Name: Kombinatoryczne podejście jednokomórkowe w celu scharakteryzowania molekularnej i immunofenotypowej heterogeniczności populacji ludzkich komórek macierzystych i progenitorowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Poznaj metodę analizy ekspresji genów w pojedynczych komórkach połączoną z FACS w celu scharakteryzowania heterogeniczności komórek macierzystych i nowotworowych. Technika ta umożliwia izolację subpopulacji do dalszych badań.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez granty ze Szwedzkiego Towarzystwa Onkologicznego, Szwedzkiej Rady ds. Badań Naukowych, Szwedzkiego Towarzystwa Badań Medycznych, Szwedzkiej Fundacji Raka Dziecięcego, Fundacji Ragnara Söderberga oraz Fundacji Knuta i Alice Wallenbergów

1. Przygotowanie płytek do lizy
<ol>
	<li>Korzystając z ławki wolnej od RNA/DNA, przygotuj wystarczającą ilość buforu do lizy dla 96 studzienek, z dodatkiem 10%, mieszając 390 μl wody wolnej od nukleaz, 17 μl 10% NP-40, 2,8 μl 10 mM dNTP, 10 μl 0,1 M DTT i 5,3 μl inhibitora RNAzy (patrz tabela materiałów). Wiruj i zakręć w dół.</li>
	<li>Rozprowadzić 4 μl buforu do lizy do każdej studzienki 96-dołkowej płytki PCR i uszczelnić płytki folią samoprzylepną. Zakręć rurki, aby zebrać płyn na dnie talerzy. Trzymaj płytki na lodzie do czasu sortowania komórek (maksymalnie 24 godziny).</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek do sortowania komórek
<ol>
	<li>Rozmrozić odpowiednią liczbę komórek (w tym przypadku CD34 wzbogacone w hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe) do eksperymentu. 1 x 106 komórek jest odpowiednich do sortowania około trzech 96-dołkowych płytek pojedynczych komórek z kontrolami.</li>
	<li>Przenieś rozmrożone komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i dodawaj 1 ml FBS co 30 s, aż do osiągnięcia całkowitej objętości 8 ml. Wirować komórki w wirówce o sile 350 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.</li>
	<li>Zawiesić komórki w 8 ml buforze barwiącym (PBS z 2% FBS) i odwirować przy 350 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w buforze barwiącym o pojemności 200 μl i usunąć komórki w celu uzyskania barwień kontrolnych.</li>
	<li>Wykonaj fluorescencję minus jedną kontrolę (FMO) dla każdego fluoroforu, barwiąc frakcję komórek w 50 μl buforu barwiącego. W tym przykładzie 6 probówek do mikrowirówek z 20 000 komórek jest używanych jako FMOS. Należy pamiętać, że liczba komórek powinna być dostosowana w zależności od badanej populacji. Dodać wszystkie przeciwciała w tym samym stężeniu, co w barwieniu próbki, z wyjątkiem jednego do każdej probówki.</li>
	<li>Wykonaj pojedyncze barwienia dla każdego fluoroforu, barwiąc frakcję komórek w buforze 50 μl dla każdego użytego fluoroforu. W tym przykładzie użyto 6 probówek do mikrowirówek z 20 000 komórek. Należy zauważyć, że cel dla każdego przeciwciała musi być wyrażony przez komórki używane do kontroli. Dodać każde przeciwciało w tym samym stężeniu, co w barwieniu próbki w poszczególnych probówkach. Dodatkowo przechowuj 20 000 niebarwionych komórek w 50 μl jako niebarwioną kontrolę.</li>
	<li>Do próbki komórki dodać przeciwciała o odpowiednim stężeniu. Stosowane są tutaj CD34-FITC w stężeniu 1/100, CD38-APC 1/50, CD90-PE 1/10, CD45RA-bv421 1/50, CD49F-PECy7 1/50 oraz Lineage Mix: CD3-PECy5 1/50, CD2-PECy5 1/50, CD19-PECy5 1/50, CD56-PECy5 1/50, CD123-PECy5 1/50, CD14-PECy5 1/50, CD16-PECy5 1/50 i CD235a-PECy5 1/1000.</li>
	<li>Inkubować komórki z przeciwciałami przez 30 minut na lodzie w ciemności.</li>
	<li>Przemyć komórki 3 ml buforu barwiącego. Odwirować komórki przy 350 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.</li>
	<li>Zawieś ponownie komórki i powtórz krok 2.9.</li>
	<li>Ponownie zawiesić próbkę w 500 μl i FMO w 100 μl buforze barwiącym z 1/100 7AAD i przefiltrować komórki przez filtr 50 μm, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.</li>
</ol>
3. Sortowanie komórek
<ol>
	<li>Upewnij się, że maszyna FACS jest prawidłowo skonfigurowana z opóźnieniem upuszczenia oraz konfiguracją i śledzeniem cytometru (CST), które zostały ostatnio wykonane zgodnie z instrukcjami producenta, aby upewnić się, że odpowiednie komórki są posortowane. W przypadku komórek krwiotwórczych zaleca się stosowanie dyszy 85 mikronów i maksymalną prędkość 4, podczas gdy optymalna szybkość zdarzeń wynosi od 800 do 2000 zdarzeń/s.</li>
	<li>Skorygować nakładanie się widma, wykonując kompensację fluorescencji i ustawiając bramki zgodnie z kontrolami FMO lub wewnętrznymi kontrolami ujemnymi.</li>
	<li>Przeprowadzić ponowną analizę populacji docelowej, sortując co najmniej 100 komórek docelowych do nowej probówki mikrowirówkowej ze 100 μl buforu barwiącego. FACS analizuje posortowane komórki, rejestrując posortowaną próbkę i upewniając się, że trafiają one do bramki sortowania.</li>
	<li>Ustaw sortowanie płytek jednokomórkowych, centrując kroplę w dołku A1 w płytce 96-dołkowej. Po wyśrodkowaniu posortuj 50–100 cząstek o wielkości 6 μm do wszystkich studzienek wokół krawędzi pustej płytki 96-dołkowej, aby upewnić się, że wszystkie studzienki będą miały komórkę w środku każdej studzienki.</li>
	<li>Jeśli to możliwe, można dodać dodatkową kontrolę w celu zapewnienia, że żywe komórki są sortowane, sortując pojedyncze komórki do wzrostu in vitro. Komórki krwiotwórcze można hodować na 96-dołkowych płytkach z dnem U w 100 μl SFEM z 1% penicyliną streptomycyną, 100 ng/ml FLT3L, TPO i SCF. Przeanalizuj każdy dołek po 3 dniach w hodowli pod kątem kolonii komórkowych za pomocą mikroskopu.</li>
	<li>Usuń folię samoprzylepną z płyt. Posortuj pojedynczą komórkę zainteresowania (tutaj komórki Lin-CD34 + CD38-) do 92 z 96 dołków, aktywuj sortowanie INDEX w oprogramowaniu do sortowania FACS, aby zapisać profil immunofenotypowy dla innych interesujących markerów (tutaj CD45RA, CD49f i CD90) dla każdej pojedynczej komórki.</li>
	<li>Posortuj dwie studzienki z odpowiednio 10 i 20 komórkami w celu kontroli liniowości we amplifikacji PCR. Zwykle stosuje się studzienki H1 i H2.</li>
	<li>Utrzymuj dwie studzienki bez żadnych komórek jako kontrolki bez szablonu, zwykle studzienki H3 i H4.</li>
	<li>Uszczelnij płytki przezroczystą folią samoprzylepną i obracaj płytki o gramaturze 300 x g przez 1 minutę przed zatrzaskowym zamrożeniem na suchym lodzie.</li>
	<li>Zamrożone talerze przechowywać w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Bezpieczny punkt zatrzymania. Posortowane i zlizowane komórki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.</li>
</ol>
4. Odwrotna transkrypcja i specyficzna amplifikacja docelowa
<ol>
	<li>Przygotuj mieszankę starterów dla wszystkich 96 celów genowych, dodając 2 μl każdej pary starterów, w tym startery genów porządkowych i startery dla wzbogaconego RNA kontrolnego, w probówce wolnej od RNAZA o pojemności 1,5 ml na ławce wolnej od RNA/DNA. Jeśli używasz mniej niż 96 starterów, dodaj równoważną objętość wody wolnej od nukleaz dla brakujących starterów. Startery są zamawiane osobno, aby pasowały do pożądanego panelu genów.</li>
