Name: Izolacja, ekspansja i indukcja adipogenna komórek śródbłonka CD34+CD31+ z ludzkiej tkanki tłuszczowej i podskórnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek śródbłonka CD34+CD31+ z ludzkiej tkanki tłuszczowej i ich różnicowanie w adipocyty białe oraz beżowe. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów adipogenezy i remodelowania tkanki tłuszczowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Becky Marquez, koordynatorowi klinicznemu w Centrum Bariatrycznym Sentara, za jej pomoc w procesie badań przesiewowych pacjentów i wyrażanie zgody. Badania te były wspierane przez R15HL114062 Anca D. Dobrian.

Komisja Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej w Szkole Medycznej Wschodniej Wirginii zatwierdziła badania i pobieranie próbek ludzkiej tkanki tłuszczowej użytych w badaniu. Od pacjentów uzyskano świadomą pisemną zgodę.
1. Przygotowanie, mediów i instrumentów
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór buforowany wodorowęglanem Krebsa Ringera (KRBBS): 135 mM chlorku sodu, 5 mM chlorku potasu, 1 mM siarczanu magnezu, 0,4 mM dwuzasadowego fosforanu potasu, 5,5 mM glukozy, 1 mM adenozyny, 0,01% mieszaniny antybiotykowo-przeciwgrzybiczej (50 μg/ml penicyliny, 50 μg/ml streptomycyny, 30 μg/ml gentamycyny, 15 ng/ml amfoterycyny) i 10 mM HEPES (pH = 7,4). Roztwór ten jest przygotowywany za każdym razem na świeżo w celu pobrania tkanek i trawienia.</li>
	<li>Przygotuj świeży roztwór kolagenazy: 1 mg/ml kolagenazy typu 1 w KRBSS; przygotuj 3 ml/g tłuszczu. Przed trawieniem tkanek podgrzej roztwór kolagenazy w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Przygotuj bufor do izolacji komórek CD34: 2% płodowa surowica bydlęca (FBS) i 1 mM EDTA w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Przygotuj pożywkę adipogenezy: DMEM/F12, 5% FBS, 50 μg/ml penicyliny/streptomycyny, 1,25 μl/ml insuliny ludzkiej (5 μg/ml lub 144 mU/ml) i 0,36 μL/ml 2,8 mM rozyglitazonu (1 μM).</li>
	<li>Przygotować 0,3% roztwór podstawowy czerwieni olejowej (ORO) (wagowo-objętościowo), rozpuszczając 0,3 g ORO w 100 ml izopropanolu.</li>
</ol>
2. Izolacja frakcji naczyniowej zrębu tkanki tłuszczowej
UWAGA: Badanie obejmowało przekrojową kohortę chorobliwie otyłych osób z cukrzycą typu 2 (T2D) i bez cukrzycy, w wieku 18-65 lat, przechodzących operację bariatryczną w Sentara Metabolic and Weight Loss Surgery Center (Sentara Medical Group, Norfolk, VA). Kryteria wykluczenia obejmowały chorobę autoimmunologiczną, w tym cukrzycę typu 1, stany wymagające przewlekłego leczenia immunosupresyjnego, leki przeciwzapalne, tiazolinendiony, aktywne palenie tytoniu, przewlekłe lub ostre infekcje lub historię nowotworu złośliwego leczoną w ciągu ostatnich 12 miesięcy. T2D zdefiniowano jako stężenie glukozy w osoczu na czczo wynoszące 126 mg/dl lub większe, stężenie glukozy 200 mg/dl lub większe po 2-godzinnym teście tolerancji glukozy lub po zastosowaniu leków przeciwcukrzycowych.
<ol>
	<li>Pobrać ludzką tkankę tłuszczową (OM) i podskórną (SC) tkankę tłuszczową (AT) od ludzi poddawanych operacji bariatrycznej.</li>
	<li>Przechowywać OM i SC AT w oddzielnych fiolkach zawierających buforowany roztwór soli Hanka z 50 μg/ml penicyliny/streptomycyny w temperaturze pokojowej natychmiast po ekstrakcji tkanek.</li>
	<li>Ostrożnie oczyść i usuń zwłókniałe i kauteryzowane odcinki tkanki za pomocą nożyczek i pęsety z 70% etanolu, gdy próbka dotrze do laboratorium po ekstrakcji tkanki.</li>
	<li>Zważ tkankę tłuszczową i podziel ją na 5 g (lub mniej) porcji w celu wytrawienia kolagenazy.</li>
	<li>Drobno zmielić 5 g AT w 5 ml roztworu kolagenazy w fiolce scyntylacyjnej w temperaturze pokojowej, używając dwóch par nożyczek.</li>
	<li>Dodaj dodatkowe 10 ml roztworu kolagenazy do tkanki mielonej, aby uzyskać łącznie 15 ml.</li>
	<li>Próbki trawić przez 1 godzinę, w temperaturze 37 °C, w łaźni wodnej z ciągłym wstrząsaniem.</li>
	<li>Odetnij końcówkę strzykawki o pojemności 20 ml, aby uzyskać koniec.</li>
	<li>Wytnij kwadrat o wymiarach 9 cm x 9 cm z siatki 250 μm i wepchnij go do połowy do stożkowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą strzykawki z końcem.</li>
	<li>Wlej próbki do strzykawki o pojemności 20 ml z końcem i przefiltruj przez nylonową siatkę 250 μm do stożkowej rurki o pojemności 50 ml, aby oddzielić adipocyty i komórki naczyniowe zrębu od niestrawionej tkanki. 
	UWAGA: Nie używaj więcej niż 5 g AT na 50 ml stożkowej probówki, ponieważ siatka zostanie zatkana z powodu nadmiaru zwłókniałego niestrawionego materiału.</li>
	<li>Przepłukać fiolkę scyntylacyjną 10 ml KRBBS i przelać ją przez filtr w celu zebrania resztek komórek.</li>
	<li>Przefiltrowane próbki inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. 
	Uwaga: Ten krok jest ważny, aby adipocyty unosiły się na górze rurki, a niektóre komórki naczyniowe zrębu osiadły na dnie probówki.</li>
	<li>Użyj strzykawki o pojemności 20 ml i igły do pipetowania 20 G x 6 cali, aby usunąć warstwę frakcji zrębu naczyniowego i przenieść ją do czystej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dodać 10 ml KRBBS i pozostawić próbki na stole przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.12–2.14 dwukrotnie. 
	Uwaga: Te kroki zapewnią, że nie dojdzie do zanieczyszczenia komórek naczyniowych zrębu pływającymi adipocytami.</li>
	<li>Frakcje naczyniowe zrębu z obu magazynów należy przechowywać na lodzie w celu dalszego przetwarzania, zgodnie z opisem w poniższych krokach. 
	Uwaga: Nie pozostawiaj komórek na lodzie dłużej niż 1 godzinę, ponieważ może to mieć wpływ na żywotność komórek. Adipocyty można błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie w celu długotrwałego przechowywania lub wykorzystać na świeżo do eksperymentów.</li>
</ol>
3. Izolacja komórek śródbłonka tkanki tłuszczowej
<ol>
	<li>Wirować frakcje naczyniowe zrębu (SVF) w temperaturze 500 x g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wyjąć próbki z wirówki i ostrożnie wylać sklarowany nad osadem; zachować osad zawierający komórki SVF.</li>
	<li>Delikatnie zawiesić granulki komórek w 5 ml PBS. 
	UWAGA: Jeśli więcej niż 5 g zapasu AT zostało przetworzone na wiele podwielokrotności (patrz krok 2.4), połącz ze sobą granulki komórek.</li>
	<li>Wirować próbki w temperaturze 500 x g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant, ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS i policzyć komórki. 
