Name: Testy behawioralne gryzoni w celu oceny deficytów funkcjonalnych spowodowanych implantacją mikroelektrod w korze ruchowej szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Poznaj testy behawioralne szczurów do oceny deficytów motorycznych po implantacji mikroelektrod w korze ruchowej. Metoda obejmuje zadania na siatce otwartego pola, drabince i pomiarze siły chwytu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było częściowo wspierane przez Merit Review Award #B1495-R (Capadona) oraz Presidential Early Career Award for Scientist and Engineers (PECASE, Capadona) od United States (US) Department of Veterans Affairs Rehabilitation Research and Development Service. Ponadto praca ta była częściowo wspierana przez Biuro Asystenta Sekretarza Obrony ds. Zdrowia za pośrednictwem Recenzowanego Programu Badań Medycznych w ramach nagrody nr W81XWH-15-1-0608. Treść nie reprezentuje poglądów Departamentu ds. Weteranów Stanów Zjednoczonych ani rządu Stanów Zjednoczonych. Autorzy chcieliby podziękować dr Hiroyuki Arakawa z CWRU Rodent Behavior Core za jego wskazówki w projektowaniu i testowaniu protokołów behawioralnych gryzoni. Autorzy chcieliby również podziękować Jamesowi Drake'owi i Kevinowi Talbotowi z Wydziału Inżynierii Mechanicznej i Lotniczej CWRU za ich pomoc w zaprojektowaniu i wyprodukowaniu testu drabiny dla gryzoni.

