Skuteczne oczyszczanie i opracowywanie testów opartych na LC-MS/MS dla dioksygenazy 5-metylocytozynowej translokacji Ten-Eleven-2

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w epigenetyce i dziedzinie demetylacji 5-metylocytozyny za pośrednictwem TET2, takie jak analiza aktywności normalnych i klinicznych mutacji TET2. Główną zaletą tej techniki jest to, że natywny TET2 można oczyścić w jednym kroku, a jego aktywność można analizować pod kątem powstawania wszystkich trzech produktów. Kilku doktorantów zademonstruje tę procedurę.

Oczyszczanie białka zostanie przeprowadzone przez Chayan Bhattacharya, test TET2 przez Aninda Sundary Dey, a analiza LC-MS/MS przez Navida Ayona. W celu transformacji bakteryjnej dodaj jeden mikrolitr rekombinowanego docelowego wektora ekspresyjnego pDEST 14 zawierającego nieoznakowaną ludzką dioksygenazę TET2 do 100 mikrolitrów chemicznie kompetentnych komórek E. coli BL21 DE3 w probówce o pojemności 1,7 mililitra. Po inkubacji na lodzie przez co najmniej 15 minut, mieszaninę należy poddać szokowi cieplnemu w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 30 sekund w łaźni wodnej.

Natychmiast po szoku cieplnym umieść komórki z powrotem na lodzie na co najmniej dwie minuty. Następnie dodaj do komórek 250 mikrolitrów super optymalnego bulionu z represją katabolitową. Inkubuj komórki bakteryjne przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w shakerze.

Po inkubacji odwiruj komórki, odwirowując probówkę pod ciśnieniem 9 000 razy większym niż grawitacja przez jedną minutę. Odrzucić 70% supernatantu przez pipetowanie i rozpuścić osad w pozostałym pożywce. Rozprowadzić zawiesinę komórkową na płytce z agarem bulionowym Lirua zawierającej 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny.

Inkubować płytkę przez 16 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wybierz jedną izolowaną kolonię i zaszczep ją w 10 mililitrach pożywki ampicyliny LB. Inkubować probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w shakerze przez noc.

Następnie użyj 100 mikrolitrów kultury bakteryjnej do zaszczepienia 100 mililitrów pożywki LB ampicyliny jako kultury podstawowej. Inkubować probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w shakerze przez noc. Następnego dnia zaszczepić 15 kolb, z których każda zawiera 600 mililitrów pożywki ampicyliny LB z sześcioma mililitrami kultury pierwotnej na kolbę.

Inkubować kolby w temperaturze 37 stopni Celsjusza na wytrząsarce z prędkością 180 obr./min. Aby sprawdzić gęstość kultury bakteryjnej, zmierz jej gęstość optyczną na 600 nanometrach lub OD600 za pomocą spektrofotometru. Gdy hodowla osiągnie gęstość 0,8 w OD600, indukuj ekspresję białka TET2 za pomocą 300 mikrolitrów jednego molowego IPTG w każdej kolbie i hoduj kulturę przez dodatkowe 16 godzin w temperaturze 17 stopni Celsjusza.

Po inkubacji przenieś kulturę bakteryjną do butelek wirówkowych. Odwirować kulturę bakteryjną wykazującą ekspresję enzymu TET2 pod ciśnieniem 5 250 razy większym niż grawitacja przez 45 minut. Użyj osadu bakteryjnego do oczyszczenia TET2.

Pracując na lodzie lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza, ponownie zawiesić osad bakteryjny w 100 mililitrach 50-milimolowego buforu MES o pH sześć. Następnie weź pięć mililitrów zawiesiny komórek i doprowadź ją do 45 mililitrów za pomocą buforu. Sonikuj zawiesinę pięć razy po 30 sekund przy mocy 20, z 60-sekundowymi przerwami na chłodzenie.

Wiruj lizatem 5 250 razy grawitacja przez 45 minut. Zebrać supernatant zawierający rozpuszczalny enzym TET2 i przepuścić go przez filtry 0,45 mikrona przed załadowaniem do systemu FPLC. Zapakuj 30 mililitrów silnej żywicy kationowymiennej do kolumny FPLC.

Zrównoważyć kolumnę z 10 objętościami złoża buforu płuczącego przy stałym natężeniu przepływu 0,3 mililitra na minutę za pomocą systemu FPLC. Załadować oczyszczony lizat do wstępnie zrównoważonej kolumny i przemyć około 10 objętościami złoża buforu do przemywania do momentu, aż przepływ stanie się czysty. Eluować TET2 przy użyciu gradientu od zera do 10% od buforu płuczącego do buforu elucyjnego w 15 objętościach złoża, a następnie utrzymywać się przy 10% buforze elucyjnym dla dwóch objętości złoża.

