Name: Skuteczne oczyszczanie i opracowywanie testów opartych na LC-MS/MS dla dioksygenazy 5-metylocytozynowej translokacji Ten-Eleven-2 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Poznaj protokół oczyszczania ludzkiej dioksygenazy TET2 metodą chromatografii jonowymiennej oraz analizę aktywności tego enzymu za pomocą LC-MS/MS w badaniach epigenetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie zostało sfinansowane przez Departament Obrony USA w formie Nagrody za Pomysł (W81XWH-13-1-0174), Grantu Fundacji Niedokrwistości Aplastycznej i MDS oraz grantu UMRB dla M.M. Autorzy dziękują Mohitowi Jaiswalowi i Subhradeepowi Bharowi za wstępne sklonowanie TET2 w wektorze pDEST14.

1. Klonowanie i oczyszczanie nieoznakowanej ludzkiej dioksygenazy TET2
<ol>
	<li>Sklonuj ludzką dioksygenazę TET2 (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) do wektora docelowego pDEST14 przy użyciu techniki rekombinacji specyficznej dla miejsca, jak opisano wcześniej22. 
	UWAGA: Poprzednie badania wykazały, że domena C-końcowej dioksygenazy TET2 (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) jest minimalną domeną aktywną katalitycznie21,23. W celu ekspresji nieznakowanej domeny dioksygenazy TET2 za pomocą wektora pDONR221, sekwencje Shine Dalgarno i Kozak zostały włączone do startera forward podczas PCR (Tabela 1).</li>
	<li>W celu transformacji bakteryjnej dodać 1 μl rekombinowanego wektora ekspresyjnego pDEST14 zawierającego nieznakowaną ludzką dioksygenazę TET2 (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) do 100 μl chemicznie kompetentnych komórek E. coli BL21 (DE3) w probówce o pojemności 1,7 ml. Przechowywać mieszaninę na lodzie przez co najmniej 15 minut, a następnie szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 30 s w łaźni wodnej.
	<ol>
		<li>Natychmiast po szoku cieplnym trzymaj komórki z powrotem na lodzie przez co najmniej 2 minuty. Następnie dodaj 250 μl super optymalnego bulionu z represją katabolitową (pożywka S.O.C) do komórek. Inkubować komórki bakteryjne przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w shakerze.</li>
		<li>Po inkubacji odwirować komórki, odwirowując probówkę o stężeniu 9 000 x g przez 1 min. Odrzucić 70% supernatantu przez pipetowanie i rozpuścić osad w pozostałym pożywce.</li>
		<li>Rozprowadzić zawiesinę komórkową na płytce agarowej z bulionu Luria (LB) zawierającej 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować płytkę przez 16 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz jedną izolowaną kolonię i zaszczep ją w 10 ml pożywki LB-ampicyliny w probówce o pojemności 50 ml. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C w wytrząsarce przez noc. Następnie użyj 100 μl kultury z probówki 50 ml do zaszczepienia 100 ml pożywki LB-ampicyliny. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C na wytrząsarce z prędkością 180 obr./min i użyć jej jako kultury podstawowej. Następnego dnia użyj 6 ml każdej z kultur pierwotnych do zaszczepienia 15 kolb, z których każda zawiera 600 ml pożywki LB-ampicyliny. Teraz inkubować 15 kolb w temperaturze 37 °C na wytrząsarce z prędkością 180 obr./min. 
	UWAGA: W celu weryfikacji przekształconych klonów należy przeprowadzić sekwencjonowanie DNA lub trawienie restrykcyjne z wyizolowanym plazmidowym DNA.</li>
