Name: Ekspresja i oczyszczanie kanałów jonowych bestrofiny ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Poznaj metodę ekspresji i oczyszczania kanałów jonowych bestrofiny ssaków w komórkach HEK293F. Technika ta umożliwia badania biofizyczne i strukturalne tych białek związanych z degeneracją plamki żółtej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt został sfinansowany z grantów NIH EY025290, GM127652 i University of Rochester na start-up.

1. Wytwarzanie baculowirusów ekspresyjnych BacMam
<ol>
	<li>Wprowadzić sekwencję kodującą wybranego białka bestrofiny ssaków do wektora pEG BacMam18 zawierającego sekwencję rozpoznawania proteazy wirusa mozaiki tytoniu (TEV), a następnie GFP-10x His-tag na C-końcu białka.</li>
	<li>Przeprowadzić przejściową transfekcję plazmidu ekspresyjnego do adherentnych komórek HEK29319,20,21,2,23. Sprawdzić ekspresję białka fuzyjnego z GFP pod mikroskopem fluorescencyjnym przy powiększeniu 10X lub 20X, źródle wzbudzenia 48 nm i filtrze emisyjnym 510 nm (Rycina 1A). 
	Uwaga: Transfekcję opartą na polimerach rutynowo wykonuje się z użyciem 1 μg DNA plazmidowego na szalkę 35 mm z komórkami HEK293.</li>
	<li>Wyprodukować bakulowirusy w komórkach owadziech Sf9 zgodnie z wcześniejszym opisem16,17. 
	Uwaga: Wirus z pasażu 3 (P3), który zostanie użyty do zakażenia komórek HEK293-F w celu produkcji białka, może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.</li>
	<li>Wyznaczyć miano (jednostki zakaźne) wirusa P3 za pomocą testu tworzenia plak16,17. 
	Uwaga: Ponieważ badane białko jest znakowane GFP, szybszą metodą sprawdzania jednostek zakaźnych jest zakażenie komórek Sf9 seryjnymi rozcieńczeniami wirusa i przeliczenie liczby komórek fluorescencyjnych po 48 h.</li>
</ol>
2. Ekspresja białek
<ol>
	<li>Kulturować komórki HEK293-F w zawiesinie w pożywce ekspresyjnej HEK293-F w 37 °C inkubator z nawilżaniem i 8% CO22Należy użyć jednorazowych kolb hodowlanych o objętości 2–2,5 raza większej niż objętość hodowli i inkubować ją na wytrząsarce orbitalnej przy prędkości 135 obr./min. 
	Uwaga: zaleca się zakażanie komórek, gdy znajdują się one między 5. a 30. pasażem, oraz wykonywanie tych czynności pod dygestorium do hodowli komórkowej.</li>
	<li>24 h przed infekcją wirusową dodać 15 μL błękitu trypanu do 15 μL alikwot hodowli komórkowej, a następnie sprawdzić gęstość i żywotność komórek za pomocą hemocytometru pod mikroskopem. Rozcieńczyć komórki do stężenia 0,6 x 106 komórek/ml w dwóch kolbach o pojemności 2 l każda, z 50 ml podgrzanego wcześniej pożywki w temperaturze 37 °C. 
	Uwaga: Martwe komórki są barwione na niebiesko za pomocą błękitu trypanowego. Pożądana żywotność komórek wynosi &gt;95%.</li>
	<li>W dniu infekcji należy sprawdzić gęstość i żywotność komórek (krok 2.2). 
	Uwaga: Wysoka żywotność komórek &gt;95% jest niezbędne dla efektywnej infekcji i ekspresji białek. Oczekiwana gęstość komórek wynosi ~1,0 x 106 komórek/ml (hodowanych przez noc z 2 x 50 ml z 0,6 x 106 komórek/ml hodowli komórkowej). Przewidywana całkowita liczba komórek wynosi ~1,0 x 109.</li>
	<li>Dodaj bakulowirusy P3 do komórek z wielokrotnością infekcji (MOI) wynoszącą 5. Aby określić ilość wirusa do inokulacji, zastosuj poniższe równanie: 
	<img alt="Wzór na obliczenie objętości: (MOI) * całkowita liczba komórek / jednostki zakaźne; schemat przygotowania inokulum." src="/files/ftp_upload/57832/57832eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"></li>
	<li>Inkubować komórki na platformie orbitalnej przy 135 obr./min w warunkach zwiększonej wilgotności 37 °C inkubator z 8% CO22 przez 24 h.</li>
