Name: Barnacle Balanus improvisus jako model morski - hodowla i ekspresja genów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Poznaj metodę hodowli Balanus improvisus przez cały rok w celu badań nad ekspresją genów i osmoregulacją. Technika umożliwia produkcję do 50 000 larw tygodniowo i dostarcza wysokiej jakości RNA do analizy molekularnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez grant 2017-04559 od Szwedzkiej Rady ds. Badań Naukowych (VR) oraz wspierany przez UE projekt SEAFRONT dla Andersa Blomberga. W szczególności utworzenie zakładu hodowli było na przestrzeni lat wspierane przez dotacje dla Pera R. Jonssona z następujących agencji finansujących: SSF (Szwedzka Fundacja Badań Strategicznych) w ramach programu Nauka i technologia morska oraz MISTRA w ramach programu Marine Paint. Kent Berntsson odegrał kluczową rolę we wczesnych fazach tworzenia ośrodka hodowlanego. Dodatkowe fundusze na utworzenie ośrodka hodowlanego pochodzą z Centrum Morskiej Biologii Ewolucyjnej (www.cemeb.science.gu.se), które jest wspierane przez grant Linneusza ze Szwedzkich Rad ds. Badań Naukowych FORMAS i VR.

<ol><li>Darwin, C. <a target="_blank" href="https://www.biodiversitylibrary.org/bibliography/2104#/summary">A monograph of the sub-class Cirripedia, with figures of all species. The Balanidae (or sessile cirripedes); the Verrucidae, etc., etc., etc</a>. , Ray Society. London, UK. (1854).</li>
<li>Lind, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+aquaporins+from+the+euryhaline+barnacle+Balanus+improvisus+reveals+differential+expression+in+response+to+changes+in+salinity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Analysis of aquaporins from the euryhaline barnacle Balanus improvisus reveals differential expression in response to changes in salinity.</a> PLoS ONE. 12 (7), 0181192(2017).</li>
<li>Lind, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+the+alpha-subunit+of+Na%2B%2FK%2B+ATPase+from+the+euryhaline+barnacle+Balanus+improvisus+reveals+multiple+genes+and+differential+expression+of+alternative+splice+variants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of the alpha-subunit of Na+/K+ ATPase from the euryhaline barnacle Balanus improvisus reveals multiple genes and differential expression of alternative splice variants.</a> PLoS ONE. 8, 77069(2013).</li>
<li>Fyhn, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Holeuryhalinity+and+its+mechanisms+in+a+cirriped+crustacean%2C+Balanus+improvisus%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+-+Part+A%3A+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Holeuryhalinity and its mechanisms in a cirriped crustacean, Balanus improvisus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Comparative Physiology. 53 (1), 19-30 (1976).</li>
<li>Wrange, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+story+of+a+hitchhiker%3A+population+genetic+patterns+in+the+invasive+barnacle+Balanus+%28Amphibalanus%29+improvisus+Darwin+1854%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The story of a hitchhiker: population genetic patterns in the invasive barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus Darwin 1854.</a> PLoS ONE. 11 (1), 0147082(2016).</li>
<li>Berntsson, K. M., Jonsson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+patterns+in+recruitment+and+succession+of+a+temperate+marine+fouling+assemblage%3A+a+comparison+of+static+panels+and+boat+hulls+during+the+boating+season%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial patterns in recruitment and succession of a temperate marine fouling assemblage: a comparison of static panels and boat hulls during the boating season.</a> Biofouling. 19 (3), 187-195 (2003).</li>
<li>Lind, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Octopamine+receptors+from+the+barnacle+Balanus+improvisus.+are+activated+by+the+alpha2-adrenoceptor+agonist+medetomidine%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Octopamine receptors from the barnacle Balanus improvisus. are activated by the alpha2-adrenoceptor agonist medetomidine.</a> Molecular Pharmacology. 78 (2), 237-248 (2010).</li>
<li>Semmler, H., Hoeg, J. T., Scholtz, G., Wanninger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+the+naupliar+musculature+and+a+scanning+electron+microscopy+atlas+of+nauplius+development+of+Balanus+improvisus+%28Crustacea%3A+Cirripedia%3A+Thoracica%29%5BTitle%5D)+AND+%22Arthropod+Structure+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of the naupliar musculature and a scanning electron microscopy atlas of nauplius development of Balanus improvisus (Crustacea: Cirripedia: Thoracica).</a> Arthropod Structure & Development. 38 (2), 135-145 (2009).</li>
<li>Anderson, D. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnderson%2C+DT+%22Barnacles+-+structure%2C+function%2C+development+and+evolution%22">Barnacles - structure, function, development and evolution</a>. , Chapman & Hall. London, UK. (1994).</li>
<li>Kennedy, V. S., DiCosimo, J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.2307/1351700">Subtidal distribution of barnacles in Chesapeake Bay, Maryland.</a> Estuaries. 6, 95-101 (1983).</li>
<li>Dreanno, C., Kirby, R. R., Clare, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locating+the+barnacle+settlement+pheromone%3A+spatial+and+ontogenetic+expression+of+the+settlement-inducing+protein+complex+of+Balanus+amphitrite%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Locating the barnacle settlement pheromone: spatial and ontogenetic expression of the settlement-inducing protein complex of Balanus amphitrite.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 273, 2721-2728 (2006).</li>
<li>Rittschoff, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/08927019809378344">Cues and context: larval responses to physical and chemical cues.</a> Biofouling. 12 (1-3), 31-44 (1998).</li>
<li>Berntsson, K. M., Jonsson, P. R., Lejhall, M., Gatenholm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+behavioural+rejection+of+micro-textured+surfaces+and+implications+for+recruitment+by+the+barnacle+Balanus+improvisus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Marine+BIology+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">Analysis of behavioural rejection of micro-textured surfaces and implications for recruitment by the barnacle Balanus improvisus.</a> Journal of Experimental Marine BIology and Ecology. 251 (1), 59-83 (2000).</li>
<li>Gamfeldt, L., Wallén, J., Jonsson, P. R., Berntsson, K. M., Havenhand, J. N. <a target="_blank" href="https://esajournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1890/05-0377">Increasing intraspecific diversity enhances settling success in a marine invertebrate.</a> Ecology. 86, 3219-3224 (2005).</li>
<li>Rittschof, D., Clare, A. S., Gerhart, D. J., Sister Avelin, M., Bonaventura, J. Barnacle in vitro assays for biologically active substances: toxicity and settlement inhibition assays using mass cultured Balanus amphitrite amphitrite Darwin. Biofouling. 6 (2), 115-122 (1992).</li>
<li>Pansch, C., Schaub, I., Havenhand, J., Wahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Habitat+traits+and+food+availability+determine+the+response+of+marine+invertebrates+to+ocean+acidification%5BTitle%5D)+AND+%22Global+Change+Biology%22%5BJournal%5D)">Habitat traits and food availability determine the response of marine invertebrates to ocean acidification.</a> Global Change Biology. 20 (3), 765-777 (2014).</li>
<li>Guillard, R. R. L. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuillard%2C+RRL+%22Culture+of+marine+invertebrate+animals%22">Culture of marine invertebrate animals</a>. Smith, W. L., Chanley, M. H. , Springer. Boston, MA. 22-60 (1975).</li>
<li>Wrange, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+plasticity+and+local+adaptation+for+coping+with+changing+salinity+in+coastal+areas%3A+a+test+case+with+barnacles+in+the+Baltic+Sea%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Importance of plasticity and local adaptation for coping with changing salinity in coastal areas: a test case with barnacles in the Baltic Sea.</a> BMC Evolutionary Biology. 14, 156(2014).</li>
<li>Bacchetti De Gregoris, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+an+adult+barnacle+%28Balanus+amphitrite%29+cDNA+library+and+selection+of+reference+genes+for+quantitative+RT-PCR+studies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Construction of an adult barnacle (Balanus amphitrite) cDNA library and selection of reference genes for quantitative RT-PCR studies.</a> BMC Molecular Biology. 10, 62(2009).</li>
<li>Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+does+insect+RNA+look+degraded%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Why does insect RNA look degraded.</a> Journal of Insect Science. 10, 159(2010).</li>
<li>Panova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+protocols+for+whole-genome+sequencing+in+marine+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+BIology%22%5BJournal%5D)">DNA extraction protocols for whole-genome sequencing in marine organisms.</a> Methods in Molecular BIology. 1452, 13-44 (2016).</li>
<li>Berglin, M., Larsson, A., Jonsson, P., Paul Gatenholm, P. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1163/156856101753213321">The adhesion of the barnacle, Balanus improvisus, to poly(dimethylsiloxane) fouling-release coatings and poly(methyl methacrylate) panels: the effect of barnacle size on strength and failure mode.</a> Journal of Adhesion Science and Technology. 15, 1485-1502 (2001).</li>
<li>Larsson, A. I., Granhag, L. M., Jonsson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instantaneous+flow+structures+and+opportunities+for+larval+settlement%3A+barnacle+larvae+swim+to+settle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Instantaneous flow structures and opportunities for larval settlement: barnacle larvae swim to settle.</a> PLoS ONE. 11, 0158957(2016).</li>
<li>Toth, G. B., Lindeborg, M. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/237075903_Water-soluble_compounds_from_the_breadcrumb_sponge_Halichondria_panicea_deter_attachment_of_the_barnacle_Balanus_improvisus">Water-soluble compounds from the breadcrumb sponge Halichondria panicea. deter attachment of the barnacle Balanus improvisus.</a> Marine Ecology Progress Series. 354, 125-132 (2008).</li>
<li>Pansch, C., Jonsson, P. R., Berglin, M., Pinori, E., Wrange, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+flow-through+bioassay+for+testing+low-emission+antifouling+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">A new flow-through bioassay for testing low-emission antifouling coatings.</a> Biofouling. 33 (8), 613-623 (2017).</li>
<li>Walne, P. <a target="_blank" href="https://www.cambridge.org/core/journals/journal-of-the-marine-biological-association-of-the-united-kingdom/article/observations-on-the-food-value-of-seven-species-of-algae-to-the-larvae-of-ostrea-edulis-i-feeding-experiments/11A8912C69162E0203BFC4079CD28070">Observation of food value of 7 species of algae to larvae of Ostrea edulis 1. Feeding experiments.</a> Journal of the Marine Biological Associateion of the UK. 43, 767-784 (1963).</li>
<li>Sandnes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+and+automatic+density+control+of+large-scale+microalgal+cultures+using+near+infrared+%28NIR%29+optical+density+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring and automatic density control of large-scale microalgal cultures using near infrared (NIR) optical density sensors.</a> Journal of Biotechnology. 122 (2), 209-215 (2006).</li>
<li>Neufeldt, C. J., Palmer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precisely+proportioned%3A+intertidal+barnacles+alter+penis+form+to+suit+coastal+wave+action%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Precisely proportioned: intertidal barnacles alter penis form to suit coastal wave action.</a> Proceedings of the Royal Society B Biological Sciences. 275, 1081-1087 (2008).</li>
<li>Dunstan, G., Volkman, J., Barrett, S., Leroi, J., Jeffrey, S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0031942200905259">Essential polyunsaturated fatty acids from 14 species of diatom (Bacillariophyceae).</a> Phytochemistry. 35, 155-161 (1994).</li>
<li>Jonsson, P. R., Berntsson, K., André, C., Wängberg, S. -Å <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s002270050571">Larval growth and settlement of the European oyster (Ostrea edulis) as a function of food quality measured as fatty acid composition.</a> Marine Biology. 134 (3), 559-570 (1999).</li>
<li>Comps, M., Bonami, J. R., Vago, C. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=FR19770139223">Virus-disease of Portuguese oyster (Crassostrea angulata. lmk).</a> Comptes rendus hebdomadaires des séances de l'Académie des Sciences. Série D, Sciences naturelles. 282, 1991-1993 (1976).</li>
<li>Segarra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+description+of+a+particular+Ostreid+herpesvirus.+1+genotype+associated+with+massive+mortality+outbreaks+of+Pacific+oysters%2C+Crassostrea+gigas%2C+in+France+in+2008%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Detection and description of a particular Ostreid herpesvirus. 1 genotype associated with massive mortality outbreaks of Pacific oysters, Crassostrea gigas, in France in 2008.</a> Virus Research. 153 (1), 92-99 (2010).</li>
<li>Suquet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival%2C+growth+and+reproduction+of+cryopreserved+larvae+from+a+marine+invertebrate%2C+the+Pacific+oyster+%28Crassostrea+gigas%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Survival, growth and reproduction of cryopreserved larvae from a marine invertebrate, the Pacific oyster (Crassostrea gigas).</a> PLoS ONE. 9 (4), 93486(2014).</li>
<li>Martínez-Páramo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryobanking+of+aquatic+species%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture%22%5BJournal%5D)">Cryobanking of aquatic species.</a> Aquaculture. 472, 156-177 (2017).</li>
<li>Anil, A. C., Tulaskar, A. S., Khandeparkar, D. C., Wagh, A. B. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0011224096919914">Cryopreservation of Balanus amphitrite nauplii.</a> Cryobiology. 34, 131-140 (1997).</li>
<li>Oo, K., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/288595251_Cryopreservation_of_Nauplius_Larvae_of_the_Barnacle_Balanus_amphitrite_Darwin">Cryopreservation of nauplius larvae of the barnacle, Balanus amphitrite Darwin.</a> Fisheries Science. 64, 857-860 (1998).</li>
<li>Lin, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+study+on+gene+expression+of+cement+proteins+and+potential+adhesion-related+genes+of+a+membranous-based+barnacle+as+revealed+from+next-generation+sequencing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">First study on gene expression of cement proteins and potential adhesion-related genes of a membranous-based barnacle as revealed from next-generation sequencing technology.</a> Biofouling. 30 (2), 169-181 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do zadeklarowania.