	<li>Wykonaj odwrotną transkrypcję i specyficzną mieszankę amplifikacji docelowej, dodając 632,5 μl 2x mieszaniny reakcyjnej, 101,2 μl Taq / indeksu górnego III, 151,8 μl mieszanki starterów i 0,7 μl wzbogaconego w kontrolny RNA. Wykonaj ten krok na ławce wolnej od DNA. Wymieszaj przez wirowanie i odwiruj, aby zebrać płyn na dnie tuby. Przechowywać na lodzie do czasu dodania do próbki.</li>
	<li>Przygotuj mieszaninę kontrolną bez odwrotnej transkrypcji dla czterech studzienek, mieszając 27,5 μl 2x mieszaniny reakcyjnej, 1,76 μl enzymu Taq, 6,6 μl mieszanki starterów i 2,64 μl wody wolnej od nukleaz. Skok kontrolnego RNA. Wykonaj ten krok na ławce wolnej od DNA. Wirować i wirować w dół, aby zebrać płyn na dnie probówki i trzymać na lodzie do momentu dodania do próbki.</li>
	<li>Rozmrozić płytki lizatu na lodzie. Dodać 8,75 μl wcześniej przygotowanej mieszanki odwrotnej transkrypcji i specyficznej amplifikacji docelowej do 92 dołków, w tym kontroli liniowości i bez matrycy. Dodać 8,75 μl mieszaniny kontrolnej bez odwrotnej transkrypcji do czterech pozostałych studzienek. Uszczelnij płytki przezroczystą folią samoprzylepną i odwiruj w dół, aby zebrać płyn na dnie płyt.</li>
	<li>Wstępna odwrotna transkrypcja i specyficzna amplifikacja docelowa poprzez uruchomienie płytki w maszynie do PCR zgodnie z programem przedwzmacniacza; krok 1: 50 °C przez 60 minut, krok 2: 95 °C przez 2 minuty, krok 3: 95 °C przez 15 s, krok 4: 60 °C przez 4 minuty, powtórz kroki 3–4 24 razy i na koniec krok 5: 8 °C na zawsze.</li>
	<li>Po zakończeniu PCR należy przechowywać płytkę w temperaturze 8 °C do krótkotrwałego przechowywania i -20 °C do długotrwałego przechowywania. 
	UWAGA: Bezpieczny punkt zatrzymania. Wzmocniony materiał może być przechowywany w temperaturze 8 °C w przypadku krótkotrwałego przechowywania i w temperaturze -20 °C w przypadku długotrwałego przechowywania.</li>
</ol>
5. Przygotowanie płytek do próbek i testów do multipleksowej analizy ekspresji genów mikroprzepływowych
<ol>
	<li>Przygotować płytkę do ładowania testu, pipetując 3 μl odczynnika do ładowania testu do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Dodać 3 μl każdego startera do poszczególnych studzienek na płytce obciążeniowej testu.</li>
	<li>Uszczelnij płytkę folią samoprzylepną i odwiruj w dół, aby zebrać płyn na dnie płytek.</li>
	<li>Przygotować płytkę rozcieńczającą, pipetując 8 μl wody wolnej od nukleaz do wszystkich studzienek płytki 96-dołkowej. Dodać 2 μl amplifikowanej próbki do płytki rozcieńczającej, uzyskując końcowe rozcieńczenie w stosunku 1:5.</li>
	<li>Uszczelnij płytkę folią samoprzylepną, mieszaj przez płytkę wirową przez 10 s, a na koniec odwiruj, aby zebrać płyn na dnie płytek.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę do ładowania próbki, ostrożnie mieszając 352 μl mieszanki wzorcowej z 35,2 μl odczynnika do ładowania próbki. Przygotować płytkę do ładowania próbki, dodając 3,3 μl mieszanki ładującej do każdego dołka na płytce 96-dołkowej.</li>
	<li>Dodać 2,7 μl z rozcieńczonej próbki do każdego dołka płytki do ładowania próbki.</li>
	<li>Uszczelnij płytkę folią samoprzylepną i odwiruj w dół, aby zebrać płyn na dnie płytek.</li>
</ol>
6. Ładowanie chipa mikroprzepływowego
<ol>
	<li>Wyjmij nowy chip mikroprzepływowy 96 x 96. Przygotuj wloty, nakłuwając je strzykawką z nakrętką, aby upewnić się, że można je przesunąć.</li>
	<li>Usunąć pęcherzyki ze strzykawek. Dodaj pełną objętość strzykawek do każdego zaworu, przechylając chip o 45 stopni i dociskając zawór. Podłącz chip do kontrolera IFC.</li>
	<li>Załaduj każdy wlot testu 4,25 μl z każdego dołka na płytce do ładowania testu. Unikaj bąbelków. Jeśli w studzience pojawią się bąbelki, usuń je końcówką pipety.</li>
	<li>Kontynuuj ładowanie każdego wlotu próbki 4,25 μl z każdego dołka na płycie do ładowania próbki, unikaj pęcherzyków, a jeśli pojawią się pęcherzyki, usuń je końcówką pipety.</li>
	<li>Załaduj chip za pomocą kontrolera IFC.</li>
	<li>Sprawdź, czy chip wygląda równo i czy wszystkie komory zostały załadowane. Usuń kurz z powierzchni wióra, dotykając go taśmą. Uruchom chip na multipleksowej platformie mikroprzepływowej ekspresji genów.</li>
</ol>
7. Uruchamianie chipa na multipleksowej platformie mikroprzepływowej ekspresji genów
<ol>
	<li>Po załadowaniu chipa do multipleksowej platformy mikroprzepływowej ekspresji genów, nazwij próbkę.</li>
	<li>Ustaw ROX jako pasywny barwnik. Ustaw pojedynczą sondę i FAM-MGB jako fluorescencję. Użyj standardu 96 x 96 v2 jako protokołu. Rozpocznij bieg.</li>
	<li>Usuń chip po zakończeniu uruchamiania.</li>
</ol>
8. Wstępna analiza przebiegu chipów
<ol>
	<li>Załaduj dane do oprogramowania do analizy PCR w czasie rzeczywistym.</li>
	<li>Załaduj nazwy genów i nazwy komórek, wklejając układy komórek i genów z pliku rozdzielanego tabulatorami.</li>
	<li>Otwórz widok obrazu i wybierz ROX jako barwnik. Sprawdź, czy wszystkie studzienki mają pasywny barwnik ROX.</li>
	<li>Sprawdź, czy wszystkie wykresy wzmocnienia wyglądają dobrze, z gładką krzywą wzmocnienia bez skoków (podobnie jak w <silna klasa="xfig">Rysunek 3E).</li>
	<li>Upewnij się, że wszystkie pojedyncze komórki mają ekspresję dołączonego kontrolnego RNA, aby upewnić się, że wszystkie zostały prawidłowo załadowane.</li>
	<li>Upewnij się, że wszystkie komórki mają ekspresję genów porządkowych, a tym samym zostały prawidłowo posortowane.</li>
	<li>Upewnij się, że kontrole liniowości 10 i 20 komórek mają około 1 CT różnicy, aby zweryfikować wzmocnienie liniowe.</li>
	<li>Sprawdź, czy w próbkach kontrolnych noRT występuje ekspresja. Jeśli ekspresja zostanie wykryta w noRT, rozważ zmianę sond na sondy, które nie wykrywają genomowego DNA w kolejnych przebiegach.</li>
	<li>Eksportuj dane w plikach csv do dalszej analizy.</li>
</ol>
9. Analiza pojedynczej komórki za pomocą SCExV
UWAGA: Dostępny jest film wprowadzający20 przedstawiający narzędzie. W tym miejscu przedstawiono krótką rekomendację, w jaki sposób przeprowadzić analizę z wykorzystaniem kontrolek wprowadzonych w protokole.
<ol>
	<li>Połącz się z witryną SCexV20.</li>
	<li>Prześlij wyeksportowane pliki CSV.</li>
	<li>Wybierz wzbogacone kontrolne RNA jako kontrolę pozytywną. Usuń każdą komórkę, która ma kontrolną CT RNA powyżej 25. Znormalizuj dane do mediany ekspresji kontrolnego RNA.</li>
	<li>Kliknij "Gotowe tutaj -> Analizuj". Usuń kontrolki noRT, notemplate, 10 i 20 komórek w opcji wykluczania komórki.</li>
	<li>Grupowanie komórek z wybranym podejściem do grupowania z oczekiwaną liczbą klastrów. Eksport przeanalizowanych wartości.</li>
</ol>
10. Analiza sortowania indeksów
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie do analizy FACS i załaduj zindeksowane próbki.</li>
	<li>Otwórz edytor skryptów i uruchom skrypt dostępny w Quinn J. i wsp.21</li>
	<li>Teraz, gdy oprogramowanie do analizy FACS powinno utworzyć bramkę dla każdej z pojedynczych komórek, otwórz edytor układu i pokoloruj komórki zgodnie z grupowaniem z SCexV (dostępnym w pliku o nazwie "Sample_complete_Data.xls").</li>
</ol>

