Małoskalowe testy kolorymetryczne wewnątrzkomórkowego mleczanu i pirogronianu u nicienia Caenorhabditis elegans

Badania te mogą pomóc odpowiedzieć na wszelkie pytania w ich dziedzinie biochemii, liczenia i metodologii, takie jak analiza praw rozwojowych nicieni. Główną zaletą tej techniki jest wytrącanie białek podczas ekstradukcji i picia oraz homogenizacja robaków. Rozpocznij ten eksperyment od wyhodowania szczepu E.coli OP50 w 300 mililitrach płynnego podłoża bulionowego LB w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.

Przechowuj udany OP50 w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odpipetować dwa mililitry hodowanego OP50 na co najmniej trzech wcześniej przygotowanych płytkach agarowych NGM lub pożywki do wzrostu nicieni i rozprowadzić, ręcznie obracając płytkę. Inkubuj płytki w temperaturze pokojowej przez noc, aby utworzyć cienką warstwę OP50.

Następnie za pomocą sterylnej wykałaczki wybierz kawałek agaru z płytki z robakami, aby dodać co najmniej 100 robaków do każdej płytki OP50 NGM. Hoduj co najmniej trzy płytki z robakami w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aż robaki osiągną stadium dorosłe, co zostanie potwierdzone pod mikroskopem stereoskopowym. Zlokalizuj grawitacyjne hermafrodyty wypełnione jajami za pomocą mikroskopu stereoskopowego.

Po dodaniu pięciu mililitrów buforu S do płytek, użyj pipety Pasteura, aby przenieść robaki ze wszystkich trzech płytek do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Umyj robaki trzy razy, dodając 15 mililitrów buforu S, a następnie odwiruj w temperaturze 300 razy G w temperaturze pokojowej przez 30 sekund. Jeśli objętość buforu S przekracza pięć mililitrów, po odwirowaniu należy usunąć nadmiar buforu.

Aby zapewnić pomyślną egzonizację i izolację jaj luzem, rozpuść robaki w 0,5 mililitra alkalicznego roztworu podchloranu. Wymieszać przez odwrócenie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut. Wirować z prędkością 1 400 obr./min przez 30 sekund, aby usunąć roztwór.

Użyj 15 mililitrów bufora S do umycia granulek jaj. Po odwirowaniu należy usunąć supernatant i powtórzyć to płukanie co najmniej trzy razy. Po ostatnim praniu zawieszamy osad w pięciu do sześciu mililitrach buforu S, bez E. coli i inkubujemy jaja przez noc w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aby je wykluć i osiągnąć synchroniczną hodowlę H larw w stadium L1.

Odpipetować 10 mikrolitrów buforu S zawierającego robaki L1 na trzech szkiełkach nakrywkowych. Policz larwy pod mikroskopem stereoskopowym i oblicz średnią, aby określić przybliżoną liczbę larw w stadium L1. Na koniec przenieś larwy w stadium L1 na pięć płytek agarowych NGM z OP50 i hoduj je w temperaturze 20 stopni Celsjusza aż do stadium młodego dorosłego osobnika, podczas którego następuje samozapłodnienie i składa się kilka jaj.

Obserwuj robaki każdego dnia pod mikroskopem, a następnie zbieraj młode dorosłe lub pięciodniowe robaki. Aby wybrać tylko żywe robaki, dodaj robaki zawieszone w trzech do czterech mililitrach buforu S do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Następnie dodaj równą objętość lodowatej 60% sacharozy i wymieszaj.

Odwirować probówkę w temperaturze 1 500 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 sekund. Następnie za pomocą pipety Pasteura ostrożnie odsuń robaki od ścianki probówki, a następnie usuń pływające robaki do świeżej probówki. Napełnij probówkę buforem S, aby umyć robaki i odwirować w temperaturze 1500 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez 30 sekund.

Wyjmij bufor i powtórz pranie jeszcze dwa razy. Po trzecim płukaniu ostrożnie usuń supernatant, uważając, aby nie usunąć żadnych robaków, i użyj końcówki pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, aby zmierzyć mokrą objętość umytych robaków. W celu wytrącenia białka użyj pipety Pasteura, aby dodać umyte robaki do równej objętości lodowatego 10% kwasu trichlorooctowego w homogenizatorze umieszczonym na lodzie.