Hodowla pąkli w Morskim Laboratorium Badawczym Tjärnö (Szwecja) trwa od ponad 20 lat i jest wykorzystywana do badań w wielu różnych obszarach badawczych. W ciągu ostatnich lat opublikowano ponad 30 prac naukowych, w których wykorzystano system hodowli, w tym badania nad przeciwporostowością13,22, hydrodynamiką23, ekologią chemiczną24, zmianami klimatu16, biologią ewolucyjną5 i biologią molekularną2.
Aby uniknąć selekcji niektórych osobników, które są bardziej przystosowane do środowiska laboratoryjnego (osobniki, które mogą nie być reprezentatywne dla dzikiej populacji), zaleca się coroczne zbieranie nowego stada lęgowego z pola. Ponadto dobrą praktyką jest również coroczne odmładzanie kultury, ponieważ w ciągu normalnego roku śmiertelność u dorosłych wynosi około 50-80%. Jednakże, jeżeli celem jest wytworzenie linii wsobnych lub rozpoczęcie badań nad ewolucją doświadczalną, należy wykorzystać tylko rodziny hodowane w laboratorium.
Dobrym momentem na zbieranie B. improvisus na panelach w Morskim Laboratorium Badawczym Tjärnö jest czerwiec-sierpień, ponieważ w tym czasie w morzu znajduje się duża ilość larw karpiowatych. Sprawdzaj panele co tydzień, aby zobaczyć, kiedy zaczyna się osadzanie pąkli i ręcznie usuwaj inne osiadłe gatunki niż B. improvisus (np. małże, osłonice, mszywioły, hydroidy, nemerteany/rureczki i inne gatunki pąkli) z paneli (np. za pomocą szczoteczki do zębów). Wokół Tjärnö występują trzy płytkowodne gatunki pąkli (B. improvisus, Semibalanus balanoides i Balanus crenatus). Jednak B. improvisus jest dominującym zanieczyszczeniem gładkich, twardych powierzchni w okresie od lipca do sierpnia. S. balanoides ma swój okres osiadania wczesną wiosną i preferuje głównie naturalne podłoża (np. kamienie). B. crenatus może występować w niskich ilościach na panelach w okresie letnim.
Możliwe jest również rozpoczęcie nowych dorosłych pokoleń pąkli z hodowlanych karpiowatych, co byłoby niezbędne, gdyby ustanowiono pewne linie o określonych cechach lub w badaniach nad ewolucją eksperymentalną. Najwygodniejszym sposobem na rozpoczęcie nowych pokoleń dorosłych jest osadzenie cyprydów na panelach termoplastycznych w laboratorium. Panele te z nowo osiadłymi karpiowatymi mogą być również wykorzystywane w zabiegach eksperymentalnych lub do ekspozycji w terenie. W nagłych przypadkach można również użyć dorosłych osobników na głazach z pobliskiego stanowiska (np. Idefjorden w przypadku Laboratorium Badań Morskich Tjärnö), gdzie B. improvisus jest powszechny. Te już zadomowione dorosłe osobniki są traktowane w taki sam sposób, jak dorosłe osobniki na panelach, w ten sposób umieszczane są na tacach i karmione za pomocą systemu przepływowego. Komory przepływowe mogą być również używane do zakładania paneli z pąklami25. Są to komory przepływowe z siatką planktonową po bokach, na których nie osiadają karpiowate, z panelami jako jedyną powierzchnią osiadania dla larw.
Istnieje kilka kroków, które mają kluczowe znaczenie dla stworzenia długotrwałej, funkcjonującej hodowli pąkli, obejmujących wszystkie etapy życia. Metody stosowane do hodowli B. improvisus są prawdopodobnie w dużym stopniu stosowane również do innych bezkręgowców morskich z swobodnie pływającymi, planktotroficznymi larwami. Procedury hodowli w przypadku niektórych gatunków są już dobrze opisane (np. w przypadku omułków jadalnych i różnych gatunków ostryg)26, podczas gdy w przypadku innych bezkręgowców morskich istnieje zaledwie kilka przykładów długoterminowych kultur obejmujących cały ich cykl życia. Jedna z pierwszych udanych prób hodowli pąkli (B. amphitrite) została przeprowadzona przez Rittschof i wsp.15. Przed rozważeniem założenia zakładu hodowli pąkli należy dysponować długoterminowymi zasobami finansowymi i osobistymi. Utrzymanie tego rodzaju całorocznej hodowli pąkli wymaga co najmniej jednej osoby pracującej na pół etatu. W przyszłości może istnieć pewien potencjał dla automatyzacji niektórych etapów linii produkcyjnej, głównie hodowli mikroalg27. Ponadto, aby odnieść sukces, niezbędny jest dostęp do dużych ilości wysokiej jakości wody morskiej. Hodowla mikroalg, artemii i pąkli nie wiąże się z żadnymi szczególnymi procedurami bezpieczeństwa. Jednak testy niektórych substancji przeciwporostowych lub toksycznych chemikaliów mogą wymagać specjalnych środków ostrożności.
Panele były sprawdzane kilka razy w tygodniu pod kątem zanieczyszczeń. Woda morska użyta w hodowli została wypompowana z głębokości 40 m w fiordzie Koster przed Morskim Laboratorium Badawczym Tjärnö i została przepuszczona przez dwa filtry piaskowe przed wejściem do laboratoryjnego systemu wodnego. Gdyby nie przeprowadzono filtrowania wody, w kulturze byłoby znacznie więcej zanieczyszczeń. Niezbędne jest regularne czyszczenie paneli w kulturze z detrytusu i innych bezkręgowców (np. hydroidów tworzących rozłogi i drapieżnych nemerteanów), które dostają się do systemu poprzez dostarczanie wody morskiej z pola. Na przykład, jeśli nie są produkowane żadne larwy, mimo że kultura została dobrze odżywiona i poza tym wydaje się być w dobrym stanie, problemem może być obecność nemerteanów, które wydają się hamować krycie. Naturalnie, wiele organizmów zanieczyszczających w kulturze w Laboratorium Badań Morskich Tjärnö było specyficznych dla zachodniego wybrzeża Szwecji, a inne rodzaje organizmów skażających będą powszechne i będą stanowić większe wyzwanie w innych obszarach geograficznych. Na zachodnim wybrzeżu Szwecji rzadko można znaleźć na panelach zanieczyszczenie innymi gatunkami pąkli. Od czasu do czasu stwierdza się pojawienie się S. balanoides , ale jest to problem marginalny (co najwyżej jedno zanieczyszczenie S. balanoides na 10 000 próbek B. improvisus ). Brak gatunków zarażających był najprawdopodobniej uzależniony od reżimu zakładającego nowe kultury w okresie letnim, kiedy larwy B. improvisus były silnie dominujące. Ponadto stwierdzono również wyraźne wzbogacenie B. improvisus na panelach, ponieważ gatunek ten jest selektywny dla gładkich powierzchni13.
Konieczne jest usunięcie martwych dorosłych pąkli. Jeśli puste muszle zostaną pozostawione na panelach, mogą stać się schronieniem zarówno dla nauplii artemii , jak i dla różnych gatunków zanieczyszczających. Ponadto zauważono, że martwe osobniki wpływają na samopoczucie sąsiednich osobników, prawdopodobnie poprzez uwalnianie toksycznych związków podczas rozkładu. Dodatkową konsekwencją śmiertelności dorosłych osobników jest to, że niektóre osobniki zostaną pozostawione same i zbyt daleko od innych dorosłych, aby umożliwić krycie (nawet jeśli pąkle mają najdłuższego penisa w świecie zwierząt w stosunku do jego rozmiaru)28. Osobniki te przeżyją, ale są nieproduktywne dla larw. Jednak te samotne dorosłe osobniki można delikatnie usunąć bez uszkadzania płytki podstawy i umieścić poziomo blisko innych, aby umożliwić krycie. Pąkle można również kryć, umieszczając panele z jednym dorosłym osobnikiem na każdym, ale na tyle blisko, aby mogło dojść do zapłodnienia krzyżowego. W ten sposób można wytworzyć linie genetyczne14.
Bardzo ważne jest, aby produkować paszę o wysokiej jakości i karmić kultury prawie codziennie. Nawet kilka dni bez jedzenia może skutkować zmniejszeniem uwalniania larw. Wcześniejsze badania składu diety wykazały, że okrzemki są niezbędne do wzrostu i przetrwania naupliusów pąkli. Kilka gatunków okrzemek wydaje się być odpowiednich jako pokarm, chociaż małe lub pojedyncze komórki (o średnicy mniejszej niż 10 μm) mogą być niezbędne do spożycia nauplii. Gatunki S. marinoi, C. simplex i T. pseudonana okazały się odpowiednią paszą dla nauplii B. improvisus , a także łatwe w uprawie. Ponadto jakość paszy jest na ogół wyższa w przypadku glonów rosnących wykładniczo. Doniesiono również, że okrzemki są niezbędne do tworzenia produktywnych kultur B. amphitrite15. Teoria dotycząca znaczenia okrzemek mówi, że mają one unikalny profil kwasów tłuszczowych i są szczególnie bogate w wysoce wielonienasycony kwas tłuszczowy 20:529. Wykazano, że niektóre kwasy tłuszczowe są ważne dla pomyślnego rozwoju larw ostryg30.
Z biegiem lat nie odnotowano przypadków szkodliwych chorób w kulturze pąkli. W wielu komercyjnych akwakulturach bezkręgowców, takich jak ostrygi i małże, choroby są dość powszechne i mogą być bardzo szkodliwe. Odnotowano również szkodliwe działanie wirusów w dzikich populacjach. Rodzima ostryga we Francji została zastąpiona przez portugalską ostrygę Crassostrea angulata w 1925 roku, ale gatunek ten został zniszczony przez irydowirusa około 1970 roku31. Ostatnio doszło do masowej śmiertelności ostryg pacyficznych Crassostrea gigas w kulturach na całym świecie, co wydaje się być związane z herpeswirusem opryszczki ostreidów 132. Do tej pory nie opublikowano żadnych doniesień na temat patogenów, bakterii lub wirusów na pąklach. Jednak w trwającym projekcie genomowym dotyczącym B. improvisus znaleziono sekwencje wirusa (Alm Rosenblad i wsp., dane niepublikowane), ale bez widocznego związku z objawami choroby. Mieszaniny antybiotyków były wcześniej stosowane w kulturach, aby zminimalizować ryzyko infekcji bakteryjnych; Jednak ta procedura jest obecnie zaniechana i jak dotąd nie spowodowało to żadnych problemów z zanieczyszczeniem.
Jeśli woda morska jest podgrzewana (jak opisano powyżej), przegrzanie może być najpoważniejszym ryzykiem na linii produkcyjnej kultur. Jest to oczywiście trudne do zabezpieczenia przed przegrzaniem, chociaż można zastosować czujniki i odpowiednie systemy alarmowe (np. wysyłanie wiadomości e-mail lub SMS do osób odpowiedzialnych). Tego rodzaju incydenty w przeszłości skutkowały w kulturze znacznymi zabójstwami dorosłych. Może to oczywiście być druzgocące i zrujnować długoterminowe inwestycje czasu i pieniędzy. W szczególności byłoby to katastrofalne, gdyby ustanowiono wsobne linie genetyczne. Aby zapewnić długowieczność takich linii i zabezpieczyć je przed przypadkową utratą, pożądane byłoby opracowanie metodologii kriokonserwacji pąkli. Doniesiono, że larwy ostryg pacyficznych mogą zostać zamrożone i ożywione z częściowym sukcesem33. Kriobankowość jest również cennym narzędziem służącym ochronie zasobów genetycznych wielu gatunków34. Nawet nauplia z B. amphitrite przetrwały zamrożenie35 i stwierdzono, że 20% zamrożonych osobników z powodzeniem przekształciło się w karpiowate36. Do tej pory nie przyjęto jednak stosowania zamrożenia w celu zapewnienia długoterminowej trwałości upraw, ale byłoby to rzeczywiście konieczne w celu utrzymania wybranych linii; Byłby to niezbędny krok do ugruntowania pozycji B. improvisus jako potężnego systemu modeli morskich.
W tym miejscu przedstawiono protokół preparacji różnych tkanek od dorosłych osobników B. improvisus (tj. cirri, soma i mantel). Należy jednak podkreślić, że można również pobrać inne tkanki. Na przykład tkanka miękka między zewnętrznym a wewnętrznym płaszczem gatunku błoniastej Tetraclita japonica formosana została starannie wyizolowana i wykorzystana do ekstrakcji RNA i analizy sekwencyjnej RNAekspresji genów 37. Opisany tutaj zoptymalizowany protokół ekstrakcji zapewnia wystarczające ilości wysokiej jakości RNA do sekwencjonowania z minimalnej ilości materiału wyjściowego. Po pierwsze, zbieranie pojedynczych larw bezpośrednio do probówek homogenizacyjnych minimalizuje wszelkie straty podczas przenoszenia z jednej probówki do drugiej. Ponadto, spośród różnych testowanych metod, homogenizacja za pomocą kulek ceramicznych okazała się najbardziej efektywna pod względem wydajności i integralności RNA w porównaniu z sonikacją lub homogenizacją tłuczkową. Planując eksperymenty z ekspresją genów lub genomiką, należy pamiętać o wyzwaniu, jakim jest wysoka zmienność genetyczna pąkli, przynajmniej w przypadku B. improvisus. Barnacle ma różnorodność genetyczną w zakresie 3–5%, nawet w regionach kodujących (Alm Rosenblad i wsp., dane niepublikowane). To oczywiście stawia szczególne wymagania dotyczące projektowania starterów do analizy qPCR, w której należy zidentyfikować bardziej konserwatywne regiony i wykorzystać je jako szablony dla starterów w celu uzyskania spójnych wyników ekspresji między partiami. Konserwatywne regiony dla genów docelowych, takich jak akwaporyny i ATPazy Na+/K+, można zidentyfikować, badając zmienność sekwencji tych genów w danych sekwencyjnych RNA uzyskanych z populacji karpiowatych zawierających setki osobników. Do analizy genomu zostanie pobrana próbka DNA. Jednak uzyskanie wysokiej jakości DNA od B. improvisus może być wyzwaniem21.
Podsumowując, uznana kultura pąkli okazała się pomocna w różnego rodzaju badaniach eksperymentalnych. W szczególności całoroczna produkcja larw pozwala nam na prowadzenie eksperymentów bez ograniczania się do naturalnie występującego okresu tarła (w przypadku B. improvisus jest to okres letni). Uzyskane larwy można wykorzystać do przeprowadzenia szerokiego zestawu badań eksperymentalnych, w tym testów osadniczych, testów behawioralnych, badań ekspresji określonych genów, a także badań transkryptomu całego genomu.

