Elastyczny, niedrogi system hydroponiczny do oceny reakcji roślin na małe cząsteczki w sterylnych warunkach

Prosty, wszechstronny i tani system hydroponiczny in vitro został z powodzeniem zoptymalizowany, umożliwiając przeprowadzanie eksperymentów na dużą skalę w sterylnych warunkach. System ten ułatwia aplikację substancji chemicznych w roztworze i ich efektywne wchłanianie przez korzenie do badań molekularnych, biochemicznych i fizjologicznych. Wykazaliśmy, że system ten był bardzo skuteczny w uzyskiwaniu jednorodnych siewek na początku rozwoju, a także w oddzielaniu korzeni i pędów za pomocą nasion rzodkiewnika pospolitego.

Następujące elementy są niezbędne do zbudowania systemu hydroponicznego i uprawy roślin w sterylnych, kontrolowanych warunkach: 7% etanol, 10% roztwór wybielacza, polisorbat 20, pożywka MS wraz z witaminami. MES monohydrat, agar, wodorotlenek potasu.

Okap z przepływem laminarnym, płyta grzejna, komora wzrostowa. Jednorazowe plastikowe pudełka, sterylne szklane szalki Petriego, taśma klejąca, sterylne końcówki do pipet o pojemności 200 i 300 mikrolitrów, nożyczki, pipeta wielokanałowa 300 mikrolitrów, pipeta 200 mikrolitrów, ostrze skalpela, pęseta i stojaki na końcówki do pipet o pojemności 200 mikrolitrów. Bardzo ważne jest, aby płaska końcówka pipety miała obszar, który ma być wypełniony medium stałym.

Sterylizuj stojaki na końcówki do pipet bez pokryw, które będą używane jako mini-zbiorniki w autoklawie w temperaturze 121 stopni przez 20 minut. Aby uniknąć zanieczyszczenia, wszystkie wcześniej wymienione materiały zostały wysterylizowane w autoklawie. Gdy nie było to możliwe, jak w przypadku jednorazowych pojemników plastikowych, materiały były czyszczone 7% etanolem przed wprowadzeniem do okapu z przepływem laminarnym.

Jeśli okap na to pozwala, światło UV można włączyć na 10 minut przed montażem systemu hydroponicznego. Uszczelnij górną powierzchnię końcówki pipety na płasko za pomocą taśmy klejącej. Jeśli to możliwe, pozostaw je w świetle UV przez 10 minut.

Następnie dodaj 108 mikrolitrów stopionego stałego podłoża do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej. Jeśli przygotowujesz wiele zbiorników, użyj płyty grzejnej, aby zapobiec zastygnięciu podłoża MS. Pozostaw podłoże do całkowitego zestalenia się przez około 30 minut.

W okresie krzepnięcia można włączyć światło UV. Całkowicie napełnij pudełko z końcówkami płynnym podłożem hodowlanym. Gwarantuj ścisłą kompaktowość między mediami stałymi i ciekłymi.

Usuń taśmy samoprzylepne z górnej powierzchni końcówki pipety na płasko i ostrożnie przymocuj ją do stojaka. System hydroponiczny jest teraz gotowy do przyjęcia wysterylizowanych nasion. Opisana tutaj sterylizacja wybielaczem w płynie jest praktyczną metodą sterylizacji nasion.

Po pierwsze, umieść 500 nasion rzodkiewnika w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml. Użyj tylu mikroprobówek, ile to konieczne, w zależności od liczby roślin wymaganych do eksperymentu. Umyj nasiona 7% etanolem przez dwie minuty z mieszaniem.

Ostrożnie usuń etanol. Dodaj jeden ml 10% roztworu wybielacza zawierającego dwa mikrolitry detergentu polisorbatowego 20. Mieszać przez pięć minut.

Ostrożnie usuń roztwór. Na koniec opłucz nasiona wysterylizowaną wodą destylowaną, aż wszystkie pozostałości wybielacza zostaną całkowicie usunięte, około pięć razy. Protokół ten jest wykonalny w przypadku rzodkiewnika, jednak system ten może być również stosowany w przypadku innych gatunków roślin.

W tym celu wspomniana procedura sterylizacji powinna zostać zmodyfikowana zgodnie z wymaganiami gatunku. Po sterylizacji powierzchniowej nasiona zanurzono w sterylnej wodzie destylowanej i rozwarstwiono w temperaturze czterech stopni w ciemności przez pięć dni, aby zsynchronizować kiełkowanie. Lekko odetnij koniec końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów za pomocą sterylnego skalpela.

Odpipetować nasiona rzodwki do stałej pożywki hodowlanej na górnej powierzchni końcówki pipety na płasko. Uważaj, aby podłoże nie poluzowało się z mieszkania, w przeciwnym razie nasiona będą zacienione, a sadzonki nie będą rosły prawidłowo. Przechowuj jak najwięcej mini-zbiorników w jednorazowym plastikowym pudełku, aby utrzymać wysoką wilgotność i środowisko wolne od mikroorganizmów.

