Name: Porównanie częstości koniugacji bakteryjnej w wysokiej rozdzielczości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: Poznaj metodę wysokiej rozdzielczości do wykrywania różnic w częstości koniugacji bakteryjnej. Protokół umożliwia precyzyjne pomiary transferu plazmidów między bakteriami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr K. Kamachi z Narodowego Instytutu Chorób Zakaźnych (Japonia) za dostarczenie pBP136 oraz prof. dr H. Nojiri z Uniwersytetu Tokijskiego (Japonia) za dostarczenie pCAR1. Jesteśmy również wdzięczni profesorowi dr Molinowi Sølenowi z Duńskiego Uniwersytetu Technicznego za udostępnienie pJBA28. Prace te były wspierane przez JSPS KAKENHI (numery grantów 15H05618 i 15KK0278) dla MS (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).

1. Przygotowanie dawcy z plazmidami znakowanymi genami oporności na białko zielonej fluorescencji (GFP) i kanamycynę
<ol>
	<li>Wprowadzenie genów markerowych do docelowego plazmidu pBP136 
	nuta: Celem tego protokołu jest wygenerowanie pBP136::gfp. Szczepy bakteryjne i plazmidy użyte w tym badaniu wymieniono w Tabeli 1.
	<ol>
		<li>Hoduj kultury Escherichia coli DH10B zawierające pBP13617 w 5 ml sterylnego bulionu Luria (LB) i E. coli S17-1λpir18 zawierającego pJBA2819 [zawierający gen oporności na kanamycynę (Km) i gen gfpmut3* z jego promotorem i terminatorem w mini-Tn5] w 5 ml sterylnego LB zawierającego 50 μg/ml Km w temperaturze 37 °C przez noc (O/N, 16–24 h) z wytrząsaniem przy 200 obrotach na minutę (rpm).</li>
		<li>Zbiór i mycie
		<ol>
			<li>Zbierz 1 ml każdej kultury, umieść ją w mikroprobówce o pojemności 2 ml i odwiruj (10 000 × g, temperatura pokojowa, 2 min). Następnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
			<li>Ponownie odwirować (10 000 × g, temperatura pokojowa, 2 min) i ponownie zawiesić w 500 μl sterylnego PBS.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Łączenie filtrów
		<ol>
			<li>Przygotuj sterylne płytki LB (z 1,6% agarem) i umieść na nich sterylny filtr membranowy o wielkości porów 0,22 μm. Wymieszaj 500 μl E. coli S17-1λpir zawierającego pJBA28 z E. coli DH10B zawierającym pBP136 i umieść mieszaninę na filtrze na płytce LB. Inkubować płytkę O/N w temperaturze 30 °C. Wyjąć filtr z płytki LB, umieścić go w sterylnej plastikowej probówce o pojemności 50 ml i dodać 1 ml sterylnego PBS. 
			Uwaga: pJBA28 może replikować się w obecności białka Π, kodowanego przez gen pir18, i może być przenoszony z S17-1λpir do DH10B. pBP136 nie zawiera genu markerowego17 i może być przenoszony z DH10B do S17-1λpir. Dlatego na tym etapie nie mogliśmy odróżnić S17-1λpir zawierającego pBP136 i pJBA28 od DH10B zawierającego pBP136 i mini-Tn5 (transponowanego do chromosomu lub pBP136). Następnie, w kolejnych krokach, wykorzystaliśmy ich mieszaniny jako dawców (1.1.4.–1.1.5.).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wyhodować kulturę O/N powyższej mieszaniny kojarzeniowej w sterylnym LB zawierającym 50 μg/ml Km w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min i kulturą Pseudomonas putida KT2440 [wrażliwą na Km (Kms), wrażliwą na ryfampicynę (Rifs), wrażliwą na gentamycynę (Gms) i odporną na tetracyklinę (Tcr)] w pożywce zawierającej 12,5 μg/ml Tc w temperaturze 30 °C i wytrząsaniu przy 200 obr./min.</li>
		<li>Po zebraniu i umyciu komórek, jak w kroku 1.1.2, należy użyć ich (mieszaniny współpracującej i KT2440) do dopasowania filtra (O/N, 30 °C), jak w kroku 1.1.3.</li>
		<li>Przygotować sterylne płytki LB zawierające 50 μg/ml Km i 12,5 μg/ml Tc (płytki LB + Km + Tc).</li>
		<li>Rozcieńczyć ponownie zawieszoną mieszaninę na filtrze membranowym sterylnym PBS (101–105-krotnie), a następnie rozprowadzić każde rozcieńczenie na płytkach LB + Km + Tc i inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 2–3 dni.</li>
		<li>Wybierz kolonie z płytek, wyhoduj kulturę O/N w sterylnym LB zawierającym Km i Tc oraz P. Resinovorans CA10dm4RG (Rifr i Gmr)6 w sterylnym LB zawierającym Rif (25 μg/mL) i Gm (30 μg/mL) w temperaturze 30 °C i 200 obr./min. 
		nuta: Jak opisano w poprzedniej notatce, kolonie na płytkach LB + Km + Tc (od 1.1.7.) mogą być KT2440 zawierającymi pBP136 przenoszący mini-Tn5 i KT2440 z mini-Tn5, ponieważ pJBA28 może być bezpośrednio przenoszony z S17-1λpir zawierającego pBP136 i pJBA28 do KT2440. Dlatego wymagane jest kolejne krycie z P. resinovorans CA10RG, aby uzyskać docelowy pBP136 z mini-Tn5 w kolejnych krokach.</li>
		<li>Po zebraniu i umyciu komórek, jak w kroku 1.1.2, należy użyć ich do połączenia filtra (O/N, 30 °C), jak w kroku 1.1.3.</li>
		<li>Przygotuj sterylne płytki LB zawierające płytki Rif, Gm i Km (płytki LB + Rif + Km + Gm).</li>
		<li>Zawiesić mieszaninę ponownie na filtrze, a następnie rozcieńczyć ją10 1–10 5-krotnie, rozprowadzić na płytkach LB + Rif + Km + Gm i inkubować płytki przez 2–3 dni w temperaturze 30 °C.</li>
		<li>Wybierz kolonie i sprawdź, czy są siedliskiem pBP136 metodą PCR przy użyciu określonych starterów dla plazmidu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wprowadzenie genu selektywnego markera do docelowego plazmidu pCAR1 
	Uwaga: Celem tego protokołu jest wygenerowanie pCAR1::gfp
	<ol>
		<li>Wyhoduj kulturę O/N P. putida KT2440 zawierającą pCAR1 (Kms, Gms, Rifs, Tcr)20 przy 200 obr./min i 30 °C i E. coli S17-1λpir18 zawierającej pJBA28 w 5 ml sterylnego LB zawierającego 50 μg/mL Km przy 200 obr./min i 37 °C.</li>
		<li>Po zebraniu i umyciu komórek, jak w kroku 1.1.2, należy użyć ich do połączenia filtra (O/N, 30 °C), jak w kroku 1.1.3.</li>
		<li>Wyjmij filtr z płytki LB, umieść go w sterylnej plastikowej probówce o pojemności 50 ml i dodaj 1 ml sterylnego PBS.</li>
		<li>Rozcieńczyć zawieszoną mieszaninę sterylnym PBS (101–105-krotnie) i rozprowadzić rozcieńczoną mieszaninę na sterylnych selektywnych płytkach LB + Tc + Km. 
		Uwaga: pCAR1 nie replikuje się w E. coli; w ten sposób P. putida KT2440 zawierający pCAR1 z mini-Tn5 można wybrać na tabliczkach LB + Tc + Km.</li>
		<li>Wybierz kolonię z talerza i wyhoduj kulturę O/N w sterylnym LB zawierającym Km i Tc oraz kulturę P. Resinovorans CA10dm4RG w sterylnym LB zawierającym Rif i Gm (200 obr./min, 30 °C).</li>
		<li>Po zebraniu i umyciu jak w kroku 1.1.2 należy użyć komór do połączenia filtra (O/N, 30 °C) jak w kroku 1.1.3.</li>
		<li>Zawiesić mieszaninę ponownie na filtrze, a następnie rozcieńczyć ją, rozprowadzić na płytkach LB + Rif + Km + Gm i inkubować płytki przez 2–3 dni w temperaturze 30 °C.</li>
		<li>Wybierz kolonie i sprawdź, czy zawierają pCAR1 metodą PCR ze specyficznymi starterami dla plazmidu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potwierdź przenośność oznakowanych plazmidów i przygotuj dawców do kolejnych kroków 
	Uwaga: Celem tego protokołu jest potwierdzenie przenośności wyżej skonstruowanych plazmidów i przygotowanie dawców do kolejnych kroków.
	<ol>
		<li>Wyhoduj kulturę O/N P. resinovorans CA10dm4RG zawierającą pBP136::gfp lub pCAR1::gfp w sterylnym LB zawierającym Km i kulturę P. putida SMDBS [Kms, Gms, Rifr, Tcr, lacIq, w której PA1/O4/O3-gfpmut3* nie ulega ekspresji z powodu chromosomalnego genu lacIq]21 w 3 ml LB zawierającego Tc (200 obr./min, 30 °C).</li>
		<li>Po zebraniu i umyciu komórek, jak w kroku 1.1.2, należy użyć ich do połączenia filtra (O/N, 30 °C), jak w kroku 1.1.3.</li>
