Name: Metoda zestawu replik: wysokoprzepustowe podejście do ilościowego pomiaru długości życia Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Poznaj metodę zestawu replik do ilościowego pomiaru długości życia i zdrowia Caenorhabditis elegans. To wysokoprzepustowe podejście umożliwia badanie genetycznych zależności wpływających na starzenie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Finansowanie tej pracy opisanej w tym manuskrypcie zostało zapewnione przez: Biuro Rektora Uniwersytetu w Rochester oraz Dziekanat Szkoły Medycyny i Stomatologii za pośrednictwem Centrum Nauk o Zdrowiu dla Innowacji Obliczeniowych (HSCCI); Stypendium Ellison Medical Foundation New Scholars in Aging (AG-NS-0681-10) Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badań, gromadzenie i analiza danych, decyzja o publikacji lub przygotowanie manuskryptu.

<ol><li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+by+ingested+dsRNA+%5B10%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific interference by ingested dsRNA [10].</a> Nature. 395 (6705), 854(1998).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biology. 2 (1), (2000).</li>
<li>Winston, W. M., Sutherlin, M., Wright, A. J., Feinberg, E. H., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+SID-2+is+required+for+environmental+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans SID-2 is required for environmental RNA interference.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (25), 10565-10570 (2007).</li>
<li>Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+RNAi+in+C.+elegans+requires+the+putative+transmembrane+protein+SID-1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1.</a> Science. 295 (5564), 2456-2459 (2002).</li>
<li>Grishok, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+mechanisms+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans.</a> FEBS letters. 579 (26), 5932-5939 (2005).</li>
<li>Ceron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+Improving+Caenorhabditis+elegans+Phenome+Mapping+With+an+ORFeome-Based+RNAi+Library%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Toward Improving Caenorhabditis elegans Phenome Mapping With an ORFeome-Based RNAi Library.</a> Genome Research. 14 (14), 2162-2168 (2004).</li>
<li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li>
<li>Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+activities+that+mediate+increased+life+span+of+C.+elegans+insulin-like+signaling+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants.</a> Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).</li>
<li>Petrascheck, M., Miller, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+Analysis+of+Lifespan+Experiment+Reproducibility%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Computational Analysis of Lifespan Experiment Reproducibility.</a> Frontiers in Genetics. 8 (June), (2017).</li>
<li>Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Caenorhabditis+elegans+Genes+Regulating+Longevity+Using+Enhanced+RNAi-sensitive+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of Caenorhabditis elegans Genes Regulating Longevity Using Enhanced RNAi-sensitive Strains.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. LXXII, 489-497 (2007).</li>
<li>R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.r-project.org/">https://www.r-project.org/</a> (2018).</li>
<li>Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+cycle+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).</li>
<li>Shi, C., Murphy, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mating+Induces+Shrinking+and+Death+in+Caenorhabditis+Mothers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mating Induces Shrinking and Death in Caenorhabditis Mothers.</a> Science. 343 (6170), 536-540 (2014).</li>
<li>Hodgkin, J. Male Phenotypes and Mating Efficiency in CAENORHABDITIS ELEGANS. Genetics. 103 (1), Available from:
 <a target="_blank" href="http://europepmc.org/articles/PMC1202023/?report=abstract">http://europepmc.org/articles/PMC1202023/?report=abstract</a> 43-64 (1983).</li>
<li>Kaplan, E. L., Meier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonparametric+Estimation+from+Incomplete+Observations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Statistical+Association%22%5BJournal%5D)">Nonparametric Estimation from Incomplete Observations.</a> Journal of the American Statistical Association. 5318910 (282), 457-481 (1958).</li>
<li>Mantel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+survival+data+and+two+new+rank+order+statistics+arising+in+its+consideration%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemotherapy+Reports%22%5BJournal%5D)">Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration.</a> Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).</li>
<li>Rechavi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starvation-induced+transgenerational+inheritance+of+small+RNAs+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Starvation-induced transgenerational inheritance of small RNAs in C. elegans.</a> Cell. , (2014).</li>
<li>Larance, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Proteomics+Analysis+of+the+Response+to+Starvation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Global Proteomics Analysis of the Response to Starvation in C. elegans.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 14 (7), 1989-2001 (2015).</li>
<li>Vanfleteren, J. R., De Vreese, A., Braeckman, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Parameter+Logistic+and+Weibull+Equations+Provide+Better+Fits+to+Survival+Data+From+Isogenic+Populations+of+Caenorhabditis+elegans+in+Axenic+Culture+Than+Does+the+Gompertz+Model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journals+of+Gerontology+Series+A%3A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Two-Parameter Logistic and Weibull Equations Provide Better Fits to Survival Data From Isogenic Populations of Caenorhabditis elegans in Axenic Culture Than Does the Gompertz Model.</a> The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 53A (6), B393-B403 (1998).</li>