	UWAGA: W tym przypadku do zliczania komórek użyto automatycznego licznika komórek. Żywotność komórek uzyskano przez zmieszanie 12 μl zawiesiny komórkowej z 12 μl roztworu pomarańczy akrydynowej/jodku propidyny (AO/PI) (patrz tabela materiałów). Średnia liczba komórek na gram AT dla każdego magazynu wynosi: a) OM Depot: 1,69 x 105 ± 4,51 x 104; (b) Zajezdnia SC: 1,24 x 105 ± 6,45 x 104. Rentowność ogniw z obu magazynów wynosiła >90%.</li>
	<li>Granulować próbki w temperaturze 500 x g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Protokół selekcji immunomagnetycznej CD34 (patrz tabela materiałów) został dostosowany do kroków 3.7–3.15.</li>
	<li>Zawiesić osad w 100 μl buforu izolacyjnego CD34. 
	UWAGA: Całkowita liczba komórek wymaga następujących objętości rehisencji: a) <2 x 107 komórek: zawiesić osad w 100 μl; b) 2 x 108–5 x 108 komórek: ponownie zawiesić osad w 1 ml. W krokach 3.9–3.16 objętości użytych odczynników zostały zmniejszone dla komórek <2 x 107.</li>
	<li>Dodać 10 μl koktajlu CD34 i inkubować próbkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 5 μl kulek magnetycznych i inkubować próbkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodaj 2,5 ml buforu izolacyjnego CD34 do każdej próbki i umieść próbki w magnesie na 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwróć magnes na 5 sekund, aby wylać bufor izolacyjny.</li>
	<li>Wyjmij próbki z magnesu i powtórz kroki 3.10 i 3.11 4x.</li>
	<li>Wyjmij probówkę z magnesu i dodaj 2 ml buforu izolacyjnego CD34.</li>
	<li>Granulować komórki w momencie 500 x g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osady komórek w 1 ml buforu izolacyjnego CD34 i policzyć komórki. 
	UWAGA: Tutaj średnia liczba komórek na gram AT wynosi: (a) OM Depot: 4,75 x 104 ± 3,36 x 104; b) Zajezdnia SC: 1,06 x 104 ± 9,53 x 103. Protokół CD31 z tworzywa sztucznego został dostosowany do kroków 3.16–3.34 (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Komórki osadu w ilości 500 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad w 250 μl buforu B i 250 μl buforu do przemywania .</li>
	<li>Dokładnie zawieś koraliki CD31, obracając rurkę wirowo.</li>
	<li>Dodać 20 μl kulek CD31. 
	UWAGA: Ze względu na całkowitą liczbę komórek >1 x 106, wolumin został przeskalowany w dół zgodnie z danymi wejściowymi producenta.</li>
	<li>Inkubować próbkę, kołysząc przez 30 minut, w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Podłącz sitko do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. 
	UWAGA: Większy otwór sitka musi znajdować się na górze.</li>
	<li>Przed rozdzieleniem komórek dodać 1 ml buforu do płukania, aby zrównoważyć sitko. Nanieść mieszaninę wytworzoną w kroku 3.16 na sitko.</li>
	<li>Przemyć sitko 5 ml buforu do przemywania okrężnymi ruchami, aby uzyskać całkowitą objętość 20 ml. Podłącz złącze do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i zamknij blokadę luer-lock.</li>
	<li>Podłącz sitko do złącza. Dodać 1 ml buforu do płukania wzdłuż ścianki sitka. Dodać 1 ml aktywowanego buforu D wzdłuż ścianki sitka. Delikatnie zamieszać próbkę i inkubować ją przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu do płukania. Oddziel komórki od kulek, pipetując w górę i w dół 10x. 
	UWAGA: Unikaj generowania pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Otwórz luer-lock i pozwól, aby odłączone komórki spłynęły do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Za każdym razem myj sitko 10x 1 ml buforu do mycia.</li>
	<li>Odrzucić łącznik i sitko i odwirować próbki o masie 300 x g przez 10 minut, w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad komórkowy w 2 ml kompletnej pożywki EGM-2 do hodowli. 
	Uwaga: Średnia liczba komórek na gram AT w tym momencie wynosi: (a) OM Depot: 5,92 x 103 ± 4,27 x 103; b) SC Depot: 4,12 x 103 ± 2,1 x 103. Rentowność ogniw z obu magazynów wyniosła ponad 90%.</li>
</ol>
4. Indukcja adipogenezy w izolowanych komórkach śródbłonka
<ol>
	<li>Hodować komórki na 6-dołkowych płytkach poddanych działaniu kultur tkankowych z kompletną pożywką EGM-2 w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Wymieniaj pożywkę co 3–4 dni, aż komórki osiągną 80–90% zbieżności. 
	UWAGA: Podwojenie populacji trwa od 2 do 3 dni.</li>
	<li>Rozwiń komórki, poszywając je na 100-milimetrowych szalkach Petriego i podziel komórki raz w stosunku 1:3. Na tym etapie komórki znajdują się w pasażu 2.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Wysiewaj około 100–200 000 komórek na 6-dołkowych płytkach, zapewniając zduplikowane dołki dla każdego magazynu i hoduj je w kompletnych pożywkach EGM-2 przez 2 dni.</li>
	<li>Odessać wszelkie podłoża wzrostowe i zastąpić je 2 ml DMEM/F12 z 5% FBS i 50 μg/ml penicyliny/streptomycyny dla komórek kontrolnych i zastąpić 2 ml pożywki adipogenezy (patrz krok 1.4) dla komórek poddanych zabiegowi.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze z 5% CO2 przez 13 dni, wymieniając odpowiednie podłoża co 3 do 4 dni. 
	UWAGA: Komórki zaczną gromadzić lipidy po 4 dniach leczenia.</li>
	<li>Przeprowadź barwienie ORO i czerwieni nilowej zgodnie z opublikowanymi metodami15-17.</li>
	<li>Aby wyizolować komórki do ekstrakcji RNA, usuń pożywkę z 6-dołkowych płytek indukcyjnych i umyj je 1 ml sterylnego PBS.</li>
	<li>Dodać 350 μl roztworu tiocyjanianu guanidu, fenolu i chloroformu (patrz tabela materiałów) do każdego dołka i inkubować go w temperaturze pokojowej przez 5–10 minut.</li>
	<li>Zeskrobać komórki z płytki za pomocą skrobaka do komórek i przenieść komórki do probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. 
	Uwaga: Próbki mogą być przechowywane w zamrażarce w temperaturze -80 °C w celu ekstrakcji RNA i dalszego przetwarzania w późniejszym terminie.</li>
	<li>Ekstrahować mRNA z próbek przy użyciu dostosowanego protokołu ekstrakcji RNA (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Przeprowadź reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-PCR), aby ocenić ekspresję genu za pomocą następujących sond: adiponektyny, UCP-1 i CIDEA (patrz tabela materiałów). 
	UWAGA: W tym przypadku procedury RT-PCR przeprowadzono przy użyciu następującego standardowego protokołu: denaturacja (95 °C; 15 s), wyżarzanie i wydłużanie (60 °C; 1 min) przez 40 cykli. Próbki, które wykazywały ekspresję genów o wartościach CT >35, uznano za niewykrywalne.</li>
</ol>

