Analiza informacyjna danych sekwencyjnych z przesiewów drożdżowych 2-hybrydowych
28 czerwca 2018
Głębokie sekwencjonowanie populacji drożdży wybranych do pozytywnych interakcji drożdży z hybrydami 2 potencjalnie dostarcza wielu informacji na temat oddziałujących białek partnerskich. W tym miejscu opisujemy działanie konkretnych narzędzi bioinformatycznych i dostosowanego zaktualizowanego oprogramowania do analizy danych sekwencyjnych z takich ekranów.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące natury interaktomii białkowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że całe przetwarzanie bioinformatyczne jest obsługiwane przez łatwy w użyciu interfejs. To oprogramowanie wykorzystuje przyjazny dla użytkownika graficzny interfejs użytkownika, z którego biolodzy molekularni, biolodzy komórkowi i biochemicy, którzy nie mają dużej wiedzy specjalistycznej, mogą łatwo przeprowadzić analizę.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w przetwarzaniu danych sekwencyjnych, mają trudności, ponieważ programy komputerowe są mylące i uciążliwe. Pomyśleliśmy, że uproszczenie informatyki sprawi, że cała technika będzie o wiele bardziej dostępna i użyteczna. Pierwszym krokiem w tej procedurze jest pobranie i zainstalowanie oprogramowania MAPster zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Następnie wprowadź wymagane pliki i parametry za pomocą zakładki Główne. Wybierz odpowiedni przycisk Parami, aby wprowadzić pliki do analizy DEEPN. Wyłącz opcję Parowanie, aby uruchomić w formacie pojedynczego odczytu.
Załaduj pliki do MAPstera, przeciągając i upuszczając do odpowiedniego okna. Z indeksowanych genomów wymienionych w polu Genom wybierz referencyjne źródło genomu DNA, które odpowiada źródłu wstawek biblioteki ofiar Y2H. Ponieważ HISAT2 obsługuje wielowątkowość, w polu Wątki wskaż liczbę procesów komputerowych, które mają być poświęcone programowi mapującemu.
Określ nazwę pliku wyjściowego, zalecana jest krótka, ale opisowa nazwa bez spacji i znaków specjalnych, ponieważ ta nazwa pliku będzie używana w całym procesie DEEPN. Za pomocą przycisku Otwórz katalog wyjściowy określ folder, w którym mają być wyprowadzane zmapowane pliki. Po wybraniu odpowiednich plików i parametrów użyj przycisku Dodaj do kolejki, aby dodać zadanie mapowania do kolejki zadań.
Po wprowadzeniu wszystkich zadań do kolejki zadań kliknij przycisk Uruchom kolejkę. Rozpocznij tę analizę od otwarcia oprogramowania DEEPN. W oknie głównym wybierz odpowiednie informacje z biblioteki zdobyczy z górnego pola wyboru.
Wybierz folder, do którego mogą trafić przetworzone pliki, klikając przycisk Folder roboczy i przechodząc do katalogu folderów. Po wybraniu folderu roboczego DEEPN utworzy trzy podfoldery o wskazanych nazwach. Aby analiza zakończyła się pomyślnie, należy upewnić się, że umieszczono poprawne pliki SAM w odpowiednich folderach i wiedzieć, które pliki mają zmapowane i niezmapowane odczyty.
W przypadku korzystania z plików sam zawierających zarówno zmapowane, jak i niezmapowane odczyty, takie jak te utworzone z domyślnymi ustawieniami programu MAPster, umieść je w folderze sam_files. Rozpocznij przetwarzanie, klikając przycisk Liczba genów plus Utwórz połączenie. Czas przetwarzania zależy od rozmiaru i liczby plików danych sekwencyjnych oraz szybkości przetwarzania używanego komputera.
Gdy DEEPN przetworzy dane, zostanie utworzony pełny zestaw folderów. Kolejnym krokiem jest wykonanie analizy w Stat Makerze. Otwórz Stat_Maker i kliknij przycisk Sprawdź instalację.
Jeśli Stat_Maker uruchomi się po raz pierwszy, automatycznie zainstaluje R, JAGS i Bioconductor, pobierając te zasoby z Internetu. Po wykryciu R, JAGS i Bioconductor Stat_Maker stanie się aktywny i umożliwi dalsze wprowadzanie danych przez użytkownika. Kliknij przycisk Wybierz folder, aby przejść do folderu roboczego przetworzonego przez DEEPN.
Stat_Maker automatycznie znajdzie i wyświetli listę plików do analizy statystycznej w oknie. Przeciągnij i upuść odpowiednie pliki z powyższego okna listy plików do okien plików poniżej dla każdego zestawu danych wektorów i przynęt oraz dla każdego warunków wzrostu, niewybranych i wybranych. Co ważne, wymaga Stat_Maker zduplikowanych zestawów danych dla samego pustego wektora, dwóch próbek niewybranych populacji i dwóch próbek wybranych.