<li>Johnson, D. W., Llop, J. R., Farrell, S. F., Yuan, J., Stolzenburg, L. R., Samuelson, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+Myc-Mondo%2FMad+Complexes+Integrate+Diverse+Longevity+Signals%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad Complexes Integrate Diverse Longevity Signals.</a> PLoS Genetics. 10 (4), e1004278(2014).</li>
<li>Ogg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fork+head+transcription+factor+DAF-16+transduces+insulin-like+metabolic+and+longevity+signals+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevity signals in C. elegans.</a> Nature. 389 (6654), 994-999 (1997).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+Methods%3A+Synchronization+and+Observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), 1-9 (2012).</li>
<li>Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+genes+tied+to+endocrine%2C+metabolic%2C+and+dietary+regulation+of+lifespan+from+a+Caenorhabditis+elegans+genomic+RNAi+screen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen.</a> PLoS Genetics. 1 (1), 0119-0128 (2005).</li>
<li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+ageing+and+development%22%5BJournal%5D)">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of ageing and development. 132 (10), 519-521 (2011).</li>
<li>Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+improves+Caenorhabditis+elegans+proteostasis+independent+of+reproduction+onset%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset.</a> PloS one. 9 (1), e85964(2014).</li>
<li>Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+FUdR+can+cause+prolonged+longevity+in+mutant+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+ageing+and+development%22%5BJournal%5D)">The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes.</a> Mechanisms of ageing and development. 131 (5), 364-365 (2010).</li>
<li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).</li>
<li>Larsen, P. L., Albert, P. S., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+regulate+both+development+and+longevity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genes that regulate both development and longevity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 139 (4), 1567-1583 (1995).</li>
<li>Shaw, W. M., Luo, S., Landis, J., Ashraf, J., Murphy, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+TGF-beta+Dauer+pathway+regulates+longevity+via+insulin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%22%5BJournal%5D)">The C. elegans TGF-beta Dauer pathway regulates longevity via insulin signaling.</a> Current biology. 17 (19), 1635-1645 (2007).</li>
<li>Mukhopadhyay, A., Oh, S. W., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worming+pathways+to+and+from+DAF-16%2FFOXO%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Worming pathways to and from DAF-16/FOXO.</a> Experimental Gerontology. 41 (10), 928-934 (2006).</li>
<li>Lin, K., Dorman, J. B., Rodan, A., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((daf-16%3A+An+HNF-3%2Fforkhead+family+member+that+can+function+to+double+the+life-span+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">daf-16: An HNF-3/forkhead family member that can function to double the life-span of Caenorhabditis elegans.</a> Science. 278 (5341), 1319-1322 (1997).</li>
<li>Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+maintaining+large%2C+aging+populations+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+ageing+and+development%22%5BJournal%5D)">A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans.</a> Mechanisms of ageing and development. 12 (2), 137-150 (1980).</li>
<li>Hosono, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterilization+and+growth+inhibition+of+Caenorhabditis+elegans+by+5-fluorodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+gerontology%22%5BJournal%5D)">Sterilization and growth inhibition of Caenorhabditis elegans by 5-fluorodeoxyuridine.</a> Experimental gerontology. 13 (5), 369-373 (1978).</li>
<li>Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+growth+and+aging+of+Caenorhabditis+elegans+in+the+presence+of+fluorodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+gerontology%22%5BJournal%5D)">Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine.</a> Journal of gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).</li>
<li>Anderson, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+lifespan+extension+by+osmotic+stress+requires+FUdR%2C+base+excision+repair%2C+FOXO%2C+and+sirtuins%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+ageing+and+development%22%5BJournal%5D)">C. elegans lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins.</a> Mechanisms of ageing and development. , 30-42 (2016).</li>
<li>Garigan, D., Hsu, A. L., Fraser, A. G., Kamath, R. S., Abringet, J., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans%3A+A+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).</li>
<li>Yu, S., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF+signaling+comes+of+age%3A+Promotion+of+healthy+aging+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">EGF signaling comes of age: Promotion of healthy aging in C. elegans.</a> Experimental Gerontology. 46 (2-3), 129-134 (2011).</li>
<li>Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormScan%3A+A+technique+for+high-throughput+phenotypic+analysis+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">WormScan: A technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. , (2012).</li>
<li>Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., López-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+caenorhabditis+elegans+lifespan+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The caenorhabditis elegans lifespan machine.</a> Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).</li>
<li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormFarm%3A+A+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Zarówno metoda tradycyjna, jak i metoda replik wymagają synchronizacji zwierząt w wieku chronologicznym. Uwzględniamy metodę, która synchronizuje zwierzęta za pomocą leczenia podchlorynem grawitacyjnych osobników dorosłych, gdzie tylko zapłodnione jaja z grawicznym dorosłym osobnikiem przeżywają leczenie. Zarodki te wylęgają się w płynnej zawiesinie i zatrzymują rozwój w pierwszym stadium larwalnym (L1). Po wysianiu zwierząt L1 do pożywienia (np. E. coli wykazującej ekspresję dsRNA do genu będącego prze...