		<li>Umieść filtr w sterylnej plastikowej probówce o pojemności 50 ml i ponownie zamieszaj z 1 ml sterylnego PBS. Rozcieńczyć zawieszoną mieszaninę sterylnym PBS (101–105-krotnie), rozprowadzić rozcieńczoną mieszaninę na sterylnych selektywnych płytkach LB + Tc + Km.</li>
		<li>Wybierz kolonie i sprawdź, czy zawierają każdy z plazmidów metodą PCR z określonymi starterami. 
		nuta: Potwierdzenie pozycji insercji mini-Tn5 poprzez bezpośrednie sekwencjonowanie po ekstrakcji plazmidu jest opcjonalne, aby potwierdzić, że insercja nie wpływa na funkcję transferu plazmidów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Obliczanie częstotliwości koniugacji metodą MPN
<ol>
	<li>Przygotuj sterylne płytki LB + Km i LB + Gm.</li>
	<li>Hodować kulturę O/N P. putida SMDBS zawierającą pBP136::gfp lub pCAR1::gfp w 3 ml sterylnego LB zawierającego Km i kulturę P. putida KT2440RGD (Gmr, Rifr) w 3 ml LB zawierającej Gm (140 obr./min, 30 °C).</li>
	<li>Po zebraniu i umyciu komórek, jak w kroku 1.1.2, należy użyć ich do połączenia filtra w temperaturze 30 °C przez 45 minut, jak w kroku 1.1.3.</li>
	<li>Seryjnie rozcieńczyć powyższą kulturę dawcy i biorcy (101 –107) i rozprowadzić ją na płytkach LB + Km (dawca) lub LB + Gm (biorca) (każda w trzech egzemplarzach), aby policzyć jednostki tworzące kolonię (CFU). Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 2 dni.</li>
	<li>Zawiesić mieszaninę na filtrze w sterylnym LB zawierającym Km i Gm i seryjnie rozcieńczyć (od 21 do 224–107.2) za pomocą 96-dołkowej płytki do hodowli komórkowej (w poczwórnym odstępie).</li>
	<li>Inkubować 96-dołkową płytkę przez odpowiedni czas (2 dni w temperaturze 30 °C).</li>
	<li>Policz jtk dawcy i biorcy na płytkach (krok 2.4) i policz liczbę studzienek, w których rosną transkoniuganty.</li>
	<li>Oblicz MPN i jego odchylenie za pomocą programu do obliczania MPN opracowanego przez Jarvisa i wsp. 22, który jest dostępny pod adresem http://www.wiwiss.fu-berlin.de/fachbereich/vwl/iso/ehemalige/professoren/wilrich/MPN_ver5.xls.
	<ol>
		<li>Wprowadź nazwę eksperymentu (np. 'test'), datę eksperymentu (np. 2018/4/9), liczbę serii testów i maksymalną liczbę rozcieńczeń (wpisać '24') w wierszu #7 arkusza "Program" pliku Excel ("MPN_ver5.xls").</li>
		<li>Wpisać "2-1 (= 0,5)" do 2-24 (= 5,96 × 10-8)" w kolumnie "współczynnik rozcieńczenia d", "0,01" w kolumnie "objętość w ml lub g w" i "4" w polu "Liczba probówek n" w automatycznie tworzonych tabelach "danych wejściowych".</li>
		<li>Wprowadzić liczbę studzienek, w których transkoniuganty rosną przy każdym rozcieńczeniu próbki (0–4).</li>
		<li>Naciśnij prawy górny przycisk "Oblicz wyniki", a następnie uzyskaj wyniki (w MPN/μL) i ich 95% granice ufności (dolna i górna).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oblicz częstość koniugacji plazmidów, dzieląc liczbę transkoniugantów (MPN/ml) przez liczbę komórek dawcy i biorcy (CFU/ml).</li>
</ol>
3. Przygotowanie do oszacowania prawdopodobieństwa koniugacji zainicjowanej przez dawcę
<ol>
	<li>Wyhodować kulturę O/N P. putida SMDBS zawierającą pBP136::gfp lub pCAR1::gfp w 3 ml sterylnego LB zawierającego Km i kulturę P. putida KT2440RGD (Gmr, Rifr) w 3 ml sterylnego LB zawierającego Gm, używając kolb 300 ml (140 obr./min, 30 °C) jako prekultur.</li>
	<li>Przenieść 200 μl kultury wstępnej do 200 ml świeżego sterylnego LB zawierającego Km lub Gm w kolbach o pojemności 500 ml i inkubować w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 140 obr./min.</li>
	<li>Zmierzyć zmętnienie kultury przy długości fali 600 nm (OD600) za pomocą spektrofotometru UV-VIS i umieścić kulturę rozcieńczoną w LB (101–108-krotnych rozcieńczeniach) na płytce LB zawierającej Km lub Gm. Inkubować te płytki LB w temperaturze 30 °C przez 1–2 dni i oznaczyć jtk.</li>
	<li>Wykreśl wartości OD600 i CFU z czasem wzrostu, aby wygenerować krzywe wzrostu dawcy i biorcy.</li>
	<li>Hoduj kultury szczepu dawcy i biorcy do środkowej fazy logarytmicznej, w oparciu o krzywą wzrostu.</li>
	<li>Po pobraniu i umyciu komórek należy przygotować 101–103 jtk dawcy w 10 μl LB i 105–10 7 jtk biorcy w 100 μl LB.</li>
	<li>Wymieszać 10 μl kultur dawcy i 100 μl kultur biorcy o różnej gęstości na płytkach 96-dołkowych (w trzech powtórzeniach). Na przykład wymieszaj 101 CFU dawcy i 105 CFU biorcy i dodaj go do każdej z 96 studzienek, a następnie wymieszaj 101 CFU dawcy i 106 CFU biorcy w innej 96-dołkowej płytce i tak dalej.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę w temperaturze 30 °C przez 45 minut, a następnie dodać wysokie stężenia antybiotyków (100 μg/ml Km i 60 μg/ml Gm) do każdego dołka, aby zahamować dalszą koniugację.</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 30 °C przez 2 dni.</li>
	<li>Policz liczbę studni, w których rosną transkoniuganty.</li>
	<li>Wybierz gęstość biorcy, która jest odpowiednia do oszacowania prawdopodobieństwa koniugacji zainicjowanej przez dawcę na podstawie powyższych danych (transkoniuganty powinny znajdować się w co najmniej 1 dołku na 96-dołkowej płytce). 
	nuta: Transkoniuganty będą rosły we wszystkich studzienkach, gdy gęstość komórek dawcy i biorcy jest wysoka i w studzience występuje więcej niż jedna koniugacja. W przeciwieństwie do tego, w żadnych studzienkach nie zostaną znalezione żadne transkoniuganty, gdy gęstość komórek jest zbyt niska. W następnej sekcji pojedyncza komórka dawcy jest sortowana do studzienki. W związku z tym zagęszczenie odbiorców powinno być maksymalne.</li>
</ol>
4. Oszacowanie prawdopodobieństwa koniugacji zainicjowanej przez dawcę
<ol>
	<li>Przygotować 200 ml kultury w środkowej fazie logarytmicznej dawcy P. putida SMDBS zawierającego pBP136::gfp lub pCAR1::gfp i biorcy P. putida KT2440RGD, jak opisano w 3.6–3.7.</li>
	<li>Umieścić 106 jtk biorcy w 100 μl LB w każdym dołku 96-dołkowej płytki.</li>
	<li>Skonfiguruj system FACS (cytometria przepływowa i sorter komórek z ramieniem robota, laserem argonowym 488 nm i kryzą dyszy 70 μm). Ustawione na forward scatter (FSC), z progiem 1% jako wyzwalaczem akwizycji. Dostosuj wzmocnienie H i wzmocnienie A FSC i rozpraszania bocznego (SSC) przy maksymalnej czułości, co może wykluczyć sygnały fałszywie dodatnie, używając PBS jako kontroli negatywnej. Ustaw bramkę sortowania w oparciu o FSC i SSC oraz tryb sortowania 0,5 drop, aby uzyskać maksymalną czystość sortowania.</li>
	<li>Sortuj pojedynczą komórkę dawcy za pomocą FACS na płytce LB (384 różne plamki), inkubuj płytkę w temperaturze 30 °C przez 2 dni, a następnie policz, ile kolonii pojawia się na płytce z posortowanych komórek. 
	nuta: Ta procedura służy do walidacji ustawionej bramki. Jeśli na płytce znajdują się 384 kolonie, oznacza to, że 100% posortowanych komórek może utworzyć kolonie. Średnia trafność sortowania wynosi zawsze 90–95%.</li>
	<li>Posortować pojedynczą komórkę dawcy za pomocą FACS do każdej studzienki 96-dołkowej płytki z biorcą (4.2).</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 45 minut w temperaturze 30 °C, a następnie dodać wysokie stężenia antybiotyków (100 μg/ml Km i 60 μg/ml Gm) do każdego dołka, aby zapobiec dalszemu koniugacji.</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 30 °C przez 2 dni.</li>
	<li>Policz liczbę studni, w których rosły transkoniuganty, zgodnie z oględzinami gołym okiem.</li>
	<li>Oblicz prawdopodobieństwo koniugacji zainicjowanej przez dawcę, dzieląc liczbę studzienek z transkoniugantami przez całkowitą liczbę dołków, w których dawca został posortowany.</li>
</ol>

