Name: Badanie przesiewowe drożdży 2-hybrydowych w partii w celu porównania interakcji białek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Poznaj udoskonaloną metodę badania przesiewowego drożdży 2-hybrydowych w partii, umożliwiającą bezpośrednie porównanie profili interakcji wielu białek przynęty. Technika wykorzystuje głębokie sekwencjonowanie do identyfikacji różnicowych interaktomów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy pracownikom Instytutu Genetyki Człowieka za przygotowanie biblioteki NGS i sekwencjonowanie. Dziękujemy Einat Snir za jej doświadczenie w przygotowywaniu fragmentów biblioteki genomowej dla wykonanej tutaj biblioteki plazmidów Y2H. Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health: NIH R21 EB021870-01A1 oraz przez NSF Research Project Grant: 1517110.

<ol><li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li>
<li>Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+two-hybrid%2C+a+powerful+tool+for+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).</li>
<li>Vidal, M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+two-hybrid+assay%3A+still+finding+connections+after+25+years%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The yeast two-hybrid assay: still finding connections after 25 years.</a> Nature Methods. 11 (12), 1203-1206 (2014).</li>
<li>Pashkova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEEPN+as+an+Approach+for+Batch+Processing+of+Yeast+2-Hybrid+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions.</a> Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).</li>
<li>Rajagopala, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+Protein-Protein+Interactome+Networks+Using+Yeast+Two-Hybrid+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).</li>
<li>Weimann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Y2H-seq+approach+defines+the+human+protein+methyltransferase+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome.</a> Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).</li>
<li>Yachie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pooled-matrix+protein+interaction+screens+using+Barcode+Fusion+Genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics.</a> Molecular Systems Biology. 12 (4), 863(2016).</li>
<li>Trigg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CrY2H-seq%3A+a+massively+multiplexed+assay+for+deep-coverage+interactome+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping.</a> Nature Methods. , (2017).</li>
<li>Estojak, J., Brent, R., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+two-hybrid+affinity+data+with+in+vitro+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurements.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5820-5829 (1995).</li>
<li>Rajagopala, S. V., Hughes, K. T., Uetz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+yeast+two-hybrid+systems+using+the+interactions+of+bacterial+motility+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Benchmarking yeast two-hybrid systems using the interactions of bacterial motility proteins.</a> Proteomics. 9 (23), 5296-5302 (2009).</li>
<li>James, P., Halladay, J., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+libraries+and+a+host+strain+designed+for+highly+efficient+two-hybrid+selection+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast.</a> Genetics. 144 (4), 1425-1436 (1996).</li>
<li>Barbas, C. F. 3rd, Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitation of DNA and RNA.</a> CSH Protoc. 2007, pdb ip47(2007).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22485921">SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (4), (2006).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Alegria-Schaffer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting+using+chemiluminescent+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Western blotting using chemiluminescent substrates.</a> Methods in Enzymology. 541, 251-259 (2014).</li>
<li>Plank, J. Practical application of Phenol/Chloroform extraction. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://bitesizebio.com/3651/practical-application-of-phenolchloroform-extraction/">http://bitesizebio.com/3651/practical-application-of-phenolchloroform-extraction/</a> (2018).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), (2012).</li>
<li>Harper, J. W., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p21+Cdk-interacting+protein+Cip1+is+a+potent+inhibitor+of+G1+cyclin-dependent+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases.</a> Cell. 75 (4), 805-816 (1993).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Tutaj przedstawiamy przewodnik, jak wykonywać testy Y2H w partiach przy użyciu zoptymalizowanych metod. W procedurze składa się kilka krytycznych kroków, które mają pomóc w zapewnieniu, że populacja drożdży, która zostanie poddana selekcji, jest reprezentatywna dla biblioteki wyjściowej i że wystarczająca ilość początkowej populacji drożdży zostanie wykorzystana do poddania selekcji w celu ograniczenia zmienności. Co ważne, te punkty odniesienia są stosunkowo łatwe do osiągnięcia wraz z dostosowaniem metod i materiałów d...