Wszystkie procedury i praktyki opieki nad zwierzętami zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetów ds. Instytucjonalnej Opieki i Wykorzystania Zwierząt w Louis Stokes Cleveland Department of Veterans Affairs Medical Center.
UWAGA: Aby zapoznać badaczy z kwestią decyzji o zastosowaniu modelu rany kłutej jako grupy kontrolnej, zaleca się przeanalizowanie pracy Pottera et al.21.
1. Chirurgiczna procedura implantacji mikroelektrod
<ol>
	<li>Przygotowanie zwierzęcia przed operacją
	<ol>
		<li>Zanurzyć zwierzę w komorze indukcyjnej i podać izofluran (2 - 4%). Podczas znieczulenia nieustannie monitorować zwierzę za pomocą systemu pomiaru parametrów życiowych w celu kontroli częstotliwości akcji serca oraz poziomu utlenowania krwi.</li>
		<li>Przenieść zwierzę do maski nosowej, aby kontynuować znieczulenie. Wstrzyknąć podskórnie (SQ) antybiotyk z grupy cefalosporyn, np. cefazolinę (25 mg/kg) oraz niesteroidowy lek przeciwzapalny, np. karprofen (5 mg/kg), odpowiednio w celu zapobiegania infekcjom i łagodzenia bólu.</li>
		<li>Obficie nałożyć maść oftalmologiczną na oczy zwierzęcia, aby zapobiec ich wysychaniu.</li>
		<li>Za pomocą obcinaczek do pazurków małych zwierząt przyciąć pazury, aby zapobiec rozgrzebaniu szwów przez zwierzę podczas gojenia rany. Należy upewnić się, że pazury nie zostały przycięte zbyt krótko, ponieważ może to spowodować ból i krwawienie.</li>
		<li>Dokładnie ogolić głowę zwierzęcia od okolic za uszami aż do obszaru między oczami, używając elektrycznej maszynki do golenia.</li>
		<li>Zapewnić znieczulenie miejscowe poprzez wstrzyknięcie podskórnie (SQ) bupiwakainy (0,3 mL bupiwakainy 0,125% rozcieńczonej z roztworem macierzystym) na szczycie głowy zwierzęcia w miejscu nacięcia.</li>
		<li>Zamocować zwierzę w ramie stereotaktycznej, używając wsporników usznych, aby zapobiec ruchom głowy podczas operacji. Pod zwierzęciem umieścić podkładkę grzewczą z cyrkulującą wodą w celu utrzymania wewnętrznej temperatury ciała.</li>
		<li>Założyć sterylną draperię, np. zatwierdzoną przez instytucję sterylną folię stretch, aby odizolować pole operacyjne.</li>
		<li>Oczyścić obszar operacyjny, stosując naprzemiennie betadynę oraz izopropanol.</li>
		<li>Wykonać test ucisku palca zgodnie z protokołem instytucjonalnym, aby upewnić się, że zwierzę znajduje się w chirurgicznej płaszczyźnie znieczulenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie zwierzęcia do implantacji
	<ol>
		<li>Wykonać nacięcie o długości około 1 cala wzdłuż linii środkowej, odsłaniając czaszkę za pomocą ostrza skalpela nr 10. Ostrożnie usunąć okostną za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką i zatamować ewentualne krwawienie za pomocą gazy. Odsunąć otaczające tkanki za pomocą kleszczyków typu alligator, a następnie oczyścić i ododawodnić czaszkę nadtlenkiem wodoru.</li>
		<li>Nanieść kilka kropel kleju tkankowego na bazie cyjanoakrylanu na odsłoniętą czaszkę, aby poprawić wiązanie cementu dentystycznego w kolejnych krokach.</li>
		<li>W wybranej półkuli zaznaczyć obszar kory ruchowej odpowiadający ruchom przedniej łapy, około 3 mm bocznie od linii środkowej i 2 mm przed bregma, wykonując niewielkie nacięcie w kości.</li>
		<li>Usunąć fragment czaszki za pomocą wiertarki dentystycznej z zaokrągloną końcówką o średnicy 1,75 mm, zwracając szczególną uwagę, aby nie wiercić zbyt szybko ani zbyt głęboko, opierając jedną rękę o ramę stereotaktyczną. Wiertarkę należy przykładać do czaszki przerywanie, aby uniknąć przegrzania31.</li>
		<li>Odsunąć oponę twardą za pomocą cienkiego haczykowatego zgłębnika do opony twardej pod kątem 45°.</li>
		<li>Oczyścić wszelkie krwawienie za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką i soli fizjologicznej, uważając, aby nie dotknąć bezpośrednio powierzchni mózgu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wprowadzenie mikroelektrody do kory ruchowej
	<ol>
		<li>Ostrożnie zamocować sterylizowaną mikroelektrodę w uchwycie uniwersalnym ramy stereotaktycznej, uważając, aby nie uderzyć w trzpień elektrody. Upewnić się, że konektor interfejsu headstage elektrody jest mocno trzymany przez uchwyt. 
		UWAGA: W tym przypadku użyto niefunkcjonalnej elektrody krzemowej typu Michigan o wymiarach 2 mm x 123 µm x 15 µm, a trzpień wprowadzono za pomocą precyzyjnej pęsety.</li>
		<li>Za pomocą mikromanipulatorów ramy stereotaktycznej ostrożnie ustawić końcówkę elektrody nad otworem trepanacyjnym.</li>
		<li>Powoli opuścić elektrodę na głębokość około 2 mm do wnętrza mózgu, używając mikromanipulatorów jako przewodnika pomiarowego (w zależności od wybranej elektrody może być wymagane automatyczne wprowadzanie z kontrolowaną prędkością). Należy unikać widocznych naczyń krwionośnych wszędzie tam, gdzie jest to możliwe. Po umieszczeniu elektrody ostrożnie zwolnić konektor z uchwytu uniwersalnego i cofnąć ramię wprowadzające.</li>
		<li>Ostrożnie oczyścić krew wokół elektrody za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką i soli fizjologicznej.</li>
		<li>Uszczelnić otwór trepanacyjny wokół zaimplantowanej elektrody za pomocą elastomeru silikonowego.</li>
		<li>Zamocować elektrodę do czaszki za pomocą cementu dentystycznego.</li>
		<li>Po całkowitym wyschnięciu cementu zbliżyć brzegi nacięcia przed i za cementową czapeczką i zszyć je.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opieka pooperacyjna
	<ol>
		<li>Pozwolić zwierzęciu dojść do siebie na podkładce grzewczej z cyrkulującą wodą, kontynuując monitorowanie jego parametrów życiowych. Należy unikać stosowania lamp grzewczych, ponieważ temperaturę z lamp trudniej kontrolować, co może prowadzić do przegrzania zwierząt.</li>
		<li>Po całkowitym wybudzeniu zwierzęcia przenieść je do czystej klatki z łatwym dostępem do pożywienia i wody.</li>
		<li>W dniach 1–3 po operacji podawać zwierzętom podskórnie (SQ) antybiotyk z grupy cefalosporyn (25 mg/kg) oraz niesteroidowy lek przeciwzapalny (5 mg/kg), aby zapobiec infekcjom i łagodzić ból.</li>
		<li>Codziennie monitorować zwierzęta pod kątem objawów bólu lub dyskomfortu, krwawienia, zmiany masy ciała lub problemów ze szwami przez co najmniej 5 dni po operacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Badania behawioralne
<ol>
	<li>W przypadku wszystkich testów behawioralnych należy poddać zwierzęta badaniom dwukrotnie dla każdego testu w tygodniu poprzedzającym operację implantacji elektrod, aby obliczyć ich bazowe wyniki przedoperacyjne. Po operacji należy zapewnić zwierzętom tydzień odpoczynku przed rozpoczęciem testów behawioralnych, przeprowadzanych dwukrotnie w tygodniu dla każdego testu. Przez cały okres badania, zarówno w fazie przed-, jak i pooperacyjnej, należy stosować spójne warunki testowe, aby zminimalizować wpływ stresu na wyniki, co mogłoby doprowadzić do pomiaru lęku.
	<ol>
		<li>Należy oczyścić cały sprzęt testowy środkiem sterylizującym na bazie dwutlenku chloru na początku każdej sesji testowej oraz po każdym zwierzęciu.</li>
		<li>Sfilmuj testy w otwartym polu, na kratce oraz na drabinie. Testy te wymagają użycia kamery wideo (1080p, minimum 15 kl./s, 78° przekątne pole widzenia), laptop oraz miejsce na przechowywanie danych wideo.</li>
		<li>Na początku każdego dnia badań należy przenieść zwierzęta do pomieszczenia testowego i pozwolić im na aklimatyzację przez co najmniej 20 min przed rozpoczęciem testów. Pomieszczenie powinno być oświetlone i mieć kontrolowaną temperaturę, a wszystkie badania powinny być przeprowadzane przez ten sam personel. W idealnym przypadku do wszystkich zwierząt w całym przebiegu badań powinno być wykorzystywane to samo pomieszczenie, bez wprowadzania w nim żadnych zmian.</li>
