Barnacle Balanus improvisus jako model morski - hodowla i ekspresja genów

Placówka hodowli może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące ekologii larw, biofoulingu i biologii ewolucyjnej. Dokładniej rzecz ujmując, może być wykorzystany w badaniach nad interakcjami receptor-ligand podczas osiedlania się larw, opracowywaniem nowych technologii przeciwporostowych oraz ewolucją i funkcją genów zaangażowanych w osmoregulację. Główną zaletą tego organizmu modelowego jest to, że pąkla Balanus improvisus jest wytrzymała, rozmnaża się przez cały rok i ma stosunkowo krótki czas generacji.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w hodowlę pąkli, można ją również zastosować do hodowli innych organizmów morskich. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z powodu dużej liczby szczegółów, które są ważne dla sukcesu, takich jak zaopatrzenie w dobrą wodę morską, solidna produkcja wysokiej jakości paszy oraz ciągłe dbałość o czyszczenie i karmienie kultur. Procedurę zademonstrują Martin Ogemark i Anna-Lisa Wrange, technik i badacz pracujący z pąklami.

Na początek ustaw ramki, które mogą pomieścić kilka przezroczystych paneli termoplastycznych. Wywierć dwa otwory w górnych rogach każdego panelu i użyj opasek kablowych, aby przymocować panele do ram. Aby zebrać dorosłe pąkle, rozłóż panele pionowo na głębokości od jednego do trzech metrów w spokojnych wodach.

Po umożliwieniu pąklom osiedlenia się i urosnięcia do pięciu milimetrów średnicy, przynieś panele do laboratorium. Następnie umieść panele pionowo w stojaku z wyfrezowanymi rowkami w tacce z polietylenu. Najpierw, używając nietoksycznej, wodoodpornej taśmy, sklej ze sobą pięć paneli, aby utworzyć sześcian, który jest otwarty u góry.

Umieść kostkę na małej tacy i napełnij ją wodą morską. Następnie dodaj około 200 cyprydów na górze kostki. Co drugi dzień karm młode pąkle 100 mililitrami Skeletonema marinoi.

Po dwóch do trzech tygodniach panele sześcianu powinny zawierać ustabilizowane młode osobniki o średnicy co najmniej pięciu milimetrów. Rozłóż kostkę na części i przenieś panele na tace z przepływającą wodą morską. Aby zebrać nauplii artemii, najpierw wyłącz pompę napowietrzającą i przyciemnij butelkę, a następnie oświetl dolną część butelki na 10 minut.

Wyklute naupliusy Artemii będą płynąć w kierunku światła. Nie wyklute cysty opadną na dno, podczas gdy muszle cyst będą unosić się na górze. Otwórz zacisk na dole i zbierz frakcję pośrednią jako gęstą populację pływających naupliów artemii.

Aby wyczyścić panele z dorosłymi pąklami, delikatnie spryskaj je słodką wodą i usuń wszelkie zanieczyszczenia miękką szczoteczką do zębów. Wyczyść tace bez pąkli i rurki gorącą słodką wodą. Następnie umieść sitko w tacce polietylenowej z portem przelewowym.

Zbierz larwy pąkli, które osiadają na sicie przez noc. Następnie napełnij wiadro 20 litrami przefiltrowanej wody morskiej i jednym litrem mieszanki mikroalg okrzemkowych, aby uzyskać gęstość 50 000 okrzemek na mililitr. Zebrane wcześniej nauplia pąkli przenosimy do naczynia krystalizującego i oświetlać naczynie z boku.

Następnie za pomocą pipety zbierz nauplia, które płyną w kierunku światła i przenieś je do innego naczynia. Przenieś nauplia do zlewki zawierającej jeden litr przefiltrowanej wody morskiej w celu policzenia. Następnie dodaj jeden litr nauplii do wcześniej przygotowanego wiadra.

Po trzech dniach użyj sitka o długości 90 mikrometrów, aby zebrać nauplius pąkli, a następnie wyczyść wiadro, napełnij je przefiltrowaną wodą morską i dodaj nową karmę dla okrzemek i naupliusów pąkli. Po kolejnych dwóch do trzech dniach inkubacji użyj sita o długości 320 mikrometrów na sicie o długości 160 mikrometrów, aby oddzielić nieliniejące naupliusy pąkli od karpiowatych. Po ustawieniu czterech czterolitrowych butelek do hodowli mikroalg, umieść butelki w świetle o intensywności od 50 do 100 mikromoli na metr kwadratowy.

Zbierz kultury, gdy są wystarczająco gęste, aby można je było wykorzystać do karmienia. Po pierwsze, wybierz duże osobniki i wstrzymaj się z jedzeniem na dwa dni przed sekcją. Następnie wyczyść skorupę pąkli szczoteczką do zębów i spłucz wodą, aby zminimalizować zanieczyszczenie innymi gatunkami obecnymi w środowisku.

Umieść pojedynczą pąklę na równej powierzchni w celu rozwarstwienia, a następnie włóż końcówkę kleszczy między płytki tergalowe i tarczkowe. Chwyć jedną płytkę i delikatnie ją pociągnij, aby ją wyjąć. Następnie użyj kleszczy, aby chwycić cirri i wyciągnąć pąklę prosto.

Na koniec umieść wypreparowane pąkle bezpośrednio w 96% etanolu lub roztworze stabilizującym RNA w celu utrwalenia. Dzięki opisanemu tutaj protokołowi w ciągu jednego tygodnia można wyprodukować do czterech partii larw pąkli nauplius. Maksymalnie każda partia z systemu hodowli składa się z około 12 000 nauplii, co oznacza, że można wyhodować do 50 000 nauplii tygodniowo.

W ciągu tygodnia od 70 do 90% zebranych naupliów przekształci się w karpiowate, co daje około 30 000 karpiowatych tygodniowo. Średnio 500 nanogramów wysokiej jakości RNA uzyskano z zaledwie 20 pojedynczych karpiowatych, niezależnie od etapu zasiedlenia. W pąklach 28S rRNA rozpada się po podgrzaniu.

Homogenizacja za pomocą kulek ceramicznych zapewnia RNA najwyższą integralność, co czyni go preferowaną metodą obróbki tkanek pąkli i stawonogów. Za pomocą analizy qPCR zaobserwowano dwukrotny wzrost długich wariantów mRNA NAK1 i niskie zasolenie w porównaniu z krótkim NAK. Wskazywało to, że długa forma dominuje w warunkach niskiego zasolenia.

Potrzeba kilku tygodni treningu, aby opanować różne etapy związane z kulturą pąkli. Podczas wykonywania tej procedury szczególnie ważne jest zminimalizowanie zanieczyszczenia na wszystkich etapach procesu hodowli. Po opracowaniu ta technika hodowli odegrała zasadniczą rolę w lepszym zrozumieniu ekologii, fizjologii i biologii molekularnej pąkli.

Jest to również ważny kamień węgielny w przekształcaniu pąkli Balanus improvisus w potężny system modeli morskich.