Pełne zrozumienie procesów biologicznych komórek opiera się na znalezieniu sieci interakcji białek, które leżą u podstaw ich mechanizmów molekularnych. Jednym z podejść do identyfikacji interakcji białkowych jest test drożdży 2-hybrydowych (Y2H), który działa poprzez złożenie działającego chimerycznego czynnika transkrypcyjnego, gdy dwie interesujące nas domeny białkowe wiążą się ze sobą1. Typowe badanie przesiewowe Y2H przeprowadza się poprzez utworzenie populacji drożdży, w której znajduje się zarówno biblioteka plazmidów kodujących oddziałujące białka połączone z aktywatorem transkrypcji (np. białkiem fuzyjnym "ofiary"), jak i dany plazmid "przynęty" składający się z białka będącego przedmiotem zainteresowania połączonego z domeną wiążącą DNA (np. domena wiążąca DNA Gal4, która wiąże się z sekwencją aktywującą Gal4). Jedną z głównych zalet podejścia Y2H jest to, że jest ono stosunkowo łatwe i niedrogie do przeprowadzenia w typowym laboratorium wyposażonym do rutynowych prac z zakresu biologii molekularnej2. Jednak w tradycyjnym przypadku użytkownik pobiera próbki pojedynczych kolonii, które powstają po selekcji w celu uzyskania pozytywnej interakcji Y2H. To poważnie ogranicza liczbę bibliotecznych klonów "ofiar", które można badać. Problem ten nasila się, gdy liczebność danej ofiary oddziałującej jest bardzo wysoka w stosunku do innych, co zmniejsza szansę na wykrycie interakcji z plazmidami ofiar o niskiej liczebności.
Jednym z rozwiązań do wykorzystania zasady Y2H w kompleksowym pokryciu proteomu jest użycie podejścia sformatowanego matrycowo, w którym tablica zawierająca znane pojedyncze plazmidy ofiar może być cyfrowo przesłuchiwana. Takie podejście wymaga jednak infrastruktury, która nie jest łatwo dostępna ani opłacalna dla indywidualnych badaczy, którzy są zainteresowani zdefiniowaniem interaktomii niewielkiej liczby białek lub domen3. Ponadto bardzo złożone biblioteki ofiar, które mogą kodować wiele fragmentów oddziałujących ze sobą białek, zwiększyłyby rozmiar takich macierzy do niepraktycznych rozmiarów. Alternatywą jest przeprowadzanie testów ze złożonymi bibliotekami w partiach i ocena obecności oddziałujących klonów przy użyciu masowego równoległego sekwencjonowania o wysokiej przepustowości4. Można to zastosować do oznaczenia obecności plazmidów ofiar, które powstają w wielu koloniach, przy użyciu typowego podejścia sformatowanego Y2H, w którym komórki drożdży zawierające oddziałującą parę białek fuzyjnych mogą rosnąć na płytce5,6. Tę ogólną ideę można zaakcentować, aby zwiększyć liczbę zapytań zarówno o wiele składników przynęty, jak i ofiary w tym samym czasie7,8.
Mimo to, wiele badań wymaga łatwiejszego, ale bardziej skoncentrowanego wysiłku na zaledwie kilku 'przynętach' białkowych i może przynieść więcej korzyści dzięki wyczerpującemu i częściowo ilościowemu przeszukiwaniu pojedynczej złożonej biblioteki zdobyczy. Opracowaliśmy i zwalidowaliśmy podejście do przeprowadzania szeroko zakrojonych badań interakcji białek przy użyciu zasady Y2H w formacie wsadowym4. Wykorzystuje to szybkość ekspansji konkretnego plazmidu ofiary jako wskaźnik zastępczy dla względnej siły interakcji Y2H9. Głębokie sekwencjonowanie wszystkich plazmidów w populacji poddanej normalnym warunkom wzrostu lub selektywnemu wzrostowi daje kompletną mapę klonów, które dają silne i słabe interakcje Y2H. Repertuar interaktorów można uzyskać i bezpośrednio porównać w wielu plazmidach przynęty. Uzyskany w ten sposób proces roboczy nazwany DEEPN (Dynamic Enrichment for Evaluation of Protein Networks) może być zatem wykorzystany do identyfikacji interaktomów różnicowych z tych samych bibliotek ofiar w celu identyfikacji białek, co pozwoli na porównanie jednego białka z drugim.
Tutaj demonstrujemy DEEPN i wprowadzamy ulepszenia w metodach laboratoryjnych, które ułatwiają jego użycie, które są opisane na rysunku 1. Do istotnych ulepszeń należą:
Generacja populacji drożdży drapieżnych. Jednym z kluczowych wymagań projektu DEEPN jest generowanie populacji drożdży z różnymi plazmidami przynęty, które mają taki sam rozkład bibliotek ofiar plazmidów. Równoważne populacje wyjściowe biblioteki plazmidów ofiar są niezbędne do dokonywania dokładnych porównań między interaktomami różnych przynęt. Najlepiej osiągnąć to, gdy plazmid biblioteczny jest już umieszczony w haploidalnej populacji drożdży, a przeniesienie danego plazmidu przynęty do tej populacji uzyskuje się poprzez krzyżowanie w celu wytworzenia diploidu. W tym miejscu przedstawiamy jasny przewodnik, jak tworzyć takie populacje za pomocą komercyjnych bibliotek mieszczących się w haploidalnych drożdżach. Chociaż znaleźliśmy metody, które generują dużą liczbę diploidów, ogólna skuteczność kojarzenia tych komercyjnych szczepów drożdży zawierających bibliotekę była niska. Dlatego skonstruowaliśmy nowy szczep, który może pomieścić biblioteki ofiar, które dają znacznie więcej diploidów na reakcję godową.
Nowy zestaw plazmidów przynęty. Wiele obecnych plazmidów, które wyrażają białka fuzyjne "przynęty" składające się z białka będącego przedmiotem zainteresowania i domeny wiążącej DNA, jest opartych na 2μ, co pozwala im na amplifikację liczby kopii. Ta liczba kopii może być dość zmienna w populacji i prowadzić do zmienności odpowiedzi transkrypcyjnej Y2H. To z kolei może zniekształcić zdolność do oceny siły danej interakcji białkowej na podstawie odpowiedzi wzrostu komórek poddanych selekcji. Można temu częściowo zaradzić, używając plazmidu o niskiej kopii, z których niektóre zostały już wcześniej opisane, takie jak dostępny na rynku pDEST3210. Skonstruowaliśmy nowy plazmid przynęty (pTEF-GBD), który wytwarza białka fuzyjne domeny wiążącej Gal4-DNA w plazmidzie o niskiej kopii na bazie centromeru TRP1 z genem oporności na Kanr, który umożliwia również klonowanie fragmentów przynęty zarówno przed, jak i za domeną wiążącą DNA Gal4.
Nowa biblioteka fragmentów Y2H o wysokiej gęstości. Skonstruowaliśmy nowy plazmid do przechowywania bibliotek ofiar Y2H i wykorzystaliśmy go do zbudowania wysoce złożonej biblioteki Y2H wykonanej z losowo ściętych fragmentów genomowego DNA z Saccharomyces cerevisiae. Analiza sekwencji wykazała, że ta biblioteka zawierała ponad 1 milion różnych elementów, znacznie bardziej złożonych niż wcześniej opisane biblioteki plazmidów genomowych Y2H drożdży11. Dzięki tej nowej bibliotece byliśmy w stanie pokazać, że przepływ pracy DEEPN jest wystarczająco solidny, aby pomieścić złożone biblioteki z wieloma różnymi plazmidami w sposób, który jest niezawodny i powtarzalny.