<ol><li>Tang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White+fat+progenitor+cells+reside+in+the+adipose+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature.</a> Science. 322 (5901), 583-586 (2008).</li>
<li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+adipogenic+niche+for+adipose+tissue+remodeling+and+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration.</a> Cell Metabolism. 18 (3), 355-367 (2013).</li>
<li>Min, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+%27brite%2Fbeige%27+adipocytes+develop+from+capillary+networks%2C+and+their+implantation+improves+metabolic+homeostasis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human 'brite/beige' adipocytes develop from capillary networks, and their implantation improves metabolic homeostasis in mice.</a> Nature Medicine. 22 (3), 312-318 (2016).</li>
<li>Gupta, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zfp423+expression+identifies+committed+preadipocytes+and+localizes+to+adipose+endothelial+and+perivascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells.</a> Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).</li>
<li>Tran, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+endothelium+of+the+adipose+tissue+gives+rise+to+both+white+and+brown+fat+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The vascular endothelium of the adipose tissue gives rise to both white and brown fat cells.</a> Cell Metabolism. 15 (2), 222-229 (2012).</li>
<li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li>
<li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+of+adipogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li>
<li>Macotela, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+differences+in+adipocyte+precursor+cells+from+different+white+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots.</a> Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).</li>
<li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+identification+of+bipotential+adipocyte+progenitors+recruited+by+beta3-adrenoceptor+activation+and+high-fat+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding.</a> Cell Metabolism. 15 (4), 480-491 (2012).</li>
<li>Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+diet-induced+obesity+in+mice+by+adipose+tissue+transformation+and+angiogenesis+using+targeted+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5552-5557 (2016).</li>
<li>Villaret, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+endothelial+cells+from+obese+human+subjects%3A+differences+among+depots+in+angiogenic%2C+metabolic%2C+and+inflammatory+gene+expression+and+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence.</a> Diabetes. 59 (11), 2755-2763 (2010).</li>
<li>Miranville, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+postnatal+neovascularization+by+human+adipose+tissue-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells.</a> Circulation. 110 (3), 349-355 (2004).</li>
<li>Sengenes, C., Lolmede, K., Zakaroff-Girard, A., Busse, R., Bouloumie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preadipocytes+in+the+human+subcutaneous+adipose+tissue+display+distinct+features+from+the+adult+mesenchymal+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Preadipocytes in the human subcutaneous adipose tissue display distinct features from the adult mesenchymal and hematopoietic stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 205 (1), 114-122 (2005).</li>
<li>Moller, D. E., Flier, J. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1881419">Insulin resistance--mechanisms, syndromes, and implications.</a> The New England Journal of Medicine. 325 (13), 938-948 (1991).</li>
<li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284 (5411), 143-147 (1999).</li>
<li>Novikoff, A. B., Novikoff, P. M., Rosen, O. M., Rubin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+relationships+in+cultured+3T3-L1+preadipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organelle relationships in cultured 3T3-L1 preadipocytes.</a> The Journal of Cell Biology. 87 (1), 180-196 (1980).</li>
<li>Satish, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+human+adipose-derived+stem+cells+during+in+vitro+differentiation+to+an+adipocyte+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medical+Genomics%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of human adipose-derived stem cells during in vitro differentiation to an adipocyte lineage.</a> BMC Medical Genomics. 8 (41), (2015).</li>
<li>Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+vascular+endothelial+cells+in+culture.+Growth+and+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis.</a> The Journal of Cell Biology. 60 (3), 673-684 (1974).</li>
<li>Burridge, K. A., Friedman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environment+and+vascular+bed+origin+influence+differences+in+endothelial+transcriptional+profiles+of+coronary+and+iliac+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299 (3), H837-H846 (2010).</li>
<li>Paruchuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pulmonary+valve+progenitor+cells+exhibit+endothelial%2Fmesenchymal+plasticity+in+response+to+vascular+endothelial+growth+factor-A+and+transforming+growth+factor-beta2%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2.</a> Circulation Research. 99 (8), 861-869 (2006).</li>
<li>Hewett, P. W., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microvessel+endothelial+cells%3A+isolation%2C+culture+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Development+Biology%22%5BJournal%5D)">Human microvessel endothelial cells: isolation, culture and characterization.</a> In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (11), 823-830 (1993).</li>
<li>Hewett, P. W., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lung+microvessel+endothelial+cells%3A+isolation%2C+culture%2C+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Human lung microvessel endothelial cells: isolation, culture, and characterization.</a> Microvascular Research. 46 (1), 89-102 (1993).</li>
<li>Hewett, P. W., Murray, J. C., Price, E. A., Watts, M. E., Woodcock, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+microvessel+endothelial+cells+from+human+mammary+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Development+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of microvessel endothelial cells from human mammary adipose tissue.</a> In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (4), 325-331 (1993).</li>
<li>Xiao, L., McCann, J. V., Dudley, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+expansion+of+tumor-specific+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture expansion of tumor-specific endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53072(2015).</li>
<li>Berry, R., Rodeheffer, M. S., Rosen, C. J., Horowitz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+residing+progenitors+%28adipocyte+lineage+progenitors+and+adipose+derived+stem+cells+%28ADSC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue residing progenitors (adipocyte lineage progenitors and adipose derived stem cells (ADSC).</a> Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 101-109 (2015).</li>
<li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+evaluation+of+endothelial+progenitor+cells+from+adipose+tissue+as+potential+angiogenic+cell+sources+for+bladder+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro evaluation of endothelial progenitor cells from adipose tissue as potential angiogenic cell sources for bladder angiogenesis.</a> PLoS One. 10 (2), e0117644(2015).</li>
<li>Curat, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+blood+monocytes+to+adipose+tissue-resident+macrophages%3A+induction+of+diapedesis+by+human+mature+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">From blood monocytes to adipose tissue-resident macrophages: induction of diapedesis by human mature adipocytes.</a> Diabetes. 53 (5), 1285-1292 (2004).</li>
<li>Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+evidence+for+CD34+as+a+common+marker+for+diverse+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors.</a> Stem Cells. 32 (6), 1380-1389 (2014).</li>
<li>Traktuev, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+population+of+multipotent+CD34-positive+adipose+stromal+cells+share+pericyte+and+mesenchymal+surface+markers%2C+reside+in+a+periendothelial+location%2C+and+stabilize+endothelial+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A population of multipotent CD34-positive adipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside in a periendothelial location, and stabilize endothelial networks.</a> Circulation Research. 102 (1), 77-85 (2008).</li>
<li>Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+of+adipose+tissues%3A+a+niche+of+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells of adipose tissues: a niche of adipogenesis.</a> Cell Cycle. 11 (15), 2765-2766 (2012).</li>
<li>Sengenes, C., Miranville, A., Lolmede, K., Curat, C. A., Bouloumie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endothelial+cells+in+inflamed+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">The role of endothelial cells in inflamed adipose tissue.</a> Journal of Internal Medicine. 262 (4), 415-421 (2007).</li>
<li>Ong, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+specific+cell-surface+markers+of+adipose-derived+stem+cells+from+subcutaneous+and+visceral+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of specific cell-surface markers of adipose-derived stem cells from subcutaneous and visceral fat depots.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).</li>
<li>Ong, W. K., Sugii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells%3A+fatty+potentials+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells: fatty potentials for therapy.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (6), 1083-1086 (2013).</li>
<li>Tchkonia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundance+of+two+human+preadipocyte+subtypes+with+distinct+capacities+for+replication%2C+adipogenesis%2C+and+apoptosis+varies+among+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinoloy+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Abundance of two human preadipocyte subtypes with distinct capacities for replication, adipogenesis, and apoptosis varies among fat depots.</a> American Journal of Physiology-Endocrinoloy and Metabolism. 288 (1), E267-E277 (2005).</li>
<li>van de Vyver, M., Andrag, E., Cockburn, I. L., Ferris, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazolidinedione-induced+lipid+droplet+formation+during+osteogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Thiazolidinedione-induced lipid droplet formation during osteogenic differentiation.</a> Journal of Endocrinology. 223 (2), 119-132 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Celem niniejszej pracy jest przedstawienie metodologii izolacji, ekspansji i indukcji adipogennej komórek śródbłonka CD34 + CD31 + z trzewnych i podskórnych magazynów ludzkiej tkanki tłuszczowej.
Opisano metodologie izolacji komórek śródbłonka z różnych łożysk naczyniowych gryzoni lub ludzi, które obejmują głównie techniki wykorzystujące przeciwciała CD31 znakowane fluorescencyjnie lub sprzężone z kulkami magnetycznymi 18,19,20,21,22,23</sup...

