Name: Małoskalowe testy kolorymetryczne wewnątrzkomórkowego mleczanu i pirogronianu u nicienia Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Poznaj małoskalowe testy kolorymetryczne mleczanu i pirogronianu u nicienia Caenorhabditis elegans. Ta metoda z precypitacją białek poprawia dokładność ilościowego oznaczania metabolitów w badaniach biochemicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była finansowana przez Specjalny Grant Badawczy od Uniwersytetu Daito Bunka dla Sumino Yanase.

1. Zsynchronizowana kultura C. elegans
<ol>
	<li>Przed wysiewem należy wyhodować szczep Escherichia coli (E. coli) OP50 przez noc w temperaturze 37 °C w 300 ml płynnego podłoża bulionowego Luria-Bertani (LB). Przechowywać kulturę OP50 w temperaturze -4 °C.
	<ol>
		<li>Aby przygotować płynną pożywkę bulionową LB, użyj 10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g NaCl i 1,5 ml 1 N NaOH i dodaj do 1 l z wodą dejonizowaną. Autoklaw. 
		UWAGA: Szczepy OP50 i C. elegans są dostępne w Caenorhabditis Genetics Center (University of Minnesota, St. Paul, MN, USA).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zrobić agar z pożywką do wzrostu nicieni (NGM), użyj 3 g NaCl, 2,5 g peptonu, 17 g agaru i 975 ml wody dejonizowanej. Autoklaw. Schłodzić do temperatury 55 °C, a następnie sterylnie dodać kolejno 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 5 mg/ml cholesterolu w EtOH i 25 ml 1 M fosforanu potasu o pH 6,0 na 90-milimetrowych szalkach Petriego.
	<ol>
		<li>Dla 1 M fosforanu potasu o pH 6,0 użyj 108,3 g KH2PO4 i 46,6 g K2HPO4 i dodaj wodę dejonizowaną do 1 L. Autoclave6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozprowadź 1-2 ml kultury OP50 na płytkach agarowych NGM. Aby uzyskać cienką warstwę OP50, inkubuj płytki przez noc w temperaturze pokojowej przed dodaniem jakichkolwiek nicieni. 
	UWAGA: Płytki agarowe NGM zaszczepione OP50 można przechowywać w temperaturze pokojowej przez 2-3 tygodnie.</li>
	<li>Dodać co najmniej 100 robaków na płytkę agarową NGM z OP50 i hodować w temperaturze 20 °C aż do osiągnięcia wieku dorosłego. Wymagane są co najmniej trzy płytki.</li>
	<li>Aby zebrać jaja w macicy, przenieś grawitacyjne hermafrodyty z trzech płytek agarowych NGM, z których każda zawiera 5 ml buforu S w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i umyj robaki 3 razy 15 ml buforu S za pomocą wirowania przy 300 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>Aby zrobić bufor S, użyj 5,9 g NaCl i 50 ml 1 M fosforanu potasu o pH 6,0, dodaj do 1 l z wodą dejonizowaną. Autoclave6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpuść robaki w alkalicznym roztworze podchlorynu do aksenizacji i izolacji jaj luzem (0,5 ml świeżego wybielacza lub odpowiednik: 5-6% podchlorynu sodu, 0,1 ml 10 M NaOH, około 4,5 ml buforu S)6, i odstaw roztwór na 10-15 minut w temperaturze pokojowej z mieszaniem przez odwrócenie. 
	UWAGA: W ciągu 15 minut dorosłe robaki powinny się rozpuścić, pozostawiając mętny roztwór jaj uwolniony z ich tusz (uwolnione jaja należy potwierdzić za pomocą mikroskopu stereoskopowego). Zamiast 0,1 ml 10 N NaOH można również użyć 0,2 ml 5 N NaOH.</li>
	<li>Po potraktowaniu podchlorynem przemyć granulki jaj 3 razy 15 ml buforu S i ponownie zawiesić w 5-6 ml buforu S. Wylęgać uwolnione jaja podczas nocnej inkubacji w temperaturze 20 °C w buforze S bez E. coli w celu przeprowadzenia synchronicznej z wiekiem hodowli larw w stadium L1.</li>
	<li>Aby określić przybliżoną liczbę larw w stadium L1, należy policzyć robaki za pomocą mikroskopu stereoskopowego w 10 μl buforu S po ponownym zawieszeniu larw co najmniej 3 razy i obliczyć średnią. Następnie przenieść larwy w stadium L1 na pięć płytek agarowych NGM z OP50 (1 500-3 000 robaków na płytkę za pomocą 90-milimetrowej szalki Petriego) i hodować w temperaturze 20 °C, aż osiągną stadium młodego dorosłego osobnika, kiedy rozpoczyna się samozapłodnienie i składa się kilka jaj (zwykle po 3 dniach).</li>
</ol>
2. Ekstrakcja frakcji komórkowej z C. elegans
<ol>
	<li>Zbierz robaki w stadium młodego dorosłego (5-dniowe zwierzęta) z pięciu płytek agarowych NGM z buforem S (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A).
	<ol>