Pąkle to skorupiaki morskie z osiadłymi dorosłymi i swobodnie pływającymi larwami planktonicznymi. Większość z 1200 gatunków pąkli zamieszkuje płytkie wody, a wiele z nich jest często narażonych na niskie zasolenie. Jeden gatunek, pąkla zatokowa Balanus (Amphibalanus) improwizuje (B. improvisus), może tolerować prawie słodką wodę, a Karol Darwin opisał ten gatunek z małego strumienia w ujściu Rio de la Plata w Urugwaju1. Ekstremalna tolerancja na niskie zasolenie sprawia, że B. improvisus jest szczególnie istotnym modelem do badań nad mechanizmami osmoregulacyjnymi2,3. Pąkla ta preferuje słonawe warunki, ale jest zdolna do życia w wodach o zasoleniu od około 1,6 psu do nawet 40 psu4. Jest to jedyny gatunek pąkli występujący w słonawym Morzu Bałtyckim. Uważa się, że B. improvisus pochodzi ze wschodniego wybrzeża kontynentu amerykańskiego, ale dziś można go znaleźć na całym świecie z powodu rozprzestrzeniania się przez shipping5. Jest to główny organizm zarastający i jest powszechnie spotykany na skałach, pomostach i kadłubach łodzi, a zatem ma ogólne znaczenie dla zrozumienia mechanizmów biofoulingu na konstrukcjach w wodach morskich i słonawych6,7.
Podobnie jak większość innych pąkli, B. improvisus jest hermafrodytyczny z zapłodnieniem krzyżowym; rozmnażanie odbywa się poprzez kojarzenie się między sąsiednimi osobnikami za pomocą wydłużonego penisa i wewnętrznego zapłodnienia. Okres rozrodczy trwa głównie od maja do września. B. improvisus ma siedem pelagicznych stadiów larwalnych (sześć nauplii, po których następuje jedno stadium karpidowe8). Z zapłodnionego jaja wykluwa się larwa naupliusa, która swobodnie pływa i żeruje w słupie wody przez okres do kilku tygodni, zanim stanie się w nieżerującą larwę karpiowatego. Cypryd używa wielu wskazówek, aby znaleźć odpowiednie miejsce do osiedlenia się, a następnie przechodzi metamorfozę w siedzącego młodocianego pąkla9. Gatunek ten może być hodowany w laboratorium i żyje 1-2 lata w morzu (2-3 lata w hodowli laboratoryjnej). Średnio B. improvisus dorasta do 10 mm średnicy (maksymalnie około 20 mm) i osiąga maksymalną wysokość około 6 mm (chociaż może rosnąć wyżej w zatłoczonych warunkach). Gatunek można rozpoznać po gładkiej, wapiennej, równej skorupie (białej lub szarawej), promieniście wzorzystej wapiennej podstawie płytki muszli oraz kształcie płytek tergalowych1,10.
Pąkla B. improvisus ma kilka korzystnych cech jako model do badań nad osmoregulacją, z naciskiem na mechanizmy molekularne i fizjologiczne, a także interakcje ekologiczne i konsekwencje ewolucyjne. Jest również szeroko stosowany jako model do badań nad biologią osadniczą, w szczególności w odniesieniu do badań nad przeciwporostowością i związanymi z nimi mechanizmami7,11,12,13. Jednak naturalne tarło sezonowe daje nieprzewidywalną podaż larw karpiowatych do badań. Zdolność do hodowli tej pąkli przez cały cykl życia przez cały rok jest zatem głównym atutem umożliwiającym różnego rodzaju badania molekularne i mechanistyczne. Ponadto jego obecność w wodach morskich/słonawych na całym świecie pozwala na połączenie badań terenowych i eksperymentalnych. Kontrolowana hodowla może również wytworzyć rodziny o znanych rodowodami do długoterminowej hodowli14, a czas pokolenia wynoszący kilka miesięcy może pozwolić na długoterminową ewolucję eksperymentalną. Dostępny jest również szkic genomu i kilka transkryptomów, a zasoby te zostały wykorzystane do klonowania kilku genów (np. genów mających znaczenie w osmoregulacji)2,3.
Celem tego protokołu jest opisanie jak założyć i utrzymać hodowlę pąkli B. improvisus przez cały rok, aby przeprowadzić badania ekspresji genów na dorosłych lub larwach tego organizmu. Rittschof i wsp.15 krótko opisywał metodę hodowli pąkli od momentu wypuszczenia nauplii do osiedlenia się karpiowatych dla gatunku Balanus amphitrite. Protokół został dostosowany do całorocznej hodowli B. improvisus w Morskim Laboratorium Badawczym Tjärnö (Szwecja) i przedstawiono szczegółowy opis wszystkich etapów linii produkcyjnej, w tym produkcji i hodowli larw pąkli, a także podawania paszy dla dorosłych i larw. Aby zapoznać się z pełną procedurą, zobacz Rysunek 1. Zastosowanie systemu hodowli jest zilustrowane kilkoma typowymi układami eksperymentalnymi i zilustrowane w funkcjonalnych badaniach genomicznych ATPazy Na+/K+ i akwaporyn, wyjaśniając ich możliwe funkcje w osmoregulacji2,3. Czasami konieczne jest zbadanie ekspresji genów w określonych tkankach, a niektóre z podstaw sekcji pąkli zostaną omówione. Dzięki dobremu zaopatrzeniu w wysokiej jakości wodę morską hodowla pąkli B. improvisus i potencjalnie wielu innych gatunków powinna być możliwa w laboratoriach morskich na całym świecie.