Daje to oszacowanie zmienności w eksperymencie. Kliknij przycisk Uruchom. W zależności od szybkości komputera obliczenia zajmą od pięciu do 15 minut.
Wyniki z danych wyjściowych Stat_Maker są umieszczane w nowym podfolderze w głównym folderze roboczym o nazwie Stat_Maker Wyniki. Zapoznaj się z wynikami. Aby przejrzeć dane dotyczące każdego potencjalnego kandydata, otwórz oprogramowanie DEEPN, wybierz odpowiednie informacje o bibliotece zdobyczy, a następnie wybierz właściwy folder roboczy za pomocą folderu roboczego.
Kliknij przycisk Blast Query, aby załadować nowe okno. W górnym polu tekstowym wpisz nazwę genu lub numer GenBank NM, aby wybrać kandydata na gen, który Cię interesuje. Nazwa genu odpowiada nazwie podanej w pliku wyjściowym Stat Maker.
Wpisz Enter lub Return, który inicjuje pobieranie interesującego genu. Wybierz zestawy danych, które będą używane do analizy, korzystając z menu Wybierz zestaw danych. Zazwyczaj obejmują one tylko wektory i próbki przynęty hodowane w warunkach nieselektywnych oraz próbkę przynęty hodowaną w warunkach selekcji.
Początkowo ładowanie danych i nazwy genu może zająć trochę czasu za pomocą programu Blast Query, ale po załadowaniu zestawu danych będzie przebiegać znacznie szybciej. Blast_Query wyświetli punkty fuzji wzdłuż interesującej nas sekwencji oraz obfitość każdego punktu fuzji. Można to wyświetlić zarówno w formie tabeli za pomocą zakładki Wyniki, jak i w formacie graficznym za pomocą karty Wykres.
Aby wyeksportować te wyniki do pliku csv, kliknij przycisk Zapisz csv w prawym górnym rogu. W oknie DEEPN kliknij przycisk Odczyt głębokości w obszarze Analizuj dane. Po otwarciu okna Głębokość odczytu wpisz numer NM w górnym polu tekstowym.
Użyj menu rozwijanego, aby wybrać odpowiedni zestaw danych, który zawiera wzbogacony gen, który Cię interesuje. Użyj tabeli po lewej stronie i wyświetlacza graficznego po prawej, aby określić, ile odczytów znaleziono w danych, które odpowiadają interesującemu genowi. Program Stat Maker tworzy plik widoczny w programie Excel, który podsumowuje istotne informacje potrzebne do identyfikacji potencjalnych białek oddziałujących.
Pokazano również odpowiednią analizę, czy plazmidy odpowiadające kandydatowi na ofiarę zawierają właściwą otwartą ramkę odczytu. Blast Query ocenia każdy gen i porządkuje różne pozycje zgodnie z ich obfitością w zbiorze danych określonym ilościowo za pomocą ppm całkowitej liczby połączeń znalezionych w bazie danych. W tym przykładzie najliczniejszą pozycją, która jest w ORF i w ramce, jest pozycja 867, co wskazuje, że nukleotyd 867 sekwencji referencyjnej GenBank NCBI NM_019648 jest początkiem fragmentu zdobyczy.
Ta grafika przedstawia hipotetyczną sekwencję i sposób zaprojektowania pięciokrotnego oligo, aby uchwycić właściwą klatkę i punkt fuzji między domeną aktywacji Gal4 a interesującą sekwencją ofiary. To okno Głębokość odczytu pokazuje, ile sekwencji zostało znalezionych w danych, które odpowiadają pozycjom nukleotydów interesującej sekwencji. Po opanowaniu przetwarzanie danych można wykonać w ciągu 10 do 20 godzin, w większości przypadków bez nadzoru.
Badania przesiewowe DEEPN i odpowiadająca im analiza informatyczna utorują drogę badaczom z wielu dziedzin do badania sieci interakcji z białkiem będącym przedmiotem ich zainteresowania. Program MAPster został zaprojektowany w celu ułatwienia mapowania plików sekwencji z eksperymentów DEEPN. Zapewnia również przyjazną dla użytkownika metodę mapowania plików sekwencji w celu odniesienia DNA do różnych zastosowań, takich jak RNA-Seq lub ChIP-Seq.