Zbierz 100 mikrolitrów próbek lizatu komórkowego przed i po załadowaniu kolumny, wraz ze wszystkimi frakcjami elucyjnymi, i przeanalizuj na żelu SDS-PAGE o rozdzielczości 10%. Połącz frakcje zawierające białko TET2 i liofilizuj białko. Następnie rozpuść enzym w 10 mililitrach wody i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Przeprowadzić wszystkie reakcje demetylacji w trzech powtórzeniach z trzema mikrogramami substratu. Dodać 100 mikrogramów oczyszczonego enzymu TET2 do 50 mikrolitrów całkowitego buforu reakcyjnego. Po godzinnej inkubacji w temperaturze 37 stopni wygasić reakcje utleniania katalizowane przez TET2 pięcioma mikrolitrami 500-milimolowego EDTA.

Aby przygotować próbki do analizy, należy oddzielić DNA od mieszaniny reakcyjnej TET2, dodając najpierw 100 mikrolitrów buforu wiążącego oligo, do 55 mikrolitrów wygaszonej reakcji. Następnie dodaj 400 mikrolitrów 100% etanolu do mieszanki. Przepuścić tę mieszaninę przez kolumnę wiążącą oligo.

Po umyciu związanego DNA 750 mikrolitrami buforu do płukania, należy wymyć DNA w 20 mikrolitrach wody. Teraz trawić wyizolowane DNA dwiema jednostkami DNazy I i 60 jednostkami nukleazy S1 w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 godzin, aby wytworzyć pojedyncze monofosforany nukleozydów. Po roztrawieniu dodać do próbek dwie jednostki fosfatazy alkalicznej jelitowej cielęcia.

Inkubować przez 12 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu usunięcia końcowych grup fosforanowych z monofosforanów nukleozydów i otrzymania nukleozydów. Przygotować 100-mikromolowy roztwór podstawowy wszystkich zmodyfikowanych nukleozydów cytozyny i normalnych zasad DNA w wodzie o jakości HPLC w celu opracowania metody LC-MS/MS. Zoptymalizuj parametry MS/MS zależne od nukleozydów, pojedynczo pojedynczo w spektrometrze mas z natężeniem przepływu 10 mikrolitrów na minutę w trybie ulepszonego skanowania MS.

Kilka parametrów można zoptymalizować za pomocą funkcji automatycznej optymalizacji ilościowej oprogramowania dla każdego nukleozydu DNA. W tym momencie zoptymalizuj pozostałe parametry dla każdego nukleozydu DNA, korzystając z funkcji ręcznej optymalizacji ilościowej oprogramowania w trybie analizy wtrysku przepływowego. Teraz zoptymalizuj parametry MS/MS w zależności od źródła, wstrzykując 10 mikrolitrów roztworu podstawowego przy użyciu gradientu z 25% rozpuszczalnikiem B przy natężeniu przepływu 0,3 mililitra na minutę.

Aby oddzielić wszystkie osiem nukleozydów DNA, należy przeprowadzić chromatografię cieczową zgodnie z opisem w protokole tekstowym na kolumnie C18. Na koniec wykryj i określ ilościowo wszystkie nukleozydy za pomocą metody LC-MS/MS w krzywych standardowych. Ponieważ domena katalityczna TET2 ma stosunkowo wysoki punkt izoelektryczny w porównaniu z większością rodzimych białek E. coli, opracowano wydajny proces oczyszczania z wykorzystaniem chromatografii kationowymiennej.

To oczyszczanie dało ponad 90% czystego enzymu TET2 w jednym kroku. W celu oddzielenia i ilościowego określenia różnych pochodnych deoksycytydyny i czterech naturalnych zasad DNA po reakcji enzymatycznej TET2 zoptymalizowano czuły test oparty na LC-MS/MS. Krzywe wzorcowe wyprowadzono przy użyciu seryjnych rozcieńczeń mieszaniny zawierającej wszystkie nukleozydy.

Wyniki chromatografii cieczowej metodą MS/MS przedstawiono tutaj. Metoda pozwala na separację i kwantyfikację czterech normalnych zasad DNA, a także czterech zmodyfikowanych zasad cytozynowych. W tej procedurze eksperymentalnej opisujemy klonowanie nieoznakowanej ludzkiej domeny katalitycznej dioksynazy TET2 przy użyciu techniki rekombinacji specyficznej dla miejsca i wystarczającej ekspresji w wektorze docelowym w E. Coli.

Skutecznie oczyściliśmy nieoznakowany enzym TET2 za pomocą chromatografii kationowymiennej, aby uzyskać ponad 90% czystości w jednym kroku. Ponadto opracowaliśmy nowatorską metodę chromatografii cieczowej w celu oddzielenia czterech normalnych zasad DNA i czterech zmodyfikowanych zasad cytozynowych. Aby określić ilościowo osiem nukleozydów z reakcji katalizowanych TET2, połączyliśmy naszą ulepszoną metodę chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas.

Czuły test LC-MS/MS został następnie wykorzystany do określenia aktywności rekombinowanego, nieznakowanego ludzkiego enzymu TET2. Opisane tutaj podejście znacznie poprawi wycenę dioksygenazy TET2 typu dzikiego i zmutowanego.