<table><tbody><tr><td>Panele z pleksi (polimetakrylanu metylu)</td><td>Plastic produkter, Bromma, Szwecja</td><td></td><td>przezroczysta</td></tr><tr><td>szklana butelka</td><td></td><td></td><td></td>PET 1,5 l</tr><tr><td>Artemia</td><td>INVE Akwakultura, Belgia</td><td></td><td>Przetestowaliśmy różne firmy; to jest naprawdę najlepsza</td></tr><tr><td>Skeletonema marinoi (szczep CCAP 1077/5)</td><td>CCAP (kolekcja kultur glonów i pierwotniaków); Szkocja&nbsp;</td><td>szczep 1077/5</td><td></td></tr><tr><td>Chaetoceros simplex var. gracilis (szczep CCAP 1085/3)</td><td>CCAP (kolekcja kultur glonów i pierwotniaków); Szkocja&nbsp;</td><td>szczep 1085/3</td><td></td></tr><tr><td>System filtrów z wkładem Millipore</td><td>Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>wkład o nominalnej wielkości porów 0,2 i mikro; m</td><td>Milipore&nbsp;</td><td>wkład CWSS01S03</td><td>Duża pojemność dla dużych objętości</td></tr><tr><td>butelki z poliwęglanu</td><td>Nalgene</td><td></td><td>autoklawalowane</td></tr><tr><td>RNA później</td><td>Qiagen</td><td>76106</td><td>&nbsp; Roztwór utrwalający do konserwacji RNA</td></tr><tr><td>Turbo Zestaw wolny od DNA</td><td>Invitrogen/Thermofisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>AM1907</td><td>Zestaw DNAzy do usuwania DNA z przygotowanego RNA</td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy cDNA iScript Zestaw do syntezy cDNA</td><td>1708890 Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green supermix</td><td>Biorad</td><td>1708880</td><td>Dye do QPCR</td></tr><tr><td>RNeasy minikit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Ekstrakcja RNA u dorosłych lub wielu karpiowatych</td></tr><tr><td>Homogenizacja tkanek miękkich CK 14, probówki 2 ml</td><td>Precellys</td><td>KT03961-1-003.2</td><td>Kulki ceramiczne do homogenizacji</td></tr><tr><td>RNeasy micro kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>Ekstrakcja RNA kilku karpiowatych</td></tr></tbody></table>