	<li>Do hodowli komórkowej należy dodać maślan sodu w stężeniu 10 mM i kontynuować inkubację przez 48 h. 
	Uwaga: W przypadku niektórych białek obniżenie temperatury hodowli komórkowej do 30 °C dodatek maślanu sodu może poprawić ekspresję i stabilność.</li>
	<li>Pod mikroskopem fluorescencyjnym przy powiększeniu 10X lub 20X, z wykorzystaniem źródła wzbudzania o długości fali 48 nm oraz filtra emisji 510 nm, należy sprawdzić odsetek oraz jasność zielonych komórek, co bezpośrednio obrazuje wydajność białka (bestrophin-GFP-10xHis) (Rycina 1B). 
	Uwaga: Procent komórek zielonych oblicza się według wzoru: 10 x (komórki zielone/wszystkie komórki). O dobrym poziomie ekspresji białka świadczy silna zielona fluorescencja widoczna pod mikroskopem.</li>
	<li>Zebrać komórki poprzez odwirowanie przy 1 0 x g w 4 °C przez 20 min. Odwirować supernatant, a osad komórkowy zawiesić w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) do objętości końcowej ok. 80 mL. Zawiesinę komórkową podzielić do dwóch probówek stożkowych o pojemności 50 mL i odwirować z prędkością 1 0 x g w 4 °C przez 20 min. Przechowywać osady komórkowe w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie białek
<ol>
	<li>Inkubować probówki stożkowe zawierające osady komórkowe w mieszającej kąpieli wodnej w temperaturze pokojowej przez 10-15 min, aż rozmrożą. Ponownie zawiesić komórki w 2x (w/v) objętości buforu A (Tabela 1) (np. 10 g osadów komórkowych w 20 mL buforu) uzupełnionego inhibitorami proteinaz (aprotininą, leupeptyną, pepstatyną A i fenylometylsulfonilofluorkiem) w stężeniu 0,1-1,0 mM. Intensywnie pipetować w górę i w dół, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórkową.</li>
	<li>Zlizować komórki za pomocą homogenizatora wysokociśnieniowego. Przepuścić zawiesinę komórkową przez homogenizator przy ciśnieniu 7-10 MPa łącznie 3-4 razy, aby uzyskać pełną homogenizację. Przechowywać lizat komórkowy na lodzie przez 2-3 min pomiędzy cyklami.</li>
	<li>Dodać detergent [np. 2% w/v n-dodecyl-β-D-maltopiranozyd (DDM) klasy sol-grade] do lizatu komórkowego. Inkubować z wytrząsaniem przez 1 h w temperaturze 20 °C, aby wyekstrahować białka błonowe. 
	Uwaga: Rodzaj detergentu musi zostać zoptymalizowany dla każdego białka docelowego18,24.</li>
	<li>Wirować przy 150 00 x g w ultrawirowarce w temperaturze 4 °C przez 1 h. 
	Uwaga: Wszystkie kolejne etapy są przeprowadzane w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zebrać klarowny lizat komórkowy i przepuścić go przez kolumnę powinowactwa His Trap Ni2+-NTA o pojemności 5 mL, uprzednio równoważoną buforem A (Tabela 1). 
	Uwaga: Po wirowaniu klarowny lizat komórkowy będzie znajdować się pomiędzy osadem na dnie a zmętniałą warstwą na górze. Użyć pipety transferowej 10 mL, aby ostrożnie zebrać klarowny lizat, a następnie przejść na pipetę 1 mL dla ostatnich kilku mililitrów lizatu. Należy unikać osadu, który może zapchać kolumnę Ni2+; dopuszczalna jest jednak niewielka ilość górnej warstwy lub można ją przefiltrować przez filtr 1,5 μm.</li>
	<li>Przemyć kolumnę 25 mL buforu B, a następnie 40 mL buforu C (Tabela 2 oraz 3, odpowiednio). 
	Uwaga: To dobry moment na przerwę, ponieważ całkowite oczyszczanie może trwać do 12 h, a białko może pozostać stabilne, będąc przyczepionym do kolumny przez noc.</li>
	<li>Podłączyć kolumnę do systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) i eluować białko z kolumny za pomocą 13 mL buforu D (Tabela 3) z frakcjonowaniem. Zebrać frakcje wzbogacone w białko na podstawie odczytu absorbancji UV. 