		<li>Stosuj nagrody pokarmowe, aby zachęcić zwierzęta do wykonywania zadań, zwłaszcza podczas treningu na drabinie. Dobrymi nagrodami są płatki zbożowe lub małe kawałki chipsów bananowych bądź krakersów.</li>
		<li>Znormalizuj wszystkie tygodniowe wyniki testów do wyników uzyskanych przed operacją dla każdego zwierzęcia z osobna (Równanie 1). 
		Równanie 1: <img alt="Wzór na procentową zmianę: \((wynik\ wyjściowy - wynik\ testu\ tygodniowego) / wynik\ wyjściowy \times 10\)" src="/files/ftp_upload/57829/57829eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"></li>
	</ol>
	</li>
	<li>Testy w otwartej przestrzeni z siatką (Open field grid testing) 
	UWAGA: Test otwartej przestrzeni z kratownicą (open field grid test) został zbudowany wewnętrznie i posiada powierzchnię biegową o wymiarach 1 m2 z nieprzezroczystymi ściankami bocznymi o wysokości około 40 cm. Dolna powierzchnia biegowa kraty jest podzielona od spodu na 9 równych kwadratów za pomocą taśmy (Rycina 1A). Kamera rejestrująca jest na stałe zamontowana na rusztowaniu nad środkiem siatki.
	<ol>
		<li>Aby rozpocząć test w otwartym polu z siatką, należy umieścić zwierzę w centrum siatki, tyłem do badacza.</li>
		<li>Pozostaw zwierzę w swobodnym ruchu przez 3 min, nagrywając w tym czasie wideo.</li>
		<li>Po zakończeniu testów należy wyjąć zwierzę z kratki i umieścić je z powrotem w klatce. Kratkę należy dokładnie oczyścić środkiem sterilizującym na bazie dwutlenku chloru.</li>
		<li>Badaj każde zwierzę raz w ciągu dnia testowego.</li>
		<li>Przeanalizuj liczbę przekroczonych linii siatki, całkowitą przebyte odległość oraz maksymalną prędkość zwierzęcia jako wskaźniki ogólnej funkcji motorycznej, wykorzystując oprogramowanie do śledzenia wideo. 
		UWAGA: Przedstawione tutaj dane zostały ilościowo określone ręcznie przez przeszkolonych badaczy, jednak zaleca się stosowanie niedawno opracowanego wewnętrznego algorytmu śledzenia32.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Testowanie drabiną 
	UWAGA: Test drabinkowy został wykonany wewnętrznie i składa się z 2 przezroczystych ścianek bocznych z akrylu, każda o długości 1 m, połączonych szczeblami o średnicy 3 mm rozmieszczonymi w odstępach 2 cm (Rysunek 2A). Test drabinkowy jest testem wymagającym umiejętności, dlatego przed zarejestrowaniem wyników bazowych przed operacją wymagany jest tydzień treningu. Protokół treningu i testowania jest taki sam.
	<ol>
		<li>Przenieś zwierzę do tymczasowej, czystej klatki przetrzymującej, aby rozpocząć test drabinkowy.</li>
		<li>Ustaw drabinę w taki sposób, aby łączyła dwie klatki. Początkowy koniec drabiny powinien opierać się na czystej klatce, a koniec końcowy na klatce macierzystej zwierzęcia, aby stanowiło to motywację do ukończenia biegu.</li>
		<li>Umieść tę samą (lub podobną) kamerę wideo na statywie w centralnej części drabiny. Kamera powinna znajdować się na wysokości szczebla i być ustawiona tak, aby widoczna była cała drabina.</li>
		<li>Przy włączonej kamerze wideo należy przytrzymać zwierzę na linii startowej drabiny, tak aby przednie łapy dotykały pierwszego szczebla.</li>
		<li>Pozwól zwierzęciu przejść przez drabinę we własnym tempie. Czas mierzony od momentu dotknięcia przez zwierzę pierwszej szczebla do przekroczenia linii wyznaczonej przez trzeci od końca szczebel określi czas przejścia zwierzęcia.</li>
		<li>Jeśli zwierzę odwróci się na drabinie lub nie będzie się poruszać przez 20 s, należy uznać próbę za nieudaną. W przypadku każdego nieudanego przebiegu należy przypisać zwierzęciu karę czasową. Wartość kary czasowej należy wyznaczyć na podstawie najwolniejszego wyniku zarejestrowanego podczas testów przedoperacyjnych.27.</li>
		<li>Każde zwierzę powinno pokonać drabinę 5 razy w dniu testowym, z przerwą wynoszącą około 1 minuty między kolejnymi próbami.</li>
		<li>Oblicz średnią z 3 najszybszych prób wykonanych w ciągu dnia jako miernik funkcji motoryki małej. Dodatkowo, z wykorzystaniem oprogramowania do śledzenia wideo, odnotuj liczbę razy, gdy każda z przednich łap ześlizgnęła się z prętów. 
		UWAGA: Przedstawione tutaj dane zostały zmierzone ręcznie przez przeszkolonych badaczy, jednak zaleca się stosowanie niedawno opracowanego wewnętrznego algorytmu śledzenia z wykorzystaniem Dona i wsp.32.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Badanie siły chwytu
	<ol>
		<li>Kalibruj dynamometr przed każdą sesją pomiarową i mierz siłę w gramach.</li>
		<li>Umieść dynamometr do pomiaru siły chwytu na krawędzi blatu tak, aby uchwyty wystawały nad podłogę.</li>
		<li>Pozwól zwierzęciu chwycić uchwyty obiema przednimi łapami, trzymając je jednocześnie u nasady ogona (Rycina 3A).</li>
		<li>Gdy zwierzę pewnie chwyci każdą łapą, powoli i jednostajnym naciskiem odsuń je od miernika, trzymając za nasadę ogona.</li>
		<li>Zapisz maksymalną siłę chwytu wywieraną przez zwierzę, wyświetlaną na cyfrowym ekranie dynamometru.</li>
		<li>Każde zwierzę należy poddać badaniu 3 razy w dniu testów, z około 2-minutową przerwą między kolejnymi próbami.</li>
		<li>Jako miarę funkcji motoryki małej, należy zarejestrować i wyciągnąć średnią z maksymalnej siły chwytu uzyskanej w każdym z 3 prób.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Protokół po badaniu behawioralnym
<ol>
	<li>Po zakończeniu wszystkich testów behawioralnych (np. 8–16 tygodni po implantacji), przeprowadź głęboką narkozę zwierząt przy użyciu ketaminy (160 mg/kg) i ksylazyny (20 mg/kg), wykonaj perfuzję transkardialną, pobierz mózgi i wykonaj kriosekcje, a następnie zabarw tkankę za pomocą markerów immunohistochemicznych w celu ilościowego określenia odpowiedzi komórkowej wokół miejsca implantacji33,34,35,36,37,38.</li>
</ol>
4. Analiza statystyczna
UWAGA: W przypadku wszelkich badań mających na celu udzielenie odpowiedzi na konkretne pytanie badawcze zdecydowanie zaleca się przeprowadzenie prospektywnej analizy mocy. Analiza mocy, która pozwala określić liczbę zwierząt niezbędną do osiągnięcia istotności statystycznej dla danego projektu badania, powinna opierać się na konkretnej hipotezie badawczej, projekcie eksperymentu, szacowanej wielkości efektu i zmienności planowanych działań terapeutycznych, a także na wielkości efektu wymaganej do osiągnięcia istotności klinicznej lub naukowej.
<ol>
	<li>Przeprowadzić analizy statystyczne przy użyciu popularnego oprogramowania statystycznego.</li>
	<li>Zestawić statystyki opisowe w formie tabeli i przedstawić je jako średnia ± błąd standardowy.</li>
	<li>Przeanalizować wyniki behawioralne [w otwartym polu (krok 2.2), na drabinie (krok 2.3) oraz w teście siły chwytu (krok 2.4)] w każdym tygodniowym punkcie czasowym, aby porównać grupę kontrolną vs. grupę z implantami, stosując test t dla dwóch prób. Każdy tygodniowy punkt czasowy należy traktować jako niezależny pomiar.</li>
	<li>Ilościowo ocenić wyniki w czasie za pomocą liniowego modelu efektów mieszanych. Tydzień oraz grupa są czynnikami stałymi, natomiast zwierzę doświadczalne jest zagnieżdżone w grupie jako efekt losowy. Do określenia wpływu czynników wykorzystuje się analizę wariancji (ANOVA) z poziomem istotności p &lt; 0,05.</li>
	<li>Porównać wyniki na drabinie z intensywnością immunoglobulin G (IgG) za pomocą analizy regresji liniowej. Współczynnik korelacji obliczyć metodą Pearsona.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj protokół został wykorzystany do skutecznego i powtarzalnego pomiaru deficytu motorycznego zarówno małego, jak i dużego w modelu uszkodzenia mózgu gryzoni. Dodatkowo pozwala na korelację zachowań motorycznych z wynikami histologicznymi po wszczepieniu mikroelektrody do kory ruchowej. Metody są łatwe do naśladowania, niedrogie w konfiguracji i mogą być modyfikowane w celu dopasowania do indywidualnych potrzeb badacza. Co więcej, testy behawioralne nie powodują dużego stresu ani bólu u zwierząt; Naukowcy...

