowadzanie transfekcji przejściowej pod kontrolą indukowalnego promotora.

Kontrolowana ekspresja kanału jonowego poprzez indukowalną transfekcję przejściową

Ten protokół opisuje techniki używane do określania struktur kanałów jonowych za pomocą mikroskopii krioelektronowej, w tym system bakulowirusa używany do efektywnej ekspresji genów w komórkach ssaków przy minimalnym wysiłku i toksyczności, ekstrakcję białek, oczyszczanie i kontrolę jakości, przygotowanie siatki próbek i badanie przesiewowe, a także zbieranie i przetwarzanie danych.

Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Na podstawie mechanizmu składania kompleksu białkowego INAD, w tym protokole, zmodyfikowano strategię oczyszczania powinowactwa i konkurencji w celu oczyszczenia endogennego kanału TRP Drosophila.

Oczyszczanie endogennych kanałów potencjału przejściowego receptora Drosophila

Ten protokół opisuje oparte na iSCAT przetwarzanie obrazów i śledzenie pojedynczych cząstek, które umożliwia jednoczesne badanie masy cząsteczkowej i dyfuzyjnego zachowania makrocząsteczek oddziałujących z błonami lipidowymi. Instrukcje krok po kroku dotyczące przygotowania próbki, konwersji masy na kontrast, akwizycji filmu i obróbki końcowej są dostępne wraz ze wskazówkami, aby zapobiec potencjalnym pułapkom.

Śledzenie cząstek czułych na masę w celu scharakteryzowania dynamiki makrocząsteczek związanych z błoną

Poznaj metody oczyszczania i rekonstytucji TRPV1 do analizy spektroskopowej EPR i DEER. Protokoły te umożliwiają uzyskanie miligramowych ilości czystego kanału jonowego do badań zmian konformacyjnych.

Oczyszczanie i rekonstytucja TRPV1 do analizy spektroskopowej

Przeglądaj więcej filmów