<ol><li>Cabezon, E., Ripoll-Rozada, J., Pena, A., de la Cruz, F., Arechaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+an+integrated+model+of+bacterial+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Towards an integrated model of bacterial conjugation.</a> FEMS Microbiology Reviews. 39 (1), 81-95 (2015).</li>
<li>Johnson, C. M., Grossman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+and+conjugative+elements+%28ICEs%29%3A+what+they+do+and+how+they+work%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Integrative and conjugative elements (ICEs): what they do and how they work.</a> Annual Review of Genetics. 49, 577-601 (2015).</li>
<li>Garcillán-Barcia, M. P., Alvarado, A., de la Cruz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+bacterial+plasmids+based+on+mobility+and+plasmid+population+biology%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Identification of bacterial plasmids based on mobility and plasmid population biology.</a> FEMS Microbiology Reviews. 35 (5), 936-956 (2011).</li>
<li>Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+of+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mobility of plasmids.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (3), 434-452 (2010).</li>
<li>Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., de la Cruz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diversity+of+conjugative+relaxases+and+its+application+in+plasmid+classification%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">The diversity of conjugative relaxases and its application in plasmid classification.</a> FEMS Microbiology Reviews. 33 (3), 657-687 (2009).</li>
<li>Shintani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recipient+range+of+IncP-7+conjugative+plasmid+pCAR2+from+Pseudomonas+putida+HS01+is+broader+than+from+other+Pseudomonas+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Letters%22%5BJournal%5D)">Recipient range of IncP-7 conjugative plasmid pCAR2 from Pseudomonas putida HS01 is broader than from other Pseudomonas strains.</a> Biotechnology Letters. 27 (23-24), 1847-1853 (2005).</li>
<li>Yanagida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparisons+of+the+transferability+of+plasmids+pCAR1%2C+pB10%2C+R388%2C+and+NAH7+among+Pseudomonas+putida+at+different+cell+densities%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%2C+Biotechnology%2C+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Comparisons of the transferability of plasmids pCAR1, pB10, R388, and NAH7 among Pseudomonas putida at different cell densities.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 80 (5), 1020-1023 (2016).</li>
<li>Schuurmans, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+growth+rate+and+selection+pressure+on+rates+of+transfer+of+an+antibiotic+resistance+plasmid+between+E.+coli+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Effect of growth rate and selection pressure on rates of transfer of an antibiotic resistance plasmid between E. coli strains.</a> Plasmid. 72, 1-8 (2014).</li>
<li>Bradley, D. E., Taylor, D. E., Cohen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+surface+mating+systems+among+conjugative+drug+resistance+plasmids+in+Escherichia+coli+K-12%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Specification of surface mating systems among conjugative drug resistance plasmids in Escherichia coli K-12.</a> Journal of Bacteriology. 143 (3), 1466-1470 (1980).</li>
<li>Nakazawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+transferability+of+incompatibility+%28Inc%29+P-7+plasmid+pCAR1+and+IncP-1+plasmid+pBP136+in+stirring+liquid+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Different transferability of incompatibility (Inc) P-7 plasmid pCAR1 and IncP-1 plasmid pBP136 in stirring liquid conditions.</a> PLoS One. 12 (10), e0186248(2017).</li>
<li>Verma, T., Ramteke, P. W., Garg, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ecological+factors+on+conjugal+transfer+of+chromium-resistant+plasmid+in+Escherichia+coli+isolated+from+tannery+effluent%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Applied+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of ecological factors on conjugal transfer of chromium-resistant plasmid in Escherichia coli isolated from tannery effluent.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 102 (1-6), 5-20 (2002).</li>
<li>Sakuda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divalent+cations+increase+the+conjugation+efficiency+of+the+incompatibility+P-7+group+plasmid+pCAR1+among+different+Pseudomonas+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Divalent cations increase the conjugation efficiency of the incompatibility P-7 group plasmid pCAR1 among different Pseudomonas hosts.</a> Microbiology. 164 (1), 20-27 (2018).</li>
<li>Corliss, T. L., Cohen, P. S., Cabelli, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-plasmid+transfer+to+and+from+Escherichia+coli+strains+Isolated+from+human+fecal+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">R-plasmid transfer to and from Escherichia coli strains Isolated from human fecal samples.</a> Applied and Environmental Microbiology. 41 (4), 959-966 (1981).</li>
<li>Zhong, X., Krol, J. E., Top, E. M., Krone, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accounting+for+mating+pair+formation+in+plasmid+population+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Theoretical+Biology%22%5BJournal%5D)">Accounting for mating pair formation in plasmid population dynamics.</a> Journal of Theoretical Biology. 262 (4), 711-719 (2010).</li>
<li>Gilmour, M. W., Lawley, T. D., Taylor, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytology+of+bacterial+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22EcoSal+Plus%22%5BJournal%5D)">The cytology of bacterial conjugation.</a> EcoSal Plus. 2004, (2004).</li>
<li>Minoia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochasticity+and+bistability+in+horizontal+transfer+control+of+a+genomic+island+in+Pseudomonas%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stochasticity and bistability in horizontal transfer control of a genomic island in Pseudomonas.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20792-20797 (2008).</li>
<li>Kamachi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid+pBP136+from+Bordetella+pertussis+represents+an+ancestral+form+of+IncP-1beta+plasmids+without+accessory+mobile+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Plasmid pBP136 from Bordetella pertussis represents an ancestral form of IncP-1beta plasmids without accessory mobile elements.</a> Microbiology. 152 (12), 3477-3484 (2006).</li>
<li>Simon, R., Priefer, U., Pühler, A. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nbt1183-784">A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria.</a> Nature Biotechnology. 1 (9), 784-791 (1983).</li>
<li>Andersen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+unstable+variants+of+green+fluorescent+protein+for+studies+of+transient+gene+expression+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 64 (6), 2240-2246 (1998).</li>
<li>Shintani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+replication%2C+maintenance%2C+and+transfer+features+of+the+IncP-7+plasmid+pCAR1%2C+which+carries+genes+involved+in+carbazole+and+dioxin+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the replication, maintenance, and transfer features of the IncP-7 plasmid pCAR1, which carries genes involved in carbazole and dioxin degradation.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (5), 3206-3216 (2006).</li>
<li>Shintani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analyses+revealed+transfer+ranges+of+IncP-1%2C+IncP-7%2C+and+IncP-9+plasmids+in+a+soil+bacterial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Single-cell analyses revealed transfer ranges of IncP-1, IncP-7, and IncP-9 plasmids in a soil bacterial community.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 138-145 (2014).</li>
<li>Jarvis, B., Wilrich, C., Wilrich, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconsideration+of+the+derivation+of+most+probable+numbers%2C+their+standard+deviations%2C+confidence+bounds+and+rarity+values%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Reconsideration of the derivation of most probable numbers, their standard deviations, confidence bounds and rarity values.</a> Journal of Applied Microbiology. 109 (5), 1660-1667 (2010).</li>
<li>Haagensen, J. A., Hansen, S. K., Johansen, T., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+horizontal+transfer+of+mobile+genetic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Ecology%22%5BJournal%5D)">In situ detection of horizontal transfer of mobile genetic elements.</a> FEMS Microbiology Ecology. 42 (2), 261-268 (2002).</li>
<li>Herrero, M., de Lorenzo, V., Timmis, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+vectors+containing+non-antibiotic+resistance+selection+markers+for+cloning+and+stable+chromosomal+insertion+of+foreign+genes+in+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 172 (11), 6557-6567 (1990).</li>
<li>Bagdasarian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific-purpose+plasmid+cloning+vectors.+II.+Broad+host+range%2C+high+copy+number%2C+RSF1010-derived+vectors%2C+and+a+host-vector+system+for+gene+cloning+in+Pseudomonas%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas.</a> Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).</li>
<li>Maeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+nucleotide+sequence+of+carbazole%2Fdioxin-degrading+plasmid+pCAR1+in+Pseudomonas+resinovorans+strain+CA10+indicates+its+mosaicity+and+the+presence+of+large+catabolic+transposon+Tn4676%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Complete nucleotide sequence of carbazole/dioxin-degrading plasmid pCAR1 in Pseudomonas resinovorans strain CA10 indicates its mosaicity and the presence of large catabolic transposon Tn4676.</a> Journal of Molecular Biology. 326 (1), 21-33 (2003).</li>
<li>Takahashi, Y., Shintani, M., Yamane, H., Nojiri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+nucleotide+sequence+of+pCAR2%3A+pCAR2+and+pCAR1+were+structurally+identical+IncP-7+carbazole+degradative+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%2C+Biotechnology%2C+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The complete nucleotide sequence of pCAR2: pCAR2 and pCAR1 were structurally identical IncP-7 carbazole degradative plasmids.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (3), 744-746 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy protokół o wysokiej rozdzielczości do wykrywania różnic w częstości koniugacji w różnych warunkach, przy użyciu metody MPN do oszacowania liczby transkoniugancji. Jednym z ważnych kroków w protokole jest rozcieńczenie mieszaniny dawcy i biorcy po kryciu, aż nie wyrosną żadne transkoniuganty. Kolejnym krokiem jest dodanie wysokich stężeń antybiotyków do selektywnej pożywki płynnej, aby zapobiec dalszej koniugacji. Procedury te mogą zmniejszyć tło spowodowane dalszą koniugacją w pożywce selektyw...