barnacle balanus improvisus jako model morski - hodowla i ekspresja genów

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Pąkle to skorupiaki morskie z osiadłymi dorosłymi i swobodnie pływającymi larwami planktonicznymi. Pąkla Balanus (Amphibalanus) improvisus jest szczególnie istotna jako model do badań nad mechanizmami osmoregulacyjnymi ze względu na jej ekstremalną tolerancję na niskie zasolenie. Jest również szeroko stosowany jako model biologii osadniczej, w szczególności w odniesieniu do badań nad przeciwporostowością. Jednak naturalne tarło sezonowe daje nieprzewidywalną podaż larw karpiowatych do badań. Opracowano protokół całorocznej hodowli B. improvisus i przedstawiono szczegółowy opis wszystkich etapów linii produkcyjnej (tj. zakładanie dorosłych kultur na panelach, zbieranie i hodowla larw pąkli oraz podawanie paszy dla dorosłych i larw). Opis zawiera również wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów i omawia krytyczne parametry (np. usuwanie zanieczyszczeń, produkcja paszy wysokiej jakości, potrzebna siła robocza i znaczenie wysokiej jakości wody morskiej). Każda partia z systemu hodowli daje maksymalnie około 12 000 naupliów i może dostarczyć cztery partie w ciągu tygodnia, dzięki czemu można wyprodukować do prawie 50 000 larw tygodniowo. Metoda stosowana do hodowli B. improvisus jest prawdopodobnie w dużym stopniu stosowana również do innych bezkręgowców morskich z wolno pływającymi larwami. Przedstawiono protokoły preparacji różnych tkanek od osób dorosłych, a także produkcji wysokiej jakości RNA do badań nad ekspresją genów. Opisano również, w jaki sposób hodowane dorosłe osobniki i hodowane karpiowate mogą być wykorzystywane w szerokim wachlarzu projektów eksperymentalnych do badania ekspresji genów w odniesieniu do czynników zewnętrznych. Wykorzystanie hodowlanych pąkli w ekspresji genów zilustrowano badaniami nad możliwymi rolami osmoregulacyjnymi ATPazy Na+/K+ i akwaporyn.