Mikroelektrody wewnątrzkorowe były pierwotnie używane do mapowania obwodów mózgu i stały się cennym narzędziem umożliwiającym wykrywanie intencji motorycznych, które mogą być wykorzystane do generowania funkcjonalnych wyników1. Wykryte wyniki funkcjonalne mogą pomóc osobom cierpiącym na urazy rdzenia kręgowego, porażenie mózgowe, stwardnienie zanikowe boczne (ALS) lub inne schorzenia ograniczające ruchy kontrolę kursora komputerowego2,3 lub robotic arm4,5,6, lub przywrócić funkcję do własnej niepełnosprawnej kończyny7. W związku z tym technologia mikroelektrod wewnątrzkorowych stała się obiecującą i szybko rozwijającą się dziedziną8.
Ze względu na sukcesy w tej dziedzinie, prowadzone są badania kliniczne mające na celu poprawę i lepsze zrozumienie możliwości technologii BMI5,9,10. Wykorzystując pełen potencjał komunikacji z neuronami w mózgu, aplikacje rehabilitacyjne są postrzegane jako nieograniczone8. Chociaż istnieje duży optymizm co do przyszłości technologii mikroelektrod wewnątrzkorowych, dobrze wiadomo również, że mikroelektrody ostatecznie zawodzą11, prawdopodobnie z powodu ostrej reakcji neurozapalnej po implantacji. Zagnieżdżenie się obcego materiału w mózgu powoduje natychmiastowe uszkodzenie otaczającej tkanki i prowadzi do dalszych uszkodzeń spowodowanych reakcją neurozapalną, która różni się w zależności od właściwości implantu12. Ponadto implant w mózgu może powodować efekt mikrouszkodzenia: zmniejszenie metabolizmu glukozy, które uważa się za spowodowane ostrym obrzękiem i krwotokiem spowodowanym wprowadzeniem urządzenia13. Co więcej, jakość sygnału i czas, w którym można rejestrować użyteczne sygnały, są niespójne, niezależnie od modelu zwierzęcego11,14,15,16. Kilka badań wykazało związek między zapaleniem nerwów a wydajnością mikroelektrod17,18,19. Dlatego konsensus społeczności jest taki, że odpowiedź zapalna tkanki nerwowej otaczającej mikroelektrody, przynajmniej częściowo, zagraża niezawodności elektrod.
Wiele badań dotyczyło miejscowego stanu zapalnego11,20,21,22 lub badał metody zmniejszenia uszkodzeń mózgu spowodowanych przez insertion11,23,24,25, w celu poprawy jakości nagrywania Z biegiem czasu14,26. Dodatkowo, ostatnio wykazaliśmy, że jatrogenne uszkodzenie spowodowane wprowadzeniem mikroelektrody do kory ruchowej szczurów powoduje natychmiastowy i trwały deficyt motoryczny27. W związku z tym celem przedstawionych tutaj protokołów jest dostarczenie badaczom ilościowej metody oceny możliwych deficytów motorycznych w wyniku urazu mózgu po implantacji i trwałej obecności urządzeń wewnątrzkorowych (mikroelektrod w przypadku tego manuskryptu). Opisane tutaj testy behawioralne zostały zaprojektowane w celu wykrycia zarówno upośledzenia funkcji motorycznych dużych, jak i małych i mogą być stosowane w wielu modelach uszkodzeń mózgu. Metody te są proste, powtarzalne i można je łatwo wdrożyć w modelu gryzoni. Co więcej, przedstawione tutaj metody pozwalają na korelację zachowań motorycznych z wynikami histologicznymi, co jest korzyścią, której do niedawna autorzy nie widzieli w publikacji w dziedzinie BMI. Wreszcie, ponieważ metody te zostały zaprojektowane do testowania funkcji motoryki małej28, funkcji motoryki dużej29, oraz zachowania związane ze stresem i lękiem29,30, przedstawione tutaj metody można również zaimplementować w różnych modelach urazów głowy, w których naukowcy chcą wykluczyć (lub w) jakiekolwiek deficyty funkcji motorycznych.