Bakteryjna koniugacja ruchomych elementów genetycznych, plazmidów koniugacyjnych oraz elementów integracyjnych i sprzęgających (ICE) jest ważna dla horyzontalnego rozprzestrzeniania informacji genetycznej. Może promować szybką ewolucję i adaptację bakterii oraz przekazywać geny oporności wielolekowej1,2. Na częstotliwość koniugacji mogą mieć wpływ białka kodowane na elementach koniugacyjnych do mobilizacji DNA (MOB) i tworzenia par godowych (MPF), w tym pilusów płciowych, które są klasyfikowane według typu MOB i MPF3,4,5. Może mieć na to również wpływ para dawca i biorca6 oraz warunki wzrostu komórek7,8,9,10,11,12 (szybkość wzrostu, gęstość komórek, powierzchnia ciała stałego lub płynne podłoże, temperatura, dostępność składników odżywczych i obecność kationów). Aby zrozumieć, w jaki sposób elementy koniugacyjne rozprzestrzeniają się wśród bakterii, konieczne jest szczegółowe porównanie częstotliwości koniugacji.
Częstotliwość koniugacji między parami dawców i biorców po kryciu jest zwykle szacowana za pomocą konwencjonalnych metod w następujący sposób. (i) Po pierwsze, liczy się liczbę kolonii dawców i biorców; (ii) następnie liczone są kolonie biorców, które otrzymały elementy koniugacyjne (= transkoniuganty); (iii) i wreszcie, częstość koniugacji oblicza się, dzieląc jednostki tworzące kolonię (CFU) transkoniugantów przez jednostki dawcy i/lub biorcy13. Jednak przy użyciu tej metody tło jest wysokie ze względu na dodatkowe zdarzenia koniugacji, które mogą również wystąpić na selektywnych płytkach używanych do otrzymywania transkoniugancji, gdy gęstość komórek jest wysoka10. W związku z tym trudno jest wykryć niewielkie różnice w częstości (poniżej 10-krotnej różnicy). Niedawno wprowadziliśmy metodę liczby najbardziej prawdopodobnej (MPN) z wykorzystaniem płynnej pożywki zawierającej wyższe stężenie antybiotyków. Metoda ta zredukowała tło poprzez zahamowanie dalszej koniugacji w pożywce selektywnej; W ten sposób częstość koniugacji można było oszacować z większą rozdzielczością.
Koniugację można podzielić na trzy etapy: (1) przyłączenie pary dawca-biorca (2) zainicjowanie transferu koniugacyjnego oraz (3) dysocjacja pary14. Podczas etapów (1) i (3) zachodzi fizyczna interakcja między komórkami dawcy i biorcy; Tak więc gęstość komórek i warunki środowiskowe mogą wpływać na te etapy, chociaż ważne są również cechy pilusów płciowych. Krok (2) jest prawdopodobnie regulowany przez ekspresję kilku genów zaangażowanych w koniugację w odpowiedzi na zmiany zewnętrzne, na które mogą mieć wpływ różne cechy plazmidu, dawcy i biorcy. Chociaż fizyczne przyłączenie lub odłączenie par dawca-biorca może być matematycznie symulowane przy użyciu oszacowania komórek jako cząstek, częstotliwość kroku (2) powinna być mierzona doświadczalnie. Pojawiło się kilka doniesień o bezpośrednich obserwacjach tego, jak często dawcy mogą inicjować koniugację [krok (2)] za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej15,16; Jednak metody te nie są wysokoprzepustowe, ponieważ należy monitorować dużą liczbę komórek. W związku z tym opracowaliśmy nową metodę szacowania prawdopodobieństwa wystąpienia kroku (2) za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Nasza metoda może być zastosowana do dowolnego plazmidu, bez identyfikacji genów niezbędnych do koniugacji.