Jednym z najbardziej przełomowych osiągnięć technologicznych w kierunku zrozumienia genetycznych podstaw starzenia się był rozwój RNAi opartego na żywieniu u C. elegans1; przed eksperymentalnym zastosowaniem RNAi, wiele fenotypów starzenia się nie było genetycznie podatnych. RNAi oparte na żywieniu uzyskuje się poprzez produkcję dsRNA w E. coli, który pasuje do endogennego mRNA C. elegans: IPTG indukuje dwukierunkową transkrypcję przez wstawkę cDNA C. elegans lub część otwartej ramki odczytu w plazmidzie2. Kiedy C. elegans żywi się nienaruszonym E. coli, dsRNA wytwarzane przez bakterie jest transportowane ze światła do komórek jelitowych przez białko transbłonowe SID-23, a następnie rozprowadzane przez resztę zwierzęcia za pośrednictwem SID-14. W każdej komórce egzogenne dsRNA jest przetwarzane przez kompleks Dicer w siRNA, które oddziałuje z dojrzałym mRNA poprzez komplementarne parowanie zasad, tworząc nowy dupleks siRNA-mRNA. Ten duplex jest rozpoznawany przez kompleks RISC i rozszczepiany, degradując w ten sposób endogenne mRNA5. W ten sposób, po prostu zmieniając wstawkę plazmidu, można dezaktywować funkcję prawie każdego genu w genomie C. elegans. Odkrycie to doprowadziło do stworzenia kilku dużych bibliotek RNAi opartych na żywieniu - kolekcji przekształconych stad E. coli, które można połączyć w celu uzyskania pokrycia około 86% znanych genów C. elegans6,7.
Od czasu rozwoju RNAi opartego na żywieniu, kompleksowe badania przesiewowe u C. elegans doprowadziły do odkrycia ponad 900 genów, które zmieniają długość życia podczas inaktywacji (czego dowodem są powiązania RNAi-fenotyp wyselekcjonowane w WormBase), które nazywamy gerogenami. Rola większości gerogenów w kontroli długowieczności została odkryta poprzez RNAi oparte na żywieniu w zaledwie kilku przełomowych raportach (zobacz <silna klasa="xfig">Rysunek 1A i Plik Uzupełniający 1, aby uzyskać szczegółowe informacje). W niektórych przypadkach te gerogeny zostały zidentyfikowane na podstawie pomiaru żywotności w jednym lub kilku punktach czasowych, co nie zapewnia wymiernej miary zmiany długości życia po leczeniu RNAi. W innych przypadkach geny te zostały ocenione ilościowo pod kątem zmian w długości życia, a także dodatkowych fenotypów związanych z wiekiem. Na przykład wcześniej zidentyfikowaliśmy 159 genów, które były niezbędne zarówno dla normalnej, jak i zwiększonej długości życia zwierząt ze zmniejszoną sygnalizacją insuliny/IGF-1 i określiliśmy ilościowo zmiany w długości zdrowia. Spośród nich 103 inaktywacje genów skutkują fenotypem progerycznym, ponieważ utrata spowodowała jedną lub więcej oznak przedwczesnego starzenia się8.
Podczas gdy niektóre gerogeny zostały powiązane ze 100 lub więcej badaniami (np. daf-16, daf-2, sir-2.1), ponad 400 gerogenów ma 10 lub mniej cytowań (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B i plik uzupełniający 2). Tak więc, podczas gdy kompleksowe badania przesiewowe RNAi oparte na żywieniu odkryły i pobieżnie scharakteryzowały setki domniemanych gerogenów, sposób, w jaki te geny funkcjonują w kontroli długowieczności i genetyczne powiązania między tymi produktami genów, pozostają słabo zbadane. Pełna analiza podłużna fenotypów związanych z wiekiem jest warunkiem wstępnym identyfikacji interakcji genetycznych między gerogenami (np. interakcji epistatycznych, interakcji asyntetycznych itp.). Uzyskanie głębszego wglądu w genetyczne powiązania między gerogenami wymaga wysokoprzepustowej metody ilościowej, która wykorzystuje również zalety RNAi opartego na karmieniu.