Homogenizacja za pomocą 40 uderzeń pasel z obrotem, do 1 300 obr./min. Do sonikacji homogenatu należy użyć homogenizatora ultradźwiękowego z 20% cyklem pracy. Za pomocą pipety Pasteura przenieś homogenat do 1,5 mililitrowej probówki umieszczonej na lodzie.

Po przeniesieniu homogenatu do mikroprobówki wirówkowej, odwirować w temperaturze 8 000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut w celu jego sklarowania. Przenieść sklarowany osad do świeżej probówki, dodać cztery molowe roztwory chlorku potasu i inkubować na lodzie przez 20 minut, aby go zneutralizować. Następnie odwiruj go w temperaturze 8 000 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut.

Przenieść supernatant do świeżej probówki i przechowywać w temperaturze 80 stopni Celsjusza do czasu, gdy będzie potrzebny do dalszych badań. Aby zmierzyć stężenie mleczanu, należy użyć zestawu do testów kolorymetrycznych w celu przeprowadzenia powtórnych analiz dla badanych próbek. Dodaj 10 mikrolitrów badanych próbek do każdego dołka 96-dołkowej płytki, a następnie dodaj bufor do oznaczania mleczanu do każdej próbki, aby dostosować objętość do 15 mikrolitrów.

Rozcieńczyć 100-milimolowy wzorzec L+mleczan buforem do oznaczania mleczanu do jednego milimola. Następnie do serii studzienek dodaj zero, dwa, cztery, sześć, osiem i 10 mikrolitrów rozcieńczonego wzorca L+Lactate. Dodaj 50 mikrolitrów mieszanki reakcyjnej do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem przez co najmniej 30 minut, aby rozwinął się kolor.

Na koniec użyj czytnika mikropłytek, aby zmierzyć absorbancję każdej studzienki przy 570 nanometrach. Odjąć absorbancję kontrolnej mieszaniny tła od absorbancji mieszaniny reakcyjnej. Następnie wykreślić krzywą wzorcową mleczanu i obliczyć stężenia mleczanu na podstawie krzywej, mnożąc każde stężenie przez 2,25.

Użyj zestawu do testów kolorymetrycznych, aby zmierzyć stężenie pirogronianu w badanych próbkach i przeprowadzić badania dwustronne. Dodaj 10 mikrolitrów badanych próbek do różnych dołków 96-dołkowej płytki i dodaj 90 mikrolitrów odczynnika roboczego do każdej próbki. Inkubować pod przykryciem przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie umieść płytkę w czytniku mikropłytek, aby zmierzyć chłonność każdej studzienki przy 570 nanometrach. Wykreślić krzywą wzorcową pirogronianu i obliczyć stężenia pirogronianu na podstawie krzywej wzorcowej, mnożąc każde stężenie przez 2,25. I wreszcie, aby zmierzyć stężenie białka w badanych próbkach, użyj zestawu do testów kolorymetrycznych, jak opisano w protokole tekstowym.

Po wytrąceniu białek można zastosować testy kolorymetryczne do ilościowego oznaczania stężeń mleczanu i pirogronianu. Eksperyment ten pokazuje dokładność testów kolorymetrycznych w przeciwieństwie do poprzednich doniesień w C.Elegans. Co więcej, testy te są wystarczająco czułe, aby mierzyć stężenia mleczanu i pirogronianu nawet w próbkach na małą skalę w krótkim czasie.

Aby dokładnie wykryć mleczan i pirogronian w C.elegans, kluczowe jest przeprowadzenie wytrącania białek podczas homogenizacji robaków. Wykryta ilość mleczanu i pirogronianu jest wyższa, gdy próbki są wytrącane białkiem podczas homogenizacji, w porównaniu z nienaruszoną frakcją cytozolową lub po homogenizacji, gdy w ogóle nie wykryto mleczanu ani pirogronianu.