<table><tbody><tr><td>Szczury Sprague Dawley, samiec, 201-225g</td><td>System</td><td></td> anestezjologiczny Charles River CD <td></td></tr><tr><td>Compac5</td><td>Vetequip</td><td>901812</td><td></td></tr><tr><td>Trymery elektryczne</td><td>Wahl</td><td>9918-6171</td><td></td></tr><tr><td>Rama stereotaktyczna</td><td>David Kopf Instruments</td><td>1760</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewana poduszka wodna i pompa Gaymar</td><td>Braintree Scientific Inc</td><td>&nbsp; TP-700</td><td></td></tr><tr><td>Klej tkankowy Vetbond</td><td>3M</td><td>07-805-5031</td><td></td></tr><tr><td>Wiertło dentystyczne</td><td>Pearson Dental</td><td>O60-0045</td><td></td></tr><tr><td>Pick Dura</td><td>Fine Science Tools</td><td>10064-14</td><td></td></tr><tr><td>Mikroelektroda z trzpieniem silikonowym</td><td>Wyprodukowano we własnym zakresie w Cleveland VA Medical Center</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Elastomer silikonowy KwikCast</td><td>World Precision Instruments</td><td>Cement dentystyczny KWIK-CAST</td><td></td></tr><tr><td>Teets&nbsp;</td><td>AM Systems</td><td>525000</td><td></td></tr><tr><td>Webcam HD Pro c920</td><td>Logitec</td><td>960-000764</td><td></td></tr><tr><td>Miernik siły chwytu</td><td>Aparat Harvard</td><td>565084</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie statystyczne Minitab 17</td><td>Minitab Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Test siatki w otwartym polu</td><td>Wykonane we własnym zakresie w Case Western Reserve University</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Test drabiny</td><td>Wyprodukowano we własnym zakresie w Case Western Reserve University</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty szczurze IgG</td><td>Bio-Rad</td><td>618501</td><td></td></tr></tbody></table>