	Uwaga: Parametry FPLC są następujące: rozmiar frakcji 1,0 mL, alarm ciśnienia przedkolumnowego ustawiony na 0,3 MPa oraz szybkość przepływu 0,5 mL/min.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie eluowanego produktu białkowego na spektrofotometrze mikrowolumetrycznym. Odczytać absorbancję przy 280 nm.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Aby usunąć znacznik GFP-10xHis, dodać proteazę TEV w stosunku masowym 1:1 i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 min. 
	Uwaga: Znacznik może lub nie może wpływać na funkcję lub strukturę oczyszczonego kanału. Obliczyć ilość TEV na podstawie objętości i stężenia białka zebranego w krokach 3.7-3.8. Na przykład, jeśli zebrano 10 mL produktu elucji o stężeniu 0,1 mg/mL, całkowita masa białka wynosi 10 x 0,1 = 1 mg i do trawienia zostanie użyte 1 mg TEV.</li>
	<li>Skoncentrować białko za pomocą wirówkowego modułu filtrującego o pojemności 15 mL (50 lub 10 kDa), wirując przy 4 00 x g w temperaturze 4 °C do końcowej objętości 40-50 μL (dla pętli załadowczej próbki 2 mL w systemie FPLC). 
	Uwaga: Czas wirowania w celu koncentracji różni się w zależności od stężenia i wielkości białka. Aby uniknąć nadmiernej koncentracji, która może spowodować precypitację białka, wirować najpierw przez 10 min, następnie ocenić pozostałą objętość i oszacować czas kolejnego wirowania (np. 2-5 min) i tak dalej, aż do uzyskania końcowej objętości. Pipetować pomiędzy wirowaniami, aby rozproszyć białko, które ściąga się na dno filtra.</li>
	<li>Przenieść skoncentrowane białko do nowej probówki 1,5 mL i usunąć wszelkie osady lub pęcherzyki powietrza z produktu skoncentrowanego. Wirować przy &gt;12 0 x g przez 5-10 min w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant do nowej probówki 1,5 mL.</li>
	<li>Nanieść produkt końcowy za pomocą strzykawki 1 mL z igłą o zaokrąglonej końcówce na system FPLC do chromatografii wykluczania z użyciem kolumny do wykluczania uprzednio równoważonej buforem E (Tabela 5). 
	Uwaga: Parametry FPLC są następujące: rozmiar frakcji 0,5 mL, alarm ciśnienia przedkolumnowego ustawiony na 2,50 MPa, objętość przepływu ustawiona na 30 mL buforu E (Tabela 5) oraz szybkość przepływu ustawiona na 0,5 mL/min.</li>
	<li>Należy zauważyć, że prawidłowo zachowujące się białka tworzą pojedynczy pik (Rysunek 2A); zebrać frakcję(e) białkowe odpowiadające temu piku (Rysunek 2A).</li>
	<li>Skoncentrować białko za pomocą wirówkowego modułu filtrującego 4 mL lub 0,5 mL (o tym samym odcięciu masy cząsteczkowej, co w kroku 3.10) i wirować przy 4 0 x g w temperaturze 4 °C do końcowego stężenia 5-10 μg/μL. Użyć spektrofotometru do sprawdzenia końcowego stężenia produktu (krok 3.8). 
	Uwaga: Czas wirowania jest zmienny, ponieważ objętość produktu końcowego może się różnić między próbami oczyszczania. Zazwyczaj wirowanie trwa 10-20 min. Zaleca się pipetowanie pomiędzy wirowaniami, aby rozproszyć białko, które ściąga się na dno filtra.</li>
	<li>Przenieść skoncentrowane białko do nowej probówki 1,5 mL. Usunąć wszelkie osady poprzez wirowanie przy &gt;12 00 x g przez 5-10 min w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki 1,5 mL. Przygotować alikwoty po 10 μL do przechowywania w temperaturze -80 °C oraz zachować jeden mały alikwot 2-5 μL do analizy na żelu SDS-PAGE z gradientem 4-15% przy 9 V/cm (Rysunek 2B).</li>
	<li>Potwierdzić tożsamość oczyszczonego białka za pomocą spektrometrii mas8. 
	Uwaga: Analizę in vitro funkcji i struktury oczyszczonego białka można przeprowadzić odpowiednio za pomocą płaskiej błony lipidowej oraz krystalografii rentgenowskiej5,8.</li>
</ol>

