Name: Multimodalne obrazowanie wolumetryczne siatkówki za pomocą skośnej skaningowej oftalmoskopii laserowej (oSLO) i optycznej koherentnej tomografii (OCT) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Poznaj multimodalne obrazowanie siatkówki metodą oSLO i OCT dla diagnostyki oftalmologicznej. Technika umożliwia trójwymiarową wizualizację mikronaczyń siatkówki in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie pochodzi z funduszy Fundacji Evans Medical z Boston Medical Center, jak również z podwykonawstwa od NIH 5R01CA183101, pilotażowego grantu BU-CTSI 1UL1TR001430, programu pilotażowego BU-Joslin oraz BU-CTSI KL2TR001411.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami (ACUC) Centrum Medycznego w Bostonie.
1. Ustawienia systemu
<ol>
	<li>System oSLO
	<ol>
		<li>Użyj źródła lasera supercontinuum jako systemowego źródła lasera.
		<ol>
			<li>Oddziel zakres światła widzialnego (450-650 nm) od wyższego zakresu długości fali (650-2000 nm) za pomocą lustra dichroicznego (DM1). Rozszerz widmo za pomocą pary pryzmatów dyspersyjnych po wiązce przechodzącej przez rozdzielacz wiązki polaryzacyjnej (PBS).</li>
			<li>Umieść szczelinę, aby wybrać zakres długości fali wzbudzenia (475-495 nm). Użyj lustra odbijającego, aby odbić przefiltrowaną wiązkę z powrotem do pary pryzmatów, a następnie połącz światło w światłowód jednomodowy (SMF 1).</li>
			<li>Użyj spektrometru, aby potwierdzić wybór długości fali na wyjściu światłowodu jednomodowego.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Podłącz światłowód jednomodowy do dwóch kaskadowych łączników światłowodowych, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 2. Jeden z portów wyjściowych światłowodu z drugiego łącznika światłowodowego dostarcza światło do systemu oSLO.</li>
		<li>Najpierw skolimuj laser w systemie oSLO.
		<ol>
			<li>Odchylić laser za pomocą zwierciadła galwanometrycznego (GM1). Przekaż laser do drugiego zwierciadła galwanometrycznego (GM2) za pomocą systemu teleskopowego 1:1, a następnie przekaż do źrenicy oka za pomocą systemu teleskopu 3:1.</li>
			<li>Zainstaluj zwierciadło dichroiczne (DM2) w systemie teleskopu 3:1, aby odbijać sygnały fluorescencyjne.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zamontuj system teleskopu 3:1 i zwierciadło dichroiczne (DM2) na niestandardowym suwaku ogona gołębiega, aby przesunąć oś optyczną i utworzyć ukośne oświetlenie skanowania, jak pokazano na Rysunek 3. Użyj suwmiarki, aby precyzyjnie kontrolować długość przesunięcia zgodnie z potrzebami.</li>
		<li>Ścieżka optyczna obrazowania fluorescencyjnego.
		<ol>
			<li>Odbij fluorescencję przez zwierciadło dichroiczne i przekaż do trzeciego lustra galwanometru, aby odskanować powolne skanowanie.</li>
			<li>Przekaż światło do soczewki obiektywu obrazującego za pomocą innego systemu teleskopu 1:1. Zainstaluj powyższą optykę na etapie tłumaczenia. 
			UWAGA: Pod trzecim zwierciadłem galwanometru (GM3) zainstalowano dwa dodatkowe stopnie translacji, aby zapewnić redundancję stopni swobody w celu optymalizacji obrazowania.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zamontuj końcowy system obrazowania na stoliku, który ma trzy stopnie swobody (obrót i dwie osie translacji). Użyj kamery planarnej, aby uchwycić obrazy fluorescencji przekroju poprzecznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>System optycznej koherentnej tomografii
	<ol>
		<li>Użyj tego samego źródła lasera supercontinuum, co systemowe źródło lasera.
		<ol>
			<li>Oddziel zakres bliskiej podczerwieni (NIR) (650-900 nm) od pozostałego światła (650-2000 nm) za pomocą innego zwierciadła dichroicznego (DM3). Użyj filtra długoprzepustowego, aby jeszcze bardziej ograniczyć pasmo do 800-900 nm. Połącz wiązkę w światłowód jednomodowy (SMF 2).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Podłącz światłowód jednomodowy do drugiego portu wejściowego dwóch kaskadowych sprzęgaczy światłowodowych, aby połączyć się z niebieskim wzbudzeniem oSLO. Skieruj światło z drugiego portu wyjściowego drugiego łącznika światłowodowego do ramienia referencyjnego OCT, które ma filtr o zmiennej gęstości neutralnej (VNDF), płytki kompensacji dyspersji i lustro odbijające. 
		UWAGA: Światło wraca z ramienia referencyjnego, a oko rekombinuje się na drugim sprzęgaczu światłowodu i jest dostarczane do spektrometru OCT w celu zebrania sygnału.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja danych
	<ol>
		<li>Użyj oprogramowania systemu akwizycji danych napisanego w LabVIEW i zmodyfikowanego na podstawie protokołu skanowania OCTA7,8,9,10. Dla każdego B-scan, ząb piły o 80% cyklu pracy z 500 krokami jest wyprowadzany przez analogową płytkę wyjściową (AO1) do sterowania szybkim lustrem skanującym x, GM2.</li>
		<li>Uruchamiaj kamerę skanowania liniowego na każdym kroku, aby uzyskać dane dla OCT tylko wtedy, gdy lustro jest skierowane w kierunku skanowania do przodu. Ustaw czas naświetlania kamery liniowej na 17 μs.</li>
		<li>Aby uzyskać sygnał OCTA, powtórz pomiar 5 razy w tym samym miejscu B-scan.</li>