<table><tbody><tr><td>MoFlo XDP</td><td>Beckman-Coulter</td><td>ML99030</td><td>FACS</td></tr><tr><td>IsoFlow</td><td>Beckman-Coulter</td><td>8599600</td><td>Roztwór</td></tr><tr><td>osłonowy Fluorosfery (10 &mu; m)</td> <td>Beckman-Coulter</td><td>6605359</td><td>koraliki do założenia</td></tr><tr><td>inkubatora</td> FACS <td>Yamato Scientific Co. Ltd</td><td>211197-IC802</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV-VIS UV-1800</td><td>SIMADZU Corporation</td><td>UV-1800</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki</td><td>NIPPON Genetics Co, Ltd</td><td>TR5003</td><td></td></tr><tr><td>mikropłytka typu szalka Petriego</td><td>AXEL</td><td>1-9668-01</td><td>do walidacji sortowania</td></tr><tr>filtr <td>membranowy</td><td>ADVANTEC</td><td>C045A025A</td> do pipet <td>współpracujących z filtrami</td></tr><tr><td></td><td>Nichiryo CO. Ltd</td><td>00-NPX2-20, 00-NPX2-200, 00-NPX2-1000</td><td>0,5-10 &mu; L, 20-200 &mu; L, 100-1000 &mu; Pipety</td></tr><tr><td>wielokanałowe</td> L <td>Nichiryo CO., Ltd</td><td>00-NPM-8VP, 00-NPM-8LP</td><td>0,5-10 &mu; L, 20-200 &mu; L</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>BD Difco</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>BD Difco</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S-5886</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Nakarai tesque</td><td>01162-15</td><td></td></tr><tr><td>ryfampicyna</td><td>Wako</td><td>185-01003</td><td></td></tr><tr><td>gentamycyna</td><td>Wako</td><td>077-02974</td><td></td></tr><tr><td>kanamycyna</td><td>Wako</td><td>115-00342</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>AXEL</td><td>3-1491-51</td><td>Mikroprobówki JPND90-15</td></tr><tr><td></td><td>Fukaekasei</td><td>131-815C</td><td></td></tr><tr><td>500 ml jednorazowa kolba obrotowa</td><td>Corning</td><td>CLS3578</td><td></td></tr></tbody></table>

