Name: Analiza informacyjna danych sekwencyjnych z przesiewów drożdżowych 2-hybrydowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Poznaj analizę interaktomów białkowych za pomocą oprogramowania MAPster z przyjaznym interfejsem graficznym. To narzędzie umożliwia badaczom bez zaawansowanej wiedzy bioinformatycznej przetwarzanie danych sekwencyjnych z przesiewów drożdżowych 2-hybrydowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health: NIH R21 EB021870-01A1 oraz przez NSF Research Project Grant: 1517110.

1. Mapowanie plików Fastq
UWAGA: Oprogramowanie DEEPN, jak również wiele programów bioinformatycznych, korzysta z danych sekwencji DNA, gdzie każda odczytana sekwencja została zmapowana pod kątem jej pozycji w referencyjnym DNA. Można do tego użyć różnych programów mapujących, w tym interfejsu MAPster, który wykorzystuje program HISTAT2 do tworzenia plików .sam używanych w kolejnych krokach.
<ol>
	<li>Zmapuj dane sekwencji do właściwej wersji genomu. W przypadku bibliotek Y2H pochodzenia mysiego należy użyć genomu UCSC mm10; w przypadku genów ludzkich należy użyć genomu referencyjnego UCSC hg38, w przypadku genów Saccharomyces cerevisiae należy użyć genomu referencyjnego UCSC SacCer3.</li>
	<li>Zainstaluj program MAPster.
	<ol>
		<li>Pobierz oprogramowanie MAPster i zainstaluj. Oprogramowanie można znaleźć za pomocą przeglądarki internetowej pod następującymi adresami: https://github.com/emptyewer/MAPster/releases. HISAT2 działa w systemach uniksowych, takich jak Apple Macintosh. Z tego powodu program MAPster będzie działał tylko na kompatybilnych systemach, takich jak Apple Macintosh i linux. 
		UWAGA: Wymagania systemowe dla komputera Apple Mac to: OSX 10.10+, >4 GB pamięci RAM, >500 GB miejsca na dysku i dostęp do Internetu w celu pobrania genomów referencyjnych. Użytkownicy mogą być zmuszeni do skonsultowania się z informatykiem w instytucji, jeśli ich przedsiębiorstwo ma protokoły zabezpieczeń ograniczające prawa i uprawnienia administratora.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wprowadź wymagane pliki i parametry za pomocą zakładki "Główne" (Rysunek 1). Wybierz odpowiedni przycisk "Parzy", aby wprowadzić pliki jako pary lub niesparowane z FASTQ jako domyślnym formatem pliku.
	<ol>
		<li>W przypadku analizy DEEPN ustaw opcję "Parzy" na "Wył.", aby uruchomić ją w formacie pojedynczego odczytu.</li>
		<li>Załaduj pliki do MAPstera, po prostu przeciągnij i upuść w odpowiednim oknie.</li>
		<li>Wybierz referencyjne źródło DNA/genomu, które odpowiada źródłu wkładek biblioteki ofiar Y2H. Zindeksowane genomy z kilku organizmów modelowych są wymienione w polu "Genom" i mogą być automatycznie pobierane z Centrum Biologii Obliczeniowej Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa. Genomy referencyjne będą przechowywane lokalnie do późniejszego wykorzystania.</li>
		<li>W polu "Wątki" należy wskazać liczbę procesów komputerowych, które mają być poświęcone programowi mapującemu, ponieważ HISAT2 obsługuje wielowątkowość. MAPster przeszuka komputer i zasugeruje maksymalną liczbę dostępnych procesorów jako domyślną.</li>
		<li>Określ nazwę pliku wyjściowego. Ta nazwa pliku będzie używana w całym procesie DEEPN, dlatego zalecana jest krótka, ale opisowa nazwa bez spacji i znaków specjalnych. Określ folder, w którym mają być wyprowadzane zmapowane pliki za pomocą przycisku "Otwórz katalog wyjściowy".</li>
		<li>Po wybraniu odpowiednich plików i parametrów dodaj zadanie mapowania do kolejki zadań za pomocą przycisku "Dodaj do kolejki". Nazwy plików w oknie głównym mogą być usuwane i zastępowane plikami odpowiadającymi nowej próbce i mogą być dodawane do kolejki po podaniu odpowiedniej nazwy pliku wyjściowego.</li>
