Badanie przesiewowe drożdży 2-hybrydowych w partii w celu porównania interakcji białek

Metoda ta wykorzystuje zasadę działania drożdżowego układu 2-hybrydowego w obu populacjach w celu identyfikacji interakcji białko-białko, które odpowiadają na kluczowe pytania dotyczące różnych procesów molekularnych i komórkowych. Technika ta wykorzystuje głębokie sekwencjonowanie, aby zobaczyć interakcje jednego białka z drugim. Ponieważ podejście to jest nastawione na dokonywanie równoległych porównań, może zidentyfikować zestawy białek, które oddziałują z jednym białkiem w porównaniu z innym lub różne potwierdzenia tego samego białka lub podczas typowania choroby powodującej zmutowaną wersję, aby ujawnić zróżnicowane interaktomie.

Do tej procedury skonstruowano nowy 2-hybrydowy plazmid przynęty drożdżowej pTEF-GBD, jak opisano w protokole tekstowym. Plazmid ten wytwarza białka fuzyjne domeny wiążącej DNA Gal4 w plazmidzie o niskiej kopii opartym na centromerze TRP1, przenoszącym gen oporności na kanamycynę, który umożliwia również klonowanie fragmentów przynęty zarówno przed, jak i za domeną wiążącą DNA Gal4. Ten plazmid przynęty został użyty do transformacji drożdży MATa, a ekspresję białek fuzyjnych przynęty Gal4 zweryfikowano przez immunoblotting z przeciwciałami anty-MIC.

Ponadto stworzono nową bibliotekę 2-hybrydową drożdży w usprawnionym wektorze plazmidu ofiary PGAL4 AD. Genomowe DNA zostało pofragmentowane przez ścinanie, wybrano rozmiar, zmodyfikowano za pomocą adapterów i wstawiono do PGAL4-AD w celu stworzenia biblioteki hybrydowej drożdży saxairtab 2. Aby rozpocząć procedurę tworzenia populacji drożdży z bibliotekami przynęt i zdobyczy, należy zaszczepić trzy mililitrowe kultury każdego z transformantów drożdżowych MATa, przenosząc różne pożywki wyjściowe zawierające plazmidy przynęty i pożywkę CSM minus

Uwzględnij dwie oddzielne kultury, zawierające sam plazmid wektorowy, aby służyły jako kontrola proceduralna. Inkubuj kultury w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 200 obr./min przez sześć godzin. Następnie rozcieńczyć każdą kulturę do 25 mililitrowej kultury w sterylnej kolbie Erlenmeyera i inkubować przez noc.

Rozmrozić zamrożoną warstwę komórek alfa MAT zawierającą bibliotekę zdobyczy przenoszącą lu2 w temperaturze pokojowej. Użyj całej rozmrożonej podłości komórek, aby zaszczepić 125 mililitrów CSM minus lu minus met pożywki w sterylnej kolbie Erlenmeyera. Uprawiaj kulturę w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 200 obr./min przez noc.

Następnego dnia, po potwierdzeniu, że OD600 w nocnych kulturach transformacyjnych maty i mieści się w zakresie od 1,0 do 1,5, przenieść kultury do 50-mililitrowych probówek stożkowych i odwirować 21 OD 600 odpowiedników każdej kultury w 4,696 razy g w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Ponownie zawiesić każdą granulkę komórek maty a w 10 mililitrach sterylnej wody, przenieść zawiesinę do nowej 50-mililitrowej stożkowej probówki i odwirować przy 4,696 g w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Za pomocą pipety delikatnie usunąć supernatant, nie naruszając granulowanych komórek, i ponownie zawiesić osad w czterech mililitrach buforowanej pożywki YPDA o pH 3,7.

Na każde 10 pożądanych reakcji kojarzenia należy umieścić 39 OD 600 odpowiedników szczepu maty alfa przenoszącego plazmidy biblioteczne w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Ponownie zawiesić komórki maty alfa w 10 mililitrach sterylnej wody i ponownie umieścić w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów pod ciśnieniem 4 696 g w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Za pomocą pipety delikatnie usunąć supernatant, nie naruszając granulowanych komórek, i ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach buforowanej pożywki YPDA o pH 3,7.

Aby ustawić każdą reakcję krycia, dodaj następujące elementy do nowej 50-mililitrowej stożkowej probówki: Jeden mililitr komórek przekształconych w MAT-A, jeden mililitr biblioteki MAT-alfa zawierających komórki i jeden mililitr buforowanej YPDA o pH 3,7. Inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza z delikatnym, orbitalnym mieszaniem przez 90 minut. Po 90 minutach odwirować komórki w temperaturze pokojowej 4 696 razy w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w dwóch mililitrach buforowanego YPDA-YPD w proporcji jeden do jednego. Umieść wszystkie dwa mililitry komórek na 100-mililitrowej płytce YPD i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez około 20 godzin. Aby zebrać komórki, należy odpipetować od dwóch do trzech mililitrów pożywki CSM minus lu minus trip na każdą płytkę YPD i użyć skrobaka do komórek, aby usunąć komórki.