		<li>Ustaw częstotliwość wyjściową AO na 100 kHz, a częstotliwość wyjściową OCT A-line na 50 kHz. Kontroluj powolne lustro skanujące y, GM1, za pomocą narastającego kształtu fali. Zsynchronizuj lustro deskanowania, GM3, z GM1, aby odskanować powolne skanowanie.</li>
		<li>Uruchom kamerę planarną za pomocą innej karty wyjścia analogowego (AO2), aby przechwycić jeden obraz fluorescencyjny w każdym miejscu y'. Przytnij rozmiar obrazowania lub wrzuć sąsiednie piksele do kosza, aby zwiększyć szybkość i czułość zgodnie z potrzebami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wyrównanie systemu
<ol>
	<li>Wyreguluj szczelinę w źródle światła oSLO, aby wybrać niebieską długość fali wzbudzenia. Użyj spektrometru, aby monitorować zakres widmowy wynoszący około 475-490 nm.</li>
	<li>Wyreguluj suwak mocowania gołębiego ogona, aby przesunąć oś optyczną o ~5 mm. Spowoduje to przesunięcie źrenicy szczura o ~1,7 mm, co spowoduje ukośny kąt ~15° na siatkówce.</li>
	<li>Wyreguluj stopień translacji układu optycznego do wykrywania fluorescencji o te same 5 mm.</li>
	<li>Dostosuj końcowy system obrazowania fluorescencji na ~30°.</li>
	<li>Zmierz moc optyczną za pomocą miernika mocy. Upewnij się, że niebieska moc wzbudzenia oSLO wynosi ≤0,2 mW, a moc lasera OCT ≤0,8 mW, co nie spowoduje uszkodzenia siatkówki. 
	UWAGA: W oparciu o standard ANSI, maksymalna dopuszczalna ekspozycja (MPE) na siatkówkę jest na poziomie ~2mW7,8 w zakresie światła widzialnego. Zgodnie ze wzorem Delori i wsp.9, MPE dla światła bliskiej podczerwieni jest około dwa razy wyższe niż dla światła widzialnego, wynosząc około 4 mW.</li>
</ol>
3. Eksperyment na zwierzętach in vivo
<ol>
	<li>Przenieś 12-tygodniowego samca szczura Long Evans do komory indukcyjnej. Znieczulać szczura 4,5% izofluranem w tlenie przez 10 minut z natężeniem przepływu 2 l/min za pomocą parownika izofluranu.
	<ol>
		<li>Potwierdź głębokość znieczulenia określoną na podstawie braku odruchu odstawienia podczas szczypania międzypalcowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po indukcji umieść szczura na 5-osiowym (przesunięcia x, y, z, odchylenie i skok). Zapewnij dodatkowe ciepło za pomocą podgrzewanego etapu, cyrkulacyjnego koca z ciepłą wodą lub innej odpowiedniej metody w długotrwałym eksperymencie. Utrzymuj znieczulenie na poziomie 1,5% izofluoranu z natężeniem przepływu 2 litry/minuty podczas pozostałej części eksperymentu. Gdy nie używasz komory indukcyjnej z aktywnym wydechem, komorę indukcyjną należy umieścić na stole z prądem wstecznym lub zstępującym lub pod fajką w celu usunięcia izofluranu.</li>
	<li>Rozszerz źrenicę 1% roztworem okulistycznym Tropicamidu przez 2 minuty. Nałóż 0,5% roztwór okulistyczny Tetracaine HCl na oko szczura, aby w razie potrzeby zastosować dodatkowe znieczulenie miejscowe. Utrzymuj nawilżenie oka dostępnymi w handlu sztucznymi łzami co najmniej raz na minutę podczas eksperymentu.</li>
	<li>Wstrzyknąć sól fluoresceiny (10% w/w) lub FITC (10% w/w) rozcieńczoną w sterylnym roztworze soli fizjologicznej (0,1-0,3 ml) przez żyłę ogonową za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły 29G.</li>
	<li>Włącz źródło lasera. Umieść filtr o neutralnej gęstości, aby stłumić wzbudzenie niebieskiego światła podczas wyrównywania. Zmierz moc światła OCT na ~0,8 mW, a niebieskie światło <0,01 mW, aby uniknąć powstawania zaćmy.</li>
	<li>Uruchom tryb skanowania i wyrównywania galwanometru. Dostosuj wysokość gałki ocznej, aby uzyskać nieruchomą plamkę lasera na rogówce. Dostosuj pozycję oka szczura tak, aby krawędź źrenicy była mniej więcej prostopadła do lasera i przesuń laser do wierzchołkowego środka oka do około ~1,5 mm.</li>
	<li>Dalej dostosuj uchwyt na zwierzęta, aż obrazy OCT osiągną optymalną jakość. W kierunku szybkiego skanowania x upewnij się, że obraz B-scan w przekroju poprzecznym jest płaski. Przełączając się na kierunek powolnego skanowania y, upewnij się, że obraz B-skanowania przekroju poprzecznego wydaje się nachylony ze względu na skanowanie ukośne.</li>
	<li>Usuń filtr o neutralnej gęstości do wzbudzenia światła niebieskiego i monitoruj obraz w czasie rzeczywistym z kamery. Powinien pojawić się przekrój poprzeczny obrazu fluorescencyjnego pokazujący naczynia krwionośne pojawiające się na różnych głębokościach.
	<ol>
		<li>Dostosuj ostrość końcowego systemu obrazowania fluorescencyjnego, aby osiągnąć optymalną ostrość. Umożliwia precyzyjną regulację pozycji oka w płaszczyźnie bocznej, aby osiągnąć optymalną jakość obrazu oSLO.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po wyrównaniu zacznij wykonywać jednoczesną angiografię OCTA i wolumetryczną angiografię fluoresceinową (vFA).</li>
	<li>Skonstruuj obrazy wolumetryczne zarówno dla OCTA, jak i oSLO za pomocą Matlaba. Algorytmy zostały wcześniej szczegółowo opisane10. Generuj naczynia krwionośne siatkówki z rozdzielczością głębokościową poprzez segmentację obrazu.</li>
	<li>Po zakończeniu obrazowania wyłącz laser, uwolnij zwierzę i nałóż trochę maści okulistycznej na oczy, a następnie umieść zwierzę w pudełku do odzyskiwania.</li>
	<li>Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka lub zgodnie z polityką instytucjonalną.</li>
</ol>