<table><tbody><tr><td>Illumina HiSeq 4000</td><td>Platforma głębokiego sekwencjonowania</td><td>Illumina</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała monoklonalne anty-HA</td><td>Biolegend</td><td>901514</td><td>Przeciwciało pierwotne do wykrywania ekspresji HA w konstruktach pGal4AD</td></tr><tr><td>Poliklonalne przeciwciała anty-myc</td><td>QED Biosciences Inc</td><td>18826</td><td>Przeciwciało pierwotne do wykrywania ekspresji MYC w konstruktach pTEF-GBD</td></tr><tr><td>NarI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0191S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3236S</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy 3350, proszek</td><td>J.T. Baker</td><td>U2211-08</td><td></td></tr><tr><td>DNA plemników łososia</td><td>Trevigen, Inc sprzedawane przez Fisher Scientific</td><td>50-948-286</td><td>DNA nośnika do przemiany drożdży, sekcja 3.2.1.</td></tr><tr><td>Monosiarczan kanamycyny</td><td>Międzynarodowe Produkty Badawcze</td><td>K22000</td><td></td></tr><tr><td>LE Agaroza</td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td>używany do produkcji żeli agarozowych DNA</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td> Research <td>Products International</td><td>S23025</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Research Products International</td><td>T60060</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Research Products International</td><td>S23080</td><td></td></tr><tr><td>Octan litu dwuwodny</td><td>MP Biomedicals</td><td>155256</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>ThermoFisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Sól sodowa</td><td>Produkty badawcze International</td><td>E57020</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy w proszku Produkty</td><td>badawcze International</td><td>Y20020</td><td></td></tr><tr><td>Drożdżowa zasada azotowa (siarczan amonu) bez aminokwasów</td><td>Research Products International</td><td>Y20040</td><td></td></tr><tr><td>CSM-TRP-LEU+40ADE</td><td>Formedium</td><td>DCS0789</td><td></td></tr><tr><td>CSM-TRP-Leu-His+40ADE</td><td>Formedium</td><td>DCS1169</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Leu-Met</td><td>Formedium</td><td>DCS0549</td><td></td></tr><tr><td>CSM-TRP-Met</td><td>Bio 101, Inc</td><td>4520-922</td><td></td></tr><tr><td>L-Metionina</td><td>Formedium</td><td>DOC0168</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Research Products International</td><td>A11500</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Research Products International</td><td>G32045</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>używany do wytwarzania płytek z mediami w sekcji 1</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Research Products International</td><td>P20240</td><td></td></tr><tr><td>3-amino-1,2,4 Triazole</td><td>Sigma</td><td>A8056</td><td></td></tr><tr><td>2- Merkaptoehanol (BME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Zymoliaza 100T</td><td>USBiological</td><td>Z1004</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>Sigma</td><td>P8281</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:Chloroform:IAA</td><td>Ambion</td><td>AM9732</td><td></td></tr><tr><td>Octan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238074</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Laboratories, INC</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>ThermoFisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td> Research <td>Products International</td><td>U20200</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Research Products International</td><td>L22010</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Gibco</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>błękit bromofenolowy</td><td>Amresco</td><td>449</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Cloning Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E5510S</td><td>Metoda szybkiego montażu do klonowania plazmidów w sekcji 2</td></tr><tr><td>NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0541S</td><td>Używany do amplifikacji produktów do montażu Gibsona w sekcji 2.3, a także przygotowania próbki do głębokiego sekwencjonowania DEEPN w sekcji 6.2.1</td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Amresco</td><td>0492-5G</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Używany do oczyszczania produktów PCR w sekcji 6.2.3</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu DNA</td><td>Qiaquick Qiagen</td><td>28704</td><td>Używany do oczyszczania strawionego pTEF-GBD w sekcji 2.1</td></tr><tr><td>Zestaw KAPA Hyper Prep</td><td>Zestaw przygotowawczy KAPA Biosystems</td><td>KK8500</td><td>do głębokiego sekwencjonowania</td></tr><tr><td>Optymalizacja kodonów</td><td>http://www.jcat.de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optymalizacja kodonów</td><td>https://www.idtdna.com/CodonOpt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zintegrowane technologie</td><td></td> DNA<td>gBlocks</td><td>Fragmenty DNA użyte do klonowania w sekcji 2.2</td></tr><tr><td>Ciągi</td><td>Fragmenty DNA Thermofisher</td><td></td><td>użyte do klonowania w sekcji 2.2</td></tr><tr><td>Zestaw mini-przygotowania plazmidowego DNA GenCatch</td><td>EPOCH Nauki Przyrodnicze</td><td></td><td>Używany do przygotowania ilości DNA w sekcji 2.3</td></tr><tr><td>Covaris E220</td><td>Wysokowydajny ultrasonograf</td><td>Covaris</td><td></td> w sekcji 7</tr><tr><td>oligo nucelotyd 5'- CGGTCTT CAATTTCTCAAGTTTCAG -3'</td><td>Zintegrowane technologie DNA lub Thermofisher</td><td></td><td>używane do amplifikacji i sekwencjonowania pcr 5' wstaw pTEF-GBD podczas budowy plazmidu</td></tr><tr><td>oligo nucelotyd 5'-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3'</td><td>Zintegrowane technologie DNA lub Thermofisher</td><td></td><td>używane do amplifikacji i sekwencjonowania pcr 5' wstaw pTEF-GBD podczas budowy plazmidu</td></tr><tr><td>oligo nucelotyd 5'-CACCGTAT TTCTGCCACCTCTTCC-3'</td><td>Zintegrowane technologie DNA lub Thermofisher</td><td></td><td>używane do amplifikacji i sekwencjonowania pcr 3' wstawka pTEF-GBD podczas budowy plazmidu</td></tr><tr><td>oligonunilotyd 5'-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3'</td><td>Zintegrowane technologie DNA lub Thermofisher</td><td></td><td>używane do amplifikacji i sekwencjonowania pcr 3' wstaw pTEF-GBD podczas budowy plazmidu</td></tr><tr><td>oligonukleotyd 5'-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3'</td><td>Integrated