testy behawioralne gryzoni w celu oceny deficytów funkcjonalnych spowodowanych implantacją mikroelektrod w korze ruchowej szczura

Rodent Behavioral Testing to Assess Functional Deficits Caused by Microelectrode Implantation in the Rat Motor Cortex

Urządzenia medyczne wszczepione do mózgu mają ogromny potencjał. Jako część systemu Brain Machine Interface (BMI), mikroelektrody wewnątrzkorowe wykazują zdolność do rejestrowania potencjałów czynnościowych z pojedynczych lub małych grup neuronów. Takie zarejestrowane sygnały zostały z powodzeniem wykorzystane, aby umożliwić pacjentom łączenie się z komputerami, kończynami robotów i własnymi kończynami lub sterowanie nimi. Jednak wcześniejsze badania na zwierzętach wykazały, że wszczepienie mikroelektrody do mózgu nie tylko uszkadza otaczającą tkankę, ale może również powodować deficyty funkcjonalne. W tym miejscu omawiamy serię testów behawioralnych w celu ilościowego określenia potencjalnych zaburzeń motorycznych po wszczepieniu mikroelektrod wewnątrzkorowych do kory ruchowej szczura. Metody badania siatki w otwartym polu, przechodzenia przez drabinę i siły chwytu dostarczają cennych informacji na temat potencjalnych powikłań wynikających z implantacji mikroelektrod. Wyniki testów behawioralnych są skorelowane z histologią punktu końcowego, dostarczając dodatkowych informacji na temat patologicznych wyników i wpływu tej procedury na sąsiednią tkankę.

Stosując przedstawione tutaj metody, przeprowadzono operację implantacji mikroelektrod w korze ruchowej zgodnie z ustalonymi procedurami39,40,41,42, po której wykonano testy na siatce w otwartym polu w celu oceny ogólnej funkcji motorycznej oraz testy na drabinie i siły chwytu w celu oceny funkcji motoryki małej27. Testy funkcji motoryczn...

Wykazaliśmy, że wszczepienie mikroelektrody w korze ruchowej szczurów powoduje natychmiastowe i trwałe deficyty motoryczne. Proponowane tutaj metody obejmują operację wszczepienia mikroelektrod i trzy zadania behawioralne gryzoni w celu wyjaśnienia potencjalnych zmian w funkcji motorycznej małej lub dużej spowodowanej uszkodzeniem kory ruchowej spowodowanym implantacją.