<ol><li>Webb, R. H., Hughes, G. W., Delori, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+scanning+laser+ophthalmoscope%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Optics%22%5BJournal%5D)">Confocal scanning laser ophthalmoscope.</a> Applied Optics. 26 (8), 1492-1499 (1987).</li>
<li>Roorda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+optics+scanning+laser+ophthalmoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy.</a> Optics Express. 10 (9), 405-412 (2002).</li>
<li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4638169/">Optical coherence tomography.</a> Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).</li>
<li>de Carlo, T. E., Romano, A., Waheed, N. K., Duker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+optical+coherence+tomography+angiography+%28OCTA%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Retina+and+Vitreous%22%5BJournal%5D)">A review of optical coherence tomography angiography (OCTA).</a> International Journal of Retina and Vitreous. 1 (1), 5(2015).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Optical+Coherence+Tomography+Angiography+of+Choroidal+Neovascularization+in+Age-Related+Macular+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Quantitative Optical Coherence Tomography Angiography of Choroidal Neovascularization in Age-Related Macular Degeneration.</a> Ophthalmology. 121 (7), 1435-1444 (2014).</li>
<li>Chen, C. -L., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+based+angiography+%5BInvited%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography based angiography [Invited].</a> Biomedical Optics Express. 8 (2), 1056-1082 (2017).</li>
<li>Yi, J., Chen, S. Y., Shu, X., Fawzi, A. A., Zhang, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+retinal+imaging+using+visible-light+optical+coherence+tomography+guided+by+scanning+laser+ophthalmoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Human retinal imaging using visible-light optical coherence tomography guided by scanning laser ophthalmoscopy.</a> Biomedical Optics Express. 6 (10), 3701-3713 (2015).</li>
<li>Zhang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-band+spectral-domain+optical+coherence+tomography+for+in+vivo+imaging+the+spectral+contrasts+of+the+retinal+nerve+fiber+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Dual-band spectral-domain optical coherence tomography for in vivo imaging the spectral contrasts of the retinal nerve fiber layer.</a> Optics Express. 19 (20), 19653-19667 (2011).</li>
<li>Delori, F. C., Webb, R. H., Sliney, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximum+permissible+exposures+for+ocular+safety+%28ANSI+2000%29%2C+with+emphasis+on+ophthalmic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Optical+Society+of+America+a-Optics+Image+Science+and+Vision%22%5BJournal%5D)">Maximum permissible exposures for ocular safety (ANSI 2000), with emphasis on ophthalmic devices.</a> Journal of the Optical Society of America a-Optics Image Science and Vision. 24 (5), 1250-1265 (2007).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+fluorescence+retinal+imaging+in+vivo+over+a+30-degree+field+of+view+by+oblique+scanning+laser+ophthalmoscopy+%28oSLO%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Volumetric fluorescence retinal imaging in vivo over a 30-degree field of view by oblique scanning laser ophthalmoscopy (oSLO).</a> Biomedical Optics Express. 9 (1), 25-40 (2018).</li>
</ol>