DNA Technologies lub Thermofisher</td><td></td><td>5' Pimer używany do amplifikacji insercji</td></tr><tr><td>oligonucelotydu pGAL4AD 5'-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3'</td><td>Integrated DNA Technologies lub Thermofisher</td><td></td><td>3' Pimer używany do amplifikacji insercji</td></tr><tr><td>oligonucelotydu pGAL4AD 5'-ACCCAAGCA GTGGTATCAACG-3'</td><td>Integrated DNA Technologies lub Thermofisher</td><td></td><td>5' Pimer używany do amplifikacji insercji</td></tr><tr><td>oligonucelotydu pGADT7 5'- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3'</td><td>Zintegrowane technologie DNA lub Thermofisher</td><td></td><td>3' Pimer używany do amplifikacji insercji szczepu drożdży pGADT7</td></tr><tr><td>PJ69-4A MatA</td><td>http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Biblioteki genomiczne i szczep gospodarza przeznaczony do wysoce wydajnej selekcji dwóch hybryd w drożdżach. GENETYKA 1996 144:1425-1436</td><td></td><td>MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7</td></tr><tr><td>pTEF-GBD</td><td>Dr. Robert Piper Lab</td><td></td><td>Gal4-DNA wiążący plazmid ekspresji doimain</td></tr><tr><td>ekspresji pGal4AD (pPL6343)</td><td>Dr. Robert Piper Lab Plazmid</td><td></td><td>ekspresji domeny aktywacji Gal4</td></tr><tr><td>100 mm szalki Petriego</td><td>Kord-Vallmark sprzedawany przez VWR</td><td>2900</td><td></td></tr><tr><td>125 ml PYREX Kolba Erlenmeyera</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63270</td><td></td></tr><tr><td>250 ml PYREX Kolba Erlenmeyera</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63271</td><td></td></tr><tr><td>1,000 ml PYREX Kolba Erlenmeyera</td><td>Fisher</td><td>Scientific S63274</td><td></td></tr><tr><td>2,000 ml PYREX Kolba Erlenmeyer</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63275</td><td></td></tr><tr><td>20 X 150 mm Jednorazowa probówka hodowlana</td><td>Thermofisher</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>serologiczna Drummond</td><td>4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Denville</td><td></td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipeta serologiczna</td><td>Denville</td><td>P7128</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Pipeta serologiczna</td><td>Denville</td><td>P7129</td><td></td></tr><tr><td>1 000 ml PYREX Zlewka Griffin</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-540P</td><td></td></tr><tr><td>1 000 ml PYREX Butelka do przechowywania nośników wielokrotnego użytku</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-414-1D</td><td></td></tr><tr><td>Butla z podziałką 1,000 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-572-6G</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax 190</td><td>Urządzenia molekularne</td><td></td><td>służące do pomiaru gęstości optycznej komórek</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>Spektrofotometr służący do ilościowego oznaczania ilości DNA</td></tr><tr><td>Elektroniczne UV transilluminator</td><td>Ultra Lum</td><td>MEB 20</td><td>służy do wizualizacji DNA w żelu agarozowym z bromkiem etydyny</td></tr><tr><td>P1000 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td></td></tr><tr><td>P200 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123601G</td> P20 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123600G <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P10 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F144802G</td><td></td></tr><tr><td>1250 i mikro; L Końcówki do pipet o niskiej retencji</td><td>GeneMate</td><td>P-1236-1250</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; Końcówki do pipet LLow VWR</td><td></td><td>10017-044</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; Końcówki do pipet L XL o niskiej retencji VWR</td><td></td><td>10017-042</td><td></td></tr><tr><td>Rurka stożkowa 50 ml</td><td>VWR</td><td>490001-627</td><td></td></tr><tr><td>Rurka stożkowa 15 ml</td><td>Skrobak do komórek VWR</td><td>490001-621</td><td></td></tr><tr><td>Denville</td><td>Scientific</td><td>TC9310</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Probówki do mikrowirówek</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fluka Analytical</td><td>318949-1L</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>J.T. Baker</td><td>5674-02</td><td></td></tr><tr><td>Aplikatory drewniane</td><td>Solon Care</td><td>55900</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka Eppendorf 5424</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-400-005</td><td>mikrowirówka</td></tr><tr><td>Sorvall ST16R</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004381</td><td>wirówka stołowa</td></tr><tr><td>Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (od osła)</td><td>GE Opieka zdrowotna</td><td>NA934-1ML</td><td>Przeciwciało wtórne</td></tr><tr><td>Amersham ECL Mysie IgG, całe Ab sprzężone z HRP (od owiec)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931-1ML</td><td>Przeciwciało wtórne</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Podłoże chemiluminescencyjne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34080</td><td>Roztwór do wykrywania ECL</td></tr><tr><td>Inkubator Isotemp Inkubator</td><td></td><td>naukowy Thermo Fisher Mutitron</td><td></td></tr><tr><td>2</td><td>INFORS HT</td><td></td><td>Inkubator z wytrząsaniem</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna Isotemp Digital-Control Model 205</td><td>Fisher Naukowa</td><td></td><td>kąpiel wodna</td></tr><tr><td>Y2H mysza biblioteka cDNA w Y187 (tkanka pana)</td><td>Clontech</td><td>630482</td><td>dostępna na rynku biblioteka cDNA</td></tr><tr><td>Y2H mysia biblioteka cDNA w Y187 (mózg myszy)</td><td>Clontech</td><td>630488</td><td>dostępna na rynku biblioteka cDNA</td></tr><tr><td>pGADT7 AD Wektor</td><td>Clontech</td><td>630442</td><td>dostępny na rynku wektor AD zawierający wiele bibliotek cDNA</td></tr><tr><td>pGBKT7 Wektor DNA-BD</td><td>Clontech</td><td>630443</td><td>dostępny na rynku wektor DNA-BD</td></tr><tr><td>Biolase Polimeraza DNA</td><td>Bioline</td><td>Polimeraza DNA BIOLINE BIO-21042</td><td>stosowana w sekcji 2.4</td></tr><tr><td>GeneMate GCL-60 Thermal Cycler</td><td>BioExpress</td><td>P-6050-60</td> maszyna <td>do pcr</td></tr><tr><td>TempAssure 0,5 ml probówki PCR</td><td>Amerykański Naukowy</td><td>1405-8100</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie przesiewowe drożdży 2-hybrydowych w partii w celu porównania interakcji białek