		<li>Aby wybrać tylko żywe robaki przy użyciu metody sacharozy6 do flotacji na 30% (w/v) sacharozy, wymieszaj robaki zawieszone w 3-4 ml buforu S z równą objętością lodowatej sacharozy 60% (w/v) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Obracać probówkę o masie 1 500 x g przez 15 s w temperaturze 4 °C i usunąć pływające robaki do świeżej probówki, odsuwając je od ścianki probówki za pomocą pipety Pasteura.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przemyć robaki 3 razy buforem S przez odwirowanie w temperaturze 1 500 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C. Sprawdź mokrą objętość umytych robaków po odwirowaniu za pomocą końcówki do mikropipet o pojemności 1 000 μl (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Dodaj umyte robaki do równej objętości lodowatego 10% (w/v) kwasu trichlorooctowego (TCA; końcowe stężenie 5%) w celu wytrącenia białka (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C). Zamiast TCA można zastosować kwas nadchlorowy (PCA) lub kwas metafosforowy.</li>
	<li>Homogenizuj robaki ze środkiem strącającym za pomocą 40 uderzeń tłuczka w homogenizatorze teflonowym (młynek do tkanek Potter-Elvehjem) z obrotem do 1,300 obr./min na lodzie.</li>
	<li>Przenieś homogenat do świeżej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety Pasteura i poddaj sonikacji za pomocą homogenizatora ultradźwiękowego przez 3 minuty (3 razy po 1 minutę) z 20% cyklem pracy na lodzie.</li>
	<li>Klarować homogenat przez odwirowanie przy 8 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zneutralizować supernatanty za pomocą 4 M KOH (0,25 objętości do 10% TCA) przez 20 minut na lodzie i odwirować przy 8 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Supernatant (jako próbka badana) może być przechowywany w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia następujących testów.</li>
</ol>
3. Test mleczanowy za pomocą zestawu do testów kolorymetrycznych
<ol>
	<li>Zmierzyć stężenie mleczanu w badanych próbkach za pomocą zestawu do oznaczania kolorymetrycznego (tabela materiałów). Przeprowadzić badania dwustronne dla próbek testowych. Dodać 5 lub 10 μl badanych próbek do 96-dołkowej płytki i dostosować objętość do 50 μl na basenik za pomocą buforu do oznaczania mleczanów dostarczonego z zestawem.</li>
	<li>W przypadku krzywej wzorcowej mleczanu rozcieńczyć 100 mM wzorca L(+)-mleczanu do 1 mM buforem do oznaczania mleczanu. Dodaj 0, 2, 4, 6, 8 i 10 μL wzorca mleczanu 1 mM L(+)-mleczanu, który jest dostarczony z zestawem, do szeregu studzienek.</li>
	<li>Dodać 50 μl mieszaniny reakcyjnej (zawierającej 46:2:2 buforu do oznaczania mleczanu, mieszaniny enzymów mleczanowych i sondy mleczanowej w DMSO, bezwodnej; wszystkie odczynniki są dostarczane z zestawem) lub mieszanki kontrolnej tła (zawierającej 48:2 buforu do oznaczania mleczanu i sondy mleczanowej) do każdej studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30-60 minut, podczas gdy próbki są chronione przed światłem.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję każdej studzienki przy długości fali 570 nm za pomocą czytnika mikropłytek i odjąć absorbancję mieszaniny kontrolnej tła od absorbancji mieszaniny reakcyjnej.</li>
	<li>Wykreślić krzywą wzorcową mleczanu. Obliczyć stężenia mleczanu w badanych próbkach na podstawie wzorcowej krzywej mleczanu.</li>
</ol>
4. Oznaczanie pirogronianu za pomocą zestawu do testów kolorymetrycznych
<ol>
	<li>Zmierzyć stężenie pirogronianu w supernatantach (próbkach testowych) za pomocą zestawu do oznaczania kolorymetrycznego (tabela materiałów). Przeprowadzić badania dwustronne dla próbek testowych. Dodać 10 μl badanych próbek i 90 μl odczynnika roboczego (zawierającego 94:1 mieszaniny enzymów i odczynnika barwnikowego, które są dostarczone z zestawem) do 96-dołkowej płytki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, podczas gdy próbki są chronione przed światłem.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję każdej studzienki przy długości fali 570 nm za pomocą czytnika mikropłytek.</li>
	<li>Wykreślić krzywą standardową pirogronianu. Obliczyć stężenia pirogronianu w badanych próbkach na podstawie krzywej wzorcowej pirogronianu.</li>
</ol>
5. Test białka do normalizacji z zawartością białka
<ol>
	<li>Zmierzyć stężenie białka w supernatantach (próbkach testowych) za pomocą zestawu do oznaczania kolorymetrycznego (tabela materiałów). Jednak ten krok nie ogranicza się do zestawu testowego, a do pomiaru stężenia białka można zastosować inne podejścia.</li>
	<li>Znormalizować wartości stężeń mleczanu i pirogronianu w badanych próbkach, stosując każde całkowite stężenie białka. 
	Uwaga: Stężenie białka w badanych próbkach jest wystarczająco wykrywane nawet po wytrąceniu białka i jest wykorzystywane do etapu normalizacji między próbkami.</li>
</ol>

