Metoda zestawu replik: wysokoprzepustowe podejście do ilościowego pomiaru długości życia Caenorhabditis elegans

Zidentyfikowano setki genów, których funkcja wpływa na starzenie się organizmu. Ale wiele z ich relacji jest słabo zrozumianych. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w dziedzinie starzenia.

Mianowicie, jakie są genetyczne zależności między genami gerA? Główną zaletą tej techniki jest zwiększenie przepustowości, liczba genetycznych uprzedzeń, które można jednocześnie zmierzyć ilościowo, zwiększa się co najmniej o rząd wielkości. Dane dotyczące długości życia zebrane za pomocą tej procedury można wykreślić i przeanalizować za pomocą oprogramowania, które dostarczamy wraz z tą publikacją.

Oprócz zapewnienia wglądu w długość życia, metoda ta może być również stosowana do innych fenotypów związanych z wiekiem, takich jak odporność na stres i zmiany w planie zdrowotnym. Na potrzeby tej procedury utwórz nową sygnaturę podbiblioteki RNAi. Najpierw podwielokrotnić każdą studzienkę z 96-dołkowej płytki z 200 mikrolitrami LB z ampicyliną, używając 12-kanałowej pipetry.

Wysterylizuj 96-pinowy replikator płytek, zanurzając kolejno szpilki w 50% wybielaczu, a następnie w ultra czystej wodzie. Następnie zanurz końcówki w etanolu i ostrożnie podpal końcówki. Następnie ostrożnie zdejmij samoprzylepną foliową osłonę z zamrożonej, 96-dołkowej płytki biblioteki glicerolu i delikatnie, ale stanowczo zmiel końcówki wysterylizowanego replikatora płytek do dołków nadal zamrożonych zapasów glicerolu.

Następnie zaszczepić kultury i uszczelnić zaszczepioną płytkę przepuszczalną membraną. Pozwól kulturom rosnąć przez noc na blacie ławki. Następnego dnia wysterylizuj replikator płytki i ostrożnie usuń uszczelkę z nocnej hodowli i zanurz końcówki kołków replikatora.

Następnie zaszczepij szpilkami prostokątną płytkę agarową LB z ampicyliną i tetracykliną. Wywieraj równomierny nacisk i używaj małych, okrężnych ruchów, aby przenieść bakterie, nie dopuszczając do zbytniego zatłoczenia miejsc. Następnie inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego dnia, na każde potrzebne 10 replik płytek, załaduj każdą studzienkę z głębokiej płytki 96-dołkowej 1,5 mililitra LB z ampicyliną. Następnie zaszczep studzienki wyhodowanymi bakteriami. Następnie uszczelnij płytkę oddychającą membraną, hoduj ją przez 20 godzin, wstrząsając.

Studnie kontrolne powinny być rozrzucone po 96 studzienkach, tak aby gdy tablica podbiblioteki 96-dołkowej została podzielona na grupy po 24, każda sekcja 24 studni ma po jednej z każdej z kontrolek. Następnego dnia załadować 120 mikrolitrów podwielokrotności kultury do płytek 24-dołkowych, używając sześciodołkowej pipety wielokanałowej, z regulowanymi odstępami między końcówkami. Następnie wysusz płytki odkryte w okapie z przepływem laminarnym, aż cała ciecz zostanie wchłonięta.

Nie pozwól im wyschnąć. Pamiętaj, aby zachować koncentrację podczas porcjowania płynnych kultur, aby upewnić się, że właściwa kultura bakteryjna zostanie umieszczona w odpowiednim dołku na 24-dołkowej płytce. Eksperymenty z zestawem replik rozpoczynają się od zestawu niezależnych, 24-dołkowych płytek replikowanych, z których każda jest zasiana tymi samymi klonami RNAi bakterii.