<ol><li>Seita, J., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell%3A+Self-renewal+versus+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Syst+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell: Self-renewal versus differentiation.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2 (6), 640-653 (2010).</li>
<li>Orkin, S. H., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoiesis%3A+An+evolving+paradigm+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology.</a> Cell. 132 (4), 631-644 (2008).</li>
<li>Ye, F., Huang, W., Guo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+hematopoiesis+using+single-cell+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">Studying hematopoiesis using single-cell technologies.</a> Journal of Hematology & Oncology. 10, 27(2017).</li>
<li>Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+technologies+sharpen+up+mammalian+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 919-927 (2014).</li>
<li>Wills, Q. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+gene+expression+analysis+reveals+genetic+associations+masked+in+whole-tissue+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single-cell gene expression analysis reveals genetic associations masked in whole-tissue experiments.</a> Nature Biotechnol. 31 (8), 748-752 (2013).</li>
<li>Velten, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+haematopoietic+stem+cell+lineage+commitment+is+a+continuous+process%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process.</a> Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).</li>
<li>Wilson, N. K., Nicola, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+single-cell+functional+and+gene+expression+analysis+resolves+heterogeneity+within+stem+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations.</a> Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).</li>
<li>Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq%3A+Advances+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges.</a> Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).</li>
<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Single+RNA+Transcripts+in+Situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of Single RNA Transcripts in Situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li>
<li>Kalisky, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+review+of+single-cell+transcriptomic+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">A brief review of single-cell transcriptomic technologies.</a> Briefings in Functional Genomics. , elx019(2017).</li>
<li>Crosetto, N., Bienko, M., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+resolved+transcriptomics+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Spatially resolved transcriptomics and beyond.</a> Nature Reviews Genetics. 16, 57(2014).</li>
<li>Bengtsson, M., Ståhlberg, A., Rorsman, P., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+in+single+cells+from+the+pancreatic+islets+of+Langerhans+reveals+lognormal+distribution+of+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling in single cells from the pancreatic islets of Langerhans reveals lognormal distribution of mRNA levels.</a> Genome Research. 15 (10), 1388-1392 (2005).</li>
<li>Bengtsson, M., Hemberg, M., Rorsman, P., Ståhlberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+mRNA+in+single+cells+and+modelling+of+RT-qPCR+induced+noise%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantification of mRNA in single cells and modelling of RT-qPCR induced noise.</a> BMC Molecular Biology. 9 (1), 63(2008).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart-seq2+for+sensitive+full-length+transcriptome+profiling+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells.</a> Nature Methods. 10, 1096(2013).</li>
<li>Tung, P. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Batch+effects+and+the+effective+design+of+single-cell+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Batch effects and the effective design of single-cell gene expression studies.</a> Scientific Reports. 7, 39921(2017).</li>
<li>Teles, J., Enver, T., Pina, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+PCR+profiling+of+gene+expression+in+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell PCR profiling of gene expression in hematopoiesis.</a> Methods in Molecular Biology. , 21-42 (2014).</li>
<li>Hayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+gene+profiling+of+planarian+stem+cells+using+fluorescent+activated+cell+sorting+and+its+%26%2334%3Bindex+sorting%26%2334%3B+function+for+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+Growth%2C+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Single-cell gene profiling of planarian stem cells using fluorescent activated cell sorting and its &#34;index sorting&#34; function for stem cell research.</a> Development, Growth, & Differentiation. 52 (1), 131-144 (2010).</li>
<li>Lang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCExV%3A+A+webtool+for+the+analysis+and+visualisation+of+single+cell+qRT-PCR+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">SCExV: A webtool for the analysis and visualisation of single cell qRT-PCR data.</a> BMC Bioinformatics. 16 (1), 320(2015).</li>
<li>de Klein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+oncogene+is+translocated+to+the+Philadelphia+chromosome+in+chronic+myelocytic+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cellular oncogene is translocated to the Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukaemia.</a> Nature. 300 (5894), 765-767 (1982).</li>
<li>Lang, S., et al. SCExV. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://stemsysbio.bmc.lu.se/SCexV/">http://stemsysbio.bmc.lu.se/SCexV/</a> (2015).</li>
<li>Quinn, J. indexed-sorting. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://github.com/FlowJo-LLC/indexed-sorting">https://github.com/FlowJo-LLC/indexed-sorting</a> (2016).</li>
<li>Warfvinge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+molecular+analysis+defines+therapy+response+and+immunophenotype+of+stem+cell+subpopulations+in+CML%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Single-cell molecular analysis defines therapy response and immunophenotype of stem cell subpopulations in CML.</a> Blood. 129 (17), 2384-2394 (2017).</li>
<li>Nestorowa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+resolution+map+of+mouse+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation.</a> Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).</li>
<li>Breton, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dendritic+cells+%28DCs%29+are+derived+from+distinct+circulating+precursors+that+are+precommitted+to+become+CD1c%2B+or+CD141%2B+DCs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human dendritic cells (DCs) are derived from distinct circulating precursors that are precommitted to become CD1c+ or CD141+ DCs.</a> The Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2861-2870 (2016).</li>
<li>Alberti-Servera, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+reveals+developmental+heterogeneity+among+early+lymphoid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing reveals developmental heterogeneity among early lymphoid progenitors.</a> The EMBO Journal. 36 (24), 3619-3633 (2017).</li>
<li>Giustacchini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+uncovers+distinct+molecular+signatures+of+stem+cells+in+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics uncovers distinct molecular signatures of stem cells in chronic myeloid leukemia.</a> Nature Medicine. 23, 692(2017).</li>
<li>Hansmann, L., Han, A., Penter, L., Liedtke, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+expansion+and+interrelatedness+of+distinct+B-lineage+compartments+in+multiple+myeloma+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Clonal expansion and interrelatedness of distinct B-lineage compartments in multiple myeloma bone marrow.</a> Cancer Immunology Research. 5 (9), 744-754 (2017).</li>
<li>Psaila, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+profiling+of+human+megakaryocyte-erythroid+progenitors+identifies+distinct+megakaryocyte+and+erythroid+differentiation+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways.</a> Genome Biology. 17 (1), 83(2016).</li>
<li>Schulte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Index+sorting+resolves+heterogeneous+murine+hematopoietic+stem+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations.</a> Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W ostatnich latach analiza ekspresji genów w pojedynczej komórce stała się cennym uzupełnieniem w celu określenia heterogeniczności różnych populacji komórek23. Pojawienie się technologii sekwencjonowania RNA teoretycznie daje możliwość pomiaru całego transkryptomu komórki, jednak metody te są skomplikowane ze względu na różnice w głębokości sekwencjonowania między komórkami i zaniki. Jednokomórkowy qPCR oferuje czułą i solidną analizę ekspresji setek krytycznych genów, w której wszystkie komórki ...