	<li>Aby sprawdzić gęstość kultury bakteryjnej, zmierz jej OD600 za pomocą spektrofotometru. Gdy hodowla osiągnie gęstość 0,8 przy OD600, indukować ekspresję białka TET2 za pomocą 300 μl 1 M (końcowe stężenie 0,5 mM w 600 ml) IPTG w każdej kolbie i dalej hodować kulturę przez 16 godzin w temperaturze 17 °C.</li>
	<li>Po 16 godzinach przenieść kulturę bakteryjną do butelek wirówkowych. Odwirować kulturę bakteryjną z ekspresją enzymu TET2 w temperaturze 5 250 x g przez 45 minut. Użyj granulatu bakteryjnego do oczyszczania TET2. 
	UWAGA: Wszystkie pozostałe etapy oczyszczania białka należy wykonać na lodzie lub w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad bakteryjny w 100 ml 50 mM buforu MES (kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy) o pH 6 i sonikować przez 5 × 30 s przy mocy 20 z 60-sekundowymi przerwami na chłodzenie.</li>
	<li>Wirować lizat przy 5 250 x g przez 45 minut. Zebrać supernatant zawierający rozpuszczalny enzym TET2 i przepuścić przez filtry 0,45 μm przed załadowaniem do systemu FPLC. 
	UWAGA: W tych eksperymentach enzym TET2 był bardzo stabilny, ale w razie potrzeby do lizatu komórkowego można dodać koktajl inhibitorów proteazy zawierający 1 mM benzamidyno-HCl, 1 mM fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF) i 0,5 mM 1,10-o-fenantrolinę, aby zapobiec degradacji enzymu TET2. Należy unikać stosowania EDTA lub EGTA w koktajlu inhibitorów, ponieważ mogą one zakłócać następującą chromatografię kationowymienną.</li>
	<li>Zapakuj 30 ml silnej żywicy kationowymiennej do kolumny FPLC. Zrównoważyć kolumnę z 10 objętościami złoża buforu do płukania (50 mM bufor MES, pH 6) przy stałym natężeniu przepływu 0,3 ml/min za pomocą systemu FPLC.</li>
	<li>Załadować oczyszczony lizat do wstępnie zrównoważonej kolumny i przemyć ∼10 objętościami złoża buforu do przemywania do momentu, gdy przepływ stanie się czysty.</li>
	<li>Elutę TET2 należy przeprowadzić przy użyciu gradientu 0-100% od buforu płuczącego do buforu elucyjnego (50 mM buforu MES, pH 6, 1 M NaCl) w 15 objętościach złoża, a następnie utrzymywać w 100% buforze elucyjnym dla objętości dwuzłożowych. 
	UWAGA: Pobrać próbki (po 100 μl każda) lizatu komórkowego przed i po załadowaniu kolumny wraz ze wszystkimi frakcjami elucji i przeanalizować w rozdzielczości 10% SDS-PAGE.</li>
	<li>Frakcje zawierające białko TET2 należy połączyć w warstwę, wyliofilizować na sucho, rozpuścić na palecie enzymów w 10 ml wody i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. 5mC Utlenianie przez dioksygenazę TET2
<ol>
	<li>Przeprowadzić wszystkie reakcje demetylacji w trzech egzemplarzach z 3 μg substratu (25-merowy dwuniciowy DNA, tabela 2).
	<ol>
		<li>Dodać 100 μg oczyszczonego enzymu TET2 do 50 μl całkowitego buforu reakcyjnego zawierającego 50 mM HEPES (pH 8,0), 200 μM FeSO4, 2 mM 2OG (2-oksoglutaran/α-ketoglutaran) i 2 mM askorbinianu i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 h21.</li>
		<li>Ugasić katalizowane przez TET2 reakcje utleniania za pomocą 5 μl 500 mM EDTA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po wygaszeniu reakcji TET2 należy przygotować próbki do analizy LC-MS/MS, oddzielając DNA od mieszaniny reakcyjnej TET2 za pomocą kolumn do oczyszczania oligo.
	<ol>
		<li>Dodać 100 μl buforu wiążącego oligonukleotydy do 55 μl wygaszonej reakcji.</li>
		<li>Następnie dodaj 400 μl 100% etanolu do mieszaniny. Przepuścić tę mieszaninę przez kolumnę wiążącą oligo.</li>