porównanie częstości koniugacji bakteryjnej w wysokiej rozdzielczości

High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies

Koniugacja bakteryjna jest ważnym krokiem w poziomym transferze genów oporności na antybiotyki za pośrednictwem elementu koniugacyjnego DNA. Dogłębne porównania częstości koniugacji w różnych warunkach są konieczne, aby zrozumieć, w jaki sposób element koniugacyjny rozprzestrzenia się w przyrodzie. Jednak konwencjonalne metody porównywania częstości koniugacji nie są odpowiednie do pogłębionych porównań ze względu na wysokie tło spowodowane wystąpieniem dodatkowych zdarzeń koniugacji na selektywnej płytce. Udało nam się zredukować tło, wprowadzając metodę najbardziej prawdopodobnej liczby (MPN) i wyższe stężenie antybiotyków, aby zapobiec dalszej koniugacji w selektywnym płynnym pożywce. Ponadto opracowaliśmy protokół szacowania prawdopodobieństwa, jak często komórki dawcy inicjują koniugację, sortując pojedyncze komórki dawcy do pul biorców za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Używając dwóch plazmidów, pBP136 i pCAR1, można było wykryć różnice w częstości koniugacji w komórkach Pseudomonas putida w płynnym podłożu przy różnych szybkościach mieszania. Częstość inicjacji koniugacji była wyższa w przypadku pBP136 niż w przypadku pCAR1. Korzystając z tych wyników, możemy lepiej zrozumieć cechy koniugacji w tych dwóch plazmidach.