Uważa się, że każda pojedyncza komórka krwi znajduje się w hierarchii komórkowej, gdzie komórki macierzyste tworzą wierzchołek na szczycie szeregu coraz bardziej zaangażowanych pośrednich progenitorów, które ostatecznie różnicują się w końcowe komórki efektorowe niosące określone funkcje biologiczne1. Duża część wiedzy na temat organizacji systemów komórek macierzystych została wygenerowana w układzie krwiotwórczym, głównie ze względu na możliwość prospektywnego izolowania odrębnych populacji krwiotwórczych wysoce wzbogaconych o komórki macierzyste lub różne komórki progenitorowe2 przez sortowanie FACS. Pozwoliło to na analizę funkcjonalną lub molekularną wielu z tych populacji, głównie poprzez profilowanie ekspresji genów3,4. Jednak podczas analizy ekspresji genów w populacjach masowych indywidualne różnice między komórkami są uśredniane i tracone5. Tak więc niezdolność do wykrycia różnic między komórkami w heterogenicznych frakcjach komórek może zaburzyć nasze zrozumienie krytycznych procesów biologicznych, jeśli małe podzbiory komórek uwzględniają wnioskowaną funkcję biologiczną tej populacji6,7. I odwrotnie, badanie sygnatur ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki daje możliwość nakreślenia heterogeniczności i obejścia przysłaniających wpływów z nadreprezentowanych podzbiorów komórek8.
Do tej pory opracowano wiele protokołów do analizy ekspresji genów w pojedynczej komórce; każde podejście ma swoje własne zastrzeżenia. Najwcześniejszą metodą była fluorescencyjna hybrydyzacja RNA in situ (RNA-FISH), która mierzy ograniczoną liczbę transkryptów na raz, ale jest wyjątkowa, ponieważ pozwala na badanie lokalizacji RNA9,11. Opracowano również wczesne metody wykorzystujące PCR i qPCR do wykrywania pojedynczego lub bardzo niewielu transkryptów12. Jednak ostatnio zostały one zastąpione przez metody oparte na mikrofluidyce, które mogą jednocześnie analizować ekspresję setek transkryptów na komórkę w setkach komórek za pomocą qPCR, a tym samym pozwalają na wysokowymiarową analizę heterogeniczności przy użyciu wcześniej określonych paneli genowych10,13. Ostatnio technologie oparte na sekwencjonowaniu RNA stały się szeroko stosowane do analizy pojedynczych komórek, ponieważ teoretycznie mogą one mierzyć cały transkryptom komórki, a tym samym dodawać wymiar eksploracyjny do analizy heterogeniczności10,14. Multipleksowana analiza qPCR i sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki mają różne cechy, dlatego uzasadnienie zastosowania którejkolwiek z metod zależy od zadanego pytania, a także od liczby komórek w populacji docelowej. Wysoka przepustowość i niski koszt na komórkę wraz z bezstronnymi, eksploracyjnymi cechami sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki są pożądane, gdy badane są nieznane komórki lub duże populacje. Jednak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki jest również nastawione na częstsze sekwencjonowanie transkryptów o dużej obfitości, podczas gdy transkrypty o niskiej obfitości są podatne na zaniki. Może to prowadzić do powstania bardzo złożonych danych, które stawiają wysokie wymagania analizie bioinformatycznej w celu ujawnienia ważnych sygnałów molekularnych, które często są subtelne lub ukryte w szumie technicznym15. Tak więc, w przypadku dobrze scharakteryzowanych tkanek, jednokomórkowa analiza qPCR przy użyciu wstępnie określonych paneli starterów wybranych pod kątem funkcjonalnie ważnych genów lub markerów molekularnych może służyć jako czułe, proste podejście do określenia heterogeniczności populacji. Należy jednak zauważyć, że w porównaniu z sekwencją RNA pojedynczej komórki, koszt na komórkę jest na ogół wyższy w przypadku jednokomórkowych metod qPCR. W tym miejscu opisujemy podejście, które łączy jednokomórkowy RT-qPCR (zmodyfikowany z Teles J. i wsp.16), do sortowania indeksu FACS17 i analizy bioinformatycznej18 w celu jednoczesnego scharakteryzowania heterogeniczności molekularnej i immunofenotypowej w populacjach.
W tym podejściu, populacja komórek będących przedmiotem zainteresowania jest barwiona, a pojedyncze komórki są sortowane przez FACS bezpośrednio do buforu do lizy w 96-dołkowych płytkach PCR. Jednocześnie poziomy ekspresji dodatkowego zestawu markerów powierzchni komórki są rejestrowane dla każdej pojedynczej komórki podczas sortowania FACS, metody określanej jako sortowanie indeksowe. Zlizowany materiał komórkowy jest następnie amplifikowany, a ekspresja genów wybranego zestawu genów analizowana za pomocą RT-qPCR, przy użyciu platformy mikroprzepływowej. Strategia ta umożliwia analizę molekularną posortowanej pojedynczej komórki, a także jednoczesną charakterystykę ekspresji markera na powierzchni komórki każdej pojedynczej komórki. Poprzez bezpośrednie mapowanie molekularnie odrębnych podzbiorów komórek na ekspresję indeksowanych posortowanych markerów, subpopulacje można powiązać ze specyficznym immunofenotypem, który można wykorzystać do ich prospektywnej izolacji. Metoda jest opisana krok po kroku w Rysunek 1. Z góry określony panel genów dodatkowo przyczynia się do wyższej rozdzielczości docelowej ekspresji genów, ponieważ omija pomiar nieistotnych, licznych genów, które w przeciwnym razie mogłyby zasłaniać subtelne sygnały ekspresji genów. Co więcej, specyficzna amplifikacja docelowa, jednoetapowa odwrotna transkrypcja i amplifikacja pozwalają na solidny pomiar transkryptów o niskiej ekspresji, takich jak czynniki transkrypcyjne lub niepoliadenylowane RNA. Co ważne, metody qPCR pozwalają na pomiar mRNA z białek fuzyjnych, które są istotne przy badaniu niektórych chorób nowotworowych19. Wreszcie, skoncentrowana liczba badanych genów, niski wskaźnik rezygnacji i ograniczone różnice techniczne między komórkami sprawiają, że metoda ta jest łatwa do analizy w porównaniu z metodami o wyższych wymiarach, takimi jak sekwencja RNA pojedynczej komórki. Postępując zgodnie z protokołem, można przeprowadzić cały eksperyment, od sortowania komórek po analizowane wyniki, w ciągu trzech dni, dzięki czemu jest to nieskomplikowana i szybka metoda czułej, wysokoprzepustowej analizy ekspresji genów jednokomórkowych.

