Kombinatoryczne podejście jednokomórkowe w celu scharakteryzowania molekularnej i immunofenotypowej heterogeniczności populacji ludzkich komórek macierzystych i progenitorowych
25 października 2018
Masowe pomiary ekspresji genów zaciemniają różnice między poszczególnymi komórkami w heterogenicznych populacjach komórek. W tym miejscu opisujemy protokół, w jaki sposób analiza ekspresji genów pojedynczej komórki i sortowanie indeksów za pomocą sortowania komórek aktywowanych florescencją (FACS) mogą być łączone w celu określenia heterogeniczności i immunofenotypowego scharakteryzowania molekularnie odrębnych populacji komórek.
Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie komórek macierzystych i nowotworów, takie jak to, jak wygląda heterogeniczność komórek macierzystych i jak można wyizolować terapię wrażliwych komórek nowotworowych. Główną zaletą tego badania jest to, że łączy ono technicznie solidną analizę ekspresji genów w pojedynczej komórce z krowianką w celu dalszej charakterystyki docelowych subpopulacji. Chociaż metoda ta może być wykorzystana do zbadania heterogeniczności raka i komórek macierzystych, może również dostarczyć informacji na temat torowania genów i potencjału linii.
Aby rozpocząć protokół, na stole wolnym od RNA / DNA, przygotuj wystarczającą ilość buforu do lizy dla 96 studzienek z 10% ekstra, mieszając 390 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz, 17 mikrolitrów 10% NP-40, 2,8 mikrolitrów 10 milimolowych dNTP, 10 mikrolitrów 0,1 molowego DTT i 5,3 mikrolitrów inhibitora RNAzy. Wiruj i odkręć rurkę. Następnie rozprowadź cztery mikrolitry buforu do lizy do każdej studzienki 96-dołkowej płytki PCR i uszczelnij płytki folią samoprzylepną.
Zakręć talerzami, aby zebrać płyn na dnie. Trzymaj płytki na lodzie do czasu sortowania komórek przez maksymalnie 24 godziny. Po prawidłowym skonfigurowaniu maszyny FACS przeprowadź ponowną analizę populacji docelowej, sortując co najmniej 100 komórek docelowych do nowej probówki mikrowirówkowej ze 100 mikrolitrami buforu do barwienia.
FACS analizuje posortowane komórki, rejestrując posortowaną próbkę i upewniając się, że trafiają one do bramki sortowania. Następnie skonfiguruj sortowanie płytek jednokomórkowych, centrując kroplę w dołku A1 na płytce 96-dołkowej. Po wyśrodkowaniu posortuj od 50 do 106 mikrometrów cząstek we wszystkich studzienkach wokół krawędzi pustej 96-dołkowej płytki, aby upewnić się, że wszystkie studzienki otrzymają komórkę w środku każdej studzienki.
Usuń folię samoprzylepną z płytek. Posortuj pojedynczą komórkę komórek Lin-CD34 plus CD38 minus do 92 z 96 dołków. Aktywuj sortowanie indeksów w oprogramowaniu sortującym FACS, aby zapisać profil immunofenotypowy dla CD45RA, CD49F i CD90 dla każdej pojedynczej komórki.
Posortuj dwie studzienki z odpowiednio 10 i 20 komórkami w celu kontroli liniowości we amplifikacji PCR. Zwykle stosuje się studzienki H1 i H2. Utrzymuj dwie studzienki bez żadnych komórek, ponieważ nie ma kontrolek szablonu, zwykle studzienek H3 i H4. Uszczelnij płytki przezroczystą folią samoprzylepną i obracaj płytki z 300-krotnością grawitacji przez jedną minutę.
Zamroź talerze na suchym lodzie. Następnie przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Wykonaj odwrotną transkrypcję i specyficzną docelową amplifikację mieszanki, dodając 632,5 mikrolitrów dwukrotnej mieszanki reakcyjnej, 101,2 mikrolitrów Taq / SuperscriptIII, 151,8 mikrolitrów mieszanki starterów i 0,7 mikrolitrów wzbogaconych w kontrolny RNA.
Zwiruj roztwór i odwiruj go w dół, aby zebrać płyn na dnie probówki. Przechowywać mieszaninę na lodzie, aż będzie gotowa do dodania do próbki. Następnie rozmrozić płytki lizatu na lodzie.