Testy behawioralne gryzoni w celu oceny deficytów funkcjonalnych spowodowanych implantacją mikroelektrod w korze ruchowej szczura

Medical devices implanted in the brain hold tremendous potential. As part of a Brain Machine Interface (BMI) system, intracortical microelectrodes ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii neuronowej, takie jak to, czy implantacja urządzenia ma wpływ na długoterminowe funkcje motoryczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że w przeciwieństwie do histologii punktu końcowego, ciągłe zachowanie zapewnia globalny pomiar funkcji motorycznych w czasie rzeczywistym przez cały czas trwania badania. Aby rozpocząć tę procedurę, wstrzyknij zwierzęciu podskórnie antybiotyk cefalosporynowy, aby zapobiec infekcji i niesteroidowy środek przeciwzapalny do leczenia bólu.Następnie nałóż maść okulistyczną na oczy zwierzęcia, aby zapobiec ich wysuszeniu. Za pomocą obcinacza do paznokci małych zwierząt przycinaj paznokcie u stóp, aby zwierzę nie drapało szwów podczas gojenia się ran po operacji. Następnie należy podać miejscowy środek przeciwbólowy z podskórnym wstrzyknięciem bupiwakainy w miejsce nacięcia na głowie zwierzęcia.Zamontuj zwierzę na ramie stereotaktycznej za pomocą pasków nausznych, aby zapobiec poruszaniu się głowy podczas operacji. Następnie umieść pod zwierzęciem poduszkę grzewczą z obiegową wodą, aby utrzymać jego temperaturę wewnętrzną. Następnie wyszoruj obszar operacyjny za pomocą naprzemiennego roztworu Betadine i peelingu izopropanolowego.Następnie wykonaj uszczypnięcie palca u nogi zgodnie z protokołem instytucjonalnym, aby upewnić się, że zwierzę znajduje się pod płaszczyzną chirurgiczną. Aby przygotować zwierzę do implantacji, wykonaj nacięcie o długości około jednego cala wzdłuż linii środkowej, aby odsłonić czaszkę. Tępo usuń okostną za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką i zatamuj krwawienie za pomocą kawałka gazy.Następnie wycofaj otaczającą tkankę za pomocą zacisków aligatorowych lub hemostatów. Po oczyszczeniu czaszki nałóż kilka kropel kleju tkankowego na bazie cyjanoakrylanu na odsłoniętą czaszkę, aby poprawić wiązanie cementu dentystycznego w późniejszych krokach. W wybranej półkuli zaznacz obszar kory ruchowej odpowiadający ruchowi przedniej łapy, tworząc nacięcie w kości.Usuń część czaszki za pomocą wiertła dentystycznego z zaokrągloną końcówką o średnicy 1,75 milimetra, zwracając szczególną uwagę, aby nie wiercić zbyt szybko ani zbyt głęboko. Wiertło należy przykładać do czaszki z przerwami, aby uniknąć przegrzania. Za pomocą soli fizjologicznej i lekkiego ssania usuń wszelkie zanieczyszczenia kostne z czaszki.Uważaj, aby nie uszkodzić opony twardej podczas wiercenia. Następnie użyj cienkich rongeurs lub zakrzywionych mikrokleszczyków, aby usunąć pozostałą kość. Następnie odbij oponę twardą za pomocą drobno zahaczonego kilofa 45 stopni opony twardej.Oczyść krwawienie za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką i soli fizjologicznej, uważając, aby nie dotykać bezpośrednio powierzchni mózgu. Aby wprowadzić mikroelektrodę do kory ruchowej, ostrożnie zamontuj wysterylizowaną mikroelektrodę w uniwersalnym uchwycie na ramie stereotaktycznej, uważając, aby nie uderzyć w trzpień elektrody. Upewnij się, że złącze interfejsu głowicy stage elektrody jest mocno przytrzymane przez uchwyt.Za pomocą mikromanipulatora na ramie stereotaktycznej ostrożnie umieść końcówkę elektrody nad otwartą kraniotomią. Delikatnie opuść elektrodę na około dwa milimetry w głąb mózgu. Zachowaj ostrożność, aby w miarę możliwości unikać widocznego unaczynienia.Do ręcznego/ręcznego wprowadzania, jak pokazano tutaj, mikrokleszcze są używane do wprowadzania silikonowej, niefunkcjonalnej mikroelektrody atrapy. Gdy elektroda znajdzie się na miejscu, ostrożnie zwolnij złącze z uchwytu uniwersalnego i wsuń ramię wprowadzające. Ostrożnie oczyść wszelkie krwawienia z okolic elektrody za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką i soli fizjologicznej.Następnie uszczelnić kraniotomię wokół wszczepionej elektrody za pomocą elastomeru silikonowego. Następnie przymocuj elektrodę do czaszki za pomocą cementu dentystycznego. Gdy cement całkowicie wyschnie, zbliż krawędzie nacięcia do siebie z przodu i z tyłu cementowej nasadki głowicy i zszyj je.W przypadku implantów niefunkcjonalnych całe nacięcie może być zamknięte. Aby rozpocząć testowanie na otwartym polu, umieść zwierzę na środku siatki, odwrócone od testera. Pozwól zwierzęciu swobodnie biegać przez trzy minuty podczas nagrywania wideo.Gdy zwierzę zakończy badania, zdejmij je z siatki i dokładnie wyczyść siatkę środkiem sterylizującym na bazie dwutlenku chloru. Analizuj liczbę przekroczonych linii siatki, całkowitą przebytą odległość i maksymalną prędkość zwierzęcia jako wskaźniki funkcji motoryki dużej za pomocą oprogramowania do śledzenia wideo. W przypadku testów drabinkowych wymagany jest tydzień szkolenia przed zarejestrowaniem wyników wyjściowych sprzed operacji.Następnie przenieś zwierzę do tymczasowej, czystej klatki, aby rozpocząć testowanie drabiny. Ustaw drabinę tak, aby łączyła dwie klatki. Początkowy koniec drabiny spoczywa na czystej klatce, a końcowy koniec spoczywa w domowej klatce zwierzęcia, aby służyć jako motywacja do ukończenia biegu.Ustaw kamerę wideo używaną do filmowania testowania drabiny na statywie na środku drabiny na wysokości szczebla. Przy włączonej kamerze wideo trzymaj zwierzę na linii startu drabiny, pozwalając jego przednim łapom dotknąć pierwszego szczebla. Pozwól szczurowi przejść przez drabinę we własnym tempie.Czas, jaki upłynął od momentu, w którym łapa zwierzęcia dotknie pierwszego szczebla, a linią mety przedostatniego szczebla określi czas przejścia zwierzęcia na przekroczenie. Jeśli zwierzę obróci się na drabinie lub nie ruszy się przez 20 sekund, weź pod uwagę, że zwierzę nie działa. Przypisz mu czas oceny karnej za każdy nieudany bieg i określ czas kary na podstawie najwolniejszego występu zarejestrowanego podczas testów przedoperacyjnych.Pozwól każdemu zwierzęciu przejść przez drabinę pięć razy w ciągu dnia testowego, z około minutą odpoczynku pomiędzy każdym biegiem. Uśrednij najszybsze trzy biegi dziennie jako metrykę funkcji motoryki małej. Dodatkowo rejestruj, ile razy każda z przednich łap ześlizgnęła się ze szczebli za pomocą oprogramowania do śledzenia wideo.W celu sprawdzenia siły chwytu umieść miernik siły chwytu na krawędzi blatu z kierownicą uchwytu wysuniętą nad podłogą. Następnie pozwól zwierzęciu chwycić kierownicę obiema przednimi łapami, trzymając zwierzę za podstawę ogona. Gdy zwierzę mocno chwyci każdą łapę, odciągnij je od miernika za podstawę ogona z powolną i stałą siłą.Za pomocą miernika siły chwytu należy zapisać maksymalną siłę chwytu wywieraną przez zwierzę. Badaj każde zwierzę trzy razy w ciągu dnia testowego, z około dwiema minutami odpoczynku między każdym badaniem. Jako metrykę funkcji motoryki małej, zapisz i uśrednij maksymalną siłę chwytu z każdej z trzech prób.Istotną różnicę w wydajności siatki na otwartym polu między zwierzętami kontrolnymi a implantowanymi zaobserwowano dopiero w pierwszym tygodniu badań po okresie rekonwalescencji. Nie stwierdzono różnicy w wydajności w pozostałej części badania, co wskazuje na brak długotrwałego deficytu funkcji motorycznych. Poza pierwszym tygodniem testów po wyzdrowieniu, zwierzęta kontrolne przekraczają drabinę znacznie szybciej niż zwierzęta implantowane.Wszczepione zwierzęta nie były w stanie utrzymać przedoperacyjnej prędkości przekraczania drabiny, co wskazuje na możliwe deficyty w funkcjach motorycznych. Jest to dodatkowo wspierane przez częstsze występowanie poślizgnięć prawej łapy u wszczepionych zwierząt, co koreluje z obszarem mózgu otrzymującym implant. Zwierzęta kontrolne często osiągały znacznie wyższe wyniki w zakresie siły chwytu w porównaniu ze zwierzętami implantowanymi w trakcie badania.Ponadto wszczepione zwierzęta osiągają znacznie niższą niż wyjściową wydajność bezpośrednio po wyzdrowieniu, ale z czasem uległy poprawie i powróciły do wydajności wyjściowej. Pokazano tutaj korelację działania drabiny z intensywnością fluorescencji immunoglobuliny G, markera przepuszczalności bariery krew-mózg. Stwierdzono współczynnik korelacji na poziomie 0,901, co wskazuje na bardzo silną korelację.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu około 30 minut na zwierzę na sesję testową. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zmniejszyć zmienne środowiskowe, ponieważ mogą one odciągnąć zwierzęta od wykonywanego zadania. Po tej procedurze można wykonać inne metody, w tym immunohistochemię lub inne techniki obrazowania światłem, w celu zbadania odpowiedzi komórek lub tkanek na wszczepioną mikroelektronikę.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać szybki, prosty i powtarzalny test na deficyty motoryczne duże i małe, które mogą wynikać z implantacji urządzenia lub urazu w pierwotnej korze ruchowej.