<table><tbody><tr><td>CD14 PECY5</td><td>eBioscience</td><td>15-0149-42</td><td>Klon: 61D3</td></tr><tr><td>CD16 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>302010</td><td>Klon: 3G8</td></tr><tr><td>CD56 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>304608</td><td>Klon: MEM-188</td></tr><tr><td>CD19 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>302210</td><td>Klon: HIB19</td></tr><tr><td>CD2 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>300210</td><td>Klon: RPA-2.10</td></tr><tr><td>CD3 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>300310</td><td>Klon: HIT3a</td></tr><tr><td>CD123 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>306008</td><td>Klon: 6H6</td></tr><tr><td>CD235A PECY5</td><td>Pharma</td><td>559944</td><td>Klon GAR2</td></tr><tr><td>CD34 FITC</td><td>Biolegend</td><td>343604</td><td>Klon: 561</td></tr><tr><td>CD38 APC</td><td>Biolegend</td><td>303510</td><td>Klon: Hit2</td></tr><tr><td>CD90 PE</td><td>Biolegend</td><td>328110</td><td>Klon: 5E10</td></tr><tr><td>CD45RA BV421</td><td>BD bioscience</td><td>560362</td><td>Klon: HI100</td></tr><tr><td>CD49f Pecy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0495-82</td><td>Klon: eBioGOH3</td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone</td><td>SV30160.3</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>HyClone</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płyta dolna w kształcie litery U</td><td>VWR</td><td>10861-564</td><td></td></tr><tr><td>SFEM</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>9650</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina streptomycyna</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>FLT3L</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Probówka 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Probówka Eppendorph</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki CST</td><td>BD</td><td></td><td></td>642412</tr><tr><td>Koraliki Accudrop</td><td>BD</td><td>345249</td><td>6 i mikro; M cząstki&nbsp;</td></tr><tr><td>Folia samoprzylepna Clear</td><td>Thermo scientific&nbsp;</td><td>AB-1170</td><td></td></tr><tr><td>Folia samoprzylepna Folia</td><td>Thermo scientific&nbsp;</td><td>AB-0626</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do PCR</td><td>Axygen</td><td>PCR-96M2-HS-C</td><td></td></tr><tr><td>PCR 1,5 ml probówka</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-L-C</td><td></td></tr><tr><td>T100 PCR cycler</td><td>BioRad</td><td>186-1096</td><td></td></tr><tr><td>10% NP40</td><td>Thermo scientific&nbsp;</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP</td><td>Takara</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>0,1 M DTT</td><td>Invitrogen</td><td>P2325</td><td></td></tr><tr><td>RNAsout</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Jednoetapowy zestaw qRT-PCR CellsDirect</td><td>Invitrogen</td><td>11753-100</td><td></td></tr><tr><td>Woda bez neukleazy</td><td>Invitrogen</td><td>11753-100</td><td>z zestawu CellsDirect</td></tr><tr><td>2x Reaction Mix</td><td>Invitrogen</td><td>11753-100</td><td>z zestawu CellsDirect</td></tr><tr><td>SuperScript III RT/Platinum Taq Mix</td><td>Invitrogen</td><td>11753-100</td><td>z zestawu CellsDirect</td></tr><tr><td>Platinum&nbsp; Taq&nbsp; Polimeraza DNA</td><td>Invitrogen</td><td>10966026</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw kontrolny komórek TaqMan do tomografii komputerowej</td><td>Invitrogen</td><td>4386995</td><td></td></tr><tr><td>Xeno RNA Control</td><td>Invitrogen 4386995</td><td></td><td>z zestawu do kontroli komórek TaqMan do CT</td></tr><tr><td>20x kontrola Xeno RNA Test ekspresji genów Taqman</td><td>Invitrogen</td><td>4386995</td><td>z zestawu kontrolnego komórek TaqMan</td></tr><tr><td>do CT 96.96 Zestaw do pobierania próbek/ładowania&mdash; 10 IFC</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M10-96.96</td><td></td></tr><tr><td>2x Test Ładowanie odczynnika</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>z 96.96 Zestaw do ładowania próbki/ładowania</td></tr><tr><td>20x</td><td>Płyn</td><td></td> do ładowania próbki GE <td>od 96.96 Zestaw</td>do ładowania próbki</tr><tr><td>Płyn w przewodzie kontrolnym&nbsp;</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>z zestawu 96.96 do próbek/ładowania</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>BioMark HD</td><td>Fluidigm</td><td>BMKHD-BMKHD</td><td></td></tr><tr><td>96.96 Dynamic Array IFC</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M10-96.96GT</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>V10</td><td></td><td>TreeStar TreeStar</td><td></td></tr><tr><td>Analiza PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Fluidigm Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD179a.VPREB1</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00356766_g1</td><td></td></tr><tr><td>naukowy ACE</td><td>Thermofisher Hs00174179_m1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AHR</td><td>Thermofisher Hs00169233_m1</td><td></td><td></td>naukowy</tr><tr><td>BCR_ABL.52</td><td>Thermofisher</td><td>Hs03043652_ft</td><td></td> naukowy</tr><tr><td>BCR_ABL41</td><td>Thermofisher Hs03024541_ft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>naukowy BMI1</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00995536_m1</td><td></td></tr><tr><td>naukowy CCNA2</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00996788_m1</td><td></td></tr><tr><td>naukowy CCNB1</td><td>Thermofisher</td><td>Hs01030099_m1</td><td></td></tr><tr><td>CCNB2</td><td>Thermofisher</td><td>naukowy Hs01084593_g1</td><td></td></tr><tr><td>CCNC</td><td>Thermofisher</td><td>Hs01029304_m1</td><td></td></tr><tr><td>naukowy CCNE1</td><td>Thermofisher Hs01026535_g1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>naukowy CCNF</td><td>Thermofisher naukowy</td><td>Hs00171049_m1</td><td></td></tr><tr><td>CCR9</td><td>Thermofisher naukowy</td><td>Hs01890924_s1</td><td></td></tr><tr><td>CD10. MME</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00153510_m1</td><td></td></tr><tr><td>naukowy CD11a</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00158218_m1</td><td></td></tr><tr><td>naukowy CD11c.ITAX</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00174217_m1</td><td></td></tr><tr><td>naukowy CD123. IL3RA</td><td>Thermofisher Hs00608141_m1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>naukowy CD133. PROM1</td><td>Thermofisher naukowy</td><td>Hs01009250_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD151</td><td>Naukowy Thermofisher</td><td>Hs00911635_g1</td><td></td></tr><tr><td>CD220. INSR</td><td>Thermofisher Hs00961554_m1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>naukowy CD24. HSA</td><td>Thermofisher Hs03044178_g1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>naukowy