Najczęstszą zastępczą miarą starzenia się jest długość życia. Tradycyjne podejście do pomiaru śmiertelności C. elegans śledzi śmierć poszczególnych zwierząt w czasie w małej próbie populacji. Stosunkowo niewielka liczba zwierząt jest obserwowana z biegiem czasu i okresowo delikatnie szturchana platynowym drutem lub rzęsą, z ruchem jako wskaźnikiem żywotności (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A). Metoda ta jest szeroko stosowana, ponieważ zapewnia proste, bezpośrednie pomiary średniej i maksymalnej długości życia. Jednak ta tradycyjna metoda jest czasochłonna i stosunkowo mało przepustowa, co ogranicza liczbę zwierząt i warunki, które można jednocześnie mierzyć w kontrolowany sposób. Niedawne badanie symulacyjne wykazało, że wiele badań nad długością życia C. elegans nie bada wystarczająco dużej liczby zwierząt, aby móc wiarygodnie wykryć niewielkie zmiany między warunkami9. Co więcej, ta tradycyjna metoda polega na wielokrotnym obchodzeniu się z tą samą kohortą zwierząt w czasie, co z kolei może wprowadzić zanieczyszczenie i uszkodzić lub zabić coraz bardziej delikatne, starzejące się zwierzęta.
Opracowaliśmy alternatywną metodologię pomiaru długości życia C. elegans w "Replica Set". W tym celu duża populacja zsynchronizowanych pod względem wieku, izogenicznych zwierząt jest dzielona na szereg małych populacji (lub replik). Generowana jest wystarczająca liczba próbek replik, aby pokryć każdy punkt czasowy w planowanym eksperymencie. W każdym punkcie obserwacyjnym jedna z replik jest oceniana za liczbę żywych, martwych i ocenzurowanych zwierząt, a następnie zwierzęta w tej replikacji są odrzucane. W związku z tym, w oczekiwanej długości życia populacji jako całości, okresowo próbkowana jest seria niezależnych subpopulacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). W przypadku korzystania z zestawów replik nie dochodzi do wielokrotnego poganiania zwierząt i wielokrotnego narażenia na potencjalne skażenie środowiska. Żywotność zaobserwowana w jednym punkcie czasowym jest całkowicie niezależna od każdej innej obserwacji, co minimalizuje obsługę i zwiększa przepustowość o co najmniej rząd wielkości. Pozwoliło nam to na ilościowe określenie zmian w długości życia setek klonów RNAi jednocześnie8,10.
Tutaj prezentujemy szczegółowe protokoły do badania długości życia C. elegans zarówno za pomocą Zestawu Replik, jak i tradycyjnych metod oceny długowieczności C. elegans. Pokazujemy, że podobne wyniki uzyskuje się między metodami. Opracowaliśmy oprogramowanie wspomagające graficzną analizę danych dotyczących długości życia generowanych za pomocą obu podejść, które bezpłatnie udostępniamy na licencji GPL V3 (patrz tabela materiałów). "WormLife" jest napisany w R11 i zawiera graficzny interfejs użytkownika (GUI) do wykreślania danych, który został przetestowany w systemach Mac OS i Linux. Na koniec porównujemy i kontrastujemy ograniczenia każdej metody i podkreślamy inne kwestie brane pod uwagę przy wyborze między podejściami do pomiaru ilościowych zmian w długości życia C. elegans.