Ji Yi posiada oczekujący patent na oSLO. Pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Tutaj opisaliśmy oSLO, technikę wolumetrycznego obrazowania fluorescencyjnego siatkówki in vivo z polem widzenia powyżej 30°. W porównaniu z OCT, obecną standardową metodą obrazowania w okulistyce, oSLO oferuje podobne możliwości obrazowania 3D, ale umożliwia kontrast fluorescencyjny, na który OCT nie jest wrażliwy. Zaletą oSLO jest to, że wymaga tylko jednego skanu rastrowego, a tym samym umożliwia bezproblemowe połączenie OCT, zapewniając dwie uzupełniające się techniki strukturalnego i fluorescencyjnego obraz...

Okulistyka i nauka o widzeniu czerpią ogromne korzyści z nowoczesnych technik obrazowania optycznego, ponieważ siatkówka jest łatwo dostępna za pomocą światła. Fluorescencyjne obrazowanie siatkówki jest niezbędnym narzędziem w diagnostyce i leczeniu chorób naczyniowych naczyń naczyniowych naczyniówkowo-siatkówkowych, takich jak retinopatia cukrzycowa (DR) i zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD), które są głównymi przyczynami ślepoty w Stanach Zjednoczonych.
Jednak nadal trudno jest uzyskać duże pole widzenia (FOV), trójwymiarowe (3D) obrazowanie siatkówki za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Fotografia dna oka nie ma zdolności rozdzielczej głębi i nie odrzuca rozproszonego światła. W rezultacie mieszanie sygnałów o różnej głębokości obniża jakość obrazu. Skaningowa oftalmoskopia laserowa (SLO) i konfokalna SLO (cSLO) mogą zmniejszyć efekt rozproszonego światła za pomocą bramkowania konfokalnego1. Jednak SLO lub cSLO ma trudności z uzyskaniem obrazu 3D ludzkiej siatkówki ze względu na ograniczenie ich głębokości ostrości. Optyka adaptatywna SLO (AOSLO) może zapewnić doskonałą rozdzielczość i kontrast poprzez korekcję aberracji czoła fali wprowadzanych przez ludzkie oko. Jednak AOSLO nadal wymagałoby stosu z do obrazowania wolumetrycznego2. Optyczna tomografia koherentna (OCT)3 i systemy angiografii OCT (OCTA) pokonują te ograniczenia, zapewniając trójwymiarowe (3D) obrazy anatomiczne i naczyniowe4,5,6, ale bezbarwny charakter OCT nie może wizualizować przecieku wskazującego na dysfunkcję naczyń krwionośnych.
Ten protokół opisuje nowatorską platformę multimodalną do wolumetrycznego obrazowania siatkówki fluorescencji 3D, a mianowicie ukośną skaningową oftalmoskopię laserową (oSLO). W tym systemie obrazowania skanowanie ukośne jest generowane przez suwak ogona gołębiega, a końcowy system obrazowania jest ustawiany pod kątem w celu wykrycia obrazów przekroju fluorescencyjnego. System wykorzystuje metody skanowania laserowego, które umożliwiają łatwą integrację z OCT jako uzupełniającą wolumetryczną metodę obrazowania strukturalnego. Aktualna rozdzielczość głębokości wynosi około 25 μm w siatkówce szczura, a pole widzenia wynosi 30°. Zasadniczo, oSLO pozwala na fluorescencyjną wersję OCT i może być jednocześnie łączony z OCT i OCTA w dużym polu widzenia.
W tym protokole opiszemy konfigurację oSLO, metodę dopasowania i konstrukcji, metodę obrazowania in vivo siatkówki szczura oraz reprezentatywne wyniki.