<ol><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13298683">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li>
<li>Matoba, S., et al. <a target="_blank" href="http://science.sciencemag.org/content/312/5780/1650.full">p53 regulates mitochondrial respiration.</a> Science. 312, 1650-1653 (2006).</li>
<li>Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+p53%2FCEP-1+is+associated+with+lifespan+extension+through+an+age-related+imbalance+in+the+energy+metabolism+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans.</a> Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).</li>
<li>Page, A. P., Johnstone, I. L. The C. elegans. Research Community. The cuticle. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPage%2C+AP+%22WormBook%22">WormBook</a>. , (2007).</li>
<li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+the+worm%3A+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).</li>
<li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. <a target="_blank" href="https://www.elsevier.com/books/caenorhibditus-elegans-modern-biological-analysis-of-an-organism/epstein/978-0-12-564149-4">Methods in Cell Biology, Volume 48, Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism</a>. Epstein, H. F., Shakes, D. C. , Academic Press, Inc. 3-29 (1995).</li>
<li>Senoo-Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defect+in+the+cytochrome+b+large+subunit+in+complex+II+causes+both+superoxide+anion+overproduction+and+abnormal+energy+metabolism+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A defect in the cytochrome b large subunit in complex II causes both superoxide anion overproduction and abnormal energy metabolism in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 41553-41558 (2001).</li>
<li>Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+metabolic+signature+for+long+life+in+the+Caenorhabditis+elegans+Mit+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants.</a> Aging Cell. 12, 130-138 (2013).</li>
<li>Marbach, E. P., Weil, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+enzymatic+measurement+of+blood+lactate+and+pyruvate%3A+Use+and+significance+of+metaphosphoric+acid+as+a+common+precipitant%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant.</a> Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).</li>
<li>Mishur, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+metabolites+extend+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial metabolites extend lifespan.</a> Aging Cell. 15, 336-348 (2016).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W przypadku korzystania z tych zestawów do testów kolorymetrycznych najbardziej krytycznym etapem ekstrakcji próbki w celu dokładnego wykrycia mleczanu komórkowego i pirogronianu u C. elegans jest proces wytrącania białek podczas homogenizacji (ryc. 1). Nie jest bezwzględnie konieczne stosowanie homogenizatora teflonowego, ponieważ inne homogenizatory (np. młynki do tkanek odbijanych i stożkowych lub młynki perełkowe) są również przystosowane do ekstrakcji robaków na małą s...

