Biodrukowalny hydrożel alginianowo-żelatynowy 3D Systemy modelowe in vitro indukują tworzenie sferoidów komórkowych

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii raka, takie jak powstawanie nowotworów, śledzenie migracji komórek oraz sygnalizacja raka i zdrowych komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala nam badać nowotworzenie w środowisku 3D wraz z komórkami zrębu, takimi jak fibroblasty, przy niskich kosztach i wysokiej odtwarzalności. Ważne jest, aby upewnić się, że materiały są zarówno biodrukowalne, jak i biofunkcjonalne, co wymaga ilościowych badań ich właściwości reologicznych i kompatybilności komórek.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy przygotowania hydrożelu i mieszania hydrożelu komórkowego są trudne do nauczenia, ponieważ tworzenie się pęcherzyków zakłóca wierność wydrukowanego modelu. W komorze bezpieczeństwa biologicznego wymieszaj trzy gramy alginianu i siedem gramów żelatyny w proszku w 250-mililitrowej zlewce. Dodaj mieszadło magnetyczne i 100 mililitrów DPBS.

Uszczelnij zlewkę sterylną folią parafinową i folią aluminiową, aby uniknąć zanieczyszczenia. Następnie pokaż uczestnikowi unikalne i specyficzne wykresy biegunowe, które odpowiadają jego wzorcom elektromiografii lub EMG. Następnie kontynuuj mieszanie w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.

Podgrzej roztwór w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż żel przejdzie przemianę fazową do stanu ciekłego. Następnie przenieś roztwór do sterylnych 50-mililitrowych stożkowych probówek wirówkowych i zamknij je. Odwirować probówki pod ciśnieniem 834 razy g przez pięć minut, aby usunąć wszelkie pęcherzyki gazu.

Następnie odessać prekursor hydrożelu do 10-mililitrowych strzykawek. Uszczelnić strzykawki nakrętkami i folią parafinową. Przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do użycia.

Gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia testów, umieść strzykawkę z przygotowanym prekursorem hydrożelu w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na jedną godzinę. Podczas nagrzewania się strzykawki włącz i zainicjuj reometr. Po godzinie wyjąć strzykawkę z łaźni wodnej.

Wyciśnij około 0,5 mililitra prekursora na platformę reometryczną. Na panelu sterowania kliknij przycisk trójkąta skierowanego w dół. Poczekaj, aż przyrząd pomiarowy przesunie się w dół do pozycji przycinania.

Za pomocą szpatułki odetnij nadmiar prekursora, który wydostał się z krawędzi narzędzia pomiarowego, i wyrzuć zbędny materiał. Następnie nanieś pipetą olej mineralny na krawędź przyrządu pomiarowego. Poczekaj, aż olej całkowicie uszczelni granicę.

Na panelu sterowania kliknij przycisk Kontynuuj. Następnie kliknij przycisk Start. Po zakończeniu testowania zwolnij narzędzie pomiarowe i kliknij przycisk trójkąta w górę.

Wyjmij przyrząd pomiarowy. Wyczyść zarówno przyrząd pomiarowy, jak i platformę 70% etanolem. Po pierwsze, należy przeprowadzić pełne przemiatanie amplitudy i temperatury, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Aby rozpocząć izotermiczne przemiatanie w czasie, kliknij pozycję Moje aplikacje, a następnie kliknij szablon Izotermiczny test czasowo-temperaturowy. Kliknij krok Pomiar w przepływie pracy. Następnie kliknij zmienne odkształcenie oscylacyjne i otwórz okno konfiguracji.

Ustaw napięcie oscylacji na 0.1% i ustaw częstotliwość oscylacji na jeden herc. W oknie rozwijanym ustaw liczbę punktów danych na 120. Ustaw częstotliwość zbierania danych na jeden punkt na minutę.

Kliknij przycisk Dodaj, aby dodać zmienną temperatury. Kliknij zmienną temperaturę i ustaw ją na 25 stopni Celsjusza. Kliknij prawym przyciskiem myszy krok Urządzenie, Przenieś do punktu pomiarowego w przepływie pracy.

Kliknij przycisk Usuń. Następnie kliknij krok Urządzenie, Ustaw wartość. Odznacz pole Poczekaj, aż zostanie osiągnięta wartość i ustaw wartość na 25 stopni Celsjusza.