<table><tbody><tr><td>Źródło lasera Supercontinuum</td><td>NKT Photonics</td><td>SuperK EXTREME EXU-OCT6</td><td></td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne (DM1)</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP650R</td><td></td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne (DM2)Lustro dichroiczne</td> <td>Chroma</td><td>ZT514/1064rpc</td><td></td></tr><tr><td>(DM3)</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP900R</td><td></td></tr><tr><td>światłowód jednomodowy (SMF 1)</td><td>Thorlabs</td><td>P3-460B-FC-2</td><td></td></tr><tr><td>Światłowód jednomodowy (SMF 2)</td><td>Thorlabs</td><td>P3-780A-FC-2</td><td></td></tr><tr><td>Łącznik światłowodowy</td><td>Thorlabs</td><td>TW850R5A2</td><td></td></tr><tr><td>System teleskopów 1:1</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-100-A&czasy; </td><td></td>2</tr><tr><td>System teleskopów 3:1</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A&czasy; </td><td></td>2</tr><tr><td>System teleskopów 3:1</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-50-A&czasy; </td><td></td>2</tr><tr><td>lustra Galvo (GM1,GM2)</td><td>Thorlabs</td><td>GVS201 i razy; </td><td></td>2</tr><tr><td>De-sacn Galvo Mirrors (GM3)</td><td>Thorlabs</td><td>GVS011</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw</td><td>Olympus</td><td>UplanSApo 20&times;/0.75</td><td></td></tr><tr><td>Końcowy system obrazowania</td><td>Olympus</td><td>UplanFL N 10&times;/0.3</td><td></td></tr><tr><td>Końcowy system obrazowania</td><td>Computar</td><td>12-36mm/1:2.8</td><td></td></tr><tr><td>Aparat</td><td>PCO</td><td>Pco.pixelfly usb</td><td></td></tr><tr><td>Filtr</td><td>Thorlabs</td><td>FEL0800</td><td></td></tr><tr><td>Bezstopniowy filtr ND</td><td>Thorlabs</td><td>NDC-50C-4M-A Kamera</td> do skanowania liniowego <td></td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>SPL2048-140K</td><td></td></tr><tr><td>Analogowa karta wyjściowa (AO1)</td><td>National Instrument</td><td>PCI-6731</td><td></td></tr><tr><td>Analogowa karta wyjściowa (AO2)</td><td>National Instrument</td><td>PCIe-6351</td><td></td></tr><tr><td>Filtr długoprzepustowy</td><td>Thorlabs</td><td>FEL0800</td><td></td></tr></tbody></table>

multimodalne obrazowanie wolumetryczne siatkówki za pomocą skośnej skaningowej oftalmoskopii laserowej (oslo) i optycznej koherentnej tomografii (oct)

Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy (oSLO) and Optical Coherence Tomography (OCT)

Chociaż obrazowanie fluorescencyjne jest szeroko stosowane w okulistyce, trójwymiarowy (3D) obraz fluorescencji siatkówki o dużym polu widzenia (FOV) jest nadal dużym wyzwaniem przy najnowocześniejszych metodach obrazowania siatkówki, ponieważ wymagałyby one układania w stos z w celu skompilowania wolumetrycznego zestawu danych. Nowsze systemy optycznej koherentnej tomografii (OCT) i angiografii OCT (OCTA) pokonują te ograniczenia, aby zapewnić trójwymiarowe (3D) obrazy anatomiczne i naczyniowe, ale bezbarwny charakter OCT nie może wizualizować przecieku wskazującego na dysfunkcję naczyń. Protokół ten opisuje nowatorską technikę ukośnej skaningowej oftalmoskopii laserowej (oSLO), która zapewnia wolumetryczne obrazowanie fluorescencji siatkówki 3D. Konfiguracja systemu obrazowania generuje skanowanie ukośne za pomocą suwaka gołębiego ogona i wyrównuje końcowy system obrazowania pod kątem, aby wykryć fluorescencyjne obrazy przekroju poprzecznego. System wykorzystuje metodę skanowania laserowego, a zatem umożliwia łatwe włączenie OCT jako uzupełniającej metody wolumetrycznego obrazowania strukturalnego. Obrazowanie in vivo siatkówki szczura przedstawiono tutaj. Roztwór fluoresceiny wstrzykuje się dożylnie w celu wytworzenia wolumetrycznej angiografii fluoresceinowej (vFA).

Rycina 4a przedstawia przekrój OCT siatkówki szczura. Ryciny 4b-4c pokazują te same obrazy przekrojowe siatkówki uzyskane metodą OCTA oraz oSLO vFA, zarejestrowane w tym samym czasie. oSLO umożliwia uzyskanie przekrojowego obrazu FA analogicznego do B-skanu OCT. W porównaniu do OCTA, obraz przekrojowy oSLO vFA wyraźnie wskazuje naczynia w warstwie włókien nerwowych (NFL) i warstwie komórek zwojowych (GCL), a takż...

Tutaj prezentujemy protokół pozwalający uzyskać trójwymiarową (3D) fluorescencję (3D) i obraz siatkówki OCT o dużym polu widzenia (FOV) za pomocą nowatorskiej platformy multimodalnej do obrazowania. Przedstawimy konfigurację systemu, metodę wyrównania i protokoły operacyjne. Przeprowadzone zostaną badania obrazowe in vivo, a ich wyniki zostaną przedstawione.

Multimodalne obrazowanie wolumetryczne siatkówki za pomocą skośnej skaningowej oftalmoskopii laserowej (oSLO) i optycznej koherentnej tomografii (OCT)