<ol><li>Hartzell, H. C., Qu, Z., Yu, K., Xiao, Q., Chien, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+physiology+of+bestrophins%3A+multifunctional+membrane+proteins+linked+to+best+disease+and+other+retinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Review%22%5BJournal%5D)">Molecular physiology of bestrophins: multifunctional membrane proteins linked to best disease and other retinopathies.</a> Physiological Review. 88 (2), 639-672 (2008).</li>
<li>Marmorstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bestrophin%2C+the+product+of+the+Best+vitelliform+macular+dystrophy+gene+%28VMD2%29%2C+localizes+to+the+basolateral+plasma+membrane+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 97 (23), 12758-12763 (2000).</li>
<li>Marquardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+a+novel+gene%2C+VMD2%2C+encoding+a+protein+of+unknown+properties+cause+juvenile-onset+vitelliform+macular+dystrophy+%28Best%27s+disease%29%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best's disease).</a> Human Molecular Genetics. 7 (9), 1517-1525 (1998).</li>
<li>Petrukhin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+gene+responsible+for+Best+macular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy.</a> Nature Genetics. 19 (3), 241-247 (1998).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+mutations+impair+BESTROPHIN1%27s+essential+role+in+mediating+Ca2%2B-dependent+Cl-+currents+in+human+RPE%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1's essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Tsunenari, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+analysis+of+the+bestrophin+family+of+anion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure-function analysis of the bestrophin family of anion channels.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (42), 41114-41125 (2003).</li>
<li>Kane Dickson, V., Pedi, L., Long, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+insights+into+the+function+of+a+Ca%282%2B%29-activated+Cl%28-%29+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure and insights into the function of a Ca(2+)-activated Cl(-) channel.</a> Nature. 516 (7530), 213-218 (2014).</li>
<li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+selectivity+in+bestrophin+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure and selectivity in bestrophin ion channels.</a> Science. 346 (6207), 355-359 (2014).</li>
<li>Johnson, A. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28153808">Bestrophin 1 and retinal disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. , (2017).</li>
<li>Allikmets, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Best+disease+gene+in+patients+with+age-related+macular+degeneration+and+other+maculopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies.</a> Human Genetics. 104 (6), 449-453 (1999).</li>
<li>Burgess, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biallelic+mutation+of+BEST1+causes+a+distinct+retinopathy+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans.</a> American Journal of Human Genetics. 82 (1), 19-31 (2008).</li>
<li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missense+mutations+in+a+retinal+pigment+epithelium+protein%2C+bestrophin-1%2C+cause+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa.</a> American Journal of Human Genetics. 85 (5), 581-592 (2009).</li>
<li>Kramer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+VMD2+gene+are+associated+with+juvenile-onset+vitelliform+macular+dystrophy+%28Best+disease%29+and+adult+vitelliform+macular+dystrophy+but+not+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration.</a> European Journal of Human Genetics. 8 (4), 286-292 (2000).</li>
<li>Yardley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+VMD2+splicing+regulators+cause+nanophthalmos+and+autosomal+dominant+vitreoretinochoroidopathy+%28ADVIRC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC).</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (10), 3683-3689 (2004).</li>
<li>Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEST1%3A+the+Best+Target+for+Gene+and+Cell+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies.</a> Molecular Therapy. 23 (12), 1805-1809 (2015).</li>
<li>Boyce, F. M., Bucher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus-mediated+gene+transfer+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).</li>
<li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).</li>
<li>Goehring, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).</li>
<li>Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-inspired+voltage-dependent+calcium+channel+blockers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers.</a> Nature Communications. 4, 2540(2013).</li>
<li>Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preassociated+apocalmodulin+mediates+Ca2%2B-dependent+sensitization+of+activation+and+inactivation+of+TMEM16A%2F16B+Ca2%2B-gated+Cl-+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (51), 18213-18218 (2014).</li>
<li>Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+RGK+GTPases+differentially+use+alpha1-+and+auxiliary+beta-binding-dependent+mechanisms+to+inhibit+CaV1.2%2FCaV2.2+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+One%22%5BJournal%5D)">Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels.</a> Public Library of Science One. 7 (5), e37079(2012).</li>
<li>Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+molecules+for+inducibly+inactivating+CaV+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels.</a> Nature Chemical Biology. 3 (12), 795-804 (2007).</li>
<li>Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rem%2C+a+member+of+the+RGK+GTPases%2C+inhibits+recombinant+CaV1.2+channels+using+multiple+mechanisms+that+require+distinct+conformations+of+the+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase.</a> Journal of Physiology. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).</li>
<li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li>
<li>Schmidt, C., Urlaub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+cryo-electron+microscopy+%28cryo-EM%29+and+cross-linking+mass+spectrometry+%28CX-MS%29+for+structural+elucidation+of+large+protein+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Currents+Opinions+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Combining cryo-electron microscopy (cryo-EM) and cross-linking mass spectrometry (CX-MS) for structural elucidation of large protein assemblies.</a> Currents Opinions in Structural Biology. 46, 157-168 (2017).</li>
<li>Sun, W., Zheng, W., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+discovery+and+development+for+rare+genetic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics+Part+A%22%5BJournal%5D)">Drug discovery and development for rare genetic disorders.</a> American Journal of Medical Genetics Part A. 173 (9), 2307-2322 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje użyteczny proces ekspresji i oczyszczania kanałów jonowych bestrofiny ssaków, który ma być wykorzystany w przyszłych analizach in vitro . Podczas gdy urządzenie FPLC jest wymagane do chromatografii wykluczającej rozmiar, pompa strzykawkowa jest wystarczająca do wszystkich etapów chromatografii powinowactwa, w tym wiązania, mycia i elucji. W przypadku używania pompy strzykawkowej do przepychania roztworów (w strzykawce) przez kolumnę, konieczne jest podłożenie strony sprężyny, aby uniknąć wpy...