Stężenia mleczanu i pirogronianu są powszechnie uważane za produkty pośrednie metabolizmu energetycznego i są związane ze stanami glikolizy, cyklu kwasu trikarboksylowego (TCA) i łańcucha transportu elektronów w komórkach organizmów tlenowych. Szereg reakcji w glikolizie utlenia glukozę do pirogronianu, który leży na skrzyżowaniu metabolicznym i może zostać przekształcony w węglowodany poprzez glukoneogenezę, do kwasów tłuszczowych i metabolizmu energetycznego przez acetylo-CoA oraz do aminokwasu alaniny. Cykl TCA zachodzi w obecności wystarczającej ilości rozpuszczonego tlenu i ma zasadnicze znaczenie dla konwersji glukozy w energię. Szczególnie zmiana metabolizmu wtórnego jest interesującym zjawiskiem, w którym glikoliza jest wykorzystywana głównie do produkcji energii, a tlenowe oddychanie mitochondrialne, które obejmuje cykl TCA i łańcuch transportu elektronów, jest regulowane w dół w komórkach raka ssaków1,2. Wykazaliśmy niedawno, że poziom mleczanu i wynikający z niego stosunek mleczanu do pirogronianu (L/P) zmniejszyły się podczas starzenia się w organizmie modelowym Caenorhabditis elegans (C. elegans). Podobnie, odkryliśmy, że ortolog-1 supresora nowotworów ssaków p53 u C. elegans odgrywa ważną rolę w związanych z wiekiem zmianach metabolizmu energetycznego poprzez aktywację jego celów transkrypcyjnych3.
W testach biologicznych, takich jak pomiar stężeń mleczanu i pirogronianu w komórkach, czułość, dokładność, wielkość próbki i czas inkubacji zestawów do testów kolorymetrycznych/fluorymetrycznych uległy znacznej poprawie. Dzięki innowacjom technologicznym jesteśmy teraz w stanie analizować różne metabolity i metabolity pośrednie bez hodowli C. elegans na dużą skalę, co jest trudne ze względu na jego niewielkie rozmiary. Ogólnie rzecz biorąc, czułość testu kolorymetrycznego jest o rząd wielkości mniejsza niż w przypadku testu fluorymetrycznego; Jednak podejście kolorymetryczne jest bardziej odpowiednie w przypadku wspólnych laboratoriów. Co więcej, technika ekstrakcji obejmująca homogenizację i wytrącanie białek ma kluczowe znaczenie dla ilościowego oznaczania stężeń mleczanu i pirogronianu w komórkach C. elegans, ponieważ nicienie te są zamknięte w egzoszkielecie zwanym naskórkiem, w przeciwieństwie do linii komórkowych hodowanych przez ssaki4,5. W tym miejscu opisujemy protokół analizy stężeń mleczanu i pirogronianu przy użyciu komercyjnych zestawów do testów kolorymetrycznych, w tym końcówek do ekstrakcji próbki z C. elegans.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do oznaczania kolorymetrycznego/fluorymetrycznego mleczanu&nbsp;</td><td>BioVision</td><td>#K607-100</td><td>testów kolorymetrycznych/fluorymetrycznych 100; Przechowywać w temperaturze -20oC</td></tr><tr><td>EnzyChrom Pyruvate Assay Kit</td><td>BioAssay Systems</td><td>#EPYR-100</td><td>testów kolorymetrycznych/fluorometrycznych 100; Przechowywać w temperaturze -20oC</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>#23225</td><td>test kolorymetryczny; przechowywać w &nbsp; temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>Kwas Trichlorooctowy</td><td>Wako Pure Chemical</td><td>#207-04955</td><td>przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Homogenizator teflonowy&nbsp;</td><td>Iwaki/Pyrex</td><td>#358034 (Wheaton)</td><td>Zamiast Iwaki/Pyrex, dostępne przez Wheaton</td></tr></tbody></table>