While fluorescence imaging is widely used in ophthalmology, a large field of view (FOV) three-dimensional (3D) fluorescence retinal image is still a big ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu okulistyki i obrazowania siatkówki. Takich jak obrazowanie i kwantyfikacja zaburzeń bariery krew-siatkówka i funkcji naczyń włosowatych siatkówki. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala uzyskać duże pole widzenia, trójwymiarowe, wielokontrastowe obrazowanie siatkówki dzięki zastosowaniu skośnego lasera skanującego w jednym skanowaniu rastrowym.Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku diagnostyki retinopatii cukrzycowej i innych chorób przedsiatkówkowych. Ponieważ oSLO może uzyskać obrazy mikrokrążenia siatkówki o wysokim kontraście, aż do pojedynczych naczyń włosowatych w 3D. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w obrazowanie siatkówki, można ją również zastosować do innych systemów obrazowania wykorzystujących konwencjonalne soczewki obiektywowe.Takich jak obrazowanie in vivo kory myszy. Źródło lasera super-continuum jest używane jako systemowe źródło lasera dla ukośnej skaningowej oftalmoskopii laserowej lub konfiguracji oSLO. Zakres światła widzialnego jest oddzielony od zakresu o wyższej długości fali przez pierwsze zwierciadło dichroiczne.Widmo światła jest rozszerzane za pomocą pary pryzmatów dyspersyjnych, po tym jak wiązka przejdzie przez rozdzielacz wiązki polaryzacyjnej. Szczelina służy do wyboru zakresu długości fali wzbudzenia. A lustro odbija przefiltrowaną wiązkę z powrotem do pary pryzmatów, aby połączyć światło w światłowód jednomodowy.Spektrometr służy do potwierdzenia wyboru długości fali na wyjściu światłowodu jednomodowego. Światłowód jednomodowy jest podłączony do dwóch kaskadowych łączników światłowodowych. Jeden z portów wyjściowych światłowodu z drugiego łącznika światłowodowego dostarcza światło do systemu oSLO.W celu kolimacji lasera w systemie oSLO, laser jest odchylany przez zwierciadło galwanometru. System teleskopowy jeden do jednego przekazuje laser do drugiego zwierciadła galwanometru, a system teleskopowy trzy do jednego przekazuje laser do źrenicy oka. Dichroiczne zwierciadło w systemie teleskopów trzy do jednego odbija sygnały fluorescencyjne.System teleskopów "trzy do jednego" i zwierciadło dichroiczne są zamontowane na niestandardowym suwaku na jaskółczy ogon, aby przesunąć oś optyczną i stworzyć ukośne oświetlenie skanowania. Ukośne oświetlenie umożliwia wolumetryczne obrazowanie fluorescencyjne bez konieczności wykonywania sekcji. Poprzez przesunięcie lasera ukośna wiązka jest skupiana na siatkówce, a następnie detekcja ukośna może uchwycić tomograficzny obraz fluorescencyjny wzdłuż ukośnej ścieżki wiązki.Aby utworzyć ścieżkę optyczną obrazowania fluorescencji, fluorescencja jest odbijana przez zwierciadło dichroiczne i przekazywana do trzeciego zwierciadła galwanometru. Światło fluorescencyjne jest następnie przekazywane do soczewki obiektywu obrazującego za pomocą innego systemu teleskopu jeden do jednego. Pod trzecim zwierciadłem galwanometru zainstalowano dwa dodatkowe stopnie translacji, aby zapewnić redundancję stopni swobody w celu optymalizacji obrazu.Ostateczny system obrazowania jest zamontowany na stoliku o trzech stopniach swobody. Obrót i dwie osie translacji. Kamera planarna służy do wykonywania przekrojowych obrazów fluorescencyjnych.Kolejne lusterko dichroiczne oddziela zakres tylnej podczerwieni od pozostałego światła. Filtr długoprzepustowy służy do dalszego ograniczenia przepustowości do 800 do 900 nanometrów. Połącz wiązkę w światłowód jednomodowy.Światłowód jednomodowy jest podłączony do drugiego portu wejściowego dwóch kaskadowych sprzęgaczy światłowodowych w celu połączenia z niebieskim wzbudzeniem oSLO. Światło z drugiego portu wyjściowego drugiego łącznika światłowodowego jest kierowane do ramienia referencyjnego OCT. Który ma płytki kompensujące dyspersję, filtr o zmiennej neutralnej gęstości i lustro odblaskowe.