Bestrofiny to rodzina kanałów jonowych zachowanych przez różne gatunki, od bakterii po ludzi1. U ludzi gen BEST1, zlokalizowany na chromosomie 11q12.3, koduje białko błonowe Bestrophin-1 (BEST1), które ulega ekspresji głównie w błonie podstawno-bocznej komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) oczu2,3,4. Składa się z 585 aminokwasów, z których pierwsze ~350 są wysoce konserwatywne wśród gatunków i zawierają region transbłonowy, BEST1 działa jako CaCC u ludzi1,5,6. Co więcej, homologi BEST1 u kurcząt i Klebsiella pneumoniae funkcjonują jako homopentamers7,8, co sugeruje wysoki poziom ochrony w trakcie ewolucji.
U ludzi ponad 200 mutacji w genie BEST1 zostało klinicznie powiązanych z grupą chorób zwyrodnieniowych siatkówki zwanych bestrophinopatiami1,9. Zgłoszono pięć specyficznych bestrofinopatii, w tym chorobę Best, dystrofię szklistkowatą o początku w wieku dorosłym, autosomalną dominującą witreoretinochoroidopatię, autosomalną recesywną bestrofinopatię i barwnikowe zwyrodnienie siatkówki i barwnik<owe zwyrodnienie siatkówki class="xref">3,4,10,11,12,13,14. Choroby te, które prowadzą do pogorszenia wzroku, a nawet ślepoty, są obecnie nieuleczalne. Aby opracować terapie terapeutyczne i potencjalnie spersonalizowaną medycynę, kluczowe jest zrozumienie, w jaki sposób te powodujące chorobę mutacje BEST1 wpływają na funkcję i strukturę kanału BEST115. W tym celu badacze muszą uzyskać oczyszczone kanały bestrofiny (typu dzikiego i/lub zmutowanego) i przeprowadzić analizy in vitro5,8.
Pierwszym kluczowym krokiem jest ekspresja kanałów bestrofiny od wyższych gatunków w komórkach ssaków. Ponieważ transdukcja wirusa bakulowirusa komórek HEK293-F (system BacMam) jest potężną metodą heterologicznej ekspresji białek błonowych16,17, protokół ten wykorzystuje zoptymalizowany wektor BacMam (pEG BacMam) do solidnej ekspresji docelowego białka18, który w tym przypadku jest homologiem bestrofiny ssaków. Wektor ten został wykorzystany do ekspresji różnych białek błonowych, w tym receptorów sprzężonych z białkiem G, receptorów jądrowych i innych kanałów jonowych18. Istnieją również dowody na to, że wytworzone białka nadają się do krystalografii18. Przy wysokim poziomie ekspresji w komórkach HEK293-F białka można następnie oczyścić za pomocą chromatografii; W szczególności w przypadku bestrofinów można stosować zarówno chromatografię powinowactwa, jak i chromatografię wykluczającą wielkość.
Gdy ten protokół zostanie dopracowany dla kanału bestrofiny, oczyszczone białko może być następnie analizowane pod kątem jego funkcji i struktury odpowiednio za pomocą płaskiej dwuwarstwy lipidowej i krystalografii rentgenowskiej5,8. Podsumowując, techniki te zapewniają potężny potok do funkcjonalnych i strukturalnych badań bestrofiny i innych kanałów jonowych.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Naukowy</td><td>AC327265000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC446212500</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-500</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC301870010</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC197530010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Fisher Naukowy</td><td>AA4058704&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ63039MA</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ61188MB&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatyna A</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ20037MB</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek fenylometylosulfonylu</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC215740050</td><td></td></tr><tr><td>DDM zol</td><td>Anatrace</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>DDM anagrade</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM</td><td>ThermoFisher</td><td>10902179</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle średni</td><td>Spektrofotometr ThermoFisher</td><td>12338018</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator wysokociśnieniowy</td><td>Avestin</td><td>Emulsiflex-C5</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna HisTrap</td><td>GE</td><td>17-5248-01</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna Superdex-200</td><td>GE</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>AKTA Pure</td><td>GE</td><td>29018224</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-15 Filtry odśrodkowe</td><td>Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-4 Filtry odśrodkowe</td><td>Millipore</td><td>UFC810024</td> Ultra-0,5 Ultrawirówka Millipore UFC505024 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 Beckman</td><td>Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>Żel prefabrykowany Mini-PROTEAN</td><td>Bio-Rad</td><td>4561084</td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji PolyJet</td><td>Wektor SignaGen</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>pEG BacMam Otrzymany</td><td></td><td></td><td>z laboratorium Gouaux w Instytucie Vollum</td></tr></tbody></table>