Stosując opisaną procedurę hodowli dorosłych osobników B. improvisus, można uzyskać do czterech partii larw naupliusów tygodniowo. Zbiór larw naupliusów byłby możliwy niemal każdej nocy, jednak wymagałoby to większego zaangażowania personelu oraz rozbudowanej infrastruktury (przy dużej liczbie osobników w stadzie hodowlanym kultura uwalnia larwy w sposób ciągły). Dodatkowym czynnikiem ograniczającym produkcję larw wydaje się być dostępność wysokiej jakości paszy, w szczególności okrzemki Skeletonema. Maksymalnie każda partia z systemu hodowlanego składa się z około 12 000 naupliusów, co oznacza, że tygodniowo można wyhodować do 50 000 naupliusów. Niemniej jednak w niektórych tygodniach liczba produkowanych larw może być nawet dziesięciokrotnie mniejsza. Pojedynczy dorosły osobnik może wytworzyć do 7 000 larw na dobę14, co oznacza, że na każdą partię larwy uwalnia 1–2 osobniki dorosłe. W ciągu tygodnia około 70–90% zebranych naupliusów przekształci się w cypridy (co daje maksymalnie około 30 000 cyprid tygodniowo), które mogą być wykorzystane w testach osiadania oraz badaniach molekularnych.
Należy podkreślić, że cechy cyprid wykazują zmienność między partiami, a ogólnie zmienność między partiami jest większa niż zmienność w obrębie pojedynczej partii. Na przykład sukces osiadania w testach osiadania waha się od 30 do 70% dla różnych partii. Najprawdopodobniej jest to spowodowane indywidualną zmiennością genetyczną między konkretnymi parami osobników dorosłych uwalniających larwy w różnych okresach próbkowania. Oczywiście zaleca się, aby powtórzone eksperymenty (repliki biologiczne) obejmowały cypridy z kilku partii, jeśli mają zostać sformułowane bardziej ogólne wnioski z wyników. Zmienność między partiami stawia wymagania przed planem eksperymentalnym, w którym należy zastosować odpowiednie kontrole i normalizacje w badaniach ekspresji genów. Jednakże, nawet po zastosowaniu kilku procedur normalizacji statystycznej, które znacznie redukują zmienność między partiami, niektóre efekty wynikające z przynależności do partii są zazwyczaj nadal widoczne (dane niepublikowane).
Postępując zgodnie z przedstawionym protokołem, możliwe jest uzyskanie średnio 500 ng wysokiej jakości RNA z zaledwie 20 cypridów, niezależnie od etapu osiadania pierzniczek (Tabela 1). Jakość RNA jest zazwyczaj oceniana na podstawie stosunku pików 18S do 28S (przewidywane położenia tych dwóch pików wskazano na Rysunku 4). Jednak w przypadku pierzniczek i wielu innych stawonogów, rRNA 28S ulega degradacji podczas ogrzewania (będącego częścią metody analizy) i migruje wspólnie z pikiem 18S20. Z tego powodu w tego typu analizach dla pierzniczek w zasadzie występuje tylko jeden pojedynczy pik rRNA. Z przeprowadzonego testu (Rysunek 4) wynika wyraźnie, że homogenizacja za pomocą kulek ceramicznych zapewnia najwyższą integralność RNA i jest zatem metodą zalecaną. Ilość i jakość RNA są wystarczające do przygotowania wysokiej jakości bibliotek do sekwencjonowania, co pozwala na uzyskanie średnio 70 milionów odczytów na próbkę (liczba odczytów zależy oczywiście od poziomu multipleksowania podczas sekwencjonowania). Ilość RNA jest również wystarczająca do syntezy cDNA i analizy ekspresji qPCR dla dużej liczby genów.
Rysunek 5 przedstawia wyniki analiz qPCR akwaporyn oraz wariantów splicingowych pompy Na+/K+ ATPase (NAK1), w których badano zmiany ekspresji w odpowiedzi na zmiany bodźców środowiskowych2,3. Porównanie względnej ekspresji długiego i krótkiego wariantu splicingowego NAK1 wykazuje dwukrotny wzrost poziomu mRNA długiej formy NAK1 przy niskim zasoleniu w stosunku do krótkiej formy NAK (Rysunek 5A). Zatem dane wskazują, że splicing alternatywny sprawia, iż forma długa dominuje w warunkach niskiego zasolenia. W przypadku akwaporyn widoczne jest, że dwa paralogi transportujące wodę, AQP1 i AQP2, wykazują różnicową ekspresję (Rysunek 5B). W szczególności w tkance płaszcza widać, że ekspresja AQP1 jest znacznie obniżona przy niższym zasoleniu, co nie występuje w przypadku AQP2. Zamiast tego AQP2 wykazuje nieco zwiększoną ekspresję przy niższym zasoleniu, ale w somie. Wyniki te stanowią podstawę do badań nad funkcjonalną rolą różnych transporterów jonowych i akwaporyn B. improvisus w osmoregulacji pąkli.
<img alt="Schemat cyklu życiowego organizmów morskich; pobieranie próbek DNA/RNA; hodowla naupliusów i cypridów, eksperyment osiedleńcze." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1Przegląd całej procedury hodowli oraz ekstrakcji RNA do badań ekspresji genów u osobników dorosłych. Aby rozpocząć nową hodowlę, panele mocuje się do ramy i umieszcza w morzu na głębokości 1–3 m. Po kilku tygodniach panele z osobnikami dorosłymi/młodymi umieszcza się pionowo w regałach w kuwetach w laboratorium. Każda kuweta mieści około 40 paneli z osobnikami dorosłymi. Przy około 100 osobnikach dorosłych na panel, w każdej kuwecie hodowanych jest łącznie ≈ 4 000 osobników dorosłych. Dorosłe pereznie karmi się za pomocą Artemia or mogą być utrzymywane przez cały rok. Larwy naupliusy są zbierane z tacek kilka razy w tygodniu poprzez filtrowanie przez sito. Zebrane naupliusy przenosi się do wiader utrzymywanych w 26 °C w kąpieli wodnej i karmione mikroalgami. Nauplii hoduje się do czasu przejścia w stadium nieżywiących się cypridów, które następnie zbiera się poprzez filtrowanie. W warunkach laboratoryjnych można zakładać nowe panele poprzez osadzanie cypridów na panelach, aby zapewnić nowe panele do całorocznej hodowli lub w celu wykorzystania ich w konkretnych układach eksperymentalnych ze zmienionymi warunkami zewnętrznymi. Następnie, pod koniec eksperymentu lub w określonych punktach czasowych, izoluje się RNA z osobników młodocianych/dorosłych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ wodny z wygrodzeniami, układem sedymentacji i filtracją wody do eksperymentu z zakresu nauk o morzu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2Zdjęcia niektórych kluczowych etapów procedury hodowli. (ANa tym obrazie przedstawiono ramki z panelami służącymi do pobierania nowych populacji z terenu.B) Na tym obrazie przedstawiono panele z dorosłymi pąklami z B. improvisus w statywach umieszczonych w tackach. Panele są rozmieszczone w odstępach około 2 cm. (CNa obrazie przedstawiono tace z panelami z pąklami oraz zbiornik do karmienia po lewej stronie. Z każdej tacy odpływa woda przez wylot, w którym umieszczono sita do zbierania larw naupliusów.D) Na tym obrazie przedstawiono produkcję Artemia pasza dla dorosłych pierścienic.E) Na obrazie przedstawiono hodowlę naupliusów w wiaderkach umieszczonych w łaźni wodnej ustawionej na 26 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat anatomiczny piziarni; opisane płytki opercularne, soma, cirri do celów edukacyjnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3Opis początkowych etapów sekcji dorosłych perezaków: usuwanie ciała z muszli. (A) Chwyć jedną z płytek opercularnych, ostrożnie wsuwając pęsetę przez otwór. Delikatnie pociągnij, aby usunąć płytkę i odsłonić zwierzę. (B) Wyciągnij zwierzę, chwytając za część somy tuż poniżej cirri. (C) Ten panel przedstawia ogólną anatomię pąkli. Płaszcz i potencjalnie zapłodnione jaja (w jajniku) pozostają w jamie muszli podczas wyciągania ciała. Uwaga dotycząca anatomii pąkli (bardziej szczegółowy opis znajduje się u Andersona)9płytki ścienne serكونnicy są nachylone do wewnątrz i razem tworzą stożek przypominający wulkan. Otwór, czyli apertura, jest przykryty dwiema płytkami operkularnymi, które tworzą drzwiczki, lub operculum, służące do zamykania apertury. Serkonnice z rodzaju Acorn barnacles zazwyczaj posiadają wapienną płytkę podstawną, która jest silnie przytwierdzona do substratu; jednak niektóre gatunki serkonnic nie posiadają tej wapiennej płytki (np., S. balanoides). Piszczelnice wydzielają egzoszkielet z ciemno pigmentowanego płaszcza (karapaks). Zewnętrzna powierzchnia dwuwarstwowego płaszcza ulega zwapnieniu, stając się sztywną, natomiast wewnętrzna powierzchnia płaszcza nie jest zwapniała i w związku z tym pozostaje elastyczna. Wewnątrz otworu znajdują się w pozycji wciągniętej cirri. Są to wyrostki piersiowe, których piszczelnice używają do odżywiania się poprzez filtrowanie. Jajniki znajdują się blisko podstawy piszczelnicy, natomiast jądra tkwią w somie. Rysunek został zaadaptowany z Panova. i wsp.21 i zostało opublikowane za zgodą wydawnictwa Springer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.</a>
<img alt="Analiza fluorescencji; wykres intensywności zależny od czasu; piki emisji w 44s." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Określanie integralności rRNA za pomocą kapilarnej elektroforezy żelowej. RNA przygotowano dwiema różnymi metodami homogenizacji: (A) sonikacją oraz (B) za pomocą kulek ceramicznych. Jednostka na osi y, FU, oznacza jednostki fluorescencji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy; wpływ zasolenia i pCO2 na dane NKA-L1; ekspresja AQP w somie, cirri i płaszczu; istotność statystyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Wyniki ekspresji genów z dwóch różnych badań nad genami istotnymi dla osmoregulacji u B. improvisus. (A) Panel ten przedstawia różnicową ekspresję, zmierzoną za pomocą qPCR, wariantów splicingowych Na+/K+ ATPase NAK1 w odpowiedzi na różne poziomy zasolenia i pCO23. W wariancie o niskim zasoleniu ekspresja długiej izoformy (NAK1-L) jest zwiększona w stosunku do krótkiej (ANOVA, P &lt; 0,001). (B) Panel ten przedstawia ekspresję akwaporyn u osobników dorosłych B. improvisus podczas ekspozycji na różne poziomy zasolenia2. Do określenia poziomów ekspresji akwaporyn w stosunku do aktyny wykorzystano qPCR. Osobniki dorosłe inkubowano przy 3 różnych poziomach zasolenia (3, 20 i 33 PSU) przez 14 dni. Do przygotowania RNA wyizolowano somę, cirri i płaszcz osobników dorosłych. Na obu rycinach słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe. Symbole ** i *** wskazują poziom istotności (ANOVA), odpowiednio 0,01 i 0,001. Ryciny te zostały zmodyfikowane na podstawie pracy Lind et al.2,3. Obie ryciny zostały opublikowane za zgodą PLoS ONE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Faza osiadania</td>
			<td>Całkowita ilość RNA (ng)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swobodne pływanie</td>
			<td>512</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eksploracja: Zamknij wyszukiwanie</td>
			<td>518</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przymocowany cyprid</td>
			<td>550</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Świeżo przeobrażona osobnik młodociany</td>
			<td>832</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Wydajność izolacji RNA. Tabela ta przedstawia ilość RNA wyekstrahowanego za pomocą zestawu do preparatyki RNA z pul 20 osobników cyprid zebranych na różnych etapach procesu osiadania.