Ostatnie dowody pokazują, że zarówno u myszy, jak i u ludzi, podzbiór komórek rezydujących w unaczynieniu tkanki tłuszczowej może być zróżnicowany na białe lub beżowo-brązowe adipocyty1,2,3. Fenotyp takich komórek jest przedmiotem kontrowersji, z dowodami potwierdzającymi komórki śródbłonka, mięśnie gładkie/perycyty lub spektrum fenotypów pośrednich4,5,6,7. Celem opracowania tej metodyki było przetestowanie potencjału adipogennego komórek śródbłonka CD34+CD31+ wyizolowanych z różnych magazynów tłuszczu od otyłych ludzi. Inne badania w literaturze koncentrują się na potencjale adipogennym całkowitej frakcji naczyniowej zrębu lub znanych progenitorów adipocytów2,8,9. Ponieważ obecnie istniejące technologie mogą celować w komórki śródbłonka tkanki tłuszczowej w celu dostarczania leków10, zrozumienie potencjału takich komórek do ulegania indukcji adipogennej w kierunku białych lub beżowych adipocytów jest ważne dla przyszłych terapii celowanych.
Różne grupy zgłosiły kombinację markerów CD31 i CD34 jako substytutów do izolacji komórek śródbłonka z ludzkiej tkanki tłuszczowej11,12,13. Zazwyczaj izolację wykonuje się za pomocą dwóch kolejnych kroków i pozytywnej selekcji za pomocą kulek magnetycznych. W tym raporcie wykorzystano immunoseparację za pomocą kulek magnetycznych CD34+ w połączeniu z plastikowymi kulkami CD31. Stwierdziliśmy, że ta technika jest lepsza od sekwencyjnej immunoseparacji magnetycznej pod względem zachowania typowej morfologii śródbłonka kostki brukowej. Byliśmy również w stanie wygenerować wystarczającą ilość komórek potrzebnych do ekspansji i indukcji adipogennej, zaczynając już od 1-2 g tłuszczu. Biopsja małej próbki podskórnej tkanki tłuszczowej wystarcza do wytworzenia wymaganej ilości komórek do dalszych zastosowań. Ten aspekt jest potencjalnie ważny, szczególnie jeśli metoda ta będzie wykorzystywana do badań przesiewowych pod kątem reakcji na indukcję adipogenną u ludzi.
W przeciwieństwie do innych systemów opisywanych w literaturze, ta metoda wykorzystuje tylko dwa składniki do adipogennej indukcji komórek CD34+CD31+: agonistę PPARγ - rozyglitazon - oraz ludzką insulinę. Co ważne, ilość użytej insuliny mieści się w normalnym/wysokim zakresie krążącej insuliny poabsorpcyjnej u ludzi14. Stopień reakcji komórek in vitro na insulinę, mierzony za pomocą fosforylacji Akt, nie koreluje z ich zdolnością do reagowania na koktajl indukcyjny. Co ciekawe, przy użyciu tego koktajlu indukcyjnego i warunków eksperymentalnych uzyskano mieszankę białych i beżowo-brązowych komórek, jak określono na podstawie wielkości i liczby wewnątrzkomórkowych kropelek lipidów oraz ekspresji markerów molekularnych. Ten prosty i ekonomiczny protokół indukcji wraz z ilościową oceną fenotypu komórek odpowiadających (biały vs. beżowy) pozwala na badanie przesiewowe czynników, które mogą potencjalnie zmienić równowagę zróżnicowanych adipocytów beżowo-białych.
Ta metoda dostarcza również podejścia translacyjnego do zrozumienia podstawowych mechanizmów adipogenezy komórek progenitorowych śródbłonka naczyniowego w ludzkiej tkance tłuszczowej. Korzystając z tej specyficznej techniki izolacji/różnicowania, badacze mogą badać różne szlaki odpowiedzialne za adipogenezę w podzbiorze komórek śródbłonka naczyń krwionośnych z różnych magazynów tłuszczu u szczupłych i otyłych ludzi.