ekspresja i oczyszczanie kanałów jonowych bestrofiny ssaków

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Ludzki genom koduje cztery paralogi bestrophin, a mianowicie BEST1, BEST2, BEST3 i BEST4. BEST1, kodowany przez gen BEST1, jest kanałem Cl- aktywowanym przez Ca2+ (CaCC), ulegającym ekspresji głównie w nabłonku barwnikowym siatkówki (RPE). Fizjologiczne i patologiczne znaczenie BEST1 podkreśla fakt, że ponad 200 odrębnych mutacji w genie BEST1 zostało genetycznie powiązanych ze spektrum co najmniej pięciu zaburzeń zwyrodnieniowych siatkówki, takich jak dystrofia plamki żółtej (choroba Best). Dlatego zrozumienie biofizyki kanałów bestrofiny na poziomie pojedynczej cząsteczki ma ogromne znaczenie. Jednak uzyskanie oczyszczonych kanałów jonowych ssaków jest często trudnym zadaniem. W tym miejscu przedstawiamy protokół ekspresji białek bestrofiny ssaków za pomocą systemu transferu genów bakulowirusa BacMam i ich oczyszczania za pomocą chromatografii powinowactwa i wykluczania wielkości. Oczyszczone białka mogą zostać wykorzystane w późniejszych analizach funkcjonalnych i strukturalnych, takich jak zapis elektrofizjologiczny w dwuwarstwach lipidowych i krystalografia. Co ważne, rurociąg ten może być przystosowany do badania funkcji i struktur innych kanałów jonowych.

