Izolacja, ekspansja i indukcja adipogenna komórek śródbłonka CD34+CD31+ z ludzkiej tkanki tłuszczowej i podskórnej

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie otyłości, takie jak identyfikacja kluczowych czynników i mechanizmów, które uniemożliwiają silną odpowiedź adipogenną podczas przebudowy tkanki tłuszczowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia izolację komórek śródbłonka CD34+CD31+z ludzkiej tkanki tłuszczowej, zaczynając od niewielkich ilości tkanki. Po raz pierwszy pomysł na tę metodę wpadł nam do głowy, gdy chcieliśmy zidentyfikować komórki w ludzkim układzie tłuszczowym, które reagują na stymulację adipogenną.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy izolacji komórek są trudne do przećwiczenia ze względu na często ograniczony dostęp do świeżej ludzkiej tkanki tłuszczowej. Zbierz ludzką tkankę tłuszczową i podskórną od ludzi poddawanych operacji bariatrycznej. Natychmiast po ekstrakcji tkanek należy przechowywać ludzką tkankę tłuszczową i podskórną tkankę tłuszczową w oddzielnych fiolkach zawierających buforowany roztwór soli Hanka z 50 mikrogramami na mililitr streptomycyny penicyliny w temperaturze pokojowej.

Gdy próbka dotrze do laboratorium po ekstrakcji tkanki, ostrożnie oczyść i usuń zwłókniałe i kauteryzowane odcinki tkanki za pomocą nożyczek i pęsety z 70% etanolem. Zważ tkankę tłuszczową i podziel ją na pięć gramowych porcji w celu wytrawienia kolagenazy. Użyj dwóch par nożyczek, aby drobno zmielić pięć gramów tkanki tłuszczowej w pięciu mililitrach roztworu kolagenazy w fiolce scyntylacyjnej w temperaturze pokojowej.

Dodaj dodatkowe 10 mililitrów roztworu kolagenazy do tkanki mielonej, co daje łącznie 15 mililitrów. Próbki trawić przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej z ciągłym wstrząsaniem. Po roztrawieniu wlej próbki do 20-mililitrowej strzykawki z końcem.

Przefiltruj próbkę przez nylonową siatkę o grubości 250 mikronów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów, aby oddzielić adipocyty i komórki naczyniowe zrębu od niestrawionej tkanki. Przepłukać fiolkę scyntylacyjną 10 mililitrami KRBBS i przelać popłuczynę przez filtr w celu zebrania pozostałych komórek przed inkubacją przefiltrowanych próbek przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie użyj strzykawki o pojemności 20 mililitrów i igły do pipetowania o wymiarach 20 na sześć cali, aby usunąć warstwę frakcji zrębu naczyniowego i przenieść ją do czystej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.

Dodać 10 mililitrów KRBBS i pozostawić próbki na stole przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Frakcje naczyniowe zrębu z obu magazynów należy przechowywać na lodzie w celu dalszego przetwarzania. Wiruj frakcje naczyniowe zrębu pod ciśnieniem 500 razy G przez pięć minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Wyjąć próbki z wirówki i ostrożnie wylać supernatant, pozostawiając osad zawierający komórki frakcji zrębu naczyniowego. Delikatnie ponownie zawiesić granulki komórek w pięciu mililitrach PBS. Po ponownym odwirowaniu próbek usuń supernatant, ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze PBS i policz komórki.

Osadzać próbki po raz trzeci i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach buforu izolacyjnego CD34. Dodać 10 mikrolitrów koktajlu CD34 i inkubować próbkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj pięć mikrolitrów kulek magnetycznych i inkubuj próbkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie dodaj 2,5 mililitra buforu izolacyjnego CD34 do każdej próbki i umieść próbki w magnesie na pięć minut w temperaturze pokojowej. Odwróć magnes na pięć sekund, aby wylać bufor izolacyjny. Po czterokrotnym powtórzeniu tego procesu wyjmij rurkę z magnesu i dodaj dwa mililitry buforu izolacyjnego CD34.

Po kolejnym odwirowaniu ponownie zawiesić granulki komórek CD34 + w jednym mililitrze bufora izolacyjnego CD34 i policzyć komórki. Ponownie zagnieździć komórki i ponownie zawiesić osad w 250 mikrolitrach buforu B i 250 mikrolitrach buforu do mycia. Następnie dokładnie ponownie zawiesić kulki CD31 poprzez wirowanie probówki, a następnie dodać 20 mikrolitrów kulek CD31 do ponownie zawieszonej osadki komórkowej i inkubować próbkę z kołysaniem przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Przed rozdzieleniem komórek dodaj jeden mililitr buforu do płukania, aby zrównoważyć sitko. Następnie przygotowaną mieszaninę ponownie zawieszonych komórek w kulkach CD31 nanieść na sitko. Umyj sitko pięcioma mililitrami buforu do płukania okrężnymi ruchami, aby uzyskać łączną objętość 20 mililitrów.