małoskalowe testy kolorymetryczne wewnątrzkomórkowego mleczanu i pirogronianu u nicienia caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Mleczan i pirogronian są kluczowymi produktami pośrednimi wewnątrzkomórkowych szlaków metabolicznych energii. Monitorowanie stosunku mleczanu do pirogronianu w komórkach pomaga określić, czy istnieje nierównowaga w metabolizmie energetycznym związanym z wiekiem między mitochondrialną fosforylacją oksydacyjną a glikolizą tlenową. W tym miejscu pokazujemy wykorzystanie komercyjnych zestawów do testów kolorymetrycznych dla mleczanu i pirogronianu w organizmie modelowym C. elegans. Ostatnio czułość i dokładność zestawów do testów kolorymetrycznych/fluorymetrycznych uległa znacznej poprawie dzięki badaniom i rozwojowi prowadzonym przez producentów odczynników. Ulepszone odczynniki umożliwiły stosowanie testów na małą skalę z 96-dołkową płytką w C. elegans. Ogólnie rzecz biorąc, test fluorymetryczny ma lepszą czułość niż test kolorymetryczny; Jednak podejście kolorymetryczne jest bardziej odpowiednie do stosowania w zwykłych laboratoriach. Inną ważną kwestią w tych testach do oznaczania ilościowego jest wytrącanie białek w homogenizowanych próbkach C. elegans. W naszej metodzie wytrącania białek do przygotowania próbki stosuje się popularne środki strącające (np. kwas trichlorooctowy, kwas nadchlorowy i kwas metafosforowy). Próbkę testową bez białka przygotowuje się przez bezpośrednie dodanie zimnego środka strącającego (końcowe stężenie 5%) podczas homogenizacji.

Wykorzystując testy kolorymetryczne do ilościowego oznaczenia stężeń mleczanu i pirogronianu, wykazaliśmy dokładność tych metod w porównaniu z wcześniejszymi doniesieniami dotyczącymi C. elegans7,8. W tym przypadku proces wytrącania białek podczas ekstrakcji próbek był najważniejszym etapem pozwalającym na uzyskanie dokładnych wartości. Do wytrącania białek w celu przygotowania próbek testowych można zastosować powszechni...

Opisujemy zmodyfikowaną ekstrakcję na małą skalę i testy kolorymetryczne mleczanu i pirogronianu u nicieni C. elegans. W przypadku korzystania z komercyjnych zestawów testowych ważny jest techniczny rozwój ich czułości i dokładności. Wytrącanie białek podczas ekstrakcji jest najbardziej krytycznym etapem ilościowego oznaczania metabolitów wewnątrzkomórkowych.