Dodać 8,75 mikrolitra wcześniej przygotowanej mieszanki odwrotnej transkrypcji i specyficznej docelowej amplifikacji do 92 dołków, w tym kontroli liniowości i braku matrycy. Dodaj 8,75 mikrolitra mieszanki kontrolnej bez odwrotnej transkrypcji do czterech pozostałych studzienek. Następnie uszczelnij płytki przezroczystą folią samoprzylepną i obróć płytki, aby zebrać płyn na dnie.
Wykonaj odwrotną transkrypcję i specyficzną amplifikację docelową, uruchamiając płytkę w maszynie do PCR zgodnie z programem przedwzmacniacza. Przygotować płytkę do ładowania testu, pipetując trzy mikrolitry odczynnika do ładowania testu do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Dodaj trzy mikrolitry każdego startera do poszczególnych dołków na płytce obciążeniowej testu.
Uszczelnij płytkę folią samoprzylepną i odkręć ją w dół. Po odwirowaniu płytki należy przygotować płytkę rozcieńczającą, pipetując osiem mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do wszystkich studzienek płytki 96-dołkowej. Dodać dwa mikrolitry amplifikowanej próbki do płytki rozcieńczającej.
Uszczelnij płytkę folią samoprzylepną. Wymieszaj, obracając płytkę wirowo przez 10 sekund. Następnie odkręć talerz.
Następnie przygotuj mieszankę do ładowania próbki, ostrożnie mieszając 352 mikrolitry mieszanki wzorcowej z 35,2 mikrolitrami odczynnika do ładowania próbki. Przygotować płytkę do ładowania próbki, podając 3,3 mikrolitra mieszanki ładującej do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Dodać 2,7 mikrolitra z rozcieńczonej próbki do każdego dołka płytki ładującej próbkę.
Uszczelnij płytkę folią samoprzylepną i odkręć ją w dół. Wyjmij nowy układ mikroprzepływowy 96 na 96. Przygotuj wloty, nakłuwając je strzykawką z nasadką, aby upewnić się, że można je przenieść.
Dodaj pełną objętość strzykawek do każdego zaworu, przechylając chip pod kątem 45 stopni i dociskając zawór. Zalać chip za pomocą kontrolera IFC. Załaduj każdy wlot testu 4,25 mikrolitra z każdego dołka na płycie załadowczej testu i unikaj pęcherzyków.
Jeśli w studzience pojawią się bąbelki, usuń je końcówką pipety. Kontynuuj ładowanie każdego wlotu próbki 4,25 mikrolitra z każdego z dołków na płytce do ładowania próbki, unikając pęcherzyków, a jeśli pojawią się pęcherzyki, usuń je za pomocą końcówki pipety. Załaduj układ za pomocą kontrolera Integrated Fluidics Circuit lub kontrolera IFC.
Sprawdź, czy chip wygląda równo i czy wszystkie komory zostały załadowane. Usuń kurz z powierzchni chipa, dotykając go taśmą. Na koniec uruchom chip na multipleksowej platformie mikroprzepływowej ekspresji genów.
Mapa cieplna udanego przebiegu przedstawia równomiernie rozłożoną ekspresję w próbkach z silnym sygnałem około siedmiu do 25 CT. Ta krzywa amplifikacji wzbogaconego kontrolnego RNA sprawdza, czy wszystkie studzienki mają wyraźną ekspresję około 10 CT z niewielką lub żadną zmiennością, potwierdzając, że reakcje pre-amplifikacji i qPCR zakończyły się sukcesem dla wszystkich komórek. Analiza głównych składowych lub PCA, która wizualizuje podobieństwa między grupami komórek za pomocą redukcji wymiarów, może być przydatna do odróżnienia od siebie klastrów molekularnie odrębnych komórek, tutaj identyfikując cztery podgrupy.
Aby zidentyfikować immunofenotyp komórek z różnych klastrów molekularnych, załaduj plik indeksu FCS do FlowJo. Otwórz edytor skryptów i wklej skrypt indeksu, naciśnij Uruchom. Każda komórka będzie teraz znajdować się w osobnej bramie.