Zaklej jednorazowe plastikowe pudełko za pomocą taśmy klejącej. Systemy hydroponiczne są teraz gotowe do wejścia do komory wzrostowej. Ten system hydroponiczny został początkowo opracowany w celu ułatwienia podawania roślinom substancji chemicznych, takich jak związki znakowane izotopami, które na ogół są bardzo drogie w stosowaniu w eksperymentach na dużą skalę.

Jako dowód słuszności koncepcji zastosowaliśmy AZD8055 konkurencyjnego inhibitora ATP, który jest specyficznie ukierunkowany na miejsce wiązania ATP docelowej kinazy białkowej rapamycyny. Kinaza TOR jest głównym regulatorem integrującym wykrywanie składników odżywczych i sygnalizację energetyczną w celu promowania proliferacji i wzrostu komórek. W celu oceny pierwotnych odpowiedzi na hamowanie TOR, w którym pośredniczy AZD, nasiona rzodkiewnika uprawiano hydroponicznie do pożądanego etapu rozwojowego w ciągu 12-godzinnego okresu zdjęciowego.

Świeże podłoże zawierające dwa mikromolowe AZD lub 0,05% DMSO jako kontrolę zostało wymienione w zbiornikach hydroponicznych pod koniec nocy. Sadzonki zebrano w różnych punktach czasowych po zabiegu, rozdzielono na korzenie i pędy zamrożono w ciekłym azocie, zmielono na drobny proszek i przechowywano w temperaturze minus 80 stopni do czasu użycia. Wzorzec fosforylacji kinazy rybosomalnego białka S6, RPS6, jednego z dobrze znanych celów szlaku TOR.

Immunoblotting pokazuje ilość całkowitego i ufosforylowanego RPS6 w korzeniach, wykresie A i pędach, wykresie B. Tłumienie fosforylacji w obecności ADZ855 nastąpiło już po 30 minutach od leczenia farmakologicznego zarówno w korzeniach, jak i pędach, co pokazuje, że w zastosowanych warunkach eksperymentalnych ADZ okazał się również silnym inhibitorem TOR, który szybko hamuje aktywność kinazy. Transgeniczne linie arabidopsji ze zmniejszoną ekspresją genu TOR lub składników kompleksu TOR wykazują wyraźny fenotyp nadmiaru skrobi. Analiza jakościowa skrobi przy użyciu płynu Lugola ujawnia oczekiwany wzorzec akumulacji i degradacji skrobi podczas cyklu.

Sadzonki, które nie otrzymały aplikacji MSO lub AZD855, nie wykazały większej akumulacji skrobi w liściach pod koniec nocy, a akumulacja skrobi w roślinach kontrolnych, MSO, była zgodna z literaturą. Ponadto rośliny traktowane AZD wykazywały większą ilość pozostałej skrobi pod koniec nocy w porównaniu z siewkami kontrolnymi. Wyniki te wskazują na przydatność proponowanego systemu hydroponicznego w uprawie sadzonek naśladujących warunki fizjologiczne.

Skrobia gromadzi się w liściach w ciągu dnia i jest ponownie mobilizowana w ciągu nocy, aby podtrzymać aktywność metaboliczną. W normalnych warunkach tylko niewielka frakcja skrobi, od 5 do 10% całkowitej ilości po zakończeniu dnia, pozostaje pod koniec nocy. Wyniki te są testowane, że fenotyp skrobi obserwowany pod wpływem represji TOR występuje w całym cyklu.

Rośliny uprawiane hydroponicznie porównano z siewkami uprawiającymi podłoże ogrodnicze w bardzo podobnych warunkach klimatycznych dotyczących poziomu ekspresji kwasu abscysynowego, który ma wrażliwy czynnik wiążący element trzeci, gen ABF3, pokazany na rysunku 5-A. Ekspresja ABF3 bezpośrednio koreluje z wewnętrznymi poziomami ABA, klasą hormonów powszechnie znanych jako marker ze względu na jego rolę w wielu abiotycznych reakcjach na stres. Chociaż rośliny uprawiane hydroponicznie wykazywały znaczny wzrost ekspresji ABF3 w porównaniu z roślinami uprawianymi w glebie, poziomy ekspresji syntetazy asparaginy jednego ASN1 nie były dotknięte zabiegami MSO lub AZD pokazanymi na rysunku 5-B.

Jednak ekspresja syntazy fosforanu trehalozy piątej, TPS5, plus znaczny wzrost po ośmiu godzinach represji TOR. ASN1 i TPS5 reagują odpowiednio na niski i wysoki poziom cukru, co sugeruje, że rośliny te nie były doświadczone w stresie genetycznym. Udało nam się wykorzystać ten system do oceny zastosowania małych cząsteczek w roślinach.

Podsumowując, ten system hydroponiczny ma wiele zalet, ponieważ jest bardzo szybki i łatwy w montażu oraz ma niski koszt, ponieważ główne komponenty są tanie i mogą być szeroko wykorzystywane. Co więcej, system ten jest wszechstronny, umożliwiając badanie nienaruszonych sadzonek lub różnic w rozwoju roślin, a także jest wysoce skalowalny, co pozwala na uprawę ogromnej liczby roślin na bardzo małym obszarze.