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Badanie przesiewowe interakcji białko-białko za pomocą testu 2-hybrydowego drożdży od dawna jest skutecznym narzędziem, ale jego użycie zostało w dużej mierze ograniczone do odkrycia interaktorów o wysokim powinowactwie, które są bardzo wzbogacone w bibliotece współpracujących kandydatów. W tradycyjnym formacie test drożdży 2-hybrydowych może dać zbyt wiele kolonii do analizy, gdy jest przeprowadzany przy niskiej rygorystyczności, gdzie można znaleźć interakcje o niskim powinowactwie. Co więcej, bez kompleksowego i kompletnego zbadania tej samej biblioteki pod kątem różnych plazmidów przynęty nie można przeprowadzić analizy porównawczej. Chociaż niektóre z tych problemów można rozwiązać za pomocą tablicowych bibliotek zdobyczy, koszt i infrastruktura wymagane do obsługi takich ekranów mogą być zaporowe. Jako alternatywę dostosowaliśmy test drożdży 2-hybrydowych, aby jednocześnie odkryć dziesiątki przejściowych i statycznych interakcji białek w ramach jednego ekranu, wykorzystując strategię zwaną DEEPN (Dynamic Enrichment for Evaluation of Protein Networks), która obejmuje wysokoprzepustowe sekwencjonowanie DNA i obliczenia w celu śledzenia ewolucji populacji plazmidów, które kodują oddziałujących partnerów. W tym miejscu opisujemy niestandardowe odczynniki i protokoły, które umożliwiają łatwe i ekonomiczne wykonanie badania przesiewowego DEEPN.