Kliknij Obraz, Tytuł, Przyciski na dolnym ekranie. Odznacz pole Kontynuuj. Następnie kliknij krok Start, nazwij projekt i zapisz go.

Teraz załaduj próbkę na platformę reometryczną i rozpocznij test zgodnie z wcześniej opisanym ogólnym protokołem testowym. Następnie obserwuj liczbę pierwszą G i podwójną liczbę pierwszą G w funkcji czasu. Znajdź punkt przecięcia liczby pierwszej G i podwójnej liczby pierwszej G i określ czas w punkcie przecięcia.

Następnie kliknij pozycję Tabela, skopiuj wszystkie dane i wklej je do pliku tekstowego. Aby zmierzyć granicę plastyczności w różnych okresach żelowania, kliknij opcję My Apps (Moje aplikacje). Kliknij szablon Yield and flow stress (Plastyczność i naprężenie przepływu, żelowe).

Nazwij ten projekt. Następnie kliknij krok Start w przepływie pracy. W górnym menu kliknij Wstaw.

Następnie z menu rozwijanego wybierz opcję Czekaj. Otwórz okno konfiguracji i ustaw czas oczekiwania na 50 minut. Kliknij przycisk Start, a następnie ponownie kliknij przycisk Wstaw.

Wybierz Urządzenie z menu rozwijanego. Otwórz okno konfiguracji, wybierz Temperatura i ustaw je na 25 stopni Celsjusza. Odznacz pole Poczekaj, aż zostanie osiągnięta wartość.

W przepływie pracy wybierz krok Pomiar. Wybierz zmienną Naprężenie ścinające i rozwiń okno ustawień. Ustaw początkowe i końcowe naprężenie ścinające odpowiednio na zero i 10 000 paskal.

Następnie kliknij Kalkulator, ustaw Gęstość punktów na 0,2 punktu na paskal. Na karcie Punkty danych po lewej stronie ustaw jeden punkt na sekundę. W dolnej części okna rozwijanego wybierz zakładkę Kontrola zdarzenia, ustaw kryterium Zatrzymaj pomiar, jeśli szybkość ścinania jest większa niż 100 na sekundę.

Załaduj próbkę na platformę reometryczną i rozpocznij test zgodnie z wcześniej opisanym ogólnym protokołem testowania. Po zakończeniu testu kliknij przycisk Diagram, aby obserwować krzywą odkształcenia-naprężenia. Powtórz ten test dla czasu oczekiwania wynoszącego 30, 40 i 50 minut.

Poniższe czynności należy wykonać w sterylnych warunkach. Na początek wysterylizuj biodrukarkę, spryskując ją dokładnie 70% etanolem, a następnie wystawiając na działanie światła UV przez noc. Wyjąć strzykawkę z prekursorem hydrożelu z magazynu i ogrzać ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.

Przenieść kolbę T z wcześniej hodowanymi komórkami z inkubatora CO2 do komory bezpieczeństwa biologicznego. Wyrzuć pożywkę hodowlaną, a następnie dwukrotnie przepłucz komórki DPBS. Dodaj podgrzany roztwór trypsyny-EDTA do komórek.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć minut. Następnie dezaktywuj trypsynę, dodając tę samą objętość FBS. Wyjąć strzykawkę z prekursorem hydrożelu z łaźni wodnej i oczyścić ją.

Wysterylizuj strzykawkę 70% etanolem przed przeniesieniem jej do szafki bezpieczeństwa biologicznego. Wyciśnij około trzech mililitrów prekursora hydrożelu do 10-mililitrowego wkładu drukarskiego. Wymieszaj prekursor z komórkami MDA-MB-231-GFP w stężeniu miliona komórek na mililitr, powoli pipetując, aby uniknąć wytwarzania pęcherzyków.

Przykryj wkład zaślepką końcową i górną i uszczelnij go folią parafinową. Następnie odwiruj go z prędkością 834 razy g przez jedną minutę, aby wyeliminować wszelkie pęcherzyki gazu. Powtórz cały ten proces dla innych prekursorów.

Następnie wysterylizuj wszystkie trzy wkłady 70% etanolem. Załaduj wysterylizowane wkłady do komór biodrukarki. W oprogramowaniu sterującym drukarki kliknij opcję manual (ręcznie).