Chociaż oprogramowanie DEEPN zostało stworzone specjalnie do przetwarzania danych wsadowych drożdży dwuhybrydowych, może być również używane do przetwarzania danych RNA-Seq. Program Stat Maker nie tylko przewiduje, które geny dają autentyczną interakcję drożdży z dwiema hybrydami, ale także zestawia szereg innych parametrów, takich jak odczytywanie informacji o ramce, co pozwala badaczom szybko filtrować wyniki kandydatów. Po zidentyfikowaniu potencjalnych białek oddziałujących ze sobą ważne jest, aby zweryfikować interakcje przy użyciu standardowych testów dwuhybrydowych drożdży, biochemicznych testów ściąganych lub powiązanych metod.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł omawia metodę analizy interaktomów białkowych poprzez głębokie sekwencjonowanie populacji drożdży wybranych na podstawie pozytywnych interakcji drożdży 2-hybrydowych. Podkreśla użycie przyjaznych dla użytkownika narzędzi bioinformatycznych, które upraszczają proces analizy dla badaczy bez rozległej znajomości bioinformatyki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Bioinformatyka
- Interakcje białkowe
- Biologia drożdży
Tło
- Interaktomy białkowe to złożone sieci interakcji białkowych.
- Tradycyjne narzędzia bioinformatyczne mogą być wyzwaniem dla nieekspertów.
- Poprawa dostępności do bioinformatyki może poprawić wyniki badań.
- Oprogramowanie MAPster zostało zaprojektowane, aby uprościć proces analizy.
Cel badania
- Dostarczyć metodę analizy interakcji białkowych w drożdżach.
- Opracować przyjazne dla użytkownika oprogramowanie do przetwarzania bioinformatycznego.
- Uczynić analizę interakcji białkowych dostępną dla szerszej grupy badaczy.
Stosowane metody
- Głębokie sekwencjonowanie populacji drożdży.
- Użycie oprogramowania MAPster do analizy danych.
- Implementacja interfejsu graficznego użytkownika dla łatwości użycia.
- Krok-po-kroku protokół instalacji i obsługi oprogramowania.
Główne wyniki
- Oprogramowanie upraszcza analizę interakcji białkowych.
- Badacze mogą łatwo nawigować po interfejsie bez rozległego szkolenia.
- Zwiększona dostępność prowadzi do bardziej efektywnych wyników badań.
- Potencjał dla szerszych zastosowań w biologii molekularnej.
Wnioski
- Przyjazne dla użytkownika narzędzia bioinformatyczne mogą demokratyzować badania.
- Oprogramowanie MAPster jest cennym zasobem do analizy interaktomów białkowych.
- Uczynienie bioinformatyki dostępną może napędzać innowacje w badaniach biologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables high-throughput identification of protein-protein interactions through yeast two-hybrid screens coupled with deep sequencing, providing quantitative enrichment data that supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The integrated bioinformatics workflow reduces reliance on specialized expertise, accelerating hit-to-lead progression by delivering reproducible, frame-resolved interaction maps. This approach enhances predictive confidence in target selection and supports scalable screening campaigns across therapeutic areas.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping transient and static protein interactions within native cellular contexts.
- Operational Value: Provides quantitative enrichment profiles that distinguish specific interactors from background noise, improving target confidence.
- Predictive Value: Supports functional target validation and pathway clarification, aiding in preclinical triage and risk-adjusted decision-making.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates detailed subdomain resolution of interacting proteins, informing epitope mapping and binding interface characterization.
- Operational Value: Standardizes prey library screening through automated read mapping and counting, ensuring reproducibility across batches.
- Scalability Value: Facilitates preparation of validated interaction datasets for downstream screening, enabling reuse in hit confirmation and lead optimization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maintains continuity from discovery through preclinical validation by delivering frame-corrected plasmid sequences for functional follow-up.
- Mechanistic De-risking: Filters candidates using reading frame and open reading frame analysis, reducing false positives before biochemical validation.
- Predictive Confidence: Enables prioritization of high-abundance, in-frame fusion points for downstream assays such as pull-downs or co-immunoprecipitation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target identification through interaction profiling and feeding into lead identification via validated interaction networks.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway elucidation by identifying enriched prey proteins under selection conditions.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative interaction data with duplicate sampling for variability estimation, enhancing screening robustness.
- Analytics: Provides statistical enrichment analysis and junction-level resolution, enabling comparison of interaction strength across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by validating reading frame integrity, ensuring cloned fragments express full-length functional domains.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, modular bioinformatics pipeline applicable to RNA-Seq and ChIP-Seq, increasing platform leverage.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through domain-resolution interaction mapping.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via automated read counting, statistical modeling, and frame analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early de-risking of targets through reliable interaction networks.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering quantifiable, reproducible interaction data for target ranking.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with yeast two-hybrid principles and plasmid library design.
- Needs computational infrastructure for sequence alignment (HISAT2), statistical processing (R/JAGS), and storage of FASTQ/SAM files.
- Demands standardized input formats and duplicate sampling (empty vector, non-selected, selected) for valid statistical inference.
- Requires adaptation of reference genome selection based on prey library origin to ensure accurate mapping.
- Limited by the need for orthogonal validation (e.g., biochemical assays) to confirm predicted interactions.