		<li>Kliknij przycisk "Uruchom kolejkę" po wprowadzeniu wszystkich zadań do kolejki zadań. 
		UWAGA: Po umieszczeniu zadania mapowania w kolejce, wybranie tego zadania powoduje wyświetlenie ustawień parametrów w oknie "Parametry zadania" oraz wyświetlenie instrukcji wiersza poleceń ze wszystkimi argumentami w oknie "Polecenie zadania". Opcje wyjściowe obejmują określanie, czy zachować odczyty, które nie są wyrównane, oraz określanie liczby podstawowych wyrównań dozwolonych dla każdego odczytu. Domyślny plik wyjściowy z MAPster jest w formacie SAM (np. plik '.sam'). Będzie on zawierał wszystkie odczyty sekwencji z plików fastq określonych dla tej próbki, w tym te, które zostały (zmapowane) i nie zostały (niezmapowane) pomyślnie zmapowane do określonego geomu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przetwarzanie bioinformatyczne za pomocą oprogramowania DEEPN
UWAGA: Oprogramowanie DEEPN jest obecnie kompilowane do użytku z bibliotekami ofiar zawierającymi sekwencje cDNA myszy, sekwencje cDNA człowieka lub sekwencje genomowego DNA S. cerevisiae. DEEPN akceptuje standardowy format pliku .sam i może akceptować plik SAM (.sam) zawierający zarówno zmapowane, jak i niezamapowane odczyty lub oddzielne pliki dla każdego z niezamapowanych i zmapowanych odczytów.
<ol>
	<li>Pobierz oprogramowanie DEEPN i zainstaluj. Oprogramowanie można znaleźć za pomocą przeglądarki internetowej pod następującymi stronami: https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases. Wybierz wersję pasującą do platformy obliczeniowej i pobierz. Aby zainstalować, otwórz pobrany pakiet instalacyjny. 
	UWAGA: Wersje DEEPN są dostępne dla systemów PC, Mac i Linux. Systemy Mac i PC powinny mieć >500 GB miejsca na dysku twardym i >4 GB pamięci RAM.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie DEEPN. Z głównego okna (Rysunek 2) wybierz odpowiednie informacje o bibliotece zdobyczy z górnego pola wyboru. Wybierz folder, do którego mogą trafić przetworzone pliki, klikając przycisk "Folder roboczy" i przechodząc do folderu/katalogu. W razie potrzeby można utworzyć nowy folder/katalog. Po wybraniu "Folderu roboczego" DEEPN utworzy trzy podfoldery o nazwach unmapped_sam_files, mapped_sam_files i sam_files.
	<ol>
		<li>Jeśli używasz plików .sam zawierających zarówno zmapowane, jak i niezmapowane odczyty, takie jak te utworzone z domyślnymi ustawieniami programu MAPster, umieść je w folderze "sam_files". W przeciwnym razie umieść pliki .sam w unmapped_sam_files i odpowiednio mapped_sam_files.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpocznij przetwarzanie, klikając przycisk "Liczba genów+Tworzenie złącza". 
	UWAGA: Przetwarzanie rozpocznie się od modułu Gene Count, który użyje pozycji mapowania do zliczenia, ile odczytów odpowiada każdemu genowi. Junction Make następnie wyodrębni sekwencje złączy (sekwencje połączone bezpośrednio za domeną aktywacji Gal4) z odczytów i zidentyfikuje je za pomocą algorytmu Blast. Spowoduje to utworzenie pełnego zestawu folderów przedstawionych w Rysunek 3. Czas przetwarzania zależy od rozmiaru i liczby plików danych sekwencji oraz szybkości przetwarzania używanego komputera. Typowe czasy wahają się od 12 do 30 godzin dla eksperymentalnego zestawu danych ~250 milionów odczytów. Procedurę zliczania genów i procedurę Junction_Make można uruchomić indywidualnie, klikając przycisk "Liczba genów" lub przycisk "Tworzenie połączenia".</li>
	<li>Pobierz i zainstaluj Stat_Maker (https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases). Jest to pakiet do analizy statystycznej przeznaczony dla zestawów danych DEEPN, który obecnie działa tylko w systemach Unix Mac.
	<ol>