		<li>Przemyć związane DNA 750 μl buforem do przemywania i wymyć w 20 μl wody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trawić wyizolowany DNA za pomocą 2 jednostek DNazy I i 60 jednostek nukleazy S1 w temperaturze 37 °C przez 12 godzin w celu wytworzenia pojedynczych monofosforanów nukleozydów.</li>
	<li>Po roztwarzeniu dodać 2 jednostki alkalicznej fosfatazy jelitowej cieląt () do próbek i inkubować do dodawania przez 12 godzin w temperaturze 37 °C w celu usunięcia końcowych grup fosforanowych z monofosforanów nukleozydów w celu otrzymania nukleozydów.</li>
	<li>Oznacz ilościowo wszystkie nukleozydy, zwłaszcza zmodyfikowane cytozyny, stosując metodę LC-MS/MS opisaną poniżej.</li>
</ol>
3. Ilościowe opracowanie testów opartych na LC-MS/MS
<ol>
	<li>Przygotować 100 μM roztwór podstawowy wszystkich zmodyfikowanych nukleozydów cytozyny [5-metylo-2′-deoksycytydyny (5mdC), 5-hydroksymetylo-2′-deoksycytydyny (5hmdC), 5-formylo-2′-deoksycytydyny (5fdC) i 5-karboksylo-2′-deoksycytydyny (5cadC)] oraz normalnych zasad DNA (adenina, tymina, cytozyna i guanina) w wodzie o czystości HPLC w celu opracowania metody LC-MS/MS.</li>
	<li>Zoptymalizuj parametry MS/MS zależne od nukleozydów, pojedynczo, pojedynczo w spektrometrze mas z natężeniem przepływu 10 μl/min w trybie skanowania EMS. Zoptymalizuj następujące parametry: potencjał deklastrowania (DP), potencjał wejściowy (EP), potencjał wejścia do komórki zderzeniowej (), energia zderzenia (CE) i potencjał wyjścia komórki zderzeniowej (CXP) dla każdego nukleozydu DNA, korzystając z funkcji automatycznej optymalizacji ilościowej oprogramowania.</li>
	<li>Zoptymalizuj parametry MS/MS w zależności od źródła, wstrzykując 10 μl roztworu podstawowego przy użyciu gradientu z 25% rozpuszczalnikiem B przy natężeniu przepływu 0,3 ml/min, gdzie rozpuszczalnik A to 10 mM octan amonu (pH 4,0), a rozpuszczalnik B to 20% acetonitrylu z 10 mM octanu amonu (pH 4,0). Zoptymalizuj następujące parametry: Gaz kurtynowy (CUR): 10-50, Temperatura: 0-600 °C, Przepływ gazu 1 (GS1): 0-50, Przepływ gazu 2 (GS2): 0-50, Dysocjacja aktywowana kolizyjnie (CAD): Niska-Średnia-Wysoka, Napięcie rozpylania jonów (IS): 4000-5500 dla każdego nukleozydu DNA przy użyciu funkcji ręcznej optymalizacji ilościowej oprogramowania w trybie FIA (Analiza wtrysku przepływu).</li>
	<li>Aby oddzielić wszystkie osiem nukleozydów DNA, należy przeprowadzić chromatografię cieczową przy użyciu następującego gradientu: 0% rozpuszczalnika B (0-2 min), 0-20% rozpuszczalnika B (2-5 min), 20-60% rozpuszczalnika B (5-9 min), 60-0% rozpuszczalnika B (9-10 min), a następnie równoważyć rozpuszczalnikiem A przez 5 minut przy natężeniu przepływu 0,3 ml/min na kolumnie C18 (Wielkość cząstek: 5 μm, wielkość porów: 120 μ).</li>
	<li>Stosując optymalne parametry MS/MS (etap 3.2 i 3.3) w połączeniu z wyżej wymienionym gradientem chromatografii cieczowej (etap 3.4), należy określić liniowość odpowiedzi, granicę wykrywalności (LOD) i dolną granicę oznaczalności (LLOQ) przy użyciu dwukrotnego seryjnego rozcieńczenia 100 μM mieszaniny wzorcowej zawierającej wszystkie osiem nukleozydów. Narysuj krzywe standardowe dla wszystkich ośmiu nukleozydów DNA.</li>
	<li>Wykryć i określić ilościowo wszystkie nukleozydy, zwłaszcza zmodyfikowane cytozyny, wytworzone w kroku 2.4 przy użyciu metody LC-MS/MS i krzywych wzorcowych.</li>
</ol>