Test Y2H był szeroko stosowany do wykrywania oddziaływań białko-białko i opracowano dla niego szereg adaptacji oraz systemów. W większości przypadków te same kwestie, które pomagają zapewnić sukces w poprzednich podejściach, są istotne również dla DEEPN. Do najważniejszych punktów odniesienia należą: zapewnienie ekspresji białek fuzyjnych domeny wiążącej DNA, zapewnienie niskiego tła nieswoistego wzrostu His+ w diploidach zawierających badaną przynętę z pustym plazmidem ofiary, wysoka wyd...

Przetwarzanie wsadowe drożdżowych 2-hybrydowych ekranów pozwala na bezpośrednie porównanie profili interakcji wielu białek przynęty z wysoce złożonym zestawem białek fuzyjnych ofiar. W tym miejscu opisujemy udoskonalone metody, nowe odczynniki oraz sposób ich zastosowania w takich badaniach przesiewowych.

Badanie przesiewowe drożdży 2-hybrydowych w partii w celu porównania interakcji białek

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Metoda ta wykorzystuje zasadę działania drożdżowego układu 2-hybrydowego w obu populacjach w celu identyfikacji interakcji białko-białko, które odpowiadają na kluczowe pytania dotyczące różnych procesów molekularnych i komórkowych. Technika ta wykorzystuje głębokie sekwencjonowanie, aby zobaczyć interakcje jednego białka z drugim. Ponieważ podejście to jest nastawione na dokonywanie równoległych porównań, może zidentyfikować zestawy białek, które oddziałują z jednym białkiem w porównaniu z innym lub różne potwierdzenia tego samego białka lub podczas typowania choroby powodującej zmutowaną wersję, aby ujawnić zróżnicowane interaktomie.Do tej procedury skonstruowano nowy 2-hybrydowy plazmid przynęty drożdżowej pTEF-GBD, jak opisano w protokole tekstowym. Plazmid ten wytwarza białka fuzyjne domeny wiążącej DNA Gal4 w plazmidzie o niskiej kopii opartym na centromerze TRP1, przenoszącym gen oporności na kanamycynę, który umożliwia również klonowanie fragmentów przynęty zarówno przed, jak i za domeną wiążącą DNA Gal4. Ten plazmid przynęty został użyty do transformacji drożdży MATa, a ekspresję białek fuzyjnych przynęty Gal4 zweryfikowano przez immunoblotting z przeciwciałami anty-MIC.Ponadto stworzono nową bibliotekę 2-hybrydową drożdży w usprawnionym wektorze plazmidu ofiary PGAL4 AD. Genomowe DNA zostało pofragmentowane przez ścinanie, wybrano rozmiar, zmodyfikowano za pomocą adapterów i wstawiono do PGAL4-AD w celu stworzenia biblioteki hybrydowej drożdży saxairtab 2. Aby rozpocząć procedurę tworzenia populacji drożdży z bibliotekami przynęt i zdobyczy, należy zaszczepić trzy mililitrowe kultury każdego z transformantów drożdżowych MATa, przenosząc różne pożywki wyjściowe zawierające plazmidy przynęty i pożywkę CSM minus.Uwzględnij dwie oddzielne kultury, zawierające sam plazmid wektorowy, aby służyły jako kontrola proceduralna. Inkubuj kultury w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 200 obr./min przez sześć godzin. Następnie rozcieńczyć każdą kulturę do 25 mililitrowej kultury w sterylnej kolbie Erlenmeyera i inkubować przez noc.Rozmrozić zamrożoną warstwę komórek alfa MAT zawierającą bibliotekę zdobyczy przenoszącą lu2 w temperaturze pokojowej. Użyj całej rozmrożonej podłości komórek, aby zaszczepić 125 mililitrów CSM minus lu minus met pożywki w sterylnej kolbie Erlenmeyera. Uprawiaj kulturę w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 200 obr./min przez noc.Następnego dnia, po potwierdzeniu, że OD600 w nocnych kulturach transformacyjnych maty i mieści się w zakresie od 1,0 do 1,5, przenieść kultury do 50-mililitrowych probówek stożkowych i odwirować 21 OD 600 odpowiedników każdej kultury w 4,696 razy g w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Ponownie zawiesić każdą granulkę komórek maty a w 10 mililitrach sterylnej wody, przenieść zawiesinę do nowej 50-mililitrowej stożkowej probówki i odwirować przy 4,696 g w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Za pomocą pipety delikatnie usunąć supernatant, nie naruszając granulowanych komórek, i ponownie zawiesić osad w czterech mililitrach buforowanej pożywki YPDA o pH 3,7.Na każde 10 pożądanych reakcji kojarzenia należy umieścić 39 OD 600 odpowiedników szczepu maty alfa przenoszącego plazmidy biblioteczne w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Ponownie zawiesić komórki maty alfa w 10 mililitrach sterylnej wody i ponownie umieścić w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów pod ciśnieniem 4 696 g w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Za pomocą pipety delikatnie usunąć supernatant, nie naruszając granulowanych komórek, i ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach buforowanej pożywki YPDA o pH 3,7.Aby ustawić każdą reakcję krycia, dodaj następujące elementy do nowej 50-mililitrowej stożkowej probówki: Jeden mililitr komórek przekształconych w MAT-A, jeden mililitr biblioteki MAT-alfa zawierających komórki i jeden mililitr buforowanej YPDA o pH 3,7. Inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza z delikatnym, orbitalnym mieszaniem przez 90 minut. Po 90 minutach odwirować komórki w temperaturze pokojowej 4 696 razy w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w dwóch mililitrach buforowanego YPDA-YPD w proporcji jeden do jednego. Umieść wszystkie dwa mililitry komórek na 100-mililitrowej płytce YPD i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez około 20 godzin. Aby zebrać komórki, należy odpipetować od dwóch do trzech mililitrów pożywki CSM minus lu minus trip na każdą płytkę YPD i użyć skrobaka do komórek, aby usunąć komórki.Odpipetuj usunięte komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Przepłukać płytkę cztery do pięciu razy dwoma do trzech mililitrów pożywki CSM minus lu minus trip, używając pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów do odpipetowania pożywki i delikatnie wyrzucając ją po powierzchni płytki YPD. Odwirować komórki w temperaturze pokojowej 4 696 razy g przez pięć minut.Odrzucić supernatant z każdej stożkowej probówki i ponownie zawiesić komórki w 40 mililitrach pożywki CSM minus lu minus trip, pipetując w górę iw dół. Aby oszacować liczbę utworzonych komórek diploidalnych, rozcieńczyć cztery mikrolitry mieszaniny diploidalnej odpowiednio na 200 mikrolitrów i 2 000 mikrolitrów CSM minus lu minus pożywka wyzwalacza. Umieścić 200 mikrolitrów każdego rozcieńczenia na płytce wyzwalającej CSM minus lu minus, aby przedstawić pełne rozcieńczenie od jednego do 10 000 i od jednego do 100 000 zebranych diploidów.Inkubować płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 36 do 40 godzin. Natychmiast użyć pozostałej części z każdych 40 mililitrów zawiesiny komórek, aby zaszczepić 500 mililitrów CSM minus lu minus pożywki wyzwalającej w jednolitrowej kolbie Erlenmeyera. Zmierz OD 600 każdej kultury.Inkubować te kolby w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością 180 obr./min, aż osiągną nasycenie, co zwykle trwa od 36 do 40 godzin. Monitoruj wzrost komórek po 24 godzinach i 36 godzinach, mierząc OD 600. Przed kontynuowaniem procedury należy potwierdzić skuteczność