		<li>Otwórz Stat_Maker i kliknij przycisk "Sprawdź instalację" (Rysunek 4). Jeśli uruchomisz go po raz pierwszy, Stat_Maker automatycznie zainstaluje R, JAGS i Bioconductor, pobierając te zasoby z Internetu. Po wykryciu R, JAGS i Bioconductor stanie Stat_Maker się aktywny i umożliwi dalsze wprowadzanie danych przez użytkownika.</li>
		<li>Kliknij przycisk "Wybierz folder", aby przejść do folderu roboczego przetworzonego przez DEEPN. Stat_Maker automatycznie znajdzie i wyświetli listę plików do analizy statystycznej w oknie.</li>
		<li>Przeciągnij i upuść odpowiednie pliki z powyższego okna listy plików do poniższych okien plików dla każdego zestawu danych wektorów i przynęt oraz dla każdego warunków wzrostu: niewybrane (His+ media) i wybrane (His-media). Co ważne, wymaga Stat_Maker zduplikowanych zbiorów danych dla samego pustego wektora, dwóch próbek niewybranych populacji i dwóch próbek wybranych. Daje to oszacowanie zmienności w eksperymencie.</li>
		<li>Kliknij przycisk "Uruchom". W zależności od szybkości komputera obliczenia zajmą od 5 do 15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przejrzyj wyniki z danych wyjściowych Stat_Maker, które są umieszczane w nowym podfolderze w głównym folderze roboczym o nazwie "Stat_Maker Results". 
	UWAGA: Wyniki znajdują się w pliku CSV (wartości rozdzielane przecinkami), który można otworzyć w popularnych programach do obsługi arkuszy kalkulacyjnych. Stat_Maker uszereguje trafienia genów, które prawdopodobnie zostaną wzbogacone w różny sposób po selekcji za pomocą interesującej przynęty w stosunku do pustego pTEF-GBD (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5). W tabeli przedstawiono również procent odczytów dla każdego zestawu danych, w którym wstawienie genu znajduje się przed, za lub w otwartej ramce odczytu oraz czy gen znajduje się również w prawidłowej ramce odczytu translacyjnego. Często DEEPN wychwytuje silne interakcje Y2H przynęty z częściami danego cDNA, które znajdują się poza właściwą ramką odczytu odpowiedniego białka lub znajdują się w części cDNA, która znajduje się poniżej odpowiadającej jej ramki otwartego odczytu. Skanowanie połączonych danych wyjściowych z Stat_Maker usprawnia wykrywanie i eliminowanie tych nieistotnych trafień.</li>
	<li>Aby przejrzeć dane dotyczące każdego potencjalnego kandydata, otwórz oprogramowanie DEEPN, wybierz odpowiednie informacje z biblioteki zdobyczy, a następnie właściwy folder roboczy za pomocą "Folderu roboczego".
	<ol>
		<li>Kliknij przycisk "Blast Query". Spowoduje to załadowanie nowego okna (Rysunek 6). W górnym polu tekstowym wpisz nazwę genu lub numer GenBank NM, aby wybrać kandydata na gen, który Cię interesuje. Te nazwy genów odpowiadają nazwom wymienionym w pliku wyjściowym StatMaker. Wpisz enter lub return, który inicjuje pobieranie interesującego nas genu.</li>
		<li>Wybierz, które zestawy danych zostaną użyte do analizy, korzystając z menu "Wybierz zestaw danych". Zazwyczaj obejmują one tylko próbki wektorów i przynęt hodowane w warunkach nieselektywnych oraz próbki przynęty hodowane w warunkach selekcji. Początkowo załadowanie zestawów danych zajmie kilka chwil, jednak kolejne zapytanie dotyczące tych samych zestawów danych z różnymi genami będzie przebiegać szybko. Blast_Query wyświetli punkty fuzji wzdłuż interesującej nas sekwencji oraz obfitość każdego punktu fuzji. Może to być wyświetlane zarówno w formie tabeli za pomocą zakładki "Wyniki", jak i w formacie graficznym za pomocą zakładki "Wykres". Wyniki te można wyeksportować do pliku .csv, klikając przycisk "Zapisz .csv" w prawym górnym rogu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Weryfikacja kandydatów zidentyfikowanych przez DEEPN