<table><tbody><tr><td>IPTG (beta-digalaktopiranozyd izopropylowy-D-1-tigalaktopiranozyd)</td><td>Gold Bio</td><td>12481C100</td><td></td></tr><tr><td>FuDR (5-fluoro-2'-deoksyurydyna)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L16497</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki hodowlane</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#662102</td><td></td></tr><tr><td>Trójkątna, nieobrobiona płytka jednodołkowa, 128x86mm</td><td>Thermo-Fisher</td><td>242811</td><td></td></tr><tr><td>600 &micro; L Płytki 96-dołkowe</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#786261</td><td></td></tr><tr><td>2mL Płytki 96-dołkowe</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#780286</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelka płytkowa przepuszczająca powietrze</td><td>VWR</td><td>60941-086</td><td></td></tr><tr><td>96-pinowy replikator płytek</td><td>Nunc</td><td>250520</td><td></td></tr><tr><td>baktopepton</td><td>VWR</td><td>90000-368</td><td></td></tr><tr><td>agar bakteriologiczny</td><td>Affymetrix/USB</td><td>10906</td><td></td></tr><tr><td>Biblioteka klonów RNAi C. elegans w bakteriach HT115 - Ahringer</td><td>Source Bioscience</td><td>C. elegans RNAi Collection (Ahringer)</td><td>Zobacz także Kamath i in., Nature 2003.</td></tr><tr><td>Biblioteka klonów RNAi C. elegans w bakteriach HT115 - Vidal</td><td>Source Bioscience</td><td>C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)</td> <td>Zobacz także Rual i in., Badania nad genomem 2004. Ta biblioteka jest również dostępna w Dharmacon.</td></tr><tr><td>WormLife- Oprogramowanie do analizy przeżycia zestawu replik</td><td>Samuelson Lab</td><td>N/A</td><td>https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife</td></tr><tr><td>L4440 Pusty plazmid wektorowy</td><td>Addgene</td><td>1654</td><td>https://www.addgene.org/1654/</td></tr> <tr><td>Wormbase</td><td></td><td></td><td>http://www.wormbase.org/&nbsp;</td></tr><tr><td>OAZA</td><td></td><td></td><td>https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/&nbsp;</td></tr><tr><td>Grafpad Pryzmat</td><td></td><td></td><td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/&nbsp;</td></tr></tbody></table>

