Ekspresja i oczyszczanie kanałów jonowych bestrofiny ssaków

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania związane z biofizyką kanałów jonowych ssaków, w tym między innymi rodziny kanałów jonowych bestrofin. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją stosować do innych typów kanałów jonowych i wytwarza kluczowe produkty dla różnych dalszych testów in vitro. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii bestrofinopatii, ponieważ testy z użyciem oczyszczonego białka przyczyniają się do naszej wiedzy na temat działania kanałów bestrofiny w siatkówce i jak mutacje w genie BEST1 powodują zwyrodnienie plamki żółtej.

Dwadzieścia cztery godziny przed infekcją wirusową dodać równą objętość błękitu trypanowego do 15 mikrolitrów podwielokrotności hodowli komórek HEK293F i sprawdzić gęstość i żywotność komórek za pomocą hemocytometru pod mikroskopem. Po wykonaniu zliczania komórek, płytka 0,6 razy 10 do szóstych komórek na mililitr w objętości 500 mililitrów w każdej z dwóch jednorazowych dwulitrowych kolb. Umieść kolby w inkubatorze z wilgotnością 37 stopni Celsjusza z 8% dwutlenkiem węgla.

Obróć kulturę na platformie orbitalnej z prędkością 135 obr./min. W dniu zakażenia należy sprawdzić gęstość komórek i żywotność 15 mikrolitrów podwielokrotności kultury, tak jak poprzednio. Wysoka żywotność komórek, wynosząca ponad 95%, jest niezbędna do skutecznej infekcji i ekspresji białek.

Oczekiwana gęstość komórek wynosi około jednego razy 10 do szóstych komórek na mililitr, a oczekiwana całkowita liczba komórek wynosi około 1 razy 10 do dziewięciu. Dodaj bakulowirusa P3 do komórek przy wielokrotności infekcji wynoszącej pięć. Aby określić ilość wirusa do zaszczepienia, użyj równania pokazanego na ekranie.

Następnie inkubować zaszczepione komórki przez 24 godziny. Dwadzieścia cztery godziny później dodaj maślan sodu do końcowego stężenia 10 milimolów do każdej hodowli komórkowej i wróć do inkubatora ustawionego na 37 stopni Celsjusza lub 30 stopni Celsjusza na 48 godzin. Czterdzieści osiem godzin później sprawdź procent i jasność zielonych komórek, które bezpośrednio reprezentują białko pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Zbierz komórki, odwirowując 1 000 razy g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osady komórkowe za pomocą soli fizjologicznej buforowanej fosforanami do końcowej objętości około 80 mililitrów. Podziel zawiesinę każdej komórki na dwie 50-mililitrowe stożkowe probówki i wiruj przez 20 minut w temperaturze 1 000 g i czterech stopniach Celsjusza.

Aby rozpocząć procedurę oczyszczania białka, najpierw rozmrozić granulki komórek w mieszającej kąpieli wodnej o temperaturze pokojowej. Gdy granulki zostaną rozmrożone po 10 do 15 minutach, ponownie zawieś komórki w podwójnej objętości buforu A uzupełnionego inhibitorami proteinazy. Intensywnie pipetować w górę i w dół, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek.

Lizować komórki za pomocą homogenizatora wysokociśnieniowego. Przepuść zawiesinę komórek przez homogenizator przy siedmiu do 10 megapaskalach trzy do czterech razy, aby uzyskać pełną homogenizację. Utrzymuj lizat komórkowy na lodzie przez dwie do trzech minut między rundami.

Dodaj detergent do lizatu komórkowego. Inkubować z mieszaniem przez godzinę w temperaturze 20 stopni Celsjusza w celu ekstrakcji białek błonowych. Po inkubacji odwirować lizat komórkowy w temperaturze 150 000 g w ultrawirówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę.

Po odwirowaniu klarowny lizat komórkowy zostanie umieszczony między osadem na dole a mętną warstwą na górze. Użyj 10-mililitrowej pipety transferowej, aby ostrożnie zebrać klarowny lizat, a następnie zmień na pipetę o pojemności jednego mililitra na ostatnie kilka mililitrów lizatu. Nałóż lizat na pięciomililitrową kolumnę powinowactwa niklu NTA HisTrap wstępnie zrównoważoną buforem A. Następnie umyj kolumnę 25 mililitrami buforu B, a następnie 40 mililitrami buforu C. W tym miejscu można wstrzymać protokół.

Białko pozostanie stabilne, gdy zostanie podłączone do kolumny przez noc. Po umyciu przymocować kolumnę do systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek i rozcieńczyć białko z kolumny 13 mililitrami buforu D z frakcjonowaniem. Zebrać frakcje wzbogacone w białko zgodnie z odczytem absorbancji UV.

Zmierzyć stężenie eluowanego produktu białkowego na spektrofotometrze mikroobjętościowym, odczytując absorbancję przy 280 nanometrach. Aby usunąć znacznik GFP10x, dodaj proteazę TEV w stosunku masowym jeden do jednego i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Skoncentrować białko do końcowej objętości od 400 do 500 mikrolitrów za pomocą 15-mililitrowej jednostki filtra odśrodkowego, wirując z prędkością 4 000 razy g w wirówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza w zmiennych odstępach czasu, począwszy od 10 minut.

Przenieś skoncentrowane białko do czystej probówki o pojemności 1,5 mililitra i usuń wszelkie osady lub pęcherzyki ze skoncentrowanego produktu. Wirować z prędkością 12 000 g przez pięć do 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Użyj jednomililitrowej strzykawki i igły z okrągłą końcówką, aby załadować produkt końcowy do systemu FPLC do chromatografii wykluczania wielkości z kolumną wykluczającą wielkość wstępnie zrównoważoną buforem E. Dobrze zachowujące się białka działają jako pojedynczy pik.

Zbierz frakcję białkową lub wiele frakcji, które odpowiadają temu pikowi. Zagęścić białko za pomocą czteromililitrowej lub 0,5-mililitrowej jednostki filtra odśrodkowego o tej samej masie cząsteczkowej, co poprzednio używana. Wirować 4 000 razy g w czterech stopniach Celsjusza do końcowego stężenia od pięciu do 10 mikrogramów na mikrolitr.

Użyj spektrofotometru, aby sprawdzić stężenie produktu końcowego. Intensywność fluorescencji obserwowana w przejściowo transfekowanych adhezyjnych komórkach HEK293 jest dobrym wskaźnikiem przewidywanego poziomu ekspresji białka w zawieszonych komórkach HEK293F pokazanych tutaj. Na udane oczyszczanie wskazuje pojedynczy główny pik o oczekiwanej objętości rozcieńczenia w chromatografii wykluczającej wielkość i pojedyncze dominujące prążki na zdenaturowanym żelu stronicowym SDS.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby podczas oczyszczania trzymać wszystko na lodzie, a w przypadku wykonywania wielu oczyszczań w tym samym czasie często zmieniać rękawice i uważać, aby nie zanieczyścić próbek. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak krystalografia rentgenowska i testy dwuwarstwowe lipidów, aby odpowiedzieć na ważne pytania, takie jak relacje funkcji struktury. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się dziedzicznymi chorobami siatkówki do zbadania przyczyn bestrofinopatii na poziomie molekularnym.