<ol><li>Suzuki, M. M., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+landscapes%3A+provocative+insights+from+epigenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics.</a> Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).</li>
<li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epigenomic+reconfiguration+during+mammalian+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development.</a> Science. 341, 1237905(2013).</li>
<li>Guo, J. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution%2C+recognition+and+regulation+of+non-CpG+methylation+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distribution, recognition and regulation of non-CpG methylation in the adult mammalian brain.</a> Nature neuroscience. 17, 215-222 (2014).</li>
<li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+gene+expression%3A+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nature genetics. 33, 245-254 (2003).</li>
<li>Schultz, M. D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26030523">Human body epigenome maps reveal noncanonical DNA methylation variation.</a> Nature. 523, 212-216 (2015).</li>
<li>Bonasio, R., Tu, S., Reinberg, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21030644">Molecular signals of epigenetic states.</a> Science. 330, 612-616 (2010).</li>
<li>Feng, S., Jacobsen, S. E., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+reprogramming+in+plant+and+animal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Epigenetic reprogramming in plant and animal development.</a> Science. 330, 622-627 (2010).</li>
<li>Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+and+flexibility+of+epigenetic+gene+regulation+in+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development.</a> Nature. 447, 425-432 (2007).</li>
<li>Iyer, L. M., Tahiliani, M., Rao, A., Aravind, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+novel+families+of+enzymes+involved+in+oxidative+and+other+complex+modifications+of+bases+in+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Prediction of novel families of enzymes involved in oxidative and other complex modifications of bases in nucleic acids.</a> Cell Cycle. 8, 1698-1710 (2009).</li>
<li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li>
<li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333, 1303-1307 (2011).</li>
<li>Ponnaluri, V. K., Maciejewski, J. P., Mukherji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanistic+overview+of+TET-mediated+5-methylcytosine+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">A mechanistic overview of TET-mediated 5-methylcytosine oxidation.</a> Biochemical and biophysical research communications. 436, 115-120 (2013).</li>
<li>Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributive+Processing+by+the+Iron%28II%29%2Falpha-Ketoglutarate-Dependent+Catalytic+Domains+of+the+TET+Enzymes+Is+Consistent+with+Epigenetic+Roles+for+Oxidized+5-Methylcytosine+Bases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Distributive Processing by the Iron(II)/alpha-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 9345-9348 (2016).</li>
<li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468, 839-843 (2010).</li>
<li>Langemeijer, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquired+mutations+in+TET2+are+common+in+myelodysplastic+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Acquired mutations in TET2 are common in myelodysplastic syndromes.</a> Nat Genet. 41, 838-842 (2009).</li>
<li>Smith, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+of+the+TET2+gene+in+355+MDS+and+CMML+patients+reveals+low-abundance+mutant+clones+with+early+origins%2C+but+indicates+no+definite+prognostic+value%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing of the TET2 gene in 355 MDS and CMML patients reveals low-abundance mutant clones with early origins, but indicates no definite prognostic value.</a> Blood. 116, 3923-3932 (2010).</li>
<li>Moran-Crusio, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet2+loss+leads+to+increased+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+and+myeloid+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tet2 loss leads to increased hematopoietic stem cell self-renewal and myeloid transformation.</a> Cancer Cell. 20, 11-24 (2011).</li>
<li>Quivoron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET2+inactivation+results+in+pleiotropic+hematopoietic+abnormalities+in+mouse+and+is+a+recurrent+event+during+human+lymphomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">TET2 inactivation results in pleiotropic hematopoietic abnormalities in mouse and is a recurrent event during human lymphomagenesis.</a> Cancer Cell. 20, 25-38 (2011).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+Tet2+in+mice+leads+to+dysregulated+hematopoietic+stem+cells+and+subsequent+development+of+myeloid+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Deletion of Tet2 in mice leads to dysregulated hematopoietic stem cells and subsequent development of myeloid malignancies.</a> Blood. 118, 4509-4518 (2011).</li>
<li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten-Eleven-Translocation+2+%28TET2%29+negatively+regulates+homeostasis+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ten-Eleven-Translocation 2 (TET2) negatively regulates homeostasis and differentiation of hematopoietic stem cells in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14566-14571 (2011).</li>
<li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+TET2-DNA+complex%3A+insight+into+TET-mediated+5mC+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation.</a> Cell. 155, 1545-1555 (2013).</li>
<li>Jaiswal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convenient+expression%2C+purification+and+quantitative+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry-based+analysis+of+TET2+5-methylcytosine+demethylase%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+expression+and+purification%22%5BJournal%5D)">Convenient expression, purification and quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based analysis of TET2 5-methylcytosine demethylase.</a> Protein expression and purification. 132, 143-151 (2017).</li>
<li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insight+into+substrate+preference+for+TET-mediated+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural insight into substrate preference for TET-mediated oxidation.</a> Nature. 527, 118-122 (2015).</li>
<li>Mukherji, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+analysis+of+phytanoyl-CoA+2-hydroxylase+mutations+causing+Refsum%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Structure-function analysis of phytanoyl-CoA 2-hydroxylase mutations causing Refsum's disease.</a> Hum Mol Genet. 10, 1971-1982 (2001).</li>
<li>Mukherji, M., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2001/cc/b101039p#!divAbstract">Chemical co-substrate rescue of phytanoyl-Co A 2-hydroxylase (PAHX) mutants causing adult Refsum's disease.</a> Chem Comm. , 972-973 (2001).</li>
<li>Mukherji, M., Kershaw, N. J., Schofield, C. J., Wierzbicki, A. S., Lloyd, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+sterol+carrier+protein-2+by+phytanoyl-CoA+2-hydroxylase+in+the+peroxisomal+alpha+oxidation+of+phytanic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Utilization of sterol carrier protein-2 by phytanoyl-CoA 2-hydroxylase in the peroxisomal alpha oxidation of phytanic acid.</a> Chem Biol. 9, 597-605 (2002).</li>
<li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET2+expression+is+a+potential+prognostic+and+predictive+biomarker+in+cytogenetically+normal+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+physiology%22%5BJournal%5D)">TET2 expression is a potential prognostic and predictive biomarker in cytogenetically normal acute myeloid leukemia.</a> Journal of cellular physiology. , (2017).</li>
<li>Montagner, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28813683">TET2 Regulates Mast Cell Differentiation and Proliferation through Catalytic and Non-catalytic Activities.</a> Cell Rep. 15, 1566-1579 (2016).</li>
<li>Blaschke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+C+induces+Tet-dependent+DNA+demethylation+and+a+blastocyst-like+state+in+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells.</a> Nature. 500, 222-226 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych interesów finansowych, które mogliby zadeklarować.