NCOR1</td><td>Thermofisher Hs01094540_m1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>naukowy CD26. DPP4</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00175210_m1</td><td></td></tr><tr><td>naukowy CD274</td><td>Thermofisher Hs01125301_m1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>naukowy CD276</td><td>Thermofisher Hs00987207_m1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>naukowy CD32. FCGR2B</td><td>Thermofisher Hs01634996_s1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>naukowy CD33</td><td>Thermofisher naukowy</td><td>Hs01076281_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD34</td><td>Thermofisher naukowy</td><td>Hs00990732_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD344. FZD4</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00201853_m1</td><td></td></tr><tr><td>naukowy CD352. SLAMF6</td><td>Thermofisher</td><td>Hs01559920_m1</td><td></td></tr><tr><td>naukowy CD38</td><td>Thermofisher Hs01120071_m1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>naukowy CD4</td><td>Thermofisher</td><td>Hs01058407_m1</td><td></td></tr><tr><td>naukowy CD41. ITGA2B</td><td>Thermofisher Hs01116228_m1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>naukowy CD49f.ITGA6</td><td>Thermofisher Hs01041011_m1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>naukowy CD56. NCAM1</td><td>Thermofisher Hs00941830_m1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>naukowy CD9</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00233521_m1</td><td></td></tr><tr><td>naukowy CD97</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00173542_m1</td><td></td></tr><tr><td>naukowy CD99</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00908458_m1</td><td></td></tr><tr><td>naukowy CDK6</td><td>Thermofisher</td><td>Hs01026371_m1</td><td></td></tr><tr><td>naukowy CDKN1A</td><td>Thermofisher </td><td>Hs00355782_m1</td><td></td></tr><tr><td>naukowy CDKN1B</td><td>Thermofisher</td><td>Hs01597588_m1</td><td></td></tr><tr><td>naukowy CDKN1C</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00175938_m1</td><td></td></tr><tr><td>naukowy CEBPa</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00269972_s1</td><td></td></tr><tr><td>naukowy CSF1r</td><td>Thermofisher Hs00911250_m1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>naukowy CSF2RA</td><td>Thermofisher naukowy</td><td></td><td></td>Hs00531296_g1</tr><tr><td>CSF3RA</td><td>Thermofisher Hs01114427_m1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>naukowy E2A. TCF3</td><td>Thermofisher Hs00413032_m1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>naukowy EBF1</td><td>Thermofisher</td><td>Hs01092694_m1</td><td></td></tr><tr><td>naukowy ENG</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00923996_m1</td><td></td></tr><tr><td>naukowy EPOR</td><td>Thermofisher</td><td>naukowy Hs00959427_m1</td><td></td></tr><tr><td>ERG</td><td>Thermofisher naukowy</td><td>Hs01554629_m1</td><td></td></tr><tr><td>FLI1</td><td>Thermofisher Hs00956711_m1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>naukowy FLT3</td><td>Thermofisher Hs00174690_m1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>naukowy FOXO1</td><td>Thermofisher</td><td>Hs01054576_m1</td><td></td></tr><tr><td>naukowy GAPDH</td><td>Thermofisher naukowy</td><td>Hs02758991_g1</td><td></td></tr><tr><td>GATA1</td><td>Thermofisher Hs00231112_m1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>naukowy GATA2</td><td>Thermofisher naukowy</td><td></td><td></td>Hs00231119_m1</tr><tr><td>GATA3</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00231122_m1</td><td></td></tr><tr><td>naukowy GFI1</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00382207_m1</td><td></td></tr><tr><td>naukowy HES1</td><td>Naukowy Thermofisher</td><td>Hs01118947_g1</td><td></td></tr><tr><td>HLF</td><td>Thermofisher</td><td>naukowy Hs00171406_m1</td><td></td></tr><tr><td>HMGA2</td> Naukowy <td>Hs00171569_m1</td><td></td> <td>Thermofisher</td></tr><tr><td>HOXA5</td><td>Thermofisher Hs00430330_m1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>naukowy HOXB4</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00256884_m1</td><td></td></tr><tr><td>naukowy ID2</td><td>Hs04187239_m1</td><td></td><td>naukowy Thermofisher</td></tr><tr><td>IGF2BP1</td><td>Hs00198023_m1</td><td></td><td>naukowy Thermofisher</td></tr><tr><td>IGF2BP2</td><td>Thermofisher</td><td>Hs01118009_m1</td><td></td></tr><tr><td>naukowy IKZF1</td><td>Thermofisher naukowy</td><td>Hs00172991_m1</td><td></td></tr><tr><td>IL1RAP</td><td>Thermofisher naukowy</td><td>Hs00895050_m1</td><td></td></tr><tr><td>IL2RG</td><td>Thermofisher</td><td>naukowy Hs00953624_m1</td><td></td></tr><tr><td>IRF8</td><td>Thermofisher naukowy</td><td>Hs00175238_m1</td><td></td></tr><tr><td>ITGB7</td><td>Thermofisher Hs01565750_m1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>naukowy ZESTAW</td><td>Thermofisher naukowy</td><td></td><td></td>Hs00174029_m1</tr><tr><td>Lin28B</td><td>Thermofisher Hs01013729_m1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>naukowy LMO2</td><td>Naukowy Thermofisher</td><td>Hs00153473_m1</td><td></td></tr><tr><td>LYL1</td><td>Naukowy Thermofisher</td><td>Hs01089802_g1</td><td></td></tr><tr><td>Meis1</td><td>Naukowy Thermofisher</td><td>Hs01017441_m1</td><td></td></tr><tr><td>mKi67</td><td>Hs01032443_m1Naukowy Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MPL</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00180489_m1</td><td></td></tr><tr><td>naukowy MPO</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00924296_m1</td><td></td></tr><tr><td>naukowy NFIB</td><td>Thermofisher</td><td>Hs01029175_m1</td><td></td></tr><tr><td>naukowy Notch1</td><td>Thermofisher naukowy</td><td>Hs01062011_m1</td> Hs02621230_s1 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>naukowy Pten ThermofisherRAG2</td><td>Thermofisher Hs01851142_s1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>naukowy RPS18</td><td>Thermofisher naukowy</td><td>Hs01375212_g1</td><td></td></tr><tr><td>RUNX1</td><td>Thermofisher naukowy</td><td>Hs00231079_m1</td><td></td></tr><tr><td>Shisa2</td><td>Thermofisher naukowy</td><td>Hs01590823_m1</td><td></td></tr><tr><td>Spi1</td><td>Thermofisher naukowy</td><td>Hs02786711_m1</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny.IgH</td><td>Thermofisher naukowy</td><td>Hs00378435_m1</td><td></td></tr><tr><td>TAL1</td><td>Thermofisher naukowy</td><td>Hs01097987_m1</td><td></td></tr><tr><td>THY1</td><td>Thermofisher naukowy</td><td>Hs00264235_s1</td><td></td></tr><tr><td>Tim.3.HAVCR2</td><td>Thermofisher naukowy</td><td>Hs00958618_m1</td><td></td></tr><tr><td>VWF</td><td>Thermofisher Hs00169795_m1</td><td></td><td></td></tr></tbody></table> naukowy