UWAGA: Celem DEEPN i Stat_Maker jest zidentyfikowanie genów kandydujących, które dają pozytywną interakcję Y2H. Weryfikację takich interakcji Y2H można przeprowadzić przy użyciu tradycyjnego binarnego formatu Y2H przy użyciu plazmidu przynęty będącego przedmiotem zainteresowania w połączeniu z pustym plazmidem "ofiary" domeny aktywacji Gal4, a także w połączeniu z plazmidem ofiary przenoszącym interesujący nas fragment genu / cDNA. Nie jest możliwe wyizolowanie rzeczywistego plazmidu będącego przedmiotem zainteresowania w mieszaninie DNA wyizolowanego z populacji drożdży poddanych selekcji Y2H. Można jednak obliczeniowo zrekonstruować, czym jest fragment genu / cDNA, który wytwarza interakcję Y2H, zaprojektować startery dla końców 5' i 3' tego fragmentu i amplifikować ten fragment z DNA wyizolowanego z populacji drożdży. W tej sekcji opisano, jak znaleźć koniec 5' i 3' fragmentu kandydata na zdobycz.
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie DEEPN i wybierz parametry "Wybierz parametr" oraz folder roboczy "Wybierz folder roboczy" odpowiadający projektowi. Uruchom moduł Blast_Query, klikając przycisk "Blast Query".</li>
	<li>Wpisz nazwę interesującego genu lub jego numer "NM" GenBank w górnym polu tekstowym. Wybierz z menu rozwijanego zestaw danych, który odpowiada wybranej populacji drożdży dla interesującej Cię przynęty, aby pobrać tabelę pozycji złączy w zakładce "Wyniki". Domyślnie Blast_Query uporządkuje różne pozycje zgodnie z ich obfitością w zestawie danych, określoną ilościowo za pomocą ppm całkowitej liczby skrzyżowań znalezionych w bazie danych.
	<ol>
		<li>Znajdź najbardziej obfitą pozycję, czyli "W ORF" i "W kadrze". Wartość pozycji odpowiada pozycji nukleotydu genu z sekwencją referencyjną NCBI ("NM") znajdującą się w górnym polu tekstowym. Sekwencję tę można pobrać z GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/) lub skopiować z dolnego pola tekstowego w oknie Blast_Query. 
		UWAGA: Przykład można znaleźć w Rysunek 6, środkowy panel. W środkowym zestawie danych "Wyniki" są wyświetlane jako najliczniejsze skrzyżowanie: "Pozycja": 867; "#Junctions": 20033.821; "Rozpoczęcie zapytania", 1; CDS: W ORF; i "Ramka": W ramce. Nukleotyd 867 sekwencji referencyjnej GenBank NCBI NM_019648 jest początkiem fragmentu ofiary.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jeśli początek zapytania wynosi 1, zaprojektuj koniec 5' startera tak, aby zawierał nukleotyd odpowiadający numerowi pozycji i rozciągnął 25 nukleotydów w dół od tej pozycji (<silna klasa = "xfig">Rysunek 7). Jeśli Początek zapytania jest większy niż 1, oznacza to, że między domeną aktywacji Gal4 a sekwencją ofiary znajdują się dodatkowe nukleotydy i że starter powinien rozpocząć się dalej zgodnie z wartością Początek zapytania.</li>
	<li>W oknie DEEPN kliknij przycisk "Głębokość odczytu" w sekcji "Analizuj dane". Po otwarciu okna Głębokość odczytu wpisz numer sekwencji referencyjnej NCBI (NM) lub nazwę genu w górnym polu tekstowym. Użyj menu rozwijanego, aby wybrać odpowiedni zestaw danych, który zawiera wzbogacony gen, który Cię interesuje. Użyj tabeli po lewej stronie i grafiki wyświetlanej po prawej, aby określić, ile odczytów znaleziono w danych, które odpowiadają interesującemu genowi (<silna klasa="xfig">Rysunek 7B).</li>
	<li>Zaprojektuj 3-calowy starter końcowy, który uchwyci sekwencję fragmentu genu obliczoną przez głębokość odczytu. Jeśli obfitość odczytów wykracza poza ORF i kodon stop, zaprojektuj starter tak, aby zawierał kodon stop i obszar tuż przed kodonem stop. Jeśli sekwencje genu nie rozciągają się poza kodon stop, użyj tabeli wyników, aby znaleźć najdalszy region 3', który można wykryć, i użyj tej pozycji jako najdalszej pozycji 3', aby umieścić starter. 