Mutacje w genie TET2 są jednymi z najczęściej wykrywanych zmian genetycznych u pacjentów z różnymi nowotworami układu krwiotwórczego. Do tej pory u pacjentów12 zidentyfikowano setki różnych mutacji TET2, w tym mutacje nonsensowne, mutacje przesunięcia ramki i mutacje missense. Pacjenci z mutacjami TET2 wykazują niski poziom genomowego 5hmC w szpiku kostnym w porównaniu z pacjentami z wt-TET214. Eksperymenty z mutacją TET2 podsumowały wpływ tych mutacji na ...

Pozycja C5 zasad cytozyny w dinukleotydach CpG jest dominującym miejscem metylacji (5mCpG) w genomach ssaków1. Ponadto szereg ostatnich badań ujawniło rozległą metylację cytozyny C5 (5mC) w miejscach innych niż CpG (5mCpH, gdzie H = A, T lub C)2,3. Modyfikacja 5mC służy jako tłumik transkrypcyjny dla endogennych retrotranspozonów i promotorów genów3,4,5. Metylacja DNA w temperaturze 5mC odgrywa również ważną rolę w inaktywacji chromosomu X, imprintingu genów, przeprogramowaniu jądra i ekspresji genów specyficznych dla tkanki5,6,7. Metylacja cytozyny w pozycji C5 jest przeprowadzana przez metylotransferazy DNA, a mutacje w tych enzymach powodują znaczące wady rozwojowe8. Usuwanie znaczników 5mC jest inicjowane przez oksydazy TET1-3 5mC9,10. Te dioksygenazy z rodziny TET przekształcają 5mC w 5-hydroksymetylocytozynę (5hmC), 5-formylocytozynę (5fC) i 5-karboksylcytozynę (5caC) poprzez sekwencyjne etapy utleniania11,12,13. Wreszcie, glikozylaza tyminowo-DNA zastępuje 5fC lub 5caC niezmodyfikowaną cytozyną przy użyciu szlaku naprawy przez wycinanie zasady11.
Ludzki gen TET2 został zidentyfikowany jako często mutowany gen w różnych nowotworach układu krwiotwórczego, w tym w zespołach mielodysplastycznych (MDS)14,15,16, MDS-mieloproliferacyjne nowotwory (MDS-MPN) i ostra białaczka szpikowa (AML) pochodzące z MDS i MDS-MPN16. Poziomy modyfikacji 5hmC w DNA szpiku kostnego są niższe u pacjentów z mutacjami TET2 w porównaniu z pacjentami z typem dzikim (wt)-TET214. Wiele grup opracowało modele myszy z nokautem TET2, aby wyjaśnić jego rolę w prawidłowej hematopoezie i transformacji szpikowej17,18,19,20. Te myszy z mutacjami w genie TET2 były początkowo normalne i zdolne do życia, ale z wiekiem wykazywały różne nowotwory układu krwiotwórczego, co powodowało ich przedwczesną śmierć. Badania te wykazały ważną rolę, jaką odgrywa wt-TET2 w prawidłowym różnicowaniu układu krwiotwórczego. W tych modelach mysich heterozygotyczne hematopoetyczne komórki macierzyste (TET2+/- HSCs) i homozygotyczne TET2-/- HSC miały przewagę konkurencyjną nad homozygoycznymi HSC wt-TET2 w ponownym zasiedlaniu linii krwiotwórczych, ponieważ zarówno TET2+/- jak i TET2-/- HSC rozwinęły różne nowotwory układu krwiotwórczego17,18. Badania te wykazują, że haploinsuficjacja dioksygenazy TET2 zmienia rozwój HSC i prowadzi do nowotworów układu krwiotwórczego.
Podobnie jak myszy z mutacjami w genie TET2, większość pacjentów z białaczką wykazuje haploinsuficjentność aktywności dioksygenazy TET2. Te w większości heterozygotyczne mutacje somatyczne obejmują mutacje przesunięcia ramki odczytu i nonsensowne mutacje rozproszone w całym ciele genu TET2, podczas gdy mutacje typu missense, które są najbardziej skupione w domenie dioksygenazy12. Do tej pory w literaturze opisano niewiele charakterystyki wt- i mutanta-TET2, głównie z powodu trudności z produkcją dioksygenazy TET2 i jej testem21. Tutaj przedstawiamy proste, jednoetapowe oczyszczanie natywnej dioksygenazy TET2 za pomocą chromatografii jonowymiennej. Ponadto zoptymalizowano ilościowy test LC-MS/MS i wykorzystano go do pomiaru aktywności enzymatycznej natywnej dioksygenazy TET2.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Carbosynth</td><td>FH31182</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan żelaza(II) siedmiowodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8633</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-kwas ketoglutarowy (kwas 2-oksoglutarowy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1750</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Kwas disodowy kwasu etylenodiaminotetraoctowego dwuwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Octan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>Oligo czysty i koncentrator</td><td>Zymo Research</td><td>D4061</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>S1 Nukleaza</td><td>Thermo Scientific</td><td>ENO321</td><td></td></tr><tr><td>(Fosfataza alkaliczna jelit cieląc</td>)<td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td></td></tr><tr><td>LB Media</td><td>Affymetrix</td><td>J75852</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Carbosynth</td><td>EI05931</td><td></td></tr><tr><td>MES [monohydrat kwasu 2-(N-Morfolino)etanosulfonowego]</td><td>Carbosynth</td><td>FM37015</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>SP Sepharose</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-002-934</td><td></td></tr><tr><td>2'-deoksy-5-metylocytydyna</td><td>TCI</td><td>D3610</td><td></td></tr><tr><td>2'-deoksy-5-hydroksymetylocytydyna</td><td>TCI</td><td>D4220</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 2'-deoksycytydyno-5-karboksylowy, sól sodowa</td><td>Jagody i Amp; Associates</td><td>PY 7593</td><td></td></tr><tr><td>5-formylo-2'-deoksycytydyna</td><td>Jagody & Associates</td><td>PY 7589</td><td></td></tr><tr><td>2'-deoksycytydyna</td><td>Jagody & Associates</td><td>PY 7216</td><td></td></tr><tr><td>2'-Deoxyadenozyna</td><td>Carbosynth</td><td>ND04011</td><td></td></tr><tr><td>2'-Deoxyguanosine</td><td>Carbosynth</td><td>ND06306</td><td></td></tr><tr><td>2'-Deoksytymidyna</td><td>VWR Life Science</td><td>97061-764</td><td></td></tr><tr><td>Technologia bramki</td><td>Thermo Fisher</td><td>11801016</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Beckman Allegra X-15R&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>Dysmubrator soniczny 550</td><td>Fisher Scientific</td><td>XL2020</td><td></td></tr><tr><td>&AUML; System KTA FPLC</td><td>Pharmacia (GE Healthcare)</td><td>18116468</td><td></td></tr><tr><td>System liofilizacji FreeZone 4.5</td><td>Labconco</td><td>7750020</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny oczyszczające Zymo Oligo&nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>D4061</td><td></td></tr><tr><td>BDS Hypersil C18 kolumna</td><td>Keystone Scientific, INC</td><td>105-46-3</td><td></td></tr><tr><td>3200 Spektrometr masowy Q-Trap</td><td>AB Sciex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC&nbsp;</td><td>Shimadzu HPLC&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolumna XK16/20 FPLC</td><td>Pharmacia (GE Healthcare)</td><td>28988937</td><td></td></tr></tbody></table>