krycia dwóch szczepów drożdży.Wymagana jest minimalna liczba 200 kolonii na płytce rozcieńczającej od jednego do 10 000. Gdy kultury osiągną nasycenie, za pomocą pipety usunąć 20 mililitrowy alloquad z każdej kultury i zaszczepić dwulitrowe kolby Erlenmeyera. Jedna kolba zawierająca 750 mililitrów CSM minus lu minus pożywka wyzwalająca i druga kolba zawierająca 750 mililitrów CSM minus lu minus jego pożywka.Z najniższym poziomem triasolu trzech amino-124, który eliminuje tło, określony wcześniej zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dobrze wymieszaj nowe kultury, mieszając. Po zmierzeniu początkowego OD 600, inkubować kultury w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością 180 obr./min, aż do nasycenia, które zwykle następuje w ciągu 24 godzin dla niewybranej kultury CSM minus lu minus trip, ale może zająć ponad 70 godzin w przypadku kultur poddanych selekcji do interakcji drożdży 2-hybrydowych.Gdy kultury osiągną nasycenie, usunąć 11 mililitrów każdej kultury za pomocą pipety i osadnić komórki za pomocą pięciominutowego wirowania w temperaturze 4 696 g w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i przystąpić do ekstrakcji DNA, jak pokazano w następnym rozdziale. Aby rozpocząć procedurę ekstrakcji DNA, za pomocą pipety ponownie zawiesić każdą przygotowaną wcześniej osadkę komórkową w 500 mikrolitrach silnego buforu TE.Przenieś do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówki i dodaj 10 mikrolitrów bulionu zimolay do każdej probówki. W dygestorium dodaj trzy mikrolitry etanolu beta marketolu do każdej probówki i dobrze wymieszaj. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 do 36 godzin.Następnie należy dwukrotnie wyekstrahować próbki za pomocą 500 mikrolitrów alkoholu izolamaturalnego chloroformu fenolu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodać siedem mikrolitrów czteromolowego chlorku sodu i 900 mikrolitrów lodowatego 100% etanolu i wymieszać przez odwrócenie. Osadzaj DNA, wirując w mikrowirówce pod ciśnieniem 21, 130 razy g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Odrzucić supernatant przez pipetowanie i przemyć każdą osadkę trzykrotnie 900 mikrolitrami 70% etanolu. Osadzaj DNA, odwirowując w temperaturze 21 130 g przez dwie minuty. Po usunięciu resztek etanolu suszyć granulki w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez siedem minut.Zawiesić każdą granulkę w 120 mikrolitrach 0,1x mocnego TE w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 90 minut. Odpipetować 60 mikrolitrów wyekstrahowanego DNA do sterylnej 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki. Dodaj 120 mikrolitrów mocnego TE i 3,5 mikrolitra bulionu RN ace A, wymieszaj i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.Do każdej probówki dodaj siedem mikrolitrów pięciomolowego amonianu i 900 mikrolitrów lodowatego, 100% etanolu. Wymieszaj DNA przez inwersję i osad, jak wykazano wcześniej. Ponownie zawiesić DNA poddane działaniu RNace-A w 55 mikrolitrach 0,1x silnego TE w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 90 minut.Określ ilościowo DNA przez absorbancję przy 260 nanometrach. Kolejnym krokiem jest wykonanie PCR na insertach CDNA. Wykonaj dwie reakcje PCR o pojemności 50 mikrolitrów na próbkę DNA.Do każdej reakcji dodaj wodę, pięć mikrogramów próbki DNA, 25 pikamoli każdego startera do przodu i do tyłu pasującego do plazmidu biblioteki zdobyczy oraz 25 mikrolitrów wysokiej jakości mieszanki 2x PCR master. Wzmocnij reakcje za pomocą tego programu. 30-sekundowa denaturacja w temperaturze 98 stopni Celsjusza, 25 cykli D-natriny w temperaturze 98 stopni Celsjusza przez 10 sekund, wyżarzanie w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez 30 sekund i czas przedłużenia wynoszący trzy minuty w temperaturze 72 stopni Celsjusza, a następnie pięciominutowa inkubacja w temperaturze 72 stopni Celsjusza.Przeanalizuj każdą reakcję PCR za pomocą elektroforezy 1% DNA na schładzanie arozy z żelem zawierającym atydybrom i uwidocznij żel za pomocą transiluminacji UV. Próbki bez selekcji wykazują uogólniony rozmaz DNA, ale po selekcji można dostrzec pojedyncze prążki. Połącz zduplikowane próbki PCR i oczyść je za pomocą zestawu zgodnie z instrukcjami producenta.Określić ilościowo DNA przez absorbancję przy 260 nanometrach na spektrofotometrze. Następnie należy przeprowadzić głębokie sekwencjonowanie, a następnie przetwarzanie i weryfikację bioinformatyczną zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W zademonstrowanej procedurze wykorzystano nową, losowo rozdrobnioną bibliotekę 2-hybrydową drożdży, a wstawki plazmidowe amplifikowane metodą PCR przeanalizowano za pomocą sekwencjonowania DEEP i przetwarzania bioinformatycznego przy użyciu oprogramowania DEEPN i porównano z wcześniej opublikowaną biblioteką.Ten wykres przedstawia kolejność rang trzciny na każdy gen w bibliotekach podzieloną przez trzciny na gen znaleziony przez sekwencjonowanie genomu drożdży. Ten histogram pokazuje liczbę unikalnych plazmidów na gen, który koduje fragment, który znajduje się zarówno w regionie kodującym białko, jak i w odpowiedniej ramce odczytu translacyjnego. Pokazano porównanie liczby różnych plazmidów w każdej bibliotece, które kodują geny drożdży, oraz proporcji, które znajdują się i nie znajdują się w prawidłowej ramce odczytu translacyjnego lub są wstawiane wstecz.Ogólnie rzecz biorąc, nowa biblioteka ma o wiele więcej różnych plazmidów. Metody te zapewniają, że biblioteka może być odtwarzalnie przenoszona do komórek zawierających różne białka przynęty oraz że procedura selekcji może dać powtarzalne zestawy genów, które są wzbogacone, wyróżniając je jako specyficzne białka kandydujące oddziałujące. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu około tygodnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Większość tej pracy polega na inkubacji kultur komórkowych, a faktyczny czas pracy to zaledwie kilka godzin. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o stworzeniu populacji składających się z dużej liczby pojedynczych komórek diploidalnych, aby biblioteka mogła być odtwarzalnie przenoszona do komórek zawierających różne białka przynęty. Ważne jest również, aby zwrócić szczególną uwagę na warunki rozcieńczenia i tempo wzrostu komórek dla populacji poddawanych selekcji pod kątem dodatnich warunków hybrydowych drożdży 2.Zgodnie z tą procedurą, metody obliczeniowe, które zostały wyjaśnione w towarzyszącej pracy, zidentyfikują potencjalne białka oddziałujące i zapewnią ścieżkę walidacji tych interakcji przy użyciu tradycyjnego testu drożdży 2-hybrydowych lub innych metod biochemicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć bardzo dobry pomysł na to, jak odtwarzalnie tworzyć diploidalne populacje drożdży, które zawierają bibliotekę plazmidów ofiar i hodować je partiami, aby wybrać dodatnie interakcje hybrydowe drożdży 2. Nie zapominaj, że praca z rozpuszczalnikami organicznymi podczas protokołu oczyszczania DNA może być niebezpieczna i powinna być wykonywana w dygestoriach w rękawiczkach i fartuchu laboratoryjnym.