metoda zestawu replik: wysokoprzepustowe podejście do ilościowego pomiaru długości życia caenorhabditis elegans

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Metoda Replica Set to podejście do ilościowego pomiaru długości życia lub przeżywalności nicieni Caenorhabditis elegans w sposób wysokoprzepustowy, co pozwala pojedynczemu badaczowi na badanie większej liczby zabiegów lub schorzeń w tym samym czasie bez utraty jakości danych. Metoda wymaga powszechnego sprzętu, który można znaleźć w większości laboratoriów pracujących z C. elegans, a zatem jest prosta do przyjęcia. Podejście to koncentruje się na oznaczaniu niezależnych próbek populacji w każdym punkcie obserwacyjnym, a nie pojedynczej próbki w czasie, jak w przypadku tradycyjnych metod podłużnych. Punktacja polega na dodaniu cieczy do studzienek płytki wielodołkowej, co stymuluje C. elegans do poruszania się i ułatwia ilościowe określenie zmian w długości zdrowia. Inne główne zalety metody Replica Set to zmniejszone narażenie powierzchni agaru na zanieczyszczenia unoszące się w powietrzu (np. pleśń lub grzyby), minimalne obchodzenie się ze zwierzętami oraz odporność na sporadyczne błędne oceny (takie jak nazywanie zwierzęcia martwym, gdy jest jeszcze żywe). Aby odpowiednio przeanalizować i zwizualizować dane z eksperymentu w stylu zestawu replik, opracowano również niestandardowe narzędzie programowe. Obecne możliwości oprogramowania obejmują wykreślanie krzywych przeżycia zarówno dla zestawu replik, jak i tradycyjnych eksperymentów (Kaplana-Meiera), a także analizę statystyczną dla zestawu replik. Przedstawione tutaj protokoły opisują tradycyjne podejście eksperymentalne i metodę zestawu replik, a także przegląd odpowiedniej analizy danych.

W procesie opracowywania każdej nowej metodologii niezbędne jest, aby nowa metoda odtwarzała uznane wyniki uzyskane za pomocą wcześniejszych podejść i spełniała standardy obowiązujące w danej dziedzinie. Wykazaliśmy wcześniej empirycznie, że Replica Set oraz tradycyjne metody oceny długości życia C. elegans dają podobne wyniki20. Nicznicie C. elegans typu dzikiego (N2) utrzymywane w temperaturze 20 °C żyją zazwyczaj od 20 do 25 dni, co zaobserwo...

Tutaj opisujemy metodę Replica Set, podejście do ilościowego pomiaru długości życia/przeżycia i zdrowia C. elegans w sposób wysoce wydajny i solidny, umożliwiając w ten sposób badanie wielu schorzeń bez poświęcania jakości danych. Protokół ten szczegółowo opisuje strategię i udostępnia narzędzie programowe do analizy danych zestawu replik.

Metoda zestawu replik: wysokoprzepustowe podejście do ilościowego pomiaru długości życia Caenorhabditis elegans

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

Zidentyfikowano setki genów, których funkcja wpływa na starzenie się organizmu. Ale wiele z ich relacji jest słabo zrozumianych. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w dziedzinie starzenia.Mianowicie, jakie są genetyczne zależności między genami gerA? Główną zaletą tej techniki jest zwiększenie przepustowości, liczba genetycznych uprzedzeń, które można jednocześnie zmierzyć ilościowo, zwiększa się co najmniej o rząd wielkości. Dane dotyczące długości życia zebrane za pomocą tej procedury można wykreślić i przeanalizować za pomocą oprogramowania, które dostarczamy wraz z tą publikacją.Oprócz zapewnienia wglądu w długość życia, metoda ta może być również stosowana do innych fenotypów związanych z wiekiem, takich jak odporność na stres i zmiany w planie zdrowotnym. Na potrzeby tej procedury utwórz nową sygnaturę podbiblioteki RNAi. Najpierw podwielokrotnić każdą studzienkę z 96-dołkowej płytki z 200 mikrolitrami LB z ampicyliną, używając 12-kanałowej pipetry.Wysterylizuj 96-pinowy replikator płytek, zanurzając kolejno szpilki w 50% wybielaczu, a następnie w ultra czystej wodzie. Następnie zanurz końcówki w etanolu i ostrożnie podpal końcówki. Następnie ostrożnie zdejm

the-replica-set-method-high-throughput-approach-to-quantitatively

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W niniejszym artykule przedstawiamy ogólny protokół pomiaru długości życia nicieni utrzymywanych na pożywkach stałych z bakteriami zneutralizowanymi za pomocą promieniowania UV.