Intensywność fluorescencji w przejściowo przetransfekowanych adhezyjnych komórkach HEK293 (Rysunek 1A) jest dobrym wskaźnikiem przewidywanego poziomu ekspresji białka w komórkach HEK293-F w zawiesinie (Rysunek 1B). Jeśli białko docelowe nie wykazuje dobrej ekspresji lub jest błędnie zlokalizowane w komórkach HEK293 po transfekcji przejściowej, zaleca się rozważenie modyfikacji konstruktu ekspresyjnego (np. zmianę pozycji...

Oczyszczanie kanałów jonowych jest często wyzwaniem, ale gdy już zostanie osiągnięte, może potencjalnie umożliwić badania in vitro funkcji i struktur kanałów. W tym miejscu opisujemy etapowe procedury ekspresji i oczyszczania białek bestrofiny ssaków, rodziny kanałów Cl- aktywowanych przezCa2+.

Ekspresja i oczyszczanie kanałów jonowych bestrofiny ssaków

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania związane z biofizyką kanałów jonowych ssaków, w tym między innymi rodziny kanałów jonowych bestrofin. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją stosować do innych typów kanałów jonowych i wytwarza kluczowe produkty dla różnych dalszych testów in vitro. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii bestrofinopatii, ponieważ testy z użyciem oczyszczonego białka przyczyniają się do naszej wiedzy na temat działania kanałów bestrofiny w siatkówce i jak mutacje w genie BEST1 powodują zwyrodnienie plamki żółtej.Dwadzieścia cztery godziny przed infekcją wirusową dodać równą objętość błękitu trypanowego do 15 mikrolitrów podwielokrotności hodowli komórek HEK293F i sprawdzić gęstość i żywotność komórek za pomocą hemocytometru pod mikroskopem. Po wykonaniu zliczania komórek, płytka 0,6 razy 10 do szóstych komórek na mililitr w objętości 500 mililitrów w każdej z dwóch jednorazowych dwulitrowych kolb. Umieść kolby w inkubatorze z wilgotnością 37 stopni Celsjusza z 8% dwutlenkiem węgla.Obróć kulturę na platformie orbitalnej z prędkością 135 obr./min. W dniu zakażenia należy sprawdzić gęstość komórek i żywotność 15 mikrolitr

expression-and-purification-of-mammalian-bestrophin-ion-channels

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niezawodna metoda wysokowydajnej ekspresji in vitro i następującego po niej zapisu elektrofizjologicznego rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w hodowlach ludzkich komórek embrionalnej nerki (HEK-293T).

Zoptymalizowana strategia transfekcji dla ekspresji i rejestracji elektrofizjologicznej rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w komórkach HEK-293T

Próby ekspresji regulatora przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie (CFTR) w Saccharomyces cerevisiae przynosiły dotychczas stosunkowo niskie ilości białka. Niniejszy protokół oraz powiązane z nim odczynniki dystrybuowane przez Cystic Fibrosis Foundation powinny umożliwić przygotowanie miligramowych ilości tego „trudnego” eukariotycznego białka błonowego.

Ekspresja i oczyszczanie białka regulatora przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie w Saccharomyces cerevisiae

Opisano procedury całkowitego odtworzenia prototypu kanału potasowego bramkowanego napięciem do błon lipidowych. Odtworzone kanały nadają się do testów biochemicznych, zapisów elektrycznych, badań przesiewowych ligandów i badań krystalograficznych elektronów. Metody te mogą mieć ogólne zastosowanie w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych innych białek błonowych.