a-yeast-2-hybrid-screen-in-batch-to-compare-protein-interactions

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Metoda MYTH umożliwia czułą detekcję przejściowych i trwałych oddziaływań między białkami ekspresowanymi w organizmie modelowym Saccharomyces cerevisiae. Została ona z powodzeniem zastosowana do badania egzogennych oraz drożdżowych białek błonowych w celu wysokoprzepustowej identyfikacji ich partnerów interakcji.

System błonowego dwuhybrydowego badania drożdży (MYTH) oparty na rozszczepionej ubikwitynie: potężne narzędzie do identyfikacji oddziaływań białko-białko

Opracowaliśmy kompleksowe, nieobciążone systematycznie badania przesiewowe całego genomu, aby zrozumieć interakcje gen-lek oraz gen-środowisko. Przedstawiono metody przesiewania tych kolekcji mutantów.

Konkurencyjne przesiewy genomiczne z zastosowaniem bibliotek drożdży z kodami kreskowymi

Ten film demonstruje test dwóch hybryd drożdży do wykrywania specyficznych interakcji między białkami. W tym teście białko będące przedmiotem zainteresowania jest znakowane do dwóch domen czynnika transkrypcyjnego, który koduje enzym β-galaktozydazy. Kiedy te dwa białka wchodzą w interakcję, powoduje to transkrypcję i translację, które tworzą enzym, który jest następnie wykrywany za pomocą testu biochemicznego.

Test dwuhybrydowy drożdży w celu określenia samoasocjacji białek w komórkach drożdży

W tym filmie demonstrujemy zmodyfikowany test hybrydowy drożdży, który wykrywa wiele białek oddziałujących z docelowym DNA. Przekształcone komórki drożdży zawierają docelową sekwencję DNA przed genem reporterowym. Dodatkowo wykazują ekspresję białek czynnika transkrypcyjnego. Kiedy białka tworzą kompleksy i wiążą się z docelowym DNA, gen reporterowy ulega ekspresji i może być wykryty enzymatycznie.

Zmodyfikowany test hybrydowy drożdży i jeden do wykrywania interakcji heteromerycznego kompleksu białkowego z DNA

Ten artykuł skupia się na identyfikacji wysoce pewnych zestawów danych interakcji między białkami gospodarza i patogenu przy użyciu kombinacji dwóch ortogonalnych metod: drożdży dwuhybrydowych, a następnie wysokoprzepustowego testu interakcji w komórkach ssaków o nazwie HT-GPCA.

Podejście porównawcze do scharakteryzowania krajobrazu interakcji białko-białko gospodarz-patogen

Korzystając z mikromacierzy białkowych zawierających prawie cały proteom S. cerevisiae, sonduje się szybkie, bezstronne badanie tysięcy równoległych interakcji białko-białko. Metoda ta może być stosowana do małych cząsteczek białek, modyfikacji potranslacyjnych i innych testów o wysokiej przepustowości.

Sondowanie funkcjonalnych mikromacierzy białkowych o dużej gęstości w celu wykrycia interakcji białko-białko

Białka oddziałują na siebie nawzajem i te interakcje determinują w dużej mierze ich funkcje. Partnerzy interakcji białkowych można zidentyfikować przy wysokiej przepustowości in vivo za pomocą testu sprawności drożdży opartego na teście komplementacji fragmentów białka reduktazy dihydrofolianu (DHFR-PCA).

Badania przesiewowe interakcji białko-białko w całym genomie za pomocą testu komplementacji fragmentów białka (PCA) w żywych komórkach

Bakteryjne białka efektorowe są ważne dla skutecznego leczenia infekcji. Protokół ten opisuje eksperymentalną identyfikację białkowych partnerów wiążących bakteryjne białko efektorowe w jego naturalnym żywicielu roślinnym. Identyfikacja tych oddziaływań efektorowych za pomocą dwuhybrydowych badań przesiewowych drożdży stała się ważnym narzędziem w odkrywaniu strategii patogenności molekularnej.

Rozwikłanie funkcji efektora bakteryjnego od nienadającego się do uprawy patogenu roślinnego za pomocą drożdżowego sita dwuhybrydowego

Opisany tutaj zmodyfikowany test na jedną hybrydę drożdży jest rozszerzeniem klasycznego testu na hybrydę drożdży (Y1H) do badania i walidacji interakcji heteromerycznego kompleksu białkowego z DNA w systemie heterologicznym dla dowolnego funkcjonalnego badania genomicznego.

Zmodyfikowany system hybrydowy drożdż-jeden do badań interakcji heteromerycznego kompleksu białkowego i DNA

Głębokie sekwencjonowanie populacji drożdży wybranych do pozytywnych interakcji drożdży z hybrydami 2 potencjalnie dostarcza wielu informacji na temat oddziałujących białek partnerskich. W tym miejscu opisujemy działanie konkretnych narzędzi bioinformatycznych i dostosowanego zaktualizowanego oprogramowania do analizy danych sekwencyjnych z takich ekranów.

Analiza informacyjna danych sekwencyjnych z przesiewów drożdżowych 2-hybrydowych

Interakcje biomolekuł, takie jak interakcje białko-białko, są molekularną podstawą funkcji biologicznych. Jeśli uda się wyizolować mutanty bez interakcji/upośledzone, które specyficznie nie mają odpowiedniej interakcji, znacznie pomogą one w zrozumieniu funkcji tej interakcji. W tym artykule przedstawiono skuteczny sposób izolowania mutantów bez interakcji/z upośledzeniem.

Izolowanie mutantów o zerowej interakcji/upośledzonych przy użyciu testu dwuhybrydowego drożdży

Poznaj udoskonaloną metodę badania przesiewowego drożdży 2-hybrydowych w partii, umożliwiającą bezpośrednie porównanie profili interakcji wielu białek przynęty. Technika wykorzystuje głębokie sekwencjonowanie do identyfikacji różnicowych interaktomów.

Badanie przesiewowe drożdży 2-hybrydowych w partii w celu porównania interakcji białek

Przeglądaj więcej filmów