Odpipetuj usunięte komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Przepłukać płytkę cztery do pięciu razy dwoma do trzech mililitrów pożywki CSM minus lu minus trip, używając pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów do odpipetowania pożywki i delikatnie wyrzucając ją po powierzchni płytki YPD. Odwirować komórki w temperaturze pokojowej 4 696 razy g przez pięć minut.

Odrzucić supernatant z każdej stożkowej probówki i ponownie zawiesić komórki w 40 mililitrach pożywki CSM minus lu minus trip, pipetując w górę iw dół. Aby oszacować liczbę utworzonych komórek diploidalnych, rozcieńczyć cztery mikrolitry mieszaniny diploidalnej odpowiednio na 200 mikrolitrów i 2 000 mikrolitrów CSM minus lu minus pożywka wyzwalacza. Umieścić 200 mikrolitrów każdego rozcieńczenia na płytce wyzwalającej CSM minus lu minus, aby przedstawić pełne rozcieńczenie od jednego do 10 000 i od jednego do 100 000 zebranych diploidów.

Inkubować płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 36 do 40 godzin. Natychmiast użyć pozostałej części z każdych 40 mililitrów zawiesiny komórek, aby zaszczepić 500 mililitrów CSM minus lu minus pożywki wyzwalającej w jednolitrowej kolbie Erlenmeyera. Zmierz OD 600 każdej kultury.

Inkubować te kolby w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością 180 obr./min, aż osiągną nasycenie, co zwykle trwa od 36 do 40 godzin. Monitoruj wzrost komórek po 24 godzinach i 36 godzinach, mierząc OD 600. Przed kontynuowaniem procedury należy potwierdzić skuteczność krycia dwóch szczepów drożdży.

Wymagana jest minimalna liczba 200 kolonii na płytce rozcieńczającej od jednego do 10 000. Gdy kultury osiągną nasycenie, za pomocą pipety usunąć 20 mililitrowy alloquad z każdej kultury i zaszczepić dwulitrowe kolby Erlenmeyera. Jedna kolba zawierająca 750 mililitrów CSM minus lu minus pożywka wyzwalająca i druga kolba zawierająca 750 mililitrów CSM minus lu minus jego pożywka.

Z najniższym poziomem triasolu trzech amino-124, który eliminuje tło, określony wcześniej zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dobrze wymieszaj nowe kultury, mieszając. Po zmierzeniu początkowego OD 600, inkubować kultury w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością 180 obr./min, aż do nasycenia, które zwykle następuje w ciągu 24 godzin dla niewybranej kultury CSM minus lu minus trip, ale może zająć ponad 70 godzin w przypadku kultur poddanych selekcji do interakcji drożdży 2-hybrydowych.

Gdy kultury osiągną nasycenie, usunąć 11 mililitrów każdej kultury za pomocą pipety i osadnić komórki za pomocą pięciominutowego wirowania w temperaturze 4 696 g w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i przystąpić do ekstrakcji DNA, jak pokazano w następnym rozdziale. Aby rozpocząć procedurę ekstrakcji DNA, za pomocą pipety ponownie zawiesić każdą przygotowaną wcześniej osadkę komórkową w 500 mikrolitrach silnego buforu TE.

Przenieś do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówki i dodaj 10 mikrolitrów bulionu zimolay do każdej probówki. W dygestorium dodaj trzy mikrolitry etanolu beta marketolu do każdej probówki i dobrze wymieszaj. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 do 36 godzin.

Następnie należy dwukrotnie wyekstrahować próbki za pomocą 500 mikrolitrów alkoholu izolamaturalnego chloroformu fenolu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodać siedem mikrolitrów czteromolowego chlorku sodu i 900 mikrolitrów lodowatego 100% etanolu i wymieszać przez odwrócenie. Osadzaj DNA, wirując w mikrowirówce pod ciśnieniem 21, 130 razy g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Odrzucić supernatant przez pipetowanie i przemyć każdą osadkę trzykrotnie 900 mikrolitrami 70% etanolu. Osadzaj DNA, odwirowując w temperaturze 21 130 g przez dwie minuty. Po usunięciu resztek etanolu suszyć granulki w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez siedem minut.

Zawiesić każdą granulkę w 120 mikrolitrach 0,1x mocnego TE w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 90 minut. Odpipetować 60 mikrolitrów wyekstrahowanego DNA do sterylnej 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki. Dodaj 120 mikrolitrów mocnego TE i 3,5 mikrolitra bulionu RN ace A, wymieszaj i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.