kombinatoryczne podejście jednokomórkowe w celu scharakteryzowania molekularnej i immunofenotypowej heterogeniczności populacji ludzkich komórek macierzystych i progenitorowych

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Charakterystyka immunofenotypowa i analiza molekularna od dawna są używane do wyznaczania heterogeniczności i definiowania odrębnych populacji komórek. FACS jest z natury testem jednokomórkowym, jednak przed analizą molekularną komórki docelowe są często izolowane prospektywnie luzem, tracąc w ten sposób rozdzielczość pojedynczej komórki. Analiza ekspresji genów w pojedynczej komórce pozwala zrozumieć różnice molekularne między poszczególnymi komórkami w heterogenicznych populacjach komórek. W masowej analizie komórek nadreprezentacja odrębnego typu komórki powoduje odchylenia i niedrożności sygnałów z rzadkich komórek o znaczeniu biologicznym. Wykorzystując sortowanie indeksu FACS sprzężone z analizą ekspresji genów w pojedynczej komórce, populacje mogą być badane bez utraty rozdzielczości pojedynczej komórki, podczas gdy komórki z pośrednią ekspresją markerów powierzchniowych są również wychwytywane, co umożliwia ocenę znaczenia ciągłej ekspresji markerów powierzchniowych. W tym miejscu opisujemy podejście, które łączy ilościową kontrolę odwrotnej transkrypcji pojedynczej komórki (RT-qPCR) i sortowanie indeksu FACS w celu jednoczesnego scharakteryzowania heterogeniczności molekularnej i immunofenotypowej w populacjach komórek.
W przeciwieństwie do metod sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki, użycie qPCR ze specyficzną amplifikacją docelową pozwala na dokładne pomiary transkryptów o niskiej obfitości z mniejszą liczbą przerw, podczas gdy nie jest mylone przez problemy związane z różnicami w głębokości odczytu między komórkami. Ponadto, dzięki bezpośredniemu sortowaniu indeksowemu pojedynczych komórek w buforze do lizy, metoda ta pozwala na przeprowadzenie syntezy cDNA i specyficznej docelowej amplifikacji wstępnej w jednym kroku, a także na korelację następnie uzyskanych sygnatur molekularnych z ekspresją markera na powierzchni komórki. Opisane podejście zostało opracowane w celu badania pojedynczych komórek hematopoetycznych, ale jest również z powodzeniem stosowane na innych typach komórek.
Podsumowując, opisane tutaj podejście pozwala na czuły pomiar ekspresji mRNA dla panelu wstępnie wybranych genów z możliwością opracowania protokołów dla późniejszej prospektywnej izolacji molekularnie odrębnych subpopulacji.

Opisany protokół jest szybki, łatwy do wykonania i wysoce niezawodny. Przegląd układu eksperymentalnego przedstawiono na Ryc. 1. Cały protokół, od sortowania pojedynczych komórek, poprzez specyficzną amplifikację celu, pomiary ekspresji genów i wstępną analizę, można przeprowadzić w ciągu trzech dni. Przykład przeanalizowanych wyników w formie mapy ciepła, która przedstawia wstępnie przeanalizowane dane z analizy ekspresji genów pojedynczych komórek z wykorzy...

Masowe pomiary ekspresji genów zaciemniają różnice między poszczególnymi komórkami w heterogenicznych populacjach komórek. W tym miejscu opisujemy protokół, w jaki sposób analiza ekspresji genów pojedynczej komórki i sortowanie indeksów za pomocą sortowania komórek aktywowanych florescencją (FACS) mogą być łączone w celu określenia heterogeniczności i immunofenotypowego scharakteryzowania molekularnie odrębnych populacji komórek.