Dodaj każdą komórkę do edytora układu i pokoloruj je zgodnie z molekularnie zdefiniowanym grupowaniem z SCXV dostępnym w pliku sample_complete_data.xls. Wykresy FACS pokazują ekspresję markerów powierzchniowych komórek macierzystych dla markerów hematopoetycznych komórek macierzystych CD90 i CD45RA, które można wykorzystać do rozróżnienia klastrów i wyizolowania ich do analizy funkcjonalnej. Po tej procedurze można przeprowadzić inne techniki, takie jak sekwencjonowanie RNA nowo odkrytych subpopulacji lub eksperymenty in vitro i in vivo, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytanie, takie jak jaki mechanizm molekularny powoduje tę niejednorodność i jak subpopulacja różni się funkcjonalnie.
Strategia ta utorowała naukowcom drogę nie tylko do zbadania heterogeniczności prawidłowej i złośliwej hematopoezy, ale może być również wykorzystana do prospektywnego izolowania odkrytych subpopulacji w celu ich dalszego badania.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół łączący analizę ekspresji genów w pojedynczych komórkach z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją (FACS) w celu zbadania heterogeniczności populacji komórkowych. Jego celem jest charakterystyka molekularnie odmiennych typów komórek, w szczególności w kontekście komórek macierzystych i nowotworów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Neuronauka
- Badania nad rakiem
Wstęp
- Pomiary ekspresji genów w całej populacji komórek mogą maskować różnice między poszczególnymi komórkami.
- Zrozumienie heterogeniczności komórek macierzystych jest kluczowe dla postępów w terapii.
- Metoda FACS umożliwia izolację specyficznych populacji komórek do szczegółowej analizy.
- Metoda ta pozwala na uzyskanie informacji na temat primingu genów oraz potencjału różnicowania linii komórkowych.
Cel badania
- W celu określenia heterogeniczności populacji komórek.
- W celu immunofenotypowej charakterystyki poszczególnych typów komórek.
- W celu zbadania wpływu terapii na wrażliwe komórki nowotworowe.
Zastosowane metody
- Przygotowanie buforu do lizy dla analizy pojedynczych komórek.
- Zastosowanie sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS).
- Analiza ekspresji genów w pojedynczych komórkach.
- Dalsza charakterystyka docelowych subpopulacji.
Główne wyniki
- Metoda ta skutecznie ujawnia heterogenność komórek macierzystych.
- Umożliwia ona izolację specyficznych populacji komórek nowotworowych.
- Uzyskano informacje na temat primingu genów oraz potencjału linii komórkowych.
- Protokół jest technicznie solidny i powtarzalny.
Wnioski
- Podejście to pozwala na lepsze zrozumienie różnorodności komórkowej.
- Posiada potencjalne zastosowania zarówno w badaniach nad komórkami macierzystymi, jak i nowotworami.
- Połączenie tych technik zapewnia kompleksową analizę populacji komórek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
To kombinatoryczne podejście do analizy pojedynczych komórek rozwiązuje krytyczny problem w badaniach nad komórkami macierzystymi i nowotworami poprzez zachowanie rozdzielczości na poziomie pojedynczej komórki podczas profilowania molekularnego, co umożliwia precyzyjną identyfikację rzadkich subpopulacji odpowiedzialnych za oporność terapeutyczną lub różnicowanie linii komórkowych. Poprzez powiązanie markerów immunofenotypowych z profilami ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki, metoda ta zwiększa pewność walidacji celu i wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w wczesnych etapach procesów odkrywania leków. Podejście to zapewnia skalowalny i powtarzalny schemat postępowania w celu generowania ilościowych danych multimodalnych, które stanowią podstawę do podejmowania decyzji typu go/no-go w procesach priorytetyzacji celów oraz identyfikacji wiodących związków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez rozstrzygnięcie heterogeniczności molekularnej i immunofenotypowej w populacjach komórek macierzystych i progenitorowych.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez korelację ekspresji markerów powierzchniowych z precyzyjnie dobranymi panelami genów, co redukuje liczbę wyników fałszywie dodatnich w wyborze celu.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia identyfikację molekularnie odrębnych subpopulacji do późniejszej izolacji, zwiększając pewność ocen potencjału linii komórkowych oraz primingu genowego.