Światło powrotne z ramienia referencyjnego i oka rekombinuje w drugim sprzęgaczu światłowodu i jest dostarczane do spektrometru OCT w celu odebrania sygnału. Korzystaj z oprogramowania systemu akwizycji danych napisanego w Labview i zmodyfikowanego na podstawie protokołu skanowania OCTA. Dla każdego b-scan, piłokształtna piła o 80% cyklu pracy z 500 krokami jest wyprowadzana przez analogową płytkę wyjściową do sterowania lustrem skanującym x-prime Fast.Uruchamiaj kamerę skanowania liniowego na każdym kroku, aby uzyskać dane dla OCT, tylko wtedy, gdy lustro jest skierowane w kierunku skanowania do przodu. Ustaw czas naświetlania kamery skanującej liniowo na 17 mikrosekund. Aby uzyskać sygnał OCTA, powtórz pomiar pięć razy w tym samym miejscu b-scan.Ustaw szybkość wyjściową AO na 100 kiloherców, a szybkość linii A OCT na 50 kiloherców. Steruj lustrem wolnoskanującym y-prime, GM1, za pomocą fali narastającej. Zsynchronizuj lustro deskanujące GM3 z GM1, aby zeskanować powolne skanowanie.Uruchom kamerę planarną za pomocą innej karty wyjścia analogowego, aby uchwycić jeden obraz fluorescencyjny w każdej lokalizacji y-prime. Przytnij rozmiar obrazowania lub wrzuć sąsiednie piksele do kosza, aby zwiększyć szybkość i czułość zgodnie z potrzebami. Zacznij od potwierdzenia odpowiedniego poziomu znieczulenia u szczura poprzez brak odruchu odstawienia podczas szczypania wewnątrzpalcowego.Po indukcji znieczulenia umieść szczura na uchwycie. Załóż stożek na nos, aby utrzymać znieczulenie przez pozostałą część eksperymentu. Nałóż 5 roztworów okulistycznych chlorowodorku tetrakainy na oko szczura w celu znieczulenia miejscowego.Następnie rozszerz źrenicę 1% roztworem okulistycznym tropikamidu. Po dwóch minutach rozszerzania użyj jednomililitrowej strzykawki i igły o rozmiarze 29, aby wstrzyknąć 10% fluoresceiny lub 10% FITC rozcieńczonego w soli fizjologicznej przez żyłę ogonową. Następnie włącz źródło lasera i umieść filtr o neutralnej gęstości, aby stłumić wzbudzenie niebieskiego światła podczas wyrównywania.Zmierz moc niebieskiego światła, upewniając się, że jest mniejsza niż 10 mikrowatów. Następnie przełącz się na światło optycznej tomografii koherentnej, upewniając się, że jest ono bliskie 8 miliwatów. Włącz zasilanie lustra galwanometru, które służy do sterowania kierunkiem lasera.Dostosuj wysokość gałki ocznej, aby uzyskać nieruchomą plamkę lasera na rogówce. Dostosuj pozycję oka tak, aby krawędź źrenicy była mniej więcej prostopadła do lasera. I przesunąć laser do około 1,5 milimetra od wierzchołkowego środka oka.Następnie wyreguluj uchwyt zwierzęcia, aż obrazy z optycznej tomografii koherentnej osiągną optymalną jakość. W kierunku szybkiego skanowania x-prime upewnij się, że obraz w przekroju poprzecznym b-scan jest płaski. Przełączając się na kierunek wolnego skanowania y-prime, upewnij się, że obraz b-scan przekroju poprzecznego wydaje się nachylony z powodu skanowania ukośnego.Wyjmij filtr o neutralnej gęstości do wzbudzenia światła niebieskiego. I monitoruj obraz w czasie rzeczywistym z kamery. Powinien pojawić się przekrojowy obraz fluorescencyjny pokazujący naczynia krwionośne na różnych głębokościach.Dostosuj ostrość końcowego systemu obrazowania fluorescencyjnego, aby osiągnąć optymalną ostrość. I wykonuj precyzyjne korekty pozycji oka w płaszczyźnie bocznej, aby uzyskać optymalną jakość obrazu z ukośnego skanowania laserowego. Po wyrównaniu zacznij wykonywać jednoczesną angiografię optycznej koherentnej tomografii i wolumetryczną angiografię fluoresceinową.Zdjęcie przedstawia przekrojowy obraz siatkówki szczura z optycznej koherentnej tomografii koherentnej. Jest to angiografia optycznej tomografii koherentnej lub obraz OCTA tego samego obszaru. Oraz ukośna skaningowa oftalmoskopia laserowa i wolumetryczna angiografia fluoresceinowa obraz przekrojowej angiografii fluoresceinowej lub oSLO-VFA.Analogicznie do optycznej koherentnej tomografii b-scan. W porównaniu z OCTA, ukośna skaningowa oftalmoskopia laserowa i wolumetryczny obraz przekroju poprzecznego angiografii fluoresceinowej wyraźnie identyfikują naczynia włosowate w zewnętrznej warstwie splotowatego. Powierzchowna warstwa siatkówki jest pokazana na zdjęciu OCTA.Artefakty w postaci pionowych pasów są widoczne na obrazie. oSLO-VFA unika artefaktów ruchu poprzez wykorzystanie kontrastu emisji fluorescencji. W obrębie warstwy pośredniej siatkówki pionowo nurkujące naczynia są wyraźnie widoczne na obrazie oSLO FA.Ale nie jest to widoczne w OCTA. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby unikać ciągłej ekspozycji oka na laser przez ponad dwie minuty. Unikaj wysuszenia rogówki i pozwól oku odpocząć przez co najmniej 30 sekund między sekcjami obrazowania, blokując światło.Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak obrazowanie genetycznie zmodyfikowanych myszy w celu ekspresji białek fluorescencyjnych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania. Na przykład to, jak mogą zmieniać się określone typy komórek siatkówki i ciągnięcie za sobą obserwowane zmienne ze znanymi chorobami.