Pąkla Balanus (Amphibalanus) improvisus jest modelem do badania osmoregulacji i przeciwporostowości. Jednak naturalne tarło sezonowe daje nieprzewidywalną podaż larw karpiowatych. W tym miejscu opisano protokół całorocznej hodowli B. improvisus, w tym produkcji larw. Zilustrowano zastosowanie hodowlanych pąkli w badaniach ekspresji genów.

Barnacle Balanus improvisus jako model morski - hodowla i ekspresja genów

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

Placówka hodowli może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące ekologii larw, biofoulingu i biologii ewolucyjnej. Dokładniej rzecz ujmując, może być wykorzystany w badaniach nad interakcjami receptor-ligand podczas osiedlania się larw, opracowywaniem nowych technologii przeciwporostowych oraz ewolucją i funkcją genów zaangażowanych w osmoregulację. Główną zaletą tego organizmu modelowego jest to, że pąkla Balanus improvisus jest wytrzymała, rozmnaża się przez cały rok i ma stosunkowo krótki czas generacji.Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w hodowlę pąkli, można ją również zastosować do hodowli innych organizmów morskich. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z powodu dużej liczby szczegółów, które są ważne dla sukcesu, takich jak zaopatrzenie w dobrą wodę morską, solidna produkcja wysokiej jakości paszy oraz ciągłe dbałość o czyszczenie i karmienie kultur. Procedurę zademonstrują Martin Ogemark i Anna-Lisa Wrange, technik i badacz pracujący z pąklami.Na początek ustaw ramki, które mogą pomieścić kilka przezroczystych paneli termoplastycznych. Wywierć dwa otwory w górnych rogach każdego panelu i użyj opasek kablowych, aby przymocować panele do ram. Aby zebrać dorosłe pąkle, rozłóż panele pionowo na głębokości od jednego do trzech metrów w spokojnych wodach.Po umożliwieniu pąklom osiedlenia się i urosnięcia do pięciu milimetrów średnicy, przynieś panele do laboratorium. Następnie umieść panele pionowo w stojaku z wyfrezowanymi rowkami w tacce z polietylenu. Najpierw, używając nietoksycznej, wodoodpornej taśmy, sklej ze sobą pięć paneli, aby utworzyć sześcian, który jest otwarty u góry.Umieść kostkę na małej tacy i napełnij ją wodą morską. Następnie dodaj około 200 cyprydów na górze kostki. Co drugi dzień karm młode pąkle 100 mililitrami Skeletonema marinoi.Po dwóch do trzech tygodniach panele sześcianu powinny zawierać ustabilizowane młode osobniki o średnicy co najmniej pięciu milimetrów. Rozłóż kostkę na części i przenieś panele na tace z przepływającą wodą morską. Aby zebrać nauplii artemii, najpierw wyłącz pompę napowietrzającą i przyciemnij butelkę, a następnie oświetl dolną część butelki na 10 minut.Wyklute naupliusy Artemii będą płynąć w kierunku światła. Nie wyklute cysty opadną na dno, podczas gdy muszle cyst będą unosić się na górze. Otwórz zacisk na dole i zbierz frakcję pośrednią jako gęstą populację pływających naupliów artemii.Aby wyczyścić panele z dorosłymi pąklami, delikatnie spryskaj je słodką wodą i usuń wszelkie zanieczyszczenia miękką szczoteczką do zębów. Wyczyść tace bez pąkli i rurki gorącą słodką wodą. Następnie umieść sitko w tacce polietylenowej z portem przelewowym.Zbierz larwy pąkli, które osiadają na sicie przez noc. Następnie napełnij wiadro 20 litrami przefiltrowanej wody morskiej i jednym litrem mieszanki mikroalg okrzemkowych, aby uzyskać gęstość 50 000 okrzemek na mililitr. Zebrane wcześniej nauplia pąkli przenosimy do naczynia krystalizującego i oświetlać naczynie z boku.Następnie za pomocą pipety zbierz nauplia, które płyną w kierunku światła i przenieś je do innego naczynia. Przenieś nauplia do zlewki zawierającej jeden litr przefiltrowanej wody morskiej w celu policzenia. Następnie dodaj jeden litr nauplii do wcześniej przygotowanego wiadra.Po trzech dniach użyj sitka o długości 90 mikrometrów, aby zebrać nauplius pąkli, a następnie wyczyść wiadro, napełnij je przefiltrowaną wodą morską i dodaj nową karmę dla okrzemek i naupliusów pąkli. Po kolejnych dwóch do trzech dniach inkubacji użyj sita o długości 320 mikrometrów na sicie o długości 160 mikrometrów, aby oddzielić nieliniejące naupliusy pąkli od karpiowatych. Po ustawieniu czterech czterolitrowych butelek do hodowli mikroalg, umieść butelki w świetle o intensywności od 50 do 100 mikromoli na metr kwadratowy.Zbierz kultury, gdy są wystarczająco gęste, aby można je było wykorzystać do karmienia. Po pierwsze, wybierz duże osobniki i wstrzymaj się z jedzeniem na dwa dni przed sekcją. Następnie wyczyść skorupę pąkli szczoteczką do zębów i spłucz wodą, aby zminimalizować zanieczyszczenie innymi gatunkami obecnymi w środowisku.Umieść pojedynczą pąklę na równej powierzchni w celu rozwarstwienia, a następnie włóż końcówkę kleszczy między płytki tergalowe i tarczkowe. Chwyć jedną płytkę i delikatnie ją pociągnij, aby ją wyjąć. Następnie użyj kleszczy, aby chwycić cirri i wyciągnąć pąklę prosto.Na koniec umieść wypreparowane pąkle bezpośrednio w 96% etanolu lub roztworze stabilizującym RNA w celu utrwalenia. Dzięki opisanemu tutaj protokołowi w ciągu jednego tygodnia można wyprodukować do czterech partii larw pąkli nauplius. Maksymalnie każda partia z systemu hodowli składa się z około 12 000 nauplii, co oznacza, że można wyhodować do 50 000 nauplii tygodniowo.W ciągu tygodnia od 70 do 90% zebranych naupliów przekształci się w karpiowate, co daje około 30 000 karpiowatych tygodniowo. Średnio 500 nanogramów wysokiej jakości RNA uzyskano z zaledwie 20 pojedynczych karpiowatych, niezależnie od etapu zasiedlenia. W pąklach 28S rRNA rozpada się po podgrzaniu.Homogenizacja za pomocą kulek ceramicznych zapewnia RNA najwyższą integralność, co czyni go preferowaną metodą obróbki tkanek pąkli i stawonogów. Za pomocą analizy qPCR zaobserwowano dwukrotny wzrost długich wariantów mRNA NAK1 i niskie zasolenie w porównaniu z krótkim NAK. Wskazywało to, że długa forma dominuje w warunkach niskiego zasolenia.Potrzeba kilku tygodni treningu, aby opanować różne etapy związane z kulturą pąkli. Podczas wykonywania tej procedury szczególnie ważne jest zminimalizowanie zanieczyszczenia na wszystkich etapach procesu hodowli. Po opracowaniu ta technika hodowli odegrała zasadniczą rolę w lepszym zrozumieniu ekologii, fizjologii i biologii molekularnej pąkli.Jest to również ważny kamień węgielny w przekształcaniu pąkli Balanus improvisus w potężny system modeli morskich.