Rekonstytucja kanału Kv do błon lipidowych w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych

Rozwój biotynylowalnych białek fuzyjnych ma wiele potencjalnych zastosowań w różnych dziedzinach badań. Inżynieria białek rekombinowanych to prosta procedura, która jest opłacalna, zapewniając wysoką wydajność niestandardowych białek.

Ekspresja, izolacja i oczyszczanie rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych białek biotynylowanych do regeneracji tkanki nerwowej

Opisana tutaj jest szybka i skuteczna procedura funkcjonalnego odtwarzania oczyszczonego dzikiego i zmutowanego białka CFTR, które zachowuje aktywność tego kanału chlorkowego, który jest wadliwy w mukowiscydozie. Wypływ jodku z odtworzonych proteoliposomów, w którym pośredniczy CFTR, umożliwia badanie aktywności kanałów i wpływu małych cząsteczek.

Pomiary funkcjonalnej rekonstytucji i aktywności kanałowej oczyszczonego białka CFTR typu dzikiego i zmutowanego

To jest szybki, efektywny kosztowo protokół produkcji wydzielanych, glikozylowanych białek ssaków i późniejszego jednoetapowego oczyszczania z wystarczającą wydajnością jednorodnego białka do krystalografii rentgenowskiej i innych badań biofizycznych.

Wydajna ekspresja komórek ssaków i jednoetapowe oczyszczanie zewnątrzkomórkowych glikoprotein do krystalizacji

Tutaj opisujemy metodę ekspresji i oczyszczania wysokiej jakości domen wystających (P) norowirusa (P) w E. coli do wykorzystania w badaniach krystalografii rentgenowskiej. Metoda ta może być stosowana do innych domen kaliciwirusa P, a także białek niestrukturalnych, tj. białka wirusa sprzężonego z genomem (VPg), proteazy i polimerazy RNA zależnej od RNA (RdRp).

Wytwarzanie wystających domen ludzkiego norowirusa w E. coli do krystalografii rentgenowskiej

Protokół tutaj opisuje interakcje oczyszczonego białka kanału jonowego hEAG1 z małocząsteczkowym ligandem lipidowym fosfatydyloinozytolem 4,5-bisfosforanem (2). Pomiar pokazuje, że BLI może być potencjalną metodą badań przesiewowych ligandów kanałów jonowych małych cząsteczek.

Uchwycenie kinetyki oddziaływania białka kanału jonowego z małymi cząsteczkami za pomocą testu interferometrii biowarstwowej

Ten protokół opisuje techniki używane do określania struktur kanałów jonowych za pomocą mikroskopii krioelektronowej, w tym system bakulowirusa używany do efektywnej ekspresji genów w komórkach ssaków przy minimalnym wysiłku i toksyczności, ekstrakcję białek, oczyszczanie i kontrolę jakości, przygotowanie siatki próbek i badanie przesiewowe, a także zbieranie i przetwarzanie danych.

Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Tutaj prezentujemy protokół do ekspresji, solubilizacji i oczyszczania kilku eukariotycznych transporterów boranu o homologii do rodziny transporterów SLC4 za pomocą drożdży. Opisujemy również chemiczny test sieciowania w celu oceny oczyszczonych białek homomerycznych pod kątem składania multimerycznego. Protokoły te można dostosować do innych trudnych białek błonowych.

Ekspresja, solubilizacja i oczyszczanie eukariotycznych transporterów boranu

Badania strukturalne i biochemiczne ludzkich transporterów błonowych wymagają miligramowych ilości stabilnego, nienaruszonego i jednorodnego białka. W tym miejscu opisujemy skalowalne metody badań przesiewowych, ekspresji i oczyszczania ludzkich transporterów nośników substancji rozpuszczonych przy użyciu genów zoptymalizowanych pod kątem kodonów.

Wysokoprzepustowa ekspresja i oczyszczanie ludzkich nośników substancji rozpuszczonych do badań strukturalnych i biochemicznych

Poznaj metodę ekspresji i oczyszczania kanałów jonowych bestrofiny ssaków w komórkach HEK293F. Technika ta umożliwia badania biofizyczne i strukturalne tych białek związanych z degeneracją plamki żółtej.

Ekspresja i oczyszczanie kanałów jonowych bestrofiny ssaków

Przeglądaj więcej filmów