Kombinatoryczne podejście jednokomórkowe w celu scharakteryzowania molekularnej i immunofenotypowej heterogeniczności populacji ludzkich komórek macierzystych i progenitorowych

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie komórek macierzystych i nowotworów, takie jak to, jak wygląda heterogeniczność komórek macierzystych i jak można wyizolować terapię wrażliwych komórek nowotworowych. Główną zaletą tego badania jest to, że łączy ono technicznie solidną analizę ekspresji genów w pojedynczej komórce z krowianką w celu dalszej charakterystyki docelowych subpopulacji. Chociaż metoda ta może być wykorzystana do zbadania heterogeniczności raka i komórek macierzystych, może również dostarczyć informacji na temat torowania genów i potencjału linii.Aby rozpocząć protokół, na stole wolnym od RNA / DNA, przygotuj wystarczającą ilość buforu do lizy dla 96 studzienek z 10% ekstra, mieszając 390 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz, 17 mikrolitrów 10% NP-40, 2,8 mikrolitrów 10 milimolowych dNTP, 10 mikrolitrów 0,1 molowego DTT i 5,3 mikrolitrów inhibitora RNAzy. Wiruj i odkręć rurkę. Następnie rozprowadź cztery mikrolitry buforu do lizy do każdej studzienki 96-dołkowej płytki PCR i uszczelnij płytki folią samoprzylepną.Zakręć talerzami, aby zebrać płyn na dnie. Trzymaj płytki na lodzie do czasu sortowania komórek przez maksymalnie 24 godziny. Po prawidłow

a-combinatorial-single-cell-approach-to-characterize-molecular

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Test ekspresji genów jednokomórkowych jest potrzebny do zrozumienia heterogeniczności komórek macierzystych.

Profilowanie pojedynczych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą ilościowego RT-PCR

Ten protokół opisuje, jak ocenić ekspresję dużej liczby genów na poziomie klonalnym. Jednokomórkowy RT-qPCR daje wysoce wiarygodne wyniki z dużą czułością dla setek próbek i genów.

Ekspresja genów w pojedynczej komórce za pomocą multipleksu RT-qPCR w celu scharakteryzowania heterogeniczności rzadkich populacji limfoidalnych

Opracowaliśmy nowy protokół do badania dynamiki populacji heterokomórkowej w odpowiedzi na zakłócenia. Niniejszy manuskrypt opisuje platformę opartą na obrazowaniu, która tworzy ilościowe zestawy danych do jednoczesnej charakterystyki wielu fenotypów komórkowych populacji heterokomórkowych w solidny sposób.

Dyskryminacja i charakterystyka populacji heterokomórkowych z wykorzystaniem technik obrazowania ilościowego

Tutaj prezentujemy metodologię analizy klonalnej prekursorów hematopoetycznych komórek macierzystych podczas rozwoju embrionalnego u myszy. Łączymy sortowanie indeksowe pojedynczych komórek z zarodkowego regionu aorta-gonad-śródnercze z kohodowlą i przeszczepem komórek śródbłonka, aby scharakteryzować właściwości fenotypowe i potencjał wszczepienia pojedynczych prekursorów krwiotwórczych.

Analiza klonalna embrionalnych prekursorów hematopoetycznych komórek macierzystych przy użyciu sortowania indeksu pojedynczej komórki w połączeniu z kohodowlą niszy komórek śródbłonka

Prezentujemy metodę cytometrii przepływowej do jednoczesnej identyfikacji różnych typów komórek pobranych z mózgu myszy lub rdzenia kręgowego. Metoda ta może być wykorzystana do wyizolowania lub scharakteryzowania czystych populacji komórek w chorobach neurodegeneracyjnych lub do ilościowego określenia zakresu celowania w komórki po podaniu in vivo wektorów wirusowych lub nanocząstek.

Jednoczesna charakterystyka cytometryczna przepływowa wielu typów komórek pobranych z mózgu / rdzenia kręgowego myszy za pomocą różnych metod homogenizacji

Prezentowana tutaj jest technika oparta na cytometrii przepływowej, która pozwala na jednoczesny pomiar liczby podziałów komórkowych, fenotypu komórek powierzchniowych i pokrewieństwa komórkowego. Właściwości te można testować statystycznie przy użyciu struktury opartej na permutacjach.

Jednoczesna ocena pokrewieństwa, liczby podziału i fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej dla hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych

Sukces transkryptomiki i multiomiki pojedynczej komórki/pojedynczego jądra w dużej mierze zależy od jakości komórek/jąder. Dlatego izolowanie komórek/jąder od tkanek i ich oczyszczanie musi być wysoce ustandaryzowane. Protokół ten opisuje przygotowanie jąder z mózgu i szpiku kostnego do dalszego testu multiomu pojedynczego jądra.

Wysokiej jakości preparatyka jąder mózgu i szpiku kostnego do oznaczania wieloomów pojedynczych jąder

Ten protokół opisuje zastosowanie aktywowanego fluorescencją sortowania komórek ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych przy użyciu metody sortowania pojedynczych komórek. W szczególności zastosowanie sortowania pojedynczych komórek może osiągnąć 99% czystość komórek immunofenotypowanych z niejednorodnej populacji w połączeniu z podejściem opartym na wieloparametrycznej cytometrii przepływowej.

Sortowanie jednokomórkowe immunofenotypowanych mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkich złuszczonych zębów mlecznych

Przedstawiony tutaj protokół umożliwia identyfikację i wielowymiarową analizę komórek macierzystych i progenitorowych mięśni za pomocą jednokomórkowej cytometrii masowej oraz ich oczyszczanie przez FACS w celu dogłębnych badań ich funkcji. Podejście to można zastosować do badania dynamiki regeneracji w modelach chorobowych i testowania skuteczności interwencji farmakologicznych.

Identyfikacja i analiza progenitorów miogennych in vivo podczas ostrego uszkodzenia mięśni szkieletowych za pomocą wysokowymiarowej cytometrii masowej pojedynczej komórki

Tutaj prezentujemy protokoły, które umożliwiają izolację komórek zrębu z mysich kości, szpiku kostnego, grasicy i ludzkiej tkanki grasicy, kompatybilne z monokomórkową multiomiką.

Izolacja komórek zrębu z narządów krwiotwórczych

Poznaj metodę analizy ekspresji genów w pojedynczych komórkach połączoną z FACS w celu scharakteryzowania heterogeniczności komórek macierzystych i nowotworowych. Technika ta umożliwia izolację subpopulacji do dalszych badań.

Kombinatoryczne podejście jednokomórkowe w celu scharakteryzowania molekularnej i immunofenotypowej heterogeniczności populacji ludzkich komórek macierzystych i progenitorowych (Wideo) | JoVE Journal

Kombinatoryczne podejście jednokomórkowe w celu scharakteryzowania molekularnej i immunofenotypowej heterogeniczności populacji ludzkich komórek macierzystych i progenitorowych

Przeglądaj więcej filmów