W przypadku eksperymentów dotyczących długości życia dodaje się od 15 do 20 zwierząt L1 do każdej płytki i pozostawia się do wzrostu do stadium L4. W L4 FUdR jest dodawany do wszystkich studzienek w powtórzeniach. Później tego samego dnia można pobrać z zestawu powtórzoną płytkę i ocenić ją jako pierwszy punkt czasowy.

Aby ocenić żywotność, do dołków płytki dodaje się płyn, aby wywołać ruch zwierząt. Zwierzęta, które nie zaczynają się ruszać, są delikatnie szturchane wykałaczką do robaków. Następnie rejestruje się łączną liczbę zwierząt oraz liczbę martwych zwierząt.

Płytka z pierwszej obserwacji jest następnie odrzucana. W następnym punkcie obserwacyjnym pobierana jest kolejna powtórzona płytka z zestawu i oceniana w podobny sposób. Powtarza się to w ustalonym interwale punktacji.

Za każdym razem z nową płytką z zestawu replikatów. Kontynuuj nacinanie zestawu talerzy, aż żadne zwierzę nie pozostanie przy życiu. Po pierwsze, zsynchronizuj populację zwierząt za pomocą tej samej metody przygotowania na bazie wybielacza, która jest używana w tradycyjnym teście długości życia.

Następnie, za pomocą pipety z sześcioma dołkami o regulowanych odstępach i zbiornika na odczynniki, wysiewaj od 15 do 20 zwierząt L1 do każdego dołka z przygotowanych 24-dołkowych płytek. Podczas wysiewania płytek należy okresowo mieszać zwierzęta L1 z roztworem, aby utrzymać równomierne rozprowadzenie. Teraz pozwól zwierzętom rozwinąć się do L4. Czas rozwoju L4 musi być znany dla tego protokołu.

Okresowo monitoruj rozwój robaków. Gdy zwierzęta osiągną L4, dodaj 24 mikrolitry 50x FUdR do każdej studzienki i włóż płytki z powrotem do inkubatora. Wykorzystanie zwierząt L4 ma kluczowe znaczenie.

Jeśli hermafrodyty osiągną dojrzałość reprodukcyjną przed dodaniem FUdR, ich potomstwo przeżyje i zje pokarm. I odwrotnie, zbyt wczesne dodanie FUdR prowadzi do pęknięć u zwierząt. W żądanych punktach czasowych użyj jednej zduplikowanej płytki, aby ocenić żywotność.

Aby to zrobić, zalej studnię roztworem M9. Przed codzienną oceną żywotności należy monitorować wszystkie studnie, w których nie ma pożywienia, wydają się być skażone lub znajdują się w nich zwierzęta z wadami morfologicznymi lub rozwojowymi. Dla każdej studzienki zapisz całkowitą liczbę zwierząt w studzience i sprawdź stan nieporuszających się robaków, delikatnie dotykając każdego z nich w głowę wykałaczką do robaków.

Po policzeniu wszystkich nieruchomych zmarłych na talerzu, wyrzuć talerz. W tej procedurze rośnie przekształcony e. Coli na noc w LB z ampicyliną.

Następnego dnia należy zagęścić bakterie przez odwirowanie w stężeniu 3 000 G przez 15 do 20 minut. Ponownie zawieś bakterie w 1/10 objętości wyjściowej. Następnie podnieś 200 mikrolitrów 10x bakterii na sześciocentymetrowe płytki.

Przygotować trzy lub cztery płytki na każdy warunek badania i dołączyć dwie dodatkowe płytki na wypadek zanieczyszczenia. Wysuszyć płytki w partii z przepływem laminarnym, aż cała ciecz zostanie wchłonięta lub odparowana. Po wysuszeniu przechowuj płytki w plastikowym pudełku przez noc w temperaturze pokojowej, aby indukować produkcję dwuniciowego RNA.

Następnie przechowuj płytki do dwóch tygodni w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dla zwierząt zbierz ciężarne, dorosłe zwierzęta w M9. Umyj je dwukrotnie za pomocą M9. Powtarzanie wirowania przy aspiracji. Następnie ponownie zawieś C.elegans w czterech mililitrach M9 i dodaj dwa mililitry roztworu podchlorynu.