	UWAGA: Program Read Depth skanuje w odstępach czasu w celu znalezienia sekwencji pasujących do określonego genu/cDNA, który Cię interesuje. Pomaga to przewidzieć, gdzie znajduje się koniec 5' i 3' najliczniejszego fragmentu ofiary dla tego genu w próbce. Wahania głębokości odczytu wzdłuż długości sekwencji są normalne, co można zobaczyć na Rysunek 7. Jeśli głębokość odczytu wyraźnie wykracza poza kodon stop, oznacza to, że fragment ofiary rozciąga się poza kodon stop, a zatem starter 3' może po prostu odpowiadać obszarowi wokół kodonu stop.</li>
	<li>Wykonaj reakcję PCR 50 μl na gen. Każda reakcja zawiera 25 pmol każdego startera do przodu i do tyłu pasującego do plazmidu z biblioteki ofiar (patrz tabela materiałów). Reakcje zawierają również 25 μl High-fidelity 2x PCR Master Mix, 5 μg próbki DNA i wodę do 50 μl.
	<ol>
		<li>Amplifikować reakcje przez 25 cykli z czasem wydłużenia wynoszącym 3 minuty w temperaturze 72 °C, temperaturą wyżarzania 55 °C przez 30 s i denaturacją w temperaturze 98 °C przez 10 s. Cykl należy poprzedzić 30-sekundową denaturacją w temperaturze 98 °C, a następnie 5-minutową inkubacją w temperaturze 72 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li>
<li>Rajagopala, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+Protein-Protein+Interactome+Networks+Using+Yeast+Two-Hybrid+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).</li>
<li>Weimann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Y2H-seq+approach+defines+the+human+protein+methyltransferase+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome.</a> Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).</li>
<li>Yachie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pooled-matrix+protein+interaction+screens+using+Barcode+Fusion+Genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics.</a> Molecular Systems Biology. 12 (4), 863(2016).</li>
<li>Trigg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CrY2H-seq%3A+a+massively+multiplexed+assay+for+deep-coverage+interactome+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping.</a> Nature Methods. , (2017).</li>
<li>Pashkova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEEPN+as+an+Approach+for+Batch+Processing+of+Yeast+2-Hybrid+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions.</a> Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).</li>
<li>Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HISAT%3A+a+fast+spliced+aligner+with+low+memory+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements.</a> Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).</li>
<li>Reinert, K., Langmead, B., Weese, D., Evers, D. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25939052">Alignment of Next-Generation Sequencing Reads.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 16, 133-151 (2015).</li>
<li>Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript-level+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+HISAT%2C+StringTie+and+Ballgown%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).</li>
<li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26813401">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biology. 17, 13(2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Opisany tutaj pakiet oprogramowania pozwala na pełne przetwarzanie i analizowanie danych sekwencjonowania DNA o wysokiej przepustowości z eksperymentu DEEPN. Pierwszym używanym programem jest MAPster, który pobiera sekwencję DNA odczytaną ze standardowych plików fastq i odwzorowuje ich pozycję na referencyjnym DNA w celu dalszego przetwarzania przez cały szereg programów informatycznych, w tym oprogramowanie DEEPN. Użyteczność interfejsu MAPster i jego zdolność do kolejkowania wielu zadań, łączenia plików wejściowych, sp...