Następnie rozwiń zakładkę Głowica narzędziowa w oprogramowaniu sterującym drukarki. Kliknij jeden kartridż w interfejsie graficznym po lewej stronie, ustaw temperaturę wkładu na 25 stopni Celsjusza i odczekaj 35 minut, aby prekursor osiągnął warunki drukowania. Powtórz tę czynność dla pozostałych dwóch wkładów.

W oprogramowaniu sterującym drukarką rozwiń zakładkę Głowica narzędziowa. Kliknij jeden wkład w interfejsie graficznym, a następnie kliknij krótki przycisk pomiaru, aby zmierzyć położenie końcówki dyszy. Powtórz tę czynność dla pozostałych dwóch wkładów.

Następnie umieść przezroczystą mikropłytkę polistyrenową na stoliku drukarki. Otwórz plik G-code i zmień ciśnienie na 200 kilopaskali dla wszystkich wkładów. Wróć do oprogramowania sterującego i kliknij kartę Generator montera rusztowań.

Wybierz punkt, aby rozpocząć drukowanie, a następnie kliknij przycisk Uruchom. Powtórz ten proces, aby uzyskać trzy powtórzenia. Następnie dodaj 100-milimolowy roztwór chlorku wapnia na jedną minutę, aby usieciować modele.

Spłucz dwukrotnie DPBS. Następnie za pomocą szpatułki ostrożnie przenieś modele na pokrytą agarozą, sześciodołkową płytkę. Dodaj pięć mililitrów DMEM do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, wymieniając pożywkę do hodowli komórkowych co trzy dni.

W tym badaniu wytwarza się trójwymiarowe systemy hydrożelowe w celu podsumowania mikrośrodowisk guza in vivo i ułatwienia tworzenia wielokomórkowych sferoid guza. Pomiar temperatury prekursora A3G7 pokazuje, że G double prime jest większy niż G prime w temperaturze 37 stopni Celsjusza, co potwierdza znane właściwości prekursora. Wraz ze spadkiem temperatury prekursor ulega fizycznemu żelowaniu w wyniku spontanicznego fizycznego splątania cząsteczek żelatyny w formację trójhelisową.

Zarówno G prime, jak i G double prime zwiększają temperaturę i zbiegają się w temperaturze 30,6 stopni Celsjusza, co wskazuje na przejście zol-żel. Mikroskopia konfokalna wydrukowanego modelu śmigła pokazuje, że komórki MDA-MB-231-GFP zaczynają rozwijać sferoidy po 15 dniach od rozpoczęcia okresu hodowli, a sferoidy nadal zwiększają swój rozmiar i liczbę aż do 30 dnia. Obserwuje się również, że niektóre komórki IMR-90-mCherry tworzą aglomeracje.

Po 30 dniach hodowli można było zaobserwować komórki IMR-90-mCherry w regionie początkowo zajmowanym przez komórki MDA-MB-231-GFP, podczas gdy komórki MDA-MB-231-GFP można było zobaczyć w regionie zdominowanym przez IMR-90-mCherry. Implikuje to możliwe zdarzenia migracji w modelu. Mikroskopia konfokalna modelu dysku ujawnia, że komórki MDA-MB-231-GFP zachowują się podobnie do tego, jak w modelu śmigła, co skutkuje hydrożelem wypełnionym sferoidami po 21 dniach hodowli.

Po opanowaniu tej techniki drukowania modeli można wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby zachować świeżość hydrożelu i komórek, nie mieszać starych partii hydrożelu z nowymi i pracować w sterylnych warunkach, aby uniknąć mylących wyników. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak skaningowa mikroskopia elektronowa i poklatkowa, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak porowatość materiału, szybkość migracji komórek i przebudowa matrycy.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię raka, ponieważ ten model in vitro umożliwia systematycznie kontrolowane badania powstawania i zachowania guza w systemach kohodowlanych. Oprócz komórek raka piersi, model ten może być również łatwo zastosowany w systemach wykorzystujących inne typy komórek w różnych początkowych lokalizacjach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak tworzyć heterogeniczne modele chorób 3D poprzez prawidłowe przygotowywanie hydrożeli, osadzanie komórek i drukowanie materiału w optymalnym oknie drukowania.

Nie zapominaj, że praca z próbkami biologicznymi może być niezwykle niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej, takich jak rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne podczas wykonywania tej procedury, mogą być bardzo niebezpieczne.