skuteczne oczyszczanie i opracowywanie testów opartych na lc-ms/ms dla dioksygenazy 5-metylocytozynowej translokacji ten-eleven-2

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

Epigenetyczna regulacja transkrypcji, w której pośredniczy 5-metylocytozyna (5mC), odegrała kluczową rolę w rozwoju eukariotycznym. Demetylacja tych znaczników epigenetycznych odbywa się poprzez sekwencyjne utlenianie przez dioksygenazy translokacyjne dziesięć jedenaście (TET1-3), po którym następuje naprawa przez wycięcie zasady zależnej od glikozylazy tyminy-DNA. Inaktywacja genu TET2 z powodu mutacji genetycznych lub innych mechanizmów epigenetycznych wiąże się ze złym rokowaniem u pacjentów z różnymi nowotworami, zwłaszcza nowotworami układu krwiotwórczego. Tutaj opisujemy skuteczne jednoetapowe oczyszczanie enzymatycznie aktywnej, nieznakowanej ludzkiej dioksygenazy TET2 za pomocą chromatografii kationowymiennej. Ponadto zapewniamy podejście oparte na chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas (LC-MS / MS), które może oddzielić i określić ilościowo cztery normalne zasady DNA (A, T, G i C), a także cztery zmodyfikowane zasady cytozyny (5-metylo, 5-hydroksymetyl, 5-formyl i 5-karboksyl). Test ten można wykorzystać do oceny aktywności dioksygenaz typu dzikiego i zmutowanych TET2.