Jednym z podejść do odkrywania interakcji białek jest test 2-hybrydowy (Y2H) drożdży, który wykorzystuje zmodyfikowane komórki drożdży, które rosną tylko wtedy, gdy interesujące białko wiąże się z fragmentem oddziałującego partnera1. Wykrywanie wielu interakcji Y2H można teraz wykonać za pomocą masowego równoległego sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Opisano kilka formatów2,3,4,5, w tym jeden, który opracowaliśmy, gdzie populacje są hodowane w partiach w warunkach, które selekcjonują drożdże zawierające plazmidy, które wytwarzają dodatnią interakcję Y2H6. Opracowany przez nas przepływ pracy, nazwany DEEPN (Dynamic Enrichment for Evaluation of Protein Networks), identyfikuje zróżnicowane interakttomy z tych samych bibliotek ofiar w celu zidentyfikowania białek, które oddziałują z jednym białkiem (lub domeną) w porównaniu z jednym białkiem. inne białko lub konformacyjnie odrębną zmutowaną domenę. Jednym z głównych etapów tego przepływu pracy jest właściwe przetwarzanie i analiza danych sekwencjonowania DNA. Niektóre informacje można uzyskać, po prostu licząc liczbę odczytów dla każdego genu zarówno przed, jak i po selekcji interakcji Y2H w sposób analogiczny do eksperymentu z sekwencją RNA. Jednak z tych zbiorów danych można uzyskać znacznie bardziej szczegółowe informacje, w tym informacje na temat subdomeny danego białka, które jest zdolne do wytwarzania interakcji Y2H. Ponadto, mimo że podejście opracowane w ramach projektu DEEPN jest cenne, analiza wielu powtórzeń próbek może być kłopotliwa i kosztowna. Problem ten został rozwiązany dzięki zastosowaniu modelu statystycznego, który został opracowany specjalnie dla zestawów danych DEEPN, w których liczba powtórzeń jest ograniczona6. Aby przetwarzanie i analiza zestawów danych sekwencjonowania DNA były niezawodne, kompletne, solidne i dostępne dla badaczy bez wiedzy bioinformatycznej, opracowaliśmy pakiet programów, które obejmują wszystkie etapy analizy.
Ten zestaw samodzielnych programów, które działają na komputerach stacjonarnych, obejmuje MAPster, DEEPN i Stat_Maker. MAPster to graficzny interfejs użytkownika, który umożliwia każdemu plikowi fastq kolejkowanie do mapowania do genomu za pomocą HISAT2 program7, tworząc standardowy plik .sam do użytku w dalszych aplikacjach. DEEPN składa się z kilku modułów. Przypisuje i zlicza odczyty odpowiadające poszczególnym genom, podobnie jak w przypadku kwantyfikacji typu sekwencyjnego RNA za pomocą modułu "Liczba genów". Wyodrębnia również sekwencje odpowiadające złączu między domeną transkrypcyjną Gal4 a sekwencją ofiary i zestawia położenie tych połączeń, aby umożliwić ich inspekcję za pomocą tabel porównawczych i wykresów (przy użyciu modułu "Junction_Make") Moduł "Blast_Query" umożliwia łatwą kontrolę, kwantyfikację i porównanie sekwencji złączy Gal4 złącza. Stat_Maker ocenia statystycznie odczyty danych dotyczących wzbogacania genów jako sposób na ustalenie priorytetów prawdopodobnych trafień Y2H. Tutaj opisujemy, jak korzystać z tych programów i w pełni analizować dane sekwencji DNA z eksperymentu DEEPN Y2H. Wersje DEEPN są dostępne do uruchomienia na komputerach PC, Mac i systemach Linux. Inne programy, takie jak program do mapowania MAPster i moduł statystyk DEEPN, Stat_Maker polegać na podprogramach działających w systemie Unix i są dostępne tylko w systemach Mac i Linux.