the-barnacle-balanus-improvisus-as-marine-model-culturing-gene

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Obuzd Parhyale hawaiensis jest obiecującym organizmem modelowym do badań embriologii skorupiaków oraz porównawczego rozwoju i ewolucji stawonogówów. Protokół ten opisuje metodę ręcznego usuwania pojedynczych blastomerów z zarodków Parhyale we wczesnym stadium rozszczepienia.

Ablacja pojedynczej komórki z ośmiokomórkowych zarodków skorupiaka z rodziny Amphipod Parhyale hawaiensis

Metody tworzenia morfujących zarodków są niezbędne do badania mechanizmów rozwojowych i sieci regulacji genów.  Gwiazda morska Patiria miniata jest wyłaniającym się systemem modelowym dla tych badań.  W tym miejscu przedstawiamy protokół pozyskiwania gamet, produkcji kultur zarodków oraz szybkiej mikroiniekcji zygot tego gatunku.

Metoda mikroiniekcji zygot Patiria minata

Informujemy tutaj o solidnej i efektywnej ekspresji białek fluorescencyjnych po wstrzyknięciu mRNA do niezapłodnionych oocytów Branchiostoma lanceolatum. Opracowanie techniki mikroiniekcji w tym podstawowym strunacie utoruje drogę dla dalekosiężnych innowacji technicznych w tym powstającym systemie modelowym, w tym obrazowania in vivo i manipulacji specyficznych dla genów.

Ekspresja białek fluorescencyjnych w Branchiostoma lanceolatum przez wstrzyknięcie mRNA do niezapłodnionych oocytów

Celem tego protokołu jest dostarczenie użytkownikom zestawu metod do wysokoprzepustowej dekapsulacji zarodków i larw Lymnaea stagnalis w ramach przygotowań do hybrydyzacji in situ całego wierzchowca oraz do późniejszych zabiegów przed i po hybrydyzacji.

Cała metoda hybrydyzacji in situ dla ślimaka Lymnaea stagnalis

Tutaj pokazujemy, jak indukować i monitorować regenerację u ukwiału gwiazdkowego Nematostella vectensis, modelowego antozoana parzydełkowego.  Pokazujemy, jak amputować i kategoryzować regenerację za pomocą morfologicznego systemu oceny stopnia zaawansowania, a także używamy tego systemu, aby ujawnić wymóg autofagii w regeneracji struktur polipowych.

Indukowanie całkowitej regeneracji polipów z pęcherza brzusznego ukwiału gwiazdkowego Nematostella vectensis

Celem tego protokołu jest przeprowadzenie hybrydyzacji in situ na próbkach dorosłych koralowców, które zostały zatopione w parafinie i pocięte na szkiełka podstawowe. Jest to metoda jakościowa stosowana do wizualizacji ekspresji przestrzennej sondy antysensownej RNA w tkankach zanurzonych w parafinie.

In Situ Techniki hybrydyzacji próbek dorosłych koralowców zanurzonych w parafinie

Celem tego protokołu jest genotyp ukwiału Nematostella vectensis podczas gastrulacji bez poświęcania zarodka.

Genotypowanie ukwiałów morskich we wczesnym okresie rozwoju

Doliolidy, w tym gatunek Dolioletta gegenbauri, to mały, galaretowaty zooplankton morski o znaczeniu ekologicznym, występujący na produktywnych systemach szelfu subkontynentalnego na całym świecie. Trudność w hodowli tych delikatnych organizmów ogranicza ich badania. W tym badaniu opisujemy podejścia do uprawy w celu zbierania, hodowli i utrzymania doliolid Dolioletta gegenbauri.

Uprawa osłonicy morskiej pelagicznej Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) do badań eksperymentalnych

Artykuł przedstawia metody hodowli larw ślimaka Crepidula fornicata w systemie laboratoryjnym o małej objętości oraz w systemie mezokosmosu z otaczającą wodą morską, który może być stosowany w terenie.

Hodowla laboratoryjna i terenowa larw skałoczepa pantofelkowego, Crepidula fornicata

To badanie nakreśla ramy dla rozwoju modelu zagregowanego biofilmu wielomikrobiologicznego i optymalizacji protokołu ekstrakcji RNA w celu oceny ekspresji genu Pseudomonas aeruginosa odzwierciedlającej środowisko płuc mukowiscydozy. Zastosowania obejmują ocenę działania przeciwdrobnoustrojowego i badanie alternatyw dla antybiotyków w warunkach istotnych dla mukowiscydozy.

Model zagregowanego biofilmu mukowiscydozy do badania ekspresji genów istotnych dla infekcji

Badanie to opracowało sposób tworzenia i utrzymania stabilnych linii mutantów dla ślimaka jabłkowego słodkowodnego, Pomacea canaliculata. Protokoły obejmują zbieranie zygot, mikrowstrzyknięcie ich komponentami systemu CRISPR/Cas9 w celu wywołania edycji genomu, hodowlę zarodków ex ovo oraz genotypizację po kontrolowanych krzyżowaniach.

Złota jabłka ślimaka Pomacea canaliculata: od zygot do stabilnych linii mutantów

Poznaj metodę hodowli Balanus improvisus przez cały rok w celu badań nad ekspresją genów i osmoregulacją. Technika umożliwia produkcję do 50 000 larw tygodniowo i dostarcza wysokiej jakości RNA do analizy molekularnej.

Barnacle Balanus improvisus jako model morski - hodowla i ekspresja genów

Przeglądaj więcej filmów