rodent-behavioral-testing-to-assess-functional-deficits-caused

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opracowaliśmy metodę jednoczesnego wykonywania funkcjonalnego obrazowania rezonansem magnetycznym oraz rejestracji elektrofizjologicznej w mózgu gryzoni, co stanowi platformę do badania zależności między aktywnością neuronalną a sygnałem fMRI zależnym od poziomu utlenowania krwi (BOLD).

Jednoczesne badanie fMRI i elektrofizjologii w mózgu gryzoni

Film demonstruje procedurę wszczepienia bezprzewodowej dwukierunkowej wielokanałowej elektrody do mózgu szczura w celu nagrywania i stymulowania wielokanałowych sieci neuronowych.

Wszczepienie bezprzewodowego dwukierunkowego systemu mikroelektrod do mózgu szczura

Źródło: Fritsch, B. et al. Przezczaszkowa elektryczna stymulacja mózgu u czujnych gryzoni. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje wszczepianie elektrod i zastosowanie przezczaszkowej stymulacji elektrycznej (tES) do kory ruchowej czujnych szczurów. Przedstawiono w nim etapy związane z umieszczeniem elektrod, dostarczaniem stymulacji i wynikającą z tego aktywacją neuronów i mikrogleju, podkreślając jej potencjał neuroterapeutyczny.

Przezczaszkowa stymulacja elektryczna kory ruchowej u obudzonego szczura

Opisano metodę wszczepiania elektrod do jądra podwzgórzowego (STN) szczurów. Lepsza lokalizacja STN została osiągnięta dzięki zastosowaniu systemu mikrozapisu. Ponadto przedstawiono konfigurację stymulacji, która charakteryzuje się długotrwałymi połączeniami między głową zwierzęcia a stymulatorem.

Implantacja elektrod pod kontrolą mikroelektrod do jądra podwzgórzowego szczurów w celu długotrwałej głębokiej stymulacji mózgu

Głęboka stymulacja mózgu (DBS) jest skuteczną opcją leczenia choroby Parkinsona. Opracowaliśmy projekt badania w celu zbadania nowych paradygmatów stymulacji u szczurów. Protokół opisuje zastosowanie testu schodowego i testu cylindra do oceny wyników motorycznych u szczurów z hemiparkinsonem leczonych DBS.

Nowatorskie podejście do oceny wyników motorycznych efektów głębokiej stymulacji mózgu u szczura z połowiczaną półparkinsonem: test schodowy i cylindryczny

Celem prezentowanych tutaj testów behawioralnych jest wykrycie deficytów funkcjonalnych u szczurów po urazowym uszkodzeniu mózgu. Przedstawiono cztery specyficzne testy, które wykrywają deficyty w zachowaniach, aby odzwierciedlić uszkodzenie określonych obszarów mózgu, czasami trwające do jednego roku po urazie.

Wykrywanie deficytów behawioralnych u szczurów po urazowym uszkodzeniu mózgu

Wprowadzono bezprzewodowy, dwukierunkowy system do wielokanałowych zapisów neuronowych i stymulacji u swobodnie zachowujących się szczurów. System jest lekki i kompaktowy, dzięki czemu ma minimalny wpływ na repertuar behawioralny zwierzęcia. Co więcej, ten dwukierunkowy system zapewnia wyrafinowane narzędzie do oceny związków przyczynowo-skutkowych między wzorcami aktywacji mózgu a zachowaniem.

Bezprzewodowy, dwukierunkowy interfejs do rejestrowania in vivo i stymulacji aktywności neuronalnej u swobodnie zachowujących się szczurów

Obecne badanie miało na celu zautomatyzowanie kwantyfikacji deficytów motorycznych u szczurów. Wstępny model oceny ocenia utratę motoryczną wynikającą z implantacji mikroelektrody wewnątrzkorowej w korze ruchowej. Informujemy o rozwoju i wykorzystaniu algorytmu śledzenia za pomocą łatwego do adaptacji, prostego i łatwo dostępnego oprogramowania do kodowania.

Nowatorski system śledzenia funkcji motorycznych pojedynczego zwierzęcia za pomocą prostego, łatwo dostępnego oprogramowania

Przedstawiony tutaj protokół dostarcza informacji na temat jednoczesnej elektroencefalografii (EEG) i oceny behawioralnej w czasie rzeczywistym. Omówiliśmy wszystkie kroki związane z tym protokołem jako atrakcyjnym rozwiązaniem dla badaczy z wielu dziedzin neuronauki, szczególnie w obszarach uczenia się i pamięci.

Jednoczesne monitorowanie bezprzewodowego testu elektrofizjologii i pamięci behawioralnej jako narzędzia do badania neurogenezy hipokampa

Prezentowany jest system do pozyskiwania danych z samodzielnie zainicjowanych indywidualnych sesji behawioralnych w klatce kolonii społecznej. Skuteczność tego systemu wykazano za pomocą zautomatyzowanej oceny zasięgu, umożliwiającej scharakteryzowanie poudarowych zaburzeń motorycznych, potencjalnych zmian behawioralnych związanych z motywacją, zmian okołodobowych i innych innowacyjnych zmiennych zależnych.

Gromadzenie samodzielnie zainicjowanych danych behawioralnych szczurów w celu scharakteryzowania deficytów po udarze

Protokół ten przedstawia skrzynkę behawioralną opartą na mikrokontrolerze do oceny hamowania przedimpulsowego (PPI) poprzez zbieranie danych o przyspieszeniu z czujnika znajdującego się pod skrzynką. Dane te oceniają deficyty bramkowania sensorycznego u społecznie izolowanych szczurów, z dodatkową metodą synchronizacji danych z aktywnością neuronalną w celu przyspieszenia badań neurofizjologicznych nad zaburzeniami zachowania.

Opracowanie pudełka behawioralnego do oceny hamowania prepulsu i aktywności neuronalnej w psychiatrycznych modelach zwierzęcych

Poznaj testy behawioralne szczurów do oceny deficytów motorycznych po implantacji mikroelektrod w korze ruchowej. Metoda obejmuje zadania na siatce otwartego pola, drabince i pomiarze siły chwytu.

Testy behawioralne gryzoni w celu oceny deficytów funkcjonalnych spowodowanych implantacją mikroelektrod w korze ruchowej szczura (Wideo) | JoVE Journal

Testy behawioralne gryzoni w celu oceny deficytów funkcjonalnych spowodowanych implantacją mikroelektrod w korze ruchowej szczura

Przeglądaj więcej filmów