Dynamiczna modyfikacja 5mC w DNA przez dioksygenazy z rodziny TET odgrywa istotną rolę w epigenetycznej regulacji transkrypcji. Dioksygenaza TET2 jest często mutowana w różnych nowotworach układu krwiotwórczego12. Aby zbadać rolę enzymu TET2 w prawidłowym rozwoju i w przebiegu chorób, sklonowano jego minimalną domenę katalitycznie aktywną, bez żadnego znacznika powinowactwa, do wektora pDEST1422. Nieoznaczona dioksygenaza TET2 była produkowa...

Tutaj prezentujemy protokół skutecznego jednoetapowego oczyszczania aktywnej, nieoznakowanej, ludzkiej translokacji 10-jedenaście (TET2) 5-metylocytozynowej dioksygenazy za pomocą chromatografii jonowymiennej i jej testu opartego na chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas (LC-MS/MS).

Skuteczne oczyszczanie i opracowywanie testów opartych na LC-MS/MS dla dioksygenazy 5-metylocytozynowej translokacji Ten-Eleven-2

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w epigenetyce i dziedzinie demetylacji 5-metylocytozyny za pośrednictwem TET2, takie jak analiza aktywności normalnych i klinicznych mutacji TET2. Główną zaletą tej techniki jest to, że natywny TET2 można oczyścić w jednym kroku, a jego aktywność można analizować pod kątem powstawania wszystkich trzech produktów. Kilku doktorantów zademonstruje tę procedurę.Oczyszczanie białka zostanie przeprowadzone przez Chayan Bhattacharya, test TET2 przez Aninda Sundary Dey, a analiza LC-MS/MS przez Navida Ayona. W celu transformacji bakteryjnej dodaj jeden mikrolitr rekombinowanego docelowego wektora ekspresyjnego pDEST 14 zawierającego nieoznakowaną ludzką dioksygenazę TET2 do 100 mikrolitrów chemicznie kompetentnych komórek E. coli BL21 DE3 w probówce o pojemności 1,7 mililitra. Po inkubacji na lodzie przez co najmniej 15 minut, mieszaninę należy poddać szokowi cieplnemu w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 30 sekund w łaźni wodnej.Natychmiast po szoku cieplnym umieść komórki z powrotem na lodzie na co najmniej dwie minuty. Następnie dodaj do komórek 250 mikrolitrów super optymalnego bulionu z represją katabolitową. Inkubuj komórki ba

efficient-purification-lc-msms-based-assay-development-for-ten-eleven

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Związki wychwytujące (Capture Compounds) to trifunkcyjne małe cząsteczki służące do redukcji złożoności proteomu poprzez funkcjonalną, odwracalną oddziaływanie małej cząsteczki z białkiem, a następnie fotousieciowanie i oczyszczanie. W niniejszej procedurze wykorzystujemy związek wychwytujący z funkcją selektywności wiązania S-adenozylo-L-homocysteiny w celu wyizolowaniay metylotransferaz z lizatu całych komórek Escherichia coli oraz ich identyfikacji metodą MS.

Profilowanie metylotransferaz i innych białek wiążących S-adenozylo- L-homocysteinę za pomocą spektrometrii mas z wykorzystaniem związków wychwytujących (CCMS)

Zestaw do analizy EpiMark 5-hmC i 5-mC może być stosowany do analizy i oznaczania ilościowego 5-metylocytozyny oraz 5-hydroksymetylocytozyny w obrębie konkretnego locus. Zestaw odróżnia 5-mC od 5-hmC poprzez dodanie glukozy do grupy hydroksylowej 5-hmC w reakcji enzymatycznej z wykorzystaniem β-glukozylotransferazy (T4-BGT). Gdy 5-hmC występuje w kontekście CCGG, modyfikacja ta przekształca podatną na cięcie sekwencję rozpoznawaną przez MspI w sekwencję niepodatną na cięcie.

Wykrywanie 5-hydroksymetylocytozyny o wysokiej czułości w tkance mózgowej myszy Balb/C

Osiągnięcie zrozumienia procesów komórkowych na poziomie systemowym jest celem współczesnej biologii komórki. Opisujemy tutaj strategie multipleksowania reporterów lucyferazy różnych punktów końcowych funkcji komórkowych w celu zbadania funkcji genów przy użyciu bibliotek RNAi w skali genomu.