Porównanie częstotliwości koniugacji metodą MPN
W naszym poprzednim raporcie porównaliśmy częstotliwości konjugacji pBP136::gfp or pCAR1::gfp w trzykrotnie rozcieńczonym płynnym medium LB (1/3 LB) przy różnych prędkościach mieszania, po 45-minutowym kojeniu w kolbach z mieszadłem o pojemności 125 ml10Porównaliśmy częstotliwości konjugacji pBP136::gfp or pCAR1::gfp z 10<sup...

Mając na celu zrozumienie zachowań różnych bakteryjnych elementów koniugującego DNA w różnych warunkach, opisujemy protokół wykrywania różnic w częstotliwości koniugacji, z wysoką rozdzielczością, aby oszacować, jak skutecznie bakteria dawcy inicjuje koniugację.

Porównanie częstości koniugacji bakteryjnej w wysokiej rozdzielczości

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikrobiologii dotyczące tego, jak często plazmidowe DNA może rozprzestrzeniać się wśród różnych bakterii. Główną zaletą tej techniki jest to, że zmniejszając tło, możemy wykryć niewielkie różnice w częstotliwości koniugacji z wysoką rozdzielczością. Procedurę zademonstruje Kosuke Yanagiya, doktorant z mojego laboratorium.Aby obliczyć częstość koniugacji za pomocą najbardziej prawdopodobnej liczby, przefiltruj jeden mililitr z nocnej hodowli dawcy z jednym mililitrem z nocnej hodowli biorcy przez 45 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza, jak właśnie pokazano. Podczas inkubacji kokultury należy seryjnie rozcieńczyć pierwotne kultury dawcy i biorcy w celu posiewu w trzech egzemplarzach na bulionie Luria dawcy lub LB plus kanamycyna lub biorcy LB plus gentamycyna w celu uzyskania dwudniowej hodowli w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji ponownie zawiesić hodowlę na filtrze w sterylnym LB zawierającym kanamycynę i gentamycynę do seryjnego rozcieńczania na 96-dołkowej płytce do hodowli komórkowej w poczwórnym powiększeniu.Po dwóch dniach w temperaturze 30 stopni Celsjusza ręcznie policz jednostki tworzące kolonie lub CFU na płytkach agarowych dawcy i biorcy oraz liczbę studzienek, w których rosną transkoniuwanty za pomocą mikroskopii świetlnej. Aby obliczyć najbardziej prawdopodobną liczbę i jej odchylenie, otwórz program do obliczania MPN. Wprowadź nazwę i datę eksperymentu, numer serii testów oraz maksymalną liczbę rozcieńczeń w wierszu siódmym arkusza programu pliku arkusza kalkulacyjnego.W automatycznie utworzonych tabelach danych wejściowych wprowadź wzór w kolumnie współczynnika rozcieńczenia D, 0,01 w kolumnie objętość w mililitrach lub GW i cztery w kolumnie liczby probówek N. Wprowadź liczbę studzienek, w których rosły transkoniuwanty przy każdym rozcieńczeniu próbki i kliknij przycisk Oblicz wyniki, aby uzyskać wyniki jako najbardziej prawdopodobną liczbę na mililitr oraz górną i dolną granicę ufności 95%. Następnie podziel liczbę transkoniugantów przez liczbę jednostek tworzących kolonię dawcy i biorcy na mililitr, aby obliczyć częstotliwość koniugacji plazmidów.W tym reprezentatywnym eksperymencie częstość koniugacji obu plazmidów wzrastała przy wyższych szybkościach mieszania, przy maksymalnej różnicy w częstotliwości koniugacji obserwowanej między zerem a 400 RPM dla kultur wprowadzonych do plazmidu pBP136: gfp oraz między zerem a 200 RPM dla kultur, które zostały wprowadzone do plazmidu pCAR1: gfp. Aby określić gęstość komórek biorcy wymaganą do porównania prawdopodobieństwa koniugacji, przeprowadzono testy kojarzenia z różnymi gęstościami dawcy i biorcy. W tym reprezentatywnym eksperymencie transkoniuwanty pBP136:gfp wykryto w 100% studzienek zawierających jeden razy 10 do trzeciego CFU dawcy i jeden raz 10 do piątego do jednego razy 10 do siódmego CFU biorcy, a także te z 1 razy 10 do drugiego CFU dawcy i jeden razy 10 do szóstego do 10 do siódmego CFU biorcy, wskazując, że gęstość komórek była zbyt wysoka.Testy krycia z 10 CFU dawcy i 10 do szóstego lub 10 do piątego CFU biorcy skutkowały jednak zmniejszeniem liczby dodatnich dołków transkoniugowanych. W związku z tym przewidywano, że od 10 do piątej jtk biorcy będzie wymagane do krycia z pojedynczą komórką dawcy. Testy kojarzenia z pCAR1: gfp przy różnych gęstościach szczepów dawcy i biorcy wykazały podobne wyniki, chociaż ogólnie odsetek dodatnich basenek transkoniugantowych był znacznie niższy niż w przypadku pBP136: gfp.Zakładając, że komórki dawcy i biorcy mogą łączyć się ze sobą w podobny sposób, prawdopodobieństwo inicjacji koniugacji u dawcy pCAR1 było mniejsze niż u dawcy pBP136. Na podstawie tych wyników oszacowano, że od 10 do siódmej CFU biorcy było wymagane dla pojedynczej komórki dawcy posortowanej przez FACS. Po zliczeniu liczby dołków transkoniugujących dodatnich, odsetek basen transkoniugantowo-dodatnich dla pBP136: gfp określono jako większy niż dla pCAR1: gfp, wykazując ponad 36-krotną różnicę w prawdopodobieństwie koniugacji zainicjowanej przez dawcę między tymi dwoma plazmidami.Podczas wykonywania zabiegu należy pamiętać, aby zawsze ostrożnie rozcieńczać mieszanki bakteryjne.