Do każdej probówki dodaj siedem mikrolitrów pięciomolowego amonianu i 900 mikrolitrów lodowatego, 100% etanolu. Wymieszaj DNA przez inwersję i osad, jak wykazano wcześniej. Ponownie zawiesić DNA poddane działaniu RNace-A w 55 mikrolitrach 0,1x silnego TE w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 90 minut.

Określ ilościowo DNA przez absorbancję przy 260 nanometrach. Kolejnym krokiem jest wykonanie PCR na insertach CDNA. Wykonaj dwie reakcje PCR o pojemności 50 mikrolitrów na próbkę DNA.

Do każdej reakcji dodaj wodę, pięć mikrogramów próbki DNA, 25 pikamoli każdego startera do przodu i do tyłu pasującego do plazmidu biblioteki zdobyczy oraz 25 mikrolitrów wysokiej jakości mieszanki 2x PCR master. Wzmocnij reakcje za pomocą tego programu. 30-sekundowa denaturacja w temperaturze 98 stopni Celsjusza, 25 cykli D-natriny w temperaturze 98 stopni Celsjusza przez 10 sekund, wyżarzanie w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez 30 sekund i czas przedłużenia wynoszący trzy minuty w temperaturze 72 stopni Celsjusza, a następnie pięciominutowa inkubacja w temperaturze 72 stopni Celsjusza.

Przeanalizuj każdą reakcję PCR za pomocą elektroforezy 1% DNA na schładzanie arozy z żelem zawierającym atydybrom i uwidocznij żel za pomocą transiluminacji UV. Próbki bez selekcji wykazują uogólniony rozmaz DNA, ale po selekcji można dostrzec pojedyncze prążki. Połącz zduplikowane próbki PCR i oczyść je za pomocą zestawu zgodnie z instrukcjami producenta.

Określić ilościowo DNA przez absorbancję przy 260 nanometrach na spektrofotometrze. Następnie należy przeprowadzić głębokie sekwencjonowanie, a następnie przetwarzanie i weryfikację bioinformatyczną zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W zademonstrowanej procedurze wykorzystano nową, losowo rozdrobnioną bibliotekę 2-hybrydową drożdży, a wstawki plazmidowe amplifikowane metodą PCR przeanalizowano za pomocą sekwencjonowania DEEP i przetwarzania bioinformatycznego przy użyciu oprogramowania DEEPN i porównano z wcześniej opublikowaną biblioteką.

Ten wykres przedstawia kolejność rang trzciny na każdy gen w bibliotekach podzieloną przez trzciny na gen znaleziony przez sekwencjonowanie genomu drożdży. Ten histogram pokazuje liczbę unikalnych plazmidów na gen, który koduje fragment, który znajduje się zarówno w regionie kodującym białko, jak i w odpowiedniej ramce odczytu translacyjnego. Pokazano porównanie liczby różnych plazmidów w każdej bibliotece, które kodują geny drożdży, oraz proporcji, które znajdują się i nie znajdują się w prawidłowej ramce odczytu translacyjnego lub są wstawiane wstecz.

Ogólnie rzecz biorąc, nowa biblioteka ma o wiele więcej różnych plazmidów. Metody te zapewniają, że biblioteka może być odtwarzalnie przenoszona do komórek zawierających różne białka przynęty oraz że procedura selekcji może dać powtarzalne zestawy genów, które są wzbogacone, wyróżniając je jako specyficzne białka kandydujące oddziałujące. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu około tygodnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Większość tej pracy polega na inkubacji kultur komórkowych, a faktyczny czas pracy to zaledwie kilka godzin. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o stworzeniu populacji składających się z dużej liczby pojedynczych komórek diploidalnych, aby biblioteka mogła być odtwarzalnie przenoszona do komórek zawierających różne białka przynęty. Ważne jest również, aby zwrócić szczególną uwagę na warunki rozcieńczenia i tempo wzrostu komórek dla populacji poddawanych selekcji pod kątem dodatnich warunków hybrydowych drożdży 2.

Zgodnie z tą procedurą, metody obliczeniowe, które zostały wyjaśnione w towarzyszącej pracy, zidentyfikują potencjalne białka oddziałujące i zapewnią ścieżkę walidacji tych interakcji przy użyciu tradycyjnego testu drożdży 2-hybrydowych lub innych metod biochemicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć bardzo dobry pomysł na to, jak odtwarzalnie tworzyć diploidalne populacje drożdży, które zawierają bibliotekę plazmidów ofiar i hodować je partiami, aby wybrać dodatnie interakcje hybrydowe drożdży 2. Nie zapominaj, że praca z rozpuszczalnikami organicznymi podczas protokołu oczyszczania DNA może być niebezpieczna i powinna być wykonywana w dygestoriach w rękawiczkach i fartuchu laboratoryjnym.