Multipleksowana platforma przesiewowa oparta na lucyferazie do badania transdukcji sygnału związanego z rakiem w hodowanych komórkach

Opisaliśmy szczegółowo dwa protokoły chemiczne do hodowli embrionalnych komórek macierzystych myszy. Ta nowa metoda wykorzystuje synergiczne mechanizmy promowania utleniania za pośrednictwem Tet (przez witaminę C) i tłumienia syntezy de novo 5-metylocytozyny (przez PD0325901) w celu utrzymania hipometylacji DNA i pluripotencji embrionalnych komórek macierzystych myszy.

Alternatywna metoda hodowli w celu utrzymania genomowej hipometylacji embrionalnych komórek macierzystych myszy przy użyciu inhibitora MEK PD0325901 i witaminy C

Protokatechuatowa 3,4-dioksygenaza (PCD) może enzymatycznie usuwać wolny dwuatomowy tlen z układu wodnego za pomocą swojego substratu kwasu protokatechowego (PCA). Protokół ten opisuje ekspresję, oczyszczanie i analizę aktywności tego enzymu pochłaniającego tlen.

Ekspresja i oczyszczanie 3,4-dioksygenazy protokatechuatu 3,4-dioksygenazy bez nukleaz

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół metody sekwencjonowania opartej na LC-MS, która może być używana jako bezpośrednia metoda sekwencjonowania krótkiego RNA (&lt;35 nt na przebieg) bez pośredniego cDNA, oraz jako ogólna metoda sekwencjonowania różnych modyfikacji nukleotydów w pojedynczym badaniu z precyzją pojedynczej zasady.

2D-HELS MS Seq: Ogólna metoda oparta na LC-MS do bezpośredniego i de novo sekwencjonowania mieszanin RNA z różnymi modyfikacjami nukleotydów

Metylotransferazy DNA są potencjalnymi celami leków przeciwnowotworowych. W tym miejscu przedstawiono protokół oceny małych cząsteczek pod kątem hamowania metylotransferazy DNA. Test ten wykorzystuje endonukleazę do sprzężenia metylacji DNA z generowaniem fluorescencji i pozwala na monitorowanie aktywności enzymu w czasie rzeczywistym.

Ciągły test metylacji DNA sprzężony z endonukleazą oparty na fluorescencji w celu wykrycia inhibitorów metylotransferazy DNA

Opisano protokół czułego i ilościowego wykrywania aktywności topoizomerazy 1 za pomocą testu zwiększonej aktywności enzymatycznej w toczeniu koła. Metoda pozwala na wykrycie aktywności topoizomerazy 1 z oczyszczonych składników lub ekstraktów komórkowych/tkankowych. Protokół ten ma szerokie zastosowanie we wszystkich dziedzinach związanych z wykrywaniem aktywności enzymatycznej.

Proste i szybkie wykrywanie aktywności topoizomerazy 1 w surowych próbkach biologicznych w oparciu o amplifikację toczącego się koła

Tutaj prezentujemy kompilację testów do bezpośredniego pomiaru funkcji mitochondriów w komórkach ssaków, niezależnie od ich zdolności do zużywania tlenu cząsteczkowego.

Testy niezależne od tlenu do pomiaru funkcji mitochondriów u ssaków

Obecny protokół podkreśla zmodyfikowaną metodę wykrywania i ilościowego oznaczania wiązań krzyżowych DNA-białko (DPC) oraz ich modyfikacji potranslacyjnych (PTM), w tym ubikwitylacji, SUMOylacji i ADP-rybozylacji indukowanej przez inhibitory topoizomerazy i formaldehyd, umożliwiając tym samym badanie powstawania i naprawy DPC i ich PTM.

Ilościowe wykrywanie wiązań krzyżowych DNA-białko i ich modyfikacji potranslacyjnych

Analityczny przepływ pracy oparty na chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu (LC-TIMS-ToF MS/MS) dla wysokiej pewności i wysoce powtarzalnej "oddolnej" analizy modyfikacji histonów i identyfikacji na podstawie głównych parametrów (czas retencji [RT], przekrój zderzenia [CCS] i dokładny stosunek masy do ładunku [m/z]).

Badania przesiewowe modyfikacji histonów przy użyciu chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu

Poznaj protokół oczyszczania ludzkiej dioksygenazy TET2 metodą chromatografii jonowymiennej oraz analizę aktywności tego enzymu za pomocą LC-MS/MS w badaniach epigenetycznych.

Skuteczne oczyszczanie i opracowywanie testów opartych na LC-MS/MS dla dioksygenazy 5-metylocytozynowej translokacji Ten-Eleven-2 (Wideo) | JoVE Journal

Skuteczne oczyszczanie i opracowywanie testów opartych na LC-MS/MS dla dioksygenazy 5-metylocytozynowej translokacji Ten-Eleven-2

Przeglądaj więcej filmów