high-resolution-comparison-of-bacterial-conjugation-frequencies

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Opisano szybką i wydajną metodę wprowadzania obcego DNA o określonym znaczeniu do wcześniej przygotowanych szczepów akceptorowych, nazywanych szczepami z platformą lądowania (landing pad strains). Metoda ta umożliwia specyficzną dla miejsca integrację kasety DNA w zaprojektowanym locus platformy lądowania danego szczepu, poprzez koniugację i ekspresję integrazu ΦC31.

Inżynieria bakteryjnego chromosomu w konkretnych miejscach: wymiana kasety zapośredniczona przez integrazę $\Phi$C31 (IMCE)

Źródło: Erdogan, F. i wsp., Testy kojarzenia koniugacyjnego do specyficznej dla sekwencji analizy białek transferowych zaangażowanych w koniugację bakteryjną. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia procedurę przenoszenia plazmidu F od dawcy do biorcy komórek E. coli przy użyciu plazmidu ratunkowego i selekcji transkoniugantów poprzez podwójną oporność na antybiotyki. Proces obejmuje mieszanie kultur bakteryjnych, inkubację bez wstrząsania, przerywanie par kojarzeniowych i posiewanie na...

F Transfer plazmidu i podwójna selekcja antybiotyków w E. coli

Źródło: Chetrit, D. i in. Zastosowanie obrazowania żywych komórek oraz tomografii krioelektronowej w celu wyróżnienia cech przestrzenno-skroniowych systemu sekrecji kropkowej/icm Legionella pneumophila . J. Vis. Exp. (2020).Ten film pokazuje przygotowanie i obrazowanie bakterii patogennych znakowanych fluorescencjonie. Agarozowe podkładki są najpierw przygotowywane i umieszczane w ramie klejącej. Na podkład aplikowana jest zawiesina genetycznie modyfikowanych bakterii ekspresujących...

Przygotowanie próbek i obrazowanie bakterii znakowanych fluorescencją

Tutaj prezentujemy protokół do wyeliminowania interesującego genu zaangażowanego w koniugację plazmidu, a następnie analizujemy wpływ jego braku za pomocą testów kojarzenia. Funkcja genu jest dalej badana w określonym regionie jego sekwencji za pomocą mutacji delecyjnych lub punktowych.

Testy kojarzenia koniugacyjnego do specyficznej dla sekwencji analizy białek transferowych biorących udział w koniugacji bakteryjnej

Opisujemy tutaj trzy różne protokoły do badania in vitro koniugacji, transdukcji i naturalnej transformacji u Staphylococcus aureus.

Metodologia badania horyzontalnego transferu genów u Staphylococcus aureus

Przedstawiona tutaj jest prosta metoda tworzenia biblioteki wstawiania transpozonów o dużej gęstości w Escherichia coli lub Shigella flexneri przy użyciu koniugacji bakteryjnej. Protokół ten pozwala na stworzenie kolekcji setek tysięcy unikalnych mutantów w bakteriach poprzez losową insercję genomową transpozonu.

Stworzenie gęstej biblioteki insercji transpozonów za pomocą koniugacji bakteryjnej w szczepach enterobakteryjnych, takich jak Escherichia coli czy Shigella flexneri

Tutaj prezentujemy protokół opisujący, jak i) złożyć samoreplikujący się wektor za pomocą modułowego zestawu narzędzi do klonowania CyanoGate, ii) wprowadzić wektor do sinicowego gospodarza przez koniugację, oraz iii) scharakteryzować transgeniczne szczepy sinic za pomocą czytnika płytek lub cytometrii przepływowej.

Modyfikacja genetyczna cyjanobakterii przez koniugację przy użyciu modułowego zestawu narzędzi do klonowania CyanoGate

Ta praca przedstawia metodę mikroskopową, która umożliwia obrazowanie na żywo pojedynczej komórki Escherichia coli w celu analizy i kwantyfikacji stochastycznego zachowania obwodów syntetycznych genów.

Ciągły pomiar szumu biologicznego u Escherichia coli za pomocą mikroskopii poklatkowej

Ten manuskrypt opisuje metodę wykorzystania mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczej komórki do wizualizacji i ilościowego określenia konkurencji bakterii w kokulturze.

Kwantyfikacja konkurencji międzybakteryjnej za pomocą obrazowania fluorescencyjnego pojedynczych komórek

Koniugacja pośredniczy w poziomym transferze genów poprzez mobilizację plazmidowego DNA przez dwie różne komórki, ułatwiając rozprzestrzenianie korzystnych genów. W pracy opisano szeroko stosowaną metodę skutecznego wykrywania sprzęgającego transferu plazmidu, opartą na zastosowaniu markerów różnicowych u plazmidu koniugacyjnego, dawcy i biorcy w celu wykrycia transkoniugacji.

Wykrywanie horyzontalnego transferu genów, w którym pośredniczą naturalne plazmidy koniugacyjne w E. coli

Poznaj metodę wysokiej rozdzielczości do wykrywania różnic w częstości koniugacji bakteryjnej. Protokół umożliwia precyzyjne pomiary transferu plazmidów między bakteriami.

Porównanie częstości koniugacji bakteryjnej w wysokiej rozdzielczości

Przeglądaj więcej filmów