multimodal-volumetric-retinal-imaging-oblique-scanning-laser

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Całkowity przepływ krwi w siatkówce jest pomiarowany za pomocą optycznej koherentnej tomografii Dopplera oraz oprogramowania do półautomatycznej oceny.

Dopplerowska optyczna koherentna tomografia krążenia siatkówki

Oftalmologia fotoakustyczna (PAOM), będąca modalnością obrazowania opartą na absorpcji optycznej, umożliwia uzupełniającą ocenę siatkówki w stosunku do obecnie dostępnych technologii obrazowania okulistycznego. Przedstawiamy zastosowanie PAOM zintegrowanego z optyczną koherencyjną tomografią w domenie widmowej (SD-OCT) do jednoczesnego multimodalnego obrazowania siatkówki u szczurów.

Zintegrowana fotoakustyczna oftalmoskopia i optyczna koherentna tomografia w dziedzinie widmowej

Source: Jagodzińska, J., et. al., optyczna tomografia koherentna: obrazowanie komórek zwojowych siatkówki myszy . J. Vis. Exp. (2017)  W tym filmie pokazujemy zastosowanie optycznej koherentnej tomografii w domenie spektralnej (SD-OCT) do obrazowania warstw siatkówki i oceny zmian strukturalnych w genetycznie zmodyfikowanym modelu myszy z neuropatią nerwu wzrokowego.

Obrazowanie in vivo siatkówki myszy za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Ten manuskrypt opisuje protokół obrazowania in vivo siatkówki myszy za pomocą optycznej koherentnej tomografii spektralnej o wysokiej rozdzielczości (SD-OCT). Koncentruje się na komórkach zwojowych siatkówki (RGC) w okolicy okołobrodawkowatej, z opisanymi kilkoma podejściami do skanowania i kwantyfikacji.

Optyczna tomografia koherentna: obrazowanie komórek zwojowych siatkówki myszy in vivo

Tutaj demonstrujemy nowatorskie podejście do wykorzystania wysokiej rozdzielczości optycznej koherentnej tomografii spektralnej (HR-SD-OCT) do wspomagania dostarczania środków terapii genowej do przestrzeni podsiatkówkowej, oceny jej zasięgu powierzchniowego i charakteryzowania żywotności fotoreceptorów.

Optyczna koherentna tomografia myszy o ultrawysokiej rozdzielczości wspomagająca wstrzyknięcie do gałki ocznej w badaniach nad terapią genową siatkówki

Ten manuskrypt opisuje nowatorską procedurę konfiguracji i obsługi mikroskopii fotoakustycznej i optycznej koherentnej tomografii dual-modality do nieinwazyjnego, bezznacznikowego obrazowania kosmówkowo-siatkówkowego większych zwierząt, takich jak króliki.

Nowatorska mikroskopia fotoakustyczna i optyczna tomografia koherentna Obrazowanie naczyniówkowe siatkówki dwumodalnej w żywych oczach królika

Przedstawiono szczegółowy protokół oceny odczytów strukturalnych i wizualnych u gryzoni za pomocą optycznej koherentnej tomografii i odpowiedzi optokinetycznej. Wyniki dostarczają cennych informacji dla badań okulistycznych i neurologicznych.

Wykorzystanie optycznej tomografii koherentnej i odpowiedzi optokinetycznej jako strukturalnych i funkcjonalnych odczytów układu wzrokowego u myszy i szczurów

Tutaj opisujemy użycie optycznej koherentnej tomografii spektralnej (SD-OCT) do wizualizacji struktur siatkówki i oka in vivo w modelach zwyrodnienia siatkówki, jaskry, retinopatii cukrzycowej i krótkowzroczności.

Strukturalne oceny in vivo chorób oczu w modelach gryzoni przy użyciu optycznej koherentnej tomografii

Tutaj opisujemy technikę obrazowania in vivo wykorzystującą optyczną koherentną tomografię ułatwiającą diagnozę i ilościowy pomiar retinopatii u myszy.

Zastosowanie optycznej koherentnej tomografii do mysiego modelu retinopatii

Optyczna koherentna tomografia o wysokiej rozdzielczości (HR-OCT) jest obiecującą nieinwazyjną metodą diagnozowania i oceny terapeutycznej płaskonabłonkowej powierzchni oka (OSSN). W tym miejscu przedstawiono konfigurację systemu, technikę skanowania i reprezentatywne wyniki diagnostyczne.

Optyczna koherentna tomografia koherentna przedniej części oka w diagnostyce i monitorowaniu terapeutycznym płaskonabłonkowej powierzchni oka

Poznaj multimodalne obrazowanie siatkówki metodą oSLO i OCT dla diagnostyki oftalmologicznej. Technika umożliwia trójwymiarową wizualizację mikronaczyń siatkówki in vivo.

Multimodalne obrazowanie wolumetryczne siatkówki za pomocą skośnej skaningowej oftalmoskopii laserowej (oSLO) i optycznej koherentnej tomografii (OCT) (Wideo) | JoVE Journal

Multimodalne obrazowanie wolumetryczne siatkówki za pomocą skośnej skaningowej oftalmoskopii laserowej (oSLO) i optycznej koherentnej tomografii (OCT)

Przeglądaj więcej filmów