Małoskalowe testy kolorymetryczne wewnątrzkomórkowego mleczanu i pirogronianu u nicienia Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Badania te mogą pomóc odpowiedzieć na wszelkie pytania w ich dziedzinie biochemii, liczenia i metodologii, takie jak analiza praw rozwojowych nicieni. Główną zaletą tej techniki jest wytrącanie białek podczas ekstradukcji i picia oraz homogenizacja robaków. Rozpocznij ten eksperyment od wyhodowania szczepu E.coli OP50 w 300 mililitrach płynnego podłoża bulionowego LB w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.Przechowuj udany OP50 w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odpipetować dwa mililitry hodowanego OP50 na co najmniej trzech wcześniej przygotowanych płytkach agarowych NGM lub pożywki do wzrostu nicieni i rozprowadzić, ręcznie obracając płytkę. Inkubuj płytki w temperaturze pokojowej przez noc, aby utworzyć cienką warstwę OP50.Następnie za pomocą sterylnej wykałaczki wybierz kawałek agaru z płytki z robakami, aby dodać co najmniej 100 robaków do każdej płytki OP50 NGM. Hoduj co najmniej trzy płytki z robakami w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aż robaki osiągną stadium dorosłe, co zostanie potwierdzone pod mikroskopem stereoskopowym. Zlokalizuj grawitacyjne hermafrodyty wypełnione jajami za pomocą mikroskopu stereoskopowego.Po dodaniu pięciu mililitrów buforu S do płytek, użyj pipety Pasteura, aby przenieść robaki ze wszystkich trzech płytek do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Umyj robaki trzy razy, dodając 15 mililitrów buforu S, a następnie odwiruj w temperaturze 300 razy G w temperaturze pokojowej przez 30 sekund. Jeśli objętość buforu S przekracza pięć mililitrów, po odwirowaniu należy usunąć nadmiar buforu.Aby zapewnić pomyślną egzonizację i izolację jaj luzem, rozpuść robaki w 0,5 mililitra alkalicznego roztworu podchloranu. Wymieszać przez odwrócenie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut. Wirować z prędkością 1 400 obr./min przez 30 sekund, aby usunąć roztwór.Użyj 15 mililitrów bufora S do umycia granulek jaj. Po odwirowaniu należy usunąć supernatant i powtórzyć to płukanie co najmniej trzy razy. Po ostatnim praniu zawieszamy osad w pięciu do sześciu mililitrach buforu S, bez E. coli i inkubujemy jaja przez noc w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aby je wykluć i osiągnąć synchroniczną hodowlę H larw w stadium L1.Odpipetować 10 mikrolitrów buforu S zawierającego robaki L1 na trzech szkiełkach nakrywkowych. Policz larwy pod mikroskopem stereoskopowym i oblicz średnią, aby określić przybliżoną liczbę larw w stadium L1. Na koniec przenieś larwy w stadium L1 na pięć płytek agarowych NGM z OP50 i hoduj je w temperaturze 20 stopni Celsjusza aż do stadium młodego dorosłego osobnika, podczas którego następuje samozapłodnienie i składa się kilka jaj.Obserwuj robaki każdego dnia pod mikroskopem, a następnie zbieraj młode dorosłe lub pięciodniowe robaki. Aby wybrać tylko żywe robaki, dodaj robaki zawieszone w trzech do czterech mililitrach buforu S do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Następnie dodaj równą objętość lodowatej 60% sacharozy i wymieszaj.Odwirować probówkę w temperaturze 1 500 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 sekund. Następnie za pomocą pipety Pasteura ostrożnie odsuń robaki od ścianki probówki, a następnie usuń pływające robaki do świeżej probówki. Napełnij probówkę buforem S, aby umyć robaki i odwirować w temperaturze 1500 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez 30 sekund.Wyjmij bufor i powtórz pranie jeszcze dwa razy. Po trzecim płukaniu ostrożnie usuń supernatant, uważając, aby nie usunąć żadnych robaków, i użyj końcówki pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, aby zmierzyć mokrą objętość umytych robaków. W celu wytrącenia białka użyj pipety Pasteura, aby dodać umyte robaki do równej objętości lodowatego 10% kwasu trichlorooctowego w homogenizatorze umieszczonym na lodzie.Homogenizacja za pomocą 40 uderzeń pasel z obrotem, do 1 300 obr./min. Do sonikacji homogenatu należy użyć homogenizatora ultradźwiękowego z 20% cyklem pracy. Za pomocą pipety Pasteura przenieś homogenat do 1,5 mililitrowej probówki umieszczonej na lodzie.Po przeniesieniu homogenatu do mikroprobówki wirówkowej, odwirować w temperaturze 8 000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut w celu jego sklarowania. Przenieść sklarowany osad do świeżej probówki, dodać cztery molowe roztwory chlorku potasu i inkubować na lodzie przez 20 minut, aby go zneutralizować. Następnie odwiruj go w temperaturze 8 000 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut.Przenieść supernatant do świeżej probówki i przechowywać w temperaturze 80 stopni Celsjusza do czasu, gdy będzie potrzebny do dalszych badań. Aby zmierzyć stężenie mleczanu, należy użyć zestawu do testów kolorymetrycznych w celu przeprowadzenia powtórnych analiz dla badanych próbek. Dodaj 10 mikrolitrów badanych próbek do każdego dołka 96-dołkowej płytki, a następnie dodaj bufor do oznaczania mleczanu do każdej próbki, aby dostosować objętość do 15 mikrolitrów.Rozcieńczyć 100-milimolowy wzorzec L+mleczan buforem do oznaczania mleczanu do jednego milimola. Następnie do serii studzienek dodaj zero, dwa, cztery, sześć, osiem i 10 mikrolitrów rozcieńczonego wzorca L+Lactate. Dodaj 50 mikrolitrów mieszanki reakcyjnej do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem przez co najmniej 30 minut, aby rozwinął się kolor.Na koniec użyj czytnika mikropłytek, aby zmierzyć absorbancję każdej studzienki przy 570 nanometrach. Odjąć absorbancję kontrolnej mieszaniny tła od absorbancji mieszaniny reakcyjnej. Następnie wykreślić krzywą wzorcową mleczanu i obliczyć stężenia mleczanu na podstawie krzywej, mnożąc każde stężenie przez 2,25.Użyj zestawu do testów kolorymetrycznych, aby zmierzyć stężenie pirogronianu w badanych próbkach i przeprowadzić badania dwustronne. Dodaj 10 mikrolitrów badanych próbek do różnych dołków 96-dołkowej płytki i dodaj 90 mikrolitrów odczynnika roboczego do każdej próbki. Inkubować pod przykryciem przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Następnie umieść płytkę w czytniku mikropłytek, aby zmierzyć chłonność każdej studzienki przy 570 nanometrach. Wykreślić krzywą wzorcową pirogronianu i obliczyć stężenia pirogronianu na podstawie krzywej wzorcowej, mnożąc każde stężenie przez 2,25. I wreszcie, aby zmierzyć stężenie białka w badanych próbkach, użyj zestawu do testów kolorymetrycznych, jak opisano w protokole tekstowym.Po wytrąceniu białek można zastosować testy kolorymetryczne do ilościowego oznaczania stężeń mleczanu i pirogronianu. Eksperyment ten pokazuje dokładność testów kolorymetrycznych w przeciwieństwie do poprzednich doniesień w C.Elegans. Co więcej, testy te są wystarczająco czułe, aby mierzyć stężenia mleczanu i pirogronianu nawet w próbkach na małą skalę w krótkim czasie.Aby dokładnie wykryć mleczan i pirogronian w C.elegans, kluczowe jest przeprowadzenie wytrącania białek podczas homogenizacji robaków. Wykryta ilość mleczanu i pirogronianu jest wyższa, gdy próbki są wytrącane białkiem podczas homogenizacji, w porównaniu z nienaruszoną frakcją cytozolową lub po homogenizacji, gdy w ogóle nie wykryto mleczanu ani pirogronianu.