<table><tbody><tr><td></td><td>Oprogramowanie</td> Mapster <td></td><td></td> https://github.com/emptyewer/MAPster/releases</tr><tr><td>DEEPN</td><td>https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases</td>Statmaker https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases Minimalny system komputerowy Apple Mac Intel Core i5 lub lepszy - 4 GB pamięci RAM lub <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr>lepszy-500<td></td><td></td><td></td> <td>Gb Disk spce lub</td></tr> <tr><td>lepszy-OS</td><td></td><td></td> <td>10.10 lub nowszy</td></tr><tr><td></td><td>Dell</td><td></td><td>Intel i5-7400 lub</td></tr> <tr><td>lepszy-4</td><td></td><td></td> <td>GB pamięci RAM lub</td></tr> <tr><td>lepszy-500</td><td></td><td></td> <td>Gb Disk spce lub</td></tr> <tr><td>lepszy-Windows</td><td></td><td></td> <td>7 lub nowszy</td></tr></tbody></table>

analiza informacyjna danych sekwencyjnych z przesiewów drożdżowych 2-hybrydowych

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Dostosowaliśmy test drożdży 2-hybrydowych, aby jednocześnie odkrywać dziesiątki przejściowych i statycznych interakcji białkowych w jednym ekranie, wykorzystując wysokoprzepustowe sekwencjonowanie DNA z krótkim odczytem. Uzyskane w ten sposób zestawy danych sekwencji mogą nie tylko śledzić, jakie geny w populacji są wzbogacane podczas selekcji pod kątem dodatnich interakcji drożdży 2-hybrydowych, ale także dostarczyć szczegółowych informacji na temat odpowiednich subdomen białek wystarczających do interakcji. W tym miejscu opisujemy pełny zestaw samodzielnych programów, które pozwalają osobom niebędącym ekspertami wykonywać wszystkie kroki bioinformatyczne i statystyczne w celu przetwarzania i analizowania plików fastq sekwencji DNA z wsadowego testu 2-hybrydowego drożdży. Etapy przetwarzania objęte tym oprogramowaniem obejmują: 1) mapowanie i zliczanie odczytów sekwencji odpowiadających każdemu białku kandydującemu kodowanemu w bibliotece 2-hybrydowych ofiar drożdży; 2) program do analizy statystycznej, który ocenia profile wzbogacenia; oraz 3) narzędzia do badania ramy translacyjnej i pozycji w regionie kodującym każdego wzbogaconego plazmidu, który koduje oddziałujące białka będące przedmiotem zainteresowania.

Mapowanie danych fastq: pierwszy krok 
W prawie wszystkich zastosowaniach NGS, w tym w DEEPN, produktem początkowym jest plik krótkich odczytów sekwencji, które muszą zostać zmapowane poprzez dopasowanie (alignment) do genomowego, transkryptomicznego lub innego referencyjnego DNA8. Niedawno opracowano program dopasowujący HISAT2, który wykorzystuje najnowocześniejsze algorytmy indeksowania, aby radykalnie zwiększyć szybkość mapowania<sup class="...

Głębokie sekwencjonowanie populacji drożdży wybranych do pozytywnych interakcji drożdży z hybrydami 2 potencjalnie dostarcza wielu informacji na temat oddziałujących białek partnerskich. W tym miejscu opisujemy działanie konkretnych narzędzi bioinformatycznych i dostosowanego zaktualizowanego oprogramowania do analizy danych sekwencyjnych z takich ekranów.

Analiza informacyjna danych sekwencyjnych z przesiewów drożdżowych 2-hybrydowych

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące natury interaktomii białkowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że całe przetwarzanie bioinformatyczne jest obsługiwane przez łatwy w użyciu interfejs. To oprogramowanie wykorzystuje przyjazny dla użytkownika graficzny interfejs użytkownika, z którego biolodzy molekularni, biolodzy komórkowi i biochemicy, którzy nie mają dużej wiedzy specjalistycznej, mogą łatwo przeprowadzić analizę.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w przetwarzaniu danych sekwencyjnych, mają trudności, ponieważ programy komputerowe są mylące i uciążliwe. Pomyśleliśmy, że uproszczenie informatyki sprawi, że cała technika będzie o wiele bardziej dostępna i użyteczna. Pierwszym krokiem w tej procedurze jest pobranie i zainstalowanie oprogramowania MAPster zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Następnie wprowadź wymagane pliki i parametry za pomocą zakładki Główne. Wybierz odpowiedni przycisk Parami, aby wprowadzić pliki do analizy DEEPN. Wyłącz opcję Parowanie, aby uruchomić w formacie pojedynczego odczytu.Załaduj pliki do MAPstera, przeciągając i upuszczając do odpowiedniego okna. Z indeksowanych genomów wymienionych w polu Genom wybierz r

informatic-analysis-of-sequence-data-from-batch-yeast-2-hybrid-screens

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W niniejszym protokole ekspresja genów w drożdżach (Saccharomyces cerevisiae) ulega zmianie po narażeniu na stres oksydacyjny wywołany dodaniem nadtlenku wodoru (H2O2), który jest środkiem utleniającym.

Analiza mikromacierzy dla Saccharomyces cerevisiae

Opracowaliśmy kompleksowe, nieobciążone systematycznie badania przesiewowe całego genomu, aby zrozumieć interakcje gen-lek oraz gen-środowisko. Przedstawiono metody przesiewania tych kolekcji mutantów.

Konkurencyjne przesiewy genomiczne z zastosowaniem bibliotek drożdży z kodami kreskowymi

Ten artykuł skupia się na identyfikacji wysoce pewnych zestawów danych interakcji między białkami gospodarza i patogenu przy użyciu kombinacji dwóch ortogonalnych metod: drożdży dwuhybrydowych, a następnie wysokoprzepustowego testu interakcji w komórkach ssaków o nazwie HT-GPCA.

Podejście porównawcze do scharakteryzowania krajobrazu interakcji białko-białko gospodarz-patogen

Ten protokół opisuje metodologię o wysokiej przepustowości do funkcjonalnego badania przesiewowego pod kątem dziedziczenia opartego na białkach u S. cerevisiae.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku dziedziczenia na podstawie białek u S. cerevisiae

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący sekwencję RNA do monitorowania poziomów mRNA w czasie podczas niedotlenienia komórek S. cerevisiae. Metodę tę można dostosować do analizy ekspresji genów podczas dowolnej odpowiedzi komórkowej.

Pomiar poziomu mRNA w czasie podczas odpowiedzi niedotlenienia drożdży S. cerevisiae

Opisujemy technikę łączenia cytometrii przepływowej i sekwencjonowania o wysokiej przepustowości w celu identyfikacji późno replikujących się regionów genomu.

G2-seq: Wysokoprzepustowa technika oparta na sekwencjonowaniu do identyfikacji późno replikujących się regionów genomu

Przetwarzanie wsadowe drożdżowych 2-hybrydowych ekranów pozwala na bezpośrednie porównanie profili interakcji wielu białek przynęty z wysoce złożonym zestawem białek fuzyjnych ofiar. W tym miejscu opisujemy udoskonalone metody, nowe odczynniki oraz sposób ich zastosowania w takich badaniach przesiewowych.

Badanie przesiewowe drożdży 2-hybrydowych w partii w celu porównania interakcji białek

Prezentujemy prosty protokół ekranu tłumiącego w drożdżach rozszczepienia. Metoda ta jest skuteczna, wolna od mutagenów i selektywna w przypadku mutacji, które często występują w pojedynczym locus genomu. Protokół jest odpowiedni do izolowania supresorów, które łagodzą defekty wzrostu w płynnej kulturze, które są spowodowane mutacją lub lekiem.

Wspomagane głębokim sekwencjonowaniem, spontaniczne badanie supresorowe w drożdżach rozszczepienia Schizosaccharomyces pombe

Wąskim gardłem w cyklu "zaprojektuj-zbuduj-testuj" inżynierii mikrobiologicznej jest szybkość, z jaką możemy przeprowadzać funkcjonalne badania przesiewowe szczepów. Opisujemy wysokoprzepustową metodę badań przesiewowych szczepów stosowaną do setek do tysięcy komórek drożdży na eksperyment, która wykorzystuje sekwencjonowanie RNA oparte na kropelkach.

Wysokowydajne fenotypowanie szczepów drożdży z sekwencjonowaniem RNA na bazie kropelek

Opracowano wzbogacanie i sekwencjonowanie nowogenetycznego DNA (eSPAN) związanego z białkiem, aby wykryć względną obfitość białka związanego z chromatyną na dwóch replikujących się niciach DNA, co ujawniło molekularne wgląd w replikację chromatyny i jej sprzężone procesy. Protokół ten opisuje procedury eSPAN w komórkach macierzystych drożdży i myszy embrionalnych (ES).

Analiza białek specyficznych dla nici łańcuchowej w replikacji nici DNA poprzez wzbogacenie i sekwencjonowanie metody DNA powiązanego z białkiem

Poznaj analizę interaktomów białkowych za pomocą oprogramowania MAPster z przyjaznym interfejsem graficznym. To narzędzie umożliwia badaczom bez zaawansowanej wiedzy bioinformatycznej przetwarzanie danych sekwencyjnych z przesiewów drożdżowych 2-hybrydowych.

Analiza informacyjna danych sekwencyjnych z przesiewów drożdżowych 2-hybrydowych

Przeglądaj więcej filmów