Pomiar długości życia Caenorhabditis elegans na podłożach stałych

W niniejszym protokole przedstawiamy metodę pomiaru długości życia Caenorhabditis elegans w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych.

Pomiar długości życia Caenorhabditis elegans w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych

Ten film opisuje tradycyjną, opartą na płytkach metodę pomiaru długości życia C. elegans. Przykładowy protokół mierzy długość życia robaków poddanych działaniu RNAi.

Analiza długości życia: pomiar długowieczności C. elegans

Tutaj prezentujemy ramy do powiązania szeroko pojętych ograniczeń dietetycznych z ekspresją genów i długością życia. Opisujemy protokoły dotyczące szeroko zakrojonych ograniczeń dietetycznych i ilościowego obrazowania ekspresji genów w ramach tego paradygmatu. Następnie przedstawiamy analizy obliczeniowe, aby ujawnić podstawowe cechy przetwarzania informacji w obwodach genetycznych zaangażowanych w wykrywanie żywności.

Kwantyfikacja informacji kodowanych przez poziomy ekspresji genów podczas modulacji długości życia w warunkach szerokiego zakresu ograniczeń dietetycznych u C. elegans

Tutaj opisujemy prosty protokół szybkiego wytwarzania setek pożywek hodowlanych dla nicieni, 96-dołkowych płytek hodowlanych ze stałą liczbą Caenorhhabditis elegans na studzienkę. Kultury te są przydatne do fenotypowych badań przesiewowych całych organizmów. Skupiamy się tutaj na wykorzystaniu tych kultur do badań przesiewowych substancji chemicznych pod kątem efektów sprzyjających długowieczności.

Prosta metoda wysokoprzepustowych badań przesiewowych w kierunku Caenorhabditis elegans

Spadek proteostazy jest cechą charakterystyczną starzenia się, ułatwiając wystąpienie chorób neurodegeneracyjnych. Przedstawiamy protokół do ilościowego pomiaru proteostazy w dwóch różnych tkankach Caenorhabditis elegans poprzez heterologiczną ekspresję powtórzeń poliglutaminy połączonych z fluorescencyjnym reporterem. Model ten umożliwia szybką analizę genetyczną proteostazy in vivo.

Kwantyfikacja swoistego dla tkanki spadku proteostazy u Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans służy jako doskonały system modelowy z solidnymi i tanimi metodami badania zdrowia, długości życia i odporności na stres.

Badanie tanich metod pomiaru długości życia i długości zdrowia u Caenorhabditis elegans

Platforma obrazowania "The Lifespan Machine" automatyzuje obserwację dużych populacji przez całe życie. Pokazujemy kroki wymagane do wykonania testów długości życia, odporności na stres, patogenezy i behawioralnego starzenia się. Jakość i zakres danych pozwalają naukowcom badać interwencje w procesie starzenia się pomimo obecności zmienności biologicznej i środowiskowej.

Wysokoprzepustowe testy behawioralnego starzenia się i długości życia przy użyciu maszyny Lifespan Machine

W protokole tym opisano test do ilościowego określenia szybkości karmienia Caenorhabditis elegans w oparciu o pomiar klirensu bakterii w płynnej kulturze.

Kwantyfikacja spożycia pokarmu w Caenorhabditis elegans poprzez pomiar klirensu bakteryjnego

Ten protokół zapewnia prostą, niedrogą procedurę ilościowego określania wskaźnika śmiertelności zarodkowej u Caenorhabditis elegans. Umożliwia bezpośrednie wykrywanie zaburzeń zarodkowych w populacjach bez specjalistycznego sprzętu lub doświadczenia w wybieraniu dżdżownic. Protokół może być stosowany do ilościowego określania wpływu mutacji genetycznych, wyciszenia genów za pośrednictwem interferencji RNA i diety.

Określanie wskaźnika śmiertelności embrionalnej u Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę zestawu replik do ilościowego pomiaru długości życia i zdrowia Caenorhabditis elegans. To wysokoprzepustowe podejście umożliwia badanie genetycznych zależności wpływających na starzenie.

Metoda zestawu replik: wysokoprzepustowe podejście do ilościowego pomiaru długości życia Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów