Multimodalne obrazowanie wolumetryczne siatkówki za pomocą skośnej skaningowej oftalmoskopii laserowej (oSLO) i optycznej koherentnej tomografii (OCT)

Tutaj prezentujemy protokół pozwalający uzyskać trójwymiarową (3D) fluorescencję (3D) i obraz siatkówki OCT o dużym polu widzenia (FOV) za pomocą nowatorskiej platformy multimodalnej do obrazowania. Przedstawimy konfigurację systemu, metodę wyrównania i protokoły operacyjne. Przeprowadzone zostaną badania obrazowe in vivo, a ich wyniki zostaną przedstawione.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu okulistyki i obrazowania siatkówki. Takich jak obrazowanie i kwantyfikacja zaburzeń bariery krew-siatkówka i funkcji naczyń włosowatych siatkówki. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala uzyskać duże pole widzenia, trójwymiarowe, wielokontrastowe obrazowanie siatkówki dzięki zastosowaniu skośnego lasera skanującego w jednym skanowaniu rastrowym.

Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku diagnostyki retinopatii cukrzycowej i innych chorób przedsiatkówkowych. Ponieważ oSLO może uzyskać obrazy mikrokrążenia siatkówki o wysokim kontraście, aż do pojedynczych naczyń włosowatych w 3D. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w obrazowanie siatkówki, można ją również zastosować do innych systemów obrazowania wykorzystujących konwencjonalne soczewki obiektywowe.

Takich jak obrazowanie in vivo kory myszy. Źródło lasera super-continuum jest używane jako systemowe źródło lasera dla ukośnej skaningowej oftalmoskopii laserowej lub konfiguracji oSLO. Zakres światła widzialnego jest oddzielony od zakresu o wyższej długości fali przez pierwsze zwierciadło dichroiczne.

Widmo światła jest rozszerzane za pomocą pary pryzmatów dyspersyjnych, po tym jak wiązka przejdzie przez rozdzielacz wiązki polaryzacyjnej. Szczelina służy do wyboru zakresu długości fali wzbudzenia. A lustro odbija przefiltrowaną wiązkę z powrotem do pary pryzmatów, aby połączyć światło w światłowód jednomodowy.

Spektrometr służy do potwierdzenia wyboru długości fali na wyjściu światłowodu jednomodowego. Światłowód jednomodowy jest podłączony do dwóch kaskadowych łączników światłowodowych. Jeden z portów wyjściowych światłowodu z drugiego łącznika światłowodowego dostarcza światło do systemu oSLO.

W celu kolimacji lasera w systemie oSLO, laser jest odchylany przez zwierciadło galwanometru. System teleskopowy jeden do jednego przekazuje laser do drugiego zwierciadła galwanometru, a system teleskopowy trzy do jednego przekazuje laser do źrenicy oka. Dichroiczne zwierciadło w systemie teleskopów trzy do jednego odbija sygnały fluorescencyjne.

System teleskopów "trzy do jednego" i zwierciadło dichroiczne są zamontowane na niestandardowym suwaku na jaskółczy ogon, aby przesunąć oś optyczną i stworzyć ukośne oświetlenie skanowania. Ukośne oświetlenie umożliwia wolumetryczne obrazowanie fluorescencyjne bez konieczności wykonywania sekcji. Poprzez przesunięcie lasera ukośna wiązka jest skupiana na siatkówce, a następnie detekcja ukośna może uchwycić tomograficzny obraz fluorescencyjny wzdłuż ukośnej ścieżki wiązki.

Aby utworzyć ścieżkę optyczną obrazowania fluorescencji, fluorescencja jest odbijana przez zwierciadło dichroiczne i przekazywana do trzeciego zwierciadła galwanometru. Światło fluorescencyjne jest następnie przekazywane do soczewki obiektywu obrazującego za pomocą innego systemu teleskopu jeden do jednego. Pod trzecim zwierciadłem galwanometru zainstalowano dwa dodatkowe stopnie translacji, aby zapewnić redundancję stopni swobody w celu optymalizacji obrazu.

Ostateczny system obrazowania jest zamontowany na stoliku o trzech stopniach swobody. Obrót i dwie osie translacji. Kamera planarna służy do wykonywania przekrojowych obrazów fluorescencyjnych.

Kolejne lusterko dichroiczne oddziela zakres tylnej podczerwieni od pozostałego światła. Filtr długoprzepustowy służy do dalszego ograniczenia przepustowości do 800 do 900 nanometrów. Połącz wiązkę w światłowód jednomodowy.

Światłowód jednomodowy jest podłączony do drugiego portu wejściowego dwóch kaskadowych sprzęgaczy światłowodowych w celu połączenia z niebieskim wzbudzeniem oSLO. Światło z drugiego portu wyjściowego drugiego łącznika światłowodowego jest kierowane do ramienia referencyjnego OCT. Który ma płytki kompensujące dyspersję, filtr o zmiennej neutralnej gęstości i lustro odblaskowe.

Światło powrotne z ramienia referencyjnego i oka rekombinuje w drugim sprzęgaczu światłowodu i jest dostarczane do spektrometru OCT w celu odebrania sygnału. Korzystaj z oprogramowania systemu akwizycji danych napisanego w Labview i zmodyfikowanego na podstawie protokołu skanowania OCTA. Dla każdego b-scan, piłokształtna piła o 80% cyklu pracy z 500 krokami jest wyprowadzana przez analogową płytkę wyjściową do sterowania lustrem skanującym x-prime Fast.

Uruchamiaj kamerę skanowania liniowego na każdym kroku, aby uzyskać dane dla OCT, tylko wtedy, gdy lustro jest skierowane w kierunku skanowania do przodu. Ustaw czas naświetlania kamery skanującej liniowo na 17 mikrosekund. Aby uzyskać sygnał OCTA, powtórz pomiar pięć razy w tym samym miejscu b-scan.

Ustaw szybkość wyjściową AO na 100 kiloherców, a szybkość linii A OCT na 50 kiloherców. Steruj lustrem wolnoskanującym y-prime, GM1, za pomocą fali narastającej. Zsynchronizuj lustro deskanujące GM3 z GM1, aby zeskanować powolne skanowanie.

Uruchom kamerę planarną za pomocą innej karty wyjścia analogowego, aby uchwycić jeden obraz fluorescencyjny w każdej lokalizacji y-prime. Przytnij rozmiar obrazowania lub wrzuć sąsiednie piksele do kosza, aby zwiększyć szybkość i czułość zgodnie z potrzebami. Zacznij od potwierdzenia odpowiedniego poziomu znieczulenia u szczura poprzez brak odruchu odstawienia podczas szczypania wewnątrzpalcowego.

Po indukcji znieczulenia umieść szczura na uchwycie. Załóż stożek na nos, aby utrzymać znieczulenie przez pozostałą część eksperymentu. Nałóż 5 roztworów okulistycznych chlorowodorku tetrakainy na oko szczura w celu znieczulenia miejscowego.

Następnie rozszerz źrenicę 1% roztworem okulistycznym tropikamidu. Po dwóch minutach rozszerzania użyj jednomililitrowej strzykawki i igły o rozmiarze 29, aby wstrzyknąć 10% fluoresceiny lub 10% FITC rozcieńczonego w soli fizjologicznej przez żyłę ogonową. Następnie włącz źródło lasera i umieść filtr o neutralnej gęstości, aby stłumić wzbudzenie niebieskiego światła podczas wyrównywania.

Zmierz moc niebieskiego światła, upewniając się, że jest mniejsza niż 10 mikrowatów. Następnie przełącz się na światło optycznej tomografii koherentnej, upewniając się, że jest ono bliskie 8 miliwatów. Włącz zasilanie lustra galwanometru, które służy do sterowania kierunkiem lasera.

Dostosuj wysokość gałki ocznej, aby uzyskać nieruchomą plamkę lasera na rogówce. Dostosuj pozycję oka tak, aby krawędź źrenicy była mniej więcej prostopadła do lasera. I przesunąć laser do około 1,5 milimetra od wierzchołkowego środka oka.

Następnie wyreguluj uchwyt zwierzęcia, aż obrazy z optycznej tomografii koherentnej osiągną optymalną jakość. W kierunku szybkiego skanowania x-prime upewnij się, że obraz w przekroju poprzecznym b-scan jest płaski. Przełączając się na kierunek wolnego skanowania y-prime, upewnij się, że obraz b-scan przekroju poprzecznego wydaje się nachylony z powodu skanowania ukośnego.

Wyjmij filtr o neutralnej gęstości do wzbudzenia światła niebieskiego. I monitoruj obraz w czasie rzeczywistym z kamery. Powinien pojawić się przekrojowy obraz fluorescencyjny pokazujący naczynia krwionośne na różnych głębokościach.

Dostosuj ostrość końcowego systemu obrazowania fluorescencyjnego, aby osiągnąć optymalną ostrość. I wykonuj precyzyjne korekty pozycji oka w płaszczyźnie bocznej, aby uzyskać optymalną jakość obrazu z ukośnego skanowania laserowego. Po wyrównaniu zacznij wykonywać jednoczesną angiografię optycznej koherentnej tomografii i wolumetryczną angiografię fluoresceinową.

Zdjęcie przedstawia przekrojowy obraz siatkówki szczura z optycznej koherentnej tomografii koherentnej. Jest to angiografia optycznej tomografii koherentnej lub obraz OCTA tego samego obszaru. Oraz ukośna skaningowa oftalmoskopia laserowa i wolumetryczna angiografia fluoresceinowa obraz przekrojowej angiografii fluoresceinowej lub oSLO-VFA.

Analogicznie do optycznej koherentnej tomografii b-scan. W porównaniu z OCTA, ukośna skaningowa oftalmoskopia laserowa i wolumetryczny obraz przekroju poprzecznego angiografii fluoresceinowej wyraźnie identyfikują naczynia włosowate w zewnętrznej warstwie splotowatego. Powierzchowna warstwa siatkówki jest pokazana na zdjęciu OCTA.

Artefakty w postaci pionowych pasów są widoczne na obrazie. oSLO-VFA unika artefaktów ruchu poprzez wykorzystanie kontrastu emisji fluorescencji. W obrębie warstwy pośredniej siatkówki pionowo nurkujące naczynia są wyraźnie widoczne na obrazie oSLO FA.

Ale nie jest to widoczne w OCTA. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby unikać ciągłej ekspozycji oka na laser przez ponad dwie minuty. Unikaj wysuszenia rogówki i pozwól oku odpocząć przez co najmniej 30 sekund między sekcjami obrazowania, blokując światło.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak obrazowanie genetycznie zmodyfikowanych myszy w celu ekspresji białek fluorescencyjnych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania. Na przykład to, jak mogą zmieniać się określone typy komórek siatkówki i ciągnięcie za sobą obserwowane zmienne ze znanymi chorobami.