Teraz natychmiast wiruj robaki przez trzy minuty, z okresowym, energicznym potrząsaniem. Następnie, pod mikroskopem preparacyjnym, poszukaj chmury jaj. Jeśli chmura nie jest widoczna, wiruj robaki przez dodatkowe 10 do 20 sekund.

Następnie szybko umyj jajka M9, dwa razy, tak jak poprzednio. I ponownie zawieś umyte jajka w trzech mililitrach M9. Następnie przenieś jaja do nowej, 15-mililitrowej probówki i inkubuj probówkę w temperaturze 20 stopni Celsjusza z delikatnym obracaniem i pozwól zarodkom wykluć się przez noc. Następnego dnia określ gęstość przygotowanego roztworu L1, obliczając średnią liczbę L1 na mikrolitr w trzech kroplach po 10 mikrolitrów.

Załaduj przygotowane talerze z nasionami bakterii po 50 zwierząt L1 każda. Umieść płytki w inkubatorze Celsuis o temperaturze 20 stopni, aż zarodki rozwiną się do stadium L4. Normalny rozwój od L1 do L4 trwa około 40 godzin.

Następnie, aby zapobiec produkcji potomstwa, dodaj 160 mikrolitrów 50x FUdR do każdej płytki. Następnie usuń samce, ponieważ długość życia jest zwykle mierzona tylko za pomocą hermafrodytów. Po zakończeniu przepakuj płytki do inkubatora o temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Dopóki wszystkie robaki nie umrą, codziennie oceniaj ich żywotność. W tym celu delikatnie dotknij każdego nieruchomego nicienia na głowie platynowym drutem lub rzęsą. Zwierzęta niereagujące są martwe i muszą zostać usunięte z płytki.

Zwróć uwagę na wszelkie anomalie podczas tej rutyny. Zestaw replik i tradycyjne metody oznaczania długości życia C.elegans dają podobne wyniki w przypadku zwierząt N2 typu dzikiego. Na przykład knockdown mml-1 lub mxl-2 oparty na karmieniu RNAi znacznie skrócił normalną długość życia.

Mierzono to zarówno za pomocą tradycyjnego testu żywotności, jak i testu zestawu replik. Można również wykryć wydłużoną żywotność. Obserwowane tutaj RNAi dla mdl-1 lub mxl-1 znacznie wydłużyło żywotność C.Elegans, gdy mierzono je za pomocą dowolnej metodologii.

Korzystając z metody zestawu replik, możliwe jest jednoczesne ilościowe określenie zmian w długości życia w ponad 100 warunkach, co nie byłoby rozsądne przy bardziej tradycyjnym podejściu. Na przykład badanie przesiewowe RNAi oparte na karmieniu całego genomu zidentyfikowało 159 genów niezbędnych do wydłużenia życia wynikającego ze zmniejszenia sygnalizacji insulinopodobnej daf-2. Związek między sygnalizacją insulinopodobną a tymi genami został dodatkowo opisany poprzez pomiar zdrowia zwierząt.

O zdrowiu świadczyło miotanie się c. Elegans po zawieszeniu w roztworze. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać RNAi opartego na karmieniu do pomiaru długości życia C.Elegans.

Ale RNAi jest wszechstronny i może być stosowany do wielu różnych fenotypów. Po opanowaniu, metoda zestawu replik pozwala na ocenę żywotności ponad 100 klonów RNAi każdego dnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Punkty we wczesnym i późnym czasie można szybko zdobyć.

Wszystkie zwierzęta w studni będą albo żywe i poruszające się, albo martwe. Ocenianie trwa najdłużej, gdy zwierzęta zaczynają umierać. Mając to na uwadze, należy rozłożyć w czasie przeprowadzanie niezależnych badań.