Przesiew i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Generuje zestandaryzowane, ilościowe dane dotyczące ekspresji genów powiązane z sortowaniem indeksowym FACS, co umożliwia odtwarzalne przesiewanie stanów molekularnych w populacjach komórek.
- Skalowalność: Kompatybilność z formatami 96-dołkowymi oraz platformami mikroprzepływowymi, wspierająca średnioprzepustowe badanie zdefiniowanych paneli genów w pierwotnych próbkach ludzkich.
- Odtwarzalność: Minimalizacja zmienności technicznej dzięki lizie pojedynczych komórek w buforze oraz etapom preamplifikacji, co zapewnia spójną detekcję transkryptów o niskiej liczności.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Umożliwia prospektywną izolację zdefiniowanych molekularnie subpopulacji do walidacji funkcjonalnej in vitro oraz in vivo, łącząc etap odkryć z rozwojem przedklinicznym.
- Zgodność z biomarkerami: Wspiera identyfikację sygnatur markerów powierzchniowych skorelowanych z klastrami molekularnymi, pomagając w opracowaniu biomarkerów translacyjnych do stratyfikacji pacjentów.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Dostarcza wglądu w mechanizmy heterogeniczności, co pozwala na właściwy dobór modeli przedklinicznych i redukcję ryzyka biologicznego na późnych etapach rozwoju terapeutycznego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, umożliwiając profilowanie o wysokiej rozdzielczości heterogenicznych populacji przed identyfikacją związków wiodących, szczególnie w programach dotyczących nowotworów napędzanych przez komórki macierzyste oraz medycyny regeneracyjnej. Pozycjonuje ona charakterystykę molekularną i fenotypową jako ciągłą, wielokrotnie wykorzystywalną funkcjonalność, a nie jednorazowy test, co wspiera iteracyjne doprecyzowanie celu terapeutycznego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez powiązanie ekspresji genów w pojedynczych komórkach z profilami immunofenotypowymi, co umożliwia biologiczną redukcję ryzyka w odniesieniu do celów terapeutycznych w kontekstach hematopoetycznych i onkogennych.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy, ilościowych wyników z uprzednio namnożonego cDNA, co ułatwia wiarygodne porównywanie stanów molekularnych w posortowanych pojedynczych komórkach.
- Analityka: Umożliwia przeprowadzenie analizy głównych składowych (PCA) oraz wizualizację za pomocą map ciepła w celu identyfikacji klastrów molekularnych i ich korelacji z ekspresją markerów powierzchniowych dla rozróżnienia subpopulacji.
- Badania translacyjne: Łączy klastrowanie molekularne z walidacją funkcjonalną poprzez prospektywną izolację subpopulacji do dalszego sekwencjonowania RNA lub testów in vivo.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia zstandaryzowany protokół dla multipleksowej analizy pojedynczych komórek, który może być adaptowany w różnych systemach modelowych i obszarach terapeutycznych, ograniczając redundantne opracowywanie metod.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez rozwiązanie problemu heterogeniczności molekularnej maskowanej w analizach zbiorczych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki ustandaryzowanym protokołom lizy, preamplifikacji i qPCR, kompatybilnym z istniejącą infrastrukturą FACS i mikroprzepływową.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnej identyfikacji funkcjonalnie istotnych subpopulacji, co ogranicza inwestycje w cele niewykonalne.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko, dostarczając mechanistycznego uzasadnienia dla wprowadzenia populacji zdefiniowanych molekularnie do walidacji przedklinicznej.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w indeksowanym sortowaniu FACS, pracy z pojedynczymi komórkami oraz obsłudze platform mikroprzepływowych do qPCR.
- Zależne od dostępu do sorterów komórek aktywowanych fluorescencją z funkcją indeksowania oraz mikroprzepływowych systemów analizy ekspresji genów.
- Konieczna jest standaryzacja między zespołami w zakresie przygotowania buforu do lizy, strategii bramkowania podczas sortowania oraz rurociągów analizy danych.
- Adaptacja do systemów niehematopoetycznych może wymagać optymalizacji paneli markerów powierzchniowych i warunków lizy.
- Ograniczenia praktyczne obejmują przepustowość powiązaną z prędkością sortowania i ładowaniem chipów mikroprzepływowych; metoda ta najlepiej nadaje się do ukierunkowanych paneli, a nie do screeningu całego transkryptomu.