Przymocuj złącze do sterylnej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów i zamknij zamek leur. Po przymocowaniu sitka do łącznika należy dodać jeden mililitr buforu płuczącego wzdłuż ścianki sitka, a następnie dodać jeden mililitr aktywowanego buforu D wzdłuż ścianki sitka. Delikatnie zamieszać próbkę i inkubować ją przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie dodaj jeden mililitr buforu do płukania i oddziel komórki od kulek, pipetując w górę iw dół 10 razy. Otwórz zamek leur i pozwól, aby odłączone komórki spłynęły do 50-mililitrowej stożkowej rurki. Umyj sitko 10 razy jednym mililitrem buforu do mycia za każdym razem.

Odrzucić łącznik i sitko, a następnie odwirować próbki o stężeniu 300 razy G przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Na koniec ponownie zawiesić osad komórkowy w dwóch mililitrach kompletnego podłoża EGM2 do hodowli. Hoduj komórki na sześciodołkowych płytkach poddanych działaniu kultur tkankowych z kompletną pożywką EGM2 w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Wymieniaj pożywkę co trzy do czterech dni, aż komórki osiągną 80 do 90% zbieżności. Następnie wysiewa się około 100 do 200 tysięcy komórek na sześciodołkowe płytki, zapewniając zduplikowane dołki dla każdego magazynu, i hoduje je w kompletnych pożywkach EGM2 przez dwa dni. Po dwóch dniach odessać wszelkie podłoża wzrostowe.

Zastąp pożywkę dwoma mililitrami pożywki DMEM/F-12 z 5% FBS i 50 mikrogramami na mililitr streptomycyny penicyliny dla komórek kontrolnych. W przypadku komórek leczonych należy zastąpić pożywkę dwoma mililitrami pożywki adipogenezy. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla przez 13 dni, wymieniając odpowiednie pożywki co trzy do czterech dni.

Przedstawiono reprezentatywne wyniki przedstawiające typową śródbłonkową morfologię komórek CD34 + CD31 + po dwóch pasażach w hodowli. Wykazano również zdolność komórek do tworzenia kanalików podczas hodowli w Matrigel, zgodnie z oczekiwaniami. Równomierny wychwyt znakowanego fluorescencyjnie acetylowanego LDL wskazuje na obecność jednorodnej populacji komórek o tożsamości śródbłonka.

Pokazano tutaj barwienie obojętnymi kropelkami lipidów w komórkach CD34 + CD31 + czerwonymi kroplami po 13 dniach indukcji adipogennej. Wykazano reprezentatywne odpowiedzi komórek z magazynów tłuszczowych i podskórnych trzech różnych osób badanych, aby zilustrować dużą zmienność w odpowiedzi na indukcję tkanki tłuszczowej między magazynami tłuszczu tego samego dawcy i między dawcami. Ten obraz przedstawia fluorescencyjne wewnątrzkomórkowe barwienie lipidów w komórkach CD34 + C31 + po indukcji adipogennej przez 13 dni.

Obraz przedstawia komórki z lipidami jednopunktowymi, lipidami wieloplamkowymi i bez akumulacji lipidów. Real time PCR pokazuje ekspresję markera adipocytów adiponektyny oraz brązowo-beżowych markerów CIDEA i UCP-1. Wyniki te potwierdzają, że komórki po indukcji adipogennej wyrażają markery molekularne zgodne z mieszanym biało-beżowym fenotypem adipocytów.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu pięciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tego zabiegu należy pamiętać o użyciu świeżej ludzkiej tkanki tłuszczowej, która została pobrana i nie przechowywana dłużej niż dwie godziny. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak cytometria przepływowa, immunohistochemia i RT-PCR, w celu identyfikacji określonych podzbiorów reagujących komórek i ekspresji dojrzałych markerów adipocytów, które można wykorzystać do identyfikacji beżowo-brązowego fenotypu adipocytów.

Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się otyłością do zbadania roli tkanki tłuszczowej, komórek naczyniowych i adipogenezy u ludzi. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować, hodować i rozszerzać komórki CD34 + 31 +. Nie zapominaj, że praca z tkankami ludzkimi może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak przepisy dotyczące bezpieczeństwa biologicznego.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię chorób współistniejących związanych z otyłością, takich jak insulinooporność, ponieważ identyfikuje ona odpowiedź komórek adipogennych na potencjalną interwencję terapeutyczną.