small-scale-colorimetric-assays-intracellular-lactate-pyruvate

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film przedstawia chemotaksję u nicienia C. elegans i pokazuje przykładowy protokół testujący chemotaktyczną awersję do siarczanu miedzi.

C. elegans (C. elegans) Test chemotaksji: metoda testowania chemosensacji u robaków

Ten film opisuje test kolorymetryczny do pomiaru mleczanu w lizatach komórkowych przy użyciu enzymu dehydrogenazy mleczanowej. Enzym ten przekształca mleczan w pirogronian, wraz z konwersją NAD do NADH, który reaguje z barwnikami tetrazolowymi i daje kolorowy produkt, który można zmierzyć spektrofotometrycznie w celu ilościowego określenia mleczanu.

Test kolorymetryczny do oznaczania ilościowego mleczanu w próbkach badanych

Ten film opisuje test kolorymetryczny do ilościowego pomiaru pirogronianu we frakcjach komórkowych Caenorhabditis elegans. Wykorzystując nadtlenek wodoru wytwarzany w reakcji enzymatycznej oksydazy pirogronianowej z pirogronianem komórkowym, barwnik chromogenny jest utleniany w celu wytworzenia kolorowego produktu, mierzonego za pomocą kolorymetrii w celu określenia stężenia pirogronianu.