<table><tbody><tr><td> Duży sprzęt </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gabinet bezpieczeństwa biologicznego </td><td> Nuaire </td><td> nu-425-400 </td><td></td></tr><tr><td> Inkubator kultur komórkowych </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 800 DH </td><td></td></tr><tr><td> Kąpiel wodna </td><td> Forma Scientific </td><td> 2568 </td><td> Wytrząsarka wzajemna </td></tr><tr><td> RT-PCR Machine </td><td> BIO-RAD </td><td> CFX96-C1000 </td><td></td></tr><tr><td> Skrzynka do elektroforezy </td><td> BIO-RAD </td><td> Mini 3-komórkowa </td><td></td></tr><tr><td> Transblot Box </td><td> BIO-RAD </td><td> Mini komórka trans-Blot </td><td></td></tr><tr><td> Zasilanie do elektroforezy </td><td> BIO-RAD </td><td> PowerPac Basic </td><td></td></tr><tr><td> ELISA </td><td> Urządzenia molekularne </td><td> SpectraMax M5 </td><td></td></tr><tr><td> Blot Reader </td><td> LI-COR </td><td> Odyssey </td><td> Bliska podczerwień </td></tr><tr><td> Wirówka z chłodzeniem </td><td> Eppendorf </td><td> 5810 R </td><td></td></tr><tr><td> Wirówka stołowa </td><td> Eppendorf </td><td> MiniSpin Plus </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop fluorescencyjny </td><td> Olympus </td><td> BX50 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop odwrócony </td><td> Nikon </td><td> TMS </td><td></td></tr><tr><td> KRBSS Buffer </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Research Products International </td><td> H75030 </td><td></td></tr><tr><td> Wodorowęglan sodu </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 792519 </td><td></td></tr><tr><td> Chlorek wapnia dwuwodny </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7902 </td><td></td></tr><tr><td> Fosforan potasu monozasadowy </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5655 </td><td></td></tr><tr><td> Siarczan magnezu </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2643 </td><td></td></tr><tr><td> Chlorek sodu </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 746398 </td><td></td></tr><tr><td> Fosforan sodu jednozasadowy </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9638 </td><td></td></tr><tr><td> potas chlorek </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> Glukoza </td><td> Acros Organics </td><td> 410950010 </td><td></td></tr><tr><td> adenozyna </td><td> Acros Organics </td><td> 164040250 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina surowicy bydlęcej </td><td> GE Healthcare Bio-Sciences </td><td> SH30574.02 </td><td></td></tr><tr><td> Penicylina/Streptomycyna </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 15070063 </td><td></td></tr><tr><td> <silny>Trawienie tkankowe</silny> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 20 mL Strzykawka </td><td> Global Medical </td><td> 67-2020 </td><td></td></tr><tr><td> Siatka nylonowa, 250 i mikro; m </td><td> Sefar </td><td> 03-250/50 </td><td></td></tr><tr><td> Igły do pipetowania </td><td> Popper </td><td> 7934 </td><td></td></tr><tr><td> Drobne nożyczki </td><td> Narzędzia naukowe </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td> Kleszcze do tkanek </td><td> George Tiemann & Co </td><td> 160-20 </td><td></td></tr><tr><td> Kolagenaza, typ I </td><td> Worthington Biochemical </td><td> LS004196 </td><td></td></tr><tr><td> Petri, 100 mm </td><td> USA Scientific </td><td> 5666-4160 </td><td> TC poddane obróbce </td></tr><tr><td> Eppendorf, 1,5 ml </td><td> USA Scientific </td><td> 1615-5500 </td><td></td></tr><tr><td> Probówki stożkowe, 15 ml </td><td> Nest Scientific </td><td> 601052 </td><td></td></tr><tr><td> Probówki stożkowe, 50 ml </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td><td></td></tr><tr><td> Fiolki scyntylacyjne </td><td> Kimble </td><td> 74505-20 </td><td> Tissue Dicing </td></tr><tr><td> Izolacja komórek </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cellometer </td><td> Nexcelom </td><td> Auto 2000 </td><td></td></tr><tr><td> Slajdy wiolometryczne </td><td> Nexcelom </td><td> CHT4-SD100-002 </td><td></td></tr><tr><td> Plama żywotności celulometru </td><td> Nexcelom </td><td> CS2-0106-5mL </td><td> Acridine Orange/Prop jod idowy </td></tr><tr><td> Koraliki magnetyczne anty-CD34 </td><td> StemCell Technologies </td><td> 18056 </td><td> Kit </td></tr><tr><td> EasySep Magnet </td><td> StemCell Technologies </td><td> 18000 < </td><td></td></tr><tr><td> p>Plastikowe koraliki anty-CD31 </td><td> pluriSelect USA </td><td> 19-03100-10 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect 10x bufor do mycia </td><td> pluriSelect USA </td><td> 60-00080-10 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect Pierścień łącznika </td><td> pluriSelect USA </td><td> 41-50000-03 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect Detachment Buffer </td><td> pluriSelect USA </td><td> 60-00046-12 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect Bufor inkubacyjny </td><td> pluriSelect USA </td><td> 60-00060-12 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect S Sitko komórkowe </td><td> pluriSelect USA </td><td> 43-50030-03 </td><td></td></tr><tr><td> Hodowla komórkowa </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6-dołkowe płytki </td><td> USA Naukowe </td><td> CC7682-7506 </td><td> TC poddane obróbce </td></tr><tr><td> 4- Szkiełka z dobrze komorowymi </td><td> Corning Life Sciences </td><td> 354559 </td><td> Pokryte fibronektyną </td></tr><tr><td> 4-komorowe </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 154526PK </td><td> Szkło niepowlekane </td></tr><tr><td> Ludzkie komórki mikronaczyniowe tkanki tłuszczowej (HAMVEC) </td><td> Laboratoria Badawcze Sciencell </td><td> 7200 </td><td> Pierwotna linia komórkowa </td></tr><tr><td> Pożywka dla komórek śródbłonka (ECM) </td><td> Laboratoria Badawcze ScienCell </td><td> 1001 </td><td> Kompletny zestaw </td></tr><tr><td> DMEM/F12 Pożywka podstawowa </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 11320082 </td><td></td></tr><tr><td> Surowica bydlęca płodu (FBS) </td><td> Rocky Mountain Biologicals </td><td> FBS-BBT </td><td></td></tr><tr><td> Insulina </td><td> Lilly </td><td> U-100 </td><td> Humalog </td></tr><tr><td> Rosiglitazone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R2408 </td><td></td></tr><tr><td> Analiza komórkowa </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Oil Red O Dye </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O0625 </td><td> Przygotowany w izopropanolu </td></tr><tr><td> 96 płytkich dołkowych </td><td> USA Scientific </td><td> 1837-9600 </td><td></td></tr><tr><td> 96 płytki PCR </td><td> Genesee Scientific </td><td> 24-300 </td><td></td></tr><tr><td> Ekstrakcja RNA </td><td> Zymo Research </td><td> R2072 </td><td> Kit </td></tr><tr><td> cDNA Synteza </td><td> BIO-RAD </td><td> 1708841 </td><td> Supermix </td></tr><tr><td> JumpStart Polimeraza PCR </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9307-250UN </td><td> Gorący start, z buforem PCR N </td></tr><tr><td> Roztwór chlorku magnezu </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M8787-5ML </td><td> 3 mM końcowy w reakcji PCR </td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> Promega </td><td> U1515 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan AdipoQ </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> Hs00605917_m1 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan CIDEA </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> Hs00154455_m1 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan RPL27 </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> Hs03044961_g1 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan UCP1 </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> Hs00222453_m1 </td><td></td></tr><tr><td> Test BCA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> QPBCA-1KT </td><td> Zestaw </td></tr><tr><td> Bis-akrylamid </td><td> BIO-RAD </td><td> 1610146 </td><td> 40% roztwór podstawowy </td></tr><tr><td> Nadsiarczan amonu </td><td> BIO-RAD </td><td> 1610700 </td><td></td></tr><tr><td> TEMED </td><td> BIO-RAD </td><td> 1610800 </td><td></td><</tr>p <tr><td> >Tris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td> Glycine </td><td> BIO-RAD </td><td> 1610718 </td><td></td></tr><tr><td> Sodium Dodecal Sulfate </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L3771 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Fisher Scientific </td><td> S311-100 </td><td></td></tr><tr><td> Błękit bromofenolowy </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B8026 </td><td></td></tr><tr><td> Blot Membrana </td><td> EMD Milipore </td><td> IPFL00010 </td><td></td></tr><tr><td> metanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A452-SK4 </td><td></td></tr><tr><td> Odyssey Blocking Buffer, Tris </td><td> LI-COR </td><td> 927-50000 </td><td></td></tr><tr><td> Przeciwciało anty-AKT </td><td> Cell Signaling Technology </td><td> 2920S </td><td> Monoklonalne przeciwciało </td></tr><tr><td> Przeciwciało anty-pAKT </td><td> Technologia sygnalizacji komórkowej </td><td> 9271S </td><td> Królik poliklonalny </td></tr><tr><td> Przeciwciało anty-UCP1 </td><td> Abcam </td><td> <2p>ab10983 </td><td> Poliklonalne królicze przeciwciało poliklonalne </td></tr><tr><td> Przeciwciało przeciw mysim przeciwciałom IgG </td><td> LI-COR </td><td> 926-68070 </td><td> Kozioł poliklonalny, IRDye 680RD </td></tr><tr><td> Przeciwciało anty-królicze IgG </td><td> LI-COR </td><td> 926-32211 </td><td> 5Kozioł poliklonalny, IRDye 800CW </td></tr><tr><td> Przeciwciało przeciw króliczemu IgG </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 111-025-003 </td><td> Kozioł poliklonalny, TRITC </td></tr><tr><td> Bufor fosforanowy Saline </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 10010049 </td><td></td></tr><tr><td> 37% Roztwór formaldehydu </td><td> Mikroskopia elektronowa Sciences </td><td> 15686 </td><td> 4% roztwór do utrwalania komórek </td></tr><tr><td> Normalna surowica kozia </td><td> Vector Laboratories </td><td> S-1000 </td><td> 10% roztwór blokujący </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X-100 </td><td> 0. 1% roztwór przepuszczalny </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> D1306 </td><td></td></tr><tr><td> Calcein AM </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 65-0853-39 </td><td> Wizualizacja fluorescencyjna komórek </td></tr><tr><td> Matrigel Podstawna membrana membranowa </td><td> Corning Life Sciences </td><td> 356231 </td><td> Zmniejszony czynnik wzrostu </td></tr><tr><td> DiI oznaczony jako acetylowany LDL </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> L3484 </td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja, ekspansja i indukcja adipogenna komórek śródbłonka cd34+cd31+ z ludzkiej tkanki tłuszczowej i podskórnej

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Otyłości towarzyszy rozległa przebudowa tkanki tłuszczowej, głównie poprzez przerost adipocytów. Ekstremalny wzrost adipocytów powoduje słabą reakcję na insulinę, miejscowe niedotlenienie i stan zapalny. Stymulując różnicowanie funkcjonalnych białych adipocytów od progenitorów, można zapobiec radykalnemu przerostowi populacji adipocytów, a w konsekwencji poprawić zdrowie metaboliczne tkanki tłuszczowej wraz ze zmniejszeniem stanu zapalnego. Ponadto, stymulując różnicowanie beżowo-brązowych adipocytów, można zwiększyć całkowity wydatek energetyczny organizmu, co skutkuje utratą wagi. Takie podejście może zapobiec rozwojowi chorób współistniejących związanych z otyłością, takich jak cukrzyca typu 2 i choroby układu krążenia.
Ten artykuł opisuje izolację, ekspansję i różnicowanie białych i beżowych adipocytów z podzbioru ludzkich komórek śródbłonka tkanki tłuszczowej, które wykazują współekspresję markerów CD31 i CD34. Metoda jest stosunkowo tania i nie jest pracochłonna. Wymaga dostępu do ludzkiej tkanki tłuszczowej, a magazyn podskórny nadaje się do pobrania próbek. Na potrzeby tego protokołu podczas zabiegów chirurgii bariatrycznej pobierane są świeże próbki tkanki tłuszczowej od osób z chorobliwą otyłością [wskaźnik masy ciała (BMI)) >35]. Stosując sekwencyjną immunoseparację od zrębowej frakcji naczyniowej, wystarczająca ilość komórek jest wytwarzana z zaledwie 2-3 g tłuszczu. Komórki te mogą być namnażane w hodowli przez 10–14 dni, mogą być kriokonserwowane i zachowują swoje właściwości adipogenne przy pasażowaniu do pasażu 5–6. Komórki są traktowane przez 14 dni koktajlem adipogennym przy użyciu kombinacji insuliny ludzkiej i agonisty PPARγ-rozyglitazonu.
Ta metodologia może być wykorzystana do uzyskania eksperymentów potwierdzających słuszność koncepcji na temat mechanizmów molekularnych, które napędzają reakcje adipogenne w komórkach śródbłonka tłuszczowego, lub do badania przesiewowego nowych leków, które mogą wzmocnić odpowiedź adipogenną skierowaną na różnicowanie białych lub beżowo-brązowych adipocytów. Wykorzystując małe biopsje podskórne, metodologia ta może być wykorzystana do odsiewania osób, które nie odpowiedziały na leczenie, do badań klinicznych mających na celu stymulację beżowo-brązowych i białych adipocytów w leczeniu otyłości i chorób współistniejących.

Nasz protokół ma na celu zapewnienie podejścia in vitro do określenia potencjału adipogennego komórek naczyniowych CD34+CD31+ pochodzących z różnych depot tkanki tłuszczowej człowieka. Uproszczony schemat blokowy przedstawiono na Rysunku 1A. Pierwszy krok, polegający na selekcji pozytywnej komórek wykazujących ekspresję CD34, skutkuje uzyskaniem &gt; 95% komórek CD34+ w populacji świeżo wyizolowanych komórek (Rysunek 1A)...

Odróżnienie białych i beżowych adipocytów od komórek progenitorowych naczyń tkanki tłuszczowej niesie ze sobą potencjał do metabolicznej poprawy otyłości. Opisujemy protokoły izolacji komórek śródbłonka CD34 + CD31 + z ludzkiego tłuszczu oraz późniejszej ekspansji i różnicowania in vitro do białych i beżowych adipocytów. Omówiono kilka dalszych zastosowań.

Izolacja, ekspansja i indukcja adipogenna komórek śródbłonka CD34+CD31+ z ludzkiej tkanki tłuszczowej i podskórnej

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie otyłości, takie jak identyfikacja kluczowych czynników i mechanizmów, które uniemożliwiają silną odpowiedź adipogenną podczas przebudowy tkanki tłuszczowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia izolację komórek śródbłonka CD34+CD31+z ludzkiej tkanki tłuszczowej, zaczynając od niewielkich ilości tkanki. Po raz pierwszy pomysł na tę metodę wpadł nam do głowy, gdy chcieliśmy zidentyfikować komórki w ludzkim układzie tłuszczowym, które reagują na stymulację adipogenną.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy izolacji komórek są trudne do przećwiczenia ze względu na często ograniczony dostęp do świeżej ludzkiej tkanki tłuszczowej. Zbierz ludzką tkankę tłuszczową i podskórną od ludzi poddawanych operacji bariatrycznej. Natychmiast po ekstrakcji tkanek należy przechowywać ludzką tkankę tłuszczową i podskórną tkankę tłuszczową w oddzielnych fiolkach zawierających buforowany roztwór soli Hanka z 50 mikrogramami na mililitr streptomycyny penicyliny w temperaturze pokojowej.Gdy próbka dotrze do laboratorium po ekstrakcji tkanki, ostrożnie oczyść i usuń zwłókniałe i kauteryzowane odcinki tkanki za pomocą nożyczek i pęsety z 70% etanolem. Zważ tkankę tłuszczową i podziel ją na pięć gramowych porcji w celu wytrawienia kolagenazy. Użyj dwóch par nożyczek, aby drobno zmielić pięć gramów tkanki tłuszczowej w pięciu mililitrach roztworu kolagenazy w fiolce scyntylacyjnej w temperaturze pokojowej.Dodaj dodatkowe 10 mililitrów roztworu kolagenazy do tkanki mielonej, co daje łącznie 15 mililitrów. Próbki trawić przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej z ciągłym wstrząsaniem. Po roztrawieniu wlej próbki do 20-mililitrowej strzykawki z końcem.Przefiltruj próbkę przez nylonową siatkę o grubości 250 mikronów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów, aby oddzielić adipocyty i komórki naczyniowe zrębu od niestrawionej tkanki. Przepłukać fiolkę scyntylacyjną 10 mililitrami KRBBS i przelać popłuczynę przez filtr w celu zebrania pozostałych komórek przed inkubacją przefiltrowanych próbek przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie użyj strzykawki o pojemności 20 mililitrów i igły do pipetowania o wymiarach 20 na sześć cali, aby usunąć warstwę frakcji zrębu naczyniowego i przenieść ją do czystej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.Dodać 10 mililitrów KRBBS i pozostawić próbki na stole przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Frakcje naczyniowe zrębu z obu magazynów należy przechowywać na lodzie w celu dalszego przetwarzania. Wiruj frakcje naczyniowe zrębu pod ciśnieniem 500 razy G przez pięć minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.Wyjąć próbki z wirówki i ostrożnie wylać supernatant, pozostawiając osad zawierający komórki frakcji zrębu naczyniowego. Delikatnie ponownie zawiesić granulki komórek w pięciu mililitrach PBS. Po ponownym odwirowaniu próbek usuń supernatant, ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze PBS i policz komórki.Osadzać próbki po raz trzeci i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach buforu izolacyjnego CD34. Dodać 10 mikrolitrów koktajlu CD34 i inkubować próbkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj pięć mikrolitrów kulek magnetycznych i inkubuj próbkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Następnie dodaj 2,5 mililitra buforu izolacyjnego CD34 do każdej próbki i umieść próbki w magnesie na pięć minut w temperaturze pokojowej. Odwróć magnes na pięć sekund, aby wylać bufor izolacyjny. Po czterokrotnym powtórzeniu tego procesu wyjmij rurkę z magnesu i dodaj dwa mililitry buforu izolacyjnego CD34.Po kolejnym odwirowaniu ponownie zawiesić granulki komórek CD34 + w jednym mililitrze bufora izolacyjnego CD34 i policzyć komórki. Ponownie zagnieździć komórki i ponownie zawiesić osad w 250 mikrolitrach buforu B i 250 mikrolitrach buforu do mycia. Następnie dokładnie ponownie zawiesić kulki CD31 poprzez wirowanie probówki, a następnie dodać 20 mikrolitrów kulek CD31 do ponownie zawieszonej osadki komórkowej i inkubować próbkę z kołysaniem przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Przed rozdzieleniem komórek dodaj jeden mililitr buforu do płukania, aby zrównoważyć sitko. Następnie przygotowaną mieszaninę ponownie zawieszonych komórek w kulkach CD31 nanieść na sitko. Umyj sitko pięcioma mililitrami buforu do płukania okrężnymi ruchami, aby uzyskać łączną objętość 20 mililitrów.Przymocuj złącze do sterylnej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów i zamknij zamek leur. Po przymocowaniu sitka do łącznika należy dodać jeden mililitr buforu płuczącego wzdłuż ścianki sitka, a następnie dodać jeden mililitr aktywowanego buforu D wzdłuż ścianki sitka. Delikatnie zamieszać próbkę i inkubować ją przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Następnie dodaj jeden mililitr buforu do płukania i oddziel komórki od kulek, pipetując w górę iw dół 10 razy. Otwórz zamek leur i pozwól, aby odłączone komórki spłynęły do 50-mililitrowej stożkowej rurki. Umyj sitko 10 razy jednym mililitrem buforu do mycia za każdym razem.Odrzucić łącznik i sitko, a następnie odwirować próbki o stężeniu 300 razy G przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Na koniec ponownie zawiesić osad komórkowy w dwóch mililitrach kompletnego podłoża EGM2 do hodowli. Hoduj komórki na sześciodołkowych płytkach poddanych działaniu kultur tkankowych z kompletną pożywką EGM2 w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Wymieniaj pożywkę co trzy do czterech dni, aż komórki osiągną 80 do 90% zbieżności. Następnie wysiewa się około 100 do 200 tysięcy komórek na sześciodołkowe płytki, zapewniając zduplikowane dołki dla każdego magazynu, i hoduje je w kompletnych pożywkach EGM2 przez dwa dni. Po dwóch dniach odessać wszelkie podłoża wzrostowe.Zastąp pożywkę dwoma mililitrami pożywki DMEM/F-12 z 5% FBS i 50 mikrogramami na mililitr streptomycyny penicyliny dla komórek kontrolnych. W przypadku komórek leczonych należy zastąpić pożywkę dwoma mililitrami pożywki adipogenezy. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla przez 13 dni, wymieniając odpowiednie pożywki co trzy do czterech dni.Przedstawiono reprezentatywne wyniki przedstawiające typową śródbłonkową morfologię komórek CD34 + CD31 + po dwóch pasażach w hodowli. Wykazano również zdolność komórek do tworzenia kanalików podczas hodowli w Matrigel, zgodnie z oczekiwaniami. Równomierny wychwyt znakowanego fluorescencyjnie acetylowanego LDL wskazuje na obecność jednorodnej populacji komórek o tożsamości śródbłonka.Pokazano tutaj barwienie obojętnymi kropelkami lipidów w komórkach CD34 + CD31 + czerwonymi kroplami po 13 dniach indukcji adipogennej. Wykazano reprezentatywne odpowiedzi komórek z magazynów tłuszczowych i podskórnych trzech różnych osób badanych, aby zilustrować dużą zmienność w odpowiedzi na indukcję tkanki tłuszczowej między magazynami tłuszczu tego samego dawcy i między dawcami. Ten obraz przedstawia fluorescencyjne wewnątrzkomórkowe barwienie lipidów w komórkach CD34 + C31 + po indukcji adipogennej przez 13 dni.Obraz przedstawia komórki z lipidami jednopunktowymi, lipidami wieloplamkowymi i bez akumulacji lipidów. Real time PCR pokazuje ekspresję markera adipocytów adiponektyny oraz brązowo-beżowych markerów CIDEA i UCP-1. Wyniki te potwierdzają, że komórki po indukcji adipogennej wyrażają markery molekularne zgodne z mieszanym biało-beżowym fenotypem adipocytów.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu pięciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tego zabiegu należy pamiętać o użyciu świeżej ludzkiej tkanki tłuszczowej, która została pobrana i nie przechowywana dłużej niż dwie godziny. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak cytometria przepływowa, immunohistochemia i RT-PCR, w celu identyfikacji określonych podzbiorów reagujących komórek i ekspresji dojrzałych markerów adipocytów, które można wykorzystać do identyfikacji beżowo-brązowego fenotypu adipocytów.Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się otyłością do zbadania roli tkanki tłuszczowej, komórek naczyniowych i adipogenezy u ludzi. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować, hodować i rozszerzać komórki CD34 + 31 +. Nie zapominaj, że praca z tkankami ludzkimi może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak przepisy dotyczące bezpieczeństwa biologicznego.Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię chorób współistniejących związanych z otyłością, takich jak insulinooporność, ponieważ identyfikuje ona odpowiedź komórek adipogennych na potencjalną interwencję terapeutyczną.

isolation-expansion-adipogenic-induction-cd34-cd31-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje technikę izolowania i hodowli fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych pochodzących z grzebienia nerwowego (ADSC) z mysiej tkanki tłuszczowej łuku okołoaortalnego. Po wyizolowaniu NCADSC są wykrywane, sortowane za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, a następnie hodowane na płytce, co sprzyja proliferacji komórek.

Izolowanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej myszy okołoortowej

Niejednorodność transkrypcyjna w ludzkich komórkach zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej może być zdefiniowana na poziomie pojedynczej komórki za pomocą markerów powierzchni komórki i genów osteogennych.  Opisujemy protokół wykorzystujący cytometrię przepływową do izolacji subpopulacji komórek o zwiększonym potencjale osteogennym, który może być wykorzystany do poprawy rekonstrukcji szkieletu twarzoczaszki.

Izolacja i wzbogacenie ludzkich komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej w celu zwiększenia osteogenezy

Tutaj przedstawiamy metodę izolacji populacji komórek progenitorowych adipocytów (APC) z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej (PVAT) za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MCS). Metoda ta pozwala na zwiększoną izolację APC na gram tkanki tłuszczowej w porównaniu z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją (FACS).

Ekspansja i indukcja adipogenezy progenitorów adipocytów z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej izolowanej przez magnetyczne sortowanie komórek aktywowanych

Ten protokół opisuje techniczne podejście do izolowania subpopulacji komórek zrębu adipogennych i włóknisto-zapalnych z mysich magazynów białej tkanki tłuszczowej (WAT) w jamie brzusznej poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją lub separację kulek immunomagnetycznych.

Izolacja adipogennych i włóknisto-zapalnych subpopulacji komórek zrębu z mysich wewnątrzbrzusznych magazynów tłuszczu

Prezentujemy prostą metodę izolowania wysoce żywotnych komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej z najądrzy myszy za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją.

Preparat komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej tkanki tłuszczowej najądrza myszy

Ten protokół zapewnia efektywną metodę trawienia kolagenazy do izolacji żywotnych adipocytów i komórek frakcji naczyniowej zrębu - SVF z ludzkiego tłuszczu trzewnego w jednym procesie, w tym metodologię uzyskiwania wysokiej jakości RNA z adipocytów i fenotypyfikację makrofagów SVF poprzez barwienie wielu markerów związanych z błoną do analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja żywotnych adipocytów i frakcji naczyniowej zrębu z ludzkiej trzewnej tkanki tłuszczowej nadającej się do analizy RNA i fenotypowania makrofagów

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę preparacji mysich magazynów tłuszczu oraz izolacji i trawienia odpowiednich tętnic w celu uwolnienia, a następnie zidentyfikowania populacji komórek śródbłonka. Świeżo wyizolowane komórki wykorzystywane w dalszych zastosowaniach przyczynią się do lepszego zrozumienia biologii komórek naczyniowych i mechanizmów dysfunkcji naczyń krwionośnych.

Izolacja i identyfikacja komórek śródbłonka naczyń krwionośnych z różnych magazynów tłuszczu do dalszych zastosowań

Ten protokół opisuje metodologię izolowania i identyfikacji mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (MSC) od szczurów Sprague Dawley.

Izolacja i identyfikacja mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej szczurów Sprague Dawley

Tutaj opisujemy izolację, hodowlę i indukcję adipogenną preadipocytów pochodzących z frakcji naczyniowej zrębu z mysiej tkanki tłuszczowej okołoaortalnej, co pozwala na badanie funkcji okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej i jej związku z komórkami naczyniowymi.

Izolacja, hodowla i indukcja adipogenna preadipocytów pochodzących z frakcji zrębu naczyniowego z mysiej tkanki tłuszczowej okołooortalnej

Tkanka tłuszczowa jest doskonałym źródłem mezenchymalnych komórek macierzystych. Tutaj przedstawiamy krok po kroku ekstrakcję, hodowlę i charakterystykę komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) z tkanki tłuszczowej najądrza szwajcarskich myszy.

Izolacja, ekspansja in vitro i charakterystyka mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej najądrza myszy

Rozmiar i kruchość dojrzałych adipocytów ograniczyły dostępne techniki i narzędzia do ich badania i izolacji. W tym miejscu opisano protokół izolacji dojrzałych mysich adipocytów, który można łatwo dostosować do różnych magazynów tłuszczowych i diety myszy.

Izolacja i hodowla pierwotnych mysich adipocytów od myszy chudych i otyłych

Poznaj metodę izolacji komórek śródbłonka CD34+CD31+ z ludzkiej tkanki tłuszczowej i ich różnicowanie w adipocyty białe oraz beżowe. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów adipogenezy i remodelowania tkanki tłuszczowej.

Izolacja, ekspansja i indukcja adipogenna komórek śródbłonka CD34+CD31+ z ludzkiej tkanki tłuszczowej i podskórnej

Przeglądaj więcej filmów