Test pirogronianowy do oceny poziomów pirogronianu we frakcjach komórkowych robaków

Prezentujemy solidne metody biochemiczne i mikroskopowe do badania zapasów lipidów Caenorhabditis elegans. Szybka, prosta procedura barwienia utrwalającego do fluorescencyjnego obrazowania kropelek lipidów wykorzystuje właściwości spektralne lipofilowego barwnika czerwieni nilowej. Następnie przedstawiono pomiar biochemiczny triglicerydów i fosfolipidów z wykorzystaniem ekstrakcji do fazy stałej i chromatografii gazowej ze spektrometrią mas.

Biochemiczna i wysokoprzepustowa ocena mikroskopowa masy tłuszczowej w Caenorhabditis elegans

Mięśnie szkieletowe są niezbędne do poruszania się i są głównym magazynem białka w organizmie. Pomiary zdrowia mięśni w obrębie C. Opisano elegans. Potencjalne zmiany w strukturze i funkcji mięśni ocenia się za pomocą zlokalizowanego GFP i barwników kationowych.

Metody oceny subkomórkowych kompartmentów mięśniowych u C. elegans

Protokół jest opisany do wykrywania in vivo efektów inhibitorów mitochondrialnych w organizmie modelowym Caenorhabditis elegans oraz do identyfikacji potencjalnych związków wzmacniających. Protokół ten może być używany do badań przesiewowych bibliotek leków pod kątem związków modulujących funkcję mitochondriów.

Przesiewowy test in vivo dla modulatorów mitochondrialnych przy użyciu transgenicznych bioluminescencyjnych Caenorhabditis elegans

Prezentujemy konfigurację i protokół rejestracji zachowania, który umożliwia automatyczną analizę nicieni, preferencji Caenorhabditis elegans dla rozpuszczalnych związków w teście populacyjnym. W tym artykule opisano budowę komory behawioralnej, protokół testu behawioralnego i wykorzystanie oprogramowania do analizy wideo.

Zautomatyzowana analiza populacyjnego testu preferencji chemosensorycznej na podstawie populacji nicieni

Przewodnik krok po kroku do badania utraty kwasowości lizosomalnej w jelicie C. elegans przy użyciu wrażliwego na pH barwnika witalnego 5(6)-karboksyloksy-2',7'-dichlorofluoresceiny dioctanu...

Ocena alkalizacji lizosomalnej w jelicie żywego Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje, jak mierzyć przepuszczalność jelit Caenorhabditis elegans. Metoda ta jest pomocna w podstawowych badaniach biologicznych nad zdrowiem jelit związanych z interakcją między bakteriami jelitowymi a ich gospodarzem oraz w badaniach przesiewowych w celu identyfikacji czynników probiotycznych i chemicznych w leczeniu zespołu nieszczelnego jelita i chorób zapalnych jelit.

Pomiar wpływu bakterii i substancji chemicznych na przepuszczalność jelit Caenorhabditis elegans

To badanie przedstawia protokoły dla dwóch półautomatycznych metod analizy aktywności lokomotorycznej u robaków C. elegans complex I disease gas-1(fc21), a mianowicie ZebraLab (test o średniej przepustowości) i WormScan (test o wysokiej przepustowości) i dostarcza analizy porównawczej wśród szerokiego wachlarza metod badawczych do ilościowego określenia zachowania nicieni i zintegrowanej funkcji nerwowo-mięśniowej.

Analiza porównawcza metod eksperymentalnych do ilościowego określania aktywności zwierząt w modelach choroby mitochondrialnej Caenorhabditis elegans

Nauczanie nauk biologicznych może być bardziej stymulujące dla studentów dzięki zastosowaniu eksperymentów. Ten manuskrypt przedstawia dwa różne, ale uzupełniające się protokoły, które można wykorzystać w klasie, aby zachęcić uczniów do formułowania i testowania hipotez związanych z dietami wysokokalorycznymi, głodówką i starzeniem się.

Stosowanie tanich barwników do wizualizacji akumulacji glikogenu i integralności jelit u Caenorhabditis elegans

Poznaj małoskalowe testy kolorymetryczne mleczanu i pirogronianu u nicienia Caenorhabditis elegans. Ta metoda z precypitacją białek poprawia dokładność ilościowego oznaczania metabolitów w badaniach biochemicznych.

Małoskalowe testy kolorymetryczne wewnątrzkomórkowego mleczanu i pirogronianu u nicienia Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów