Test koimmunoprecypitacji z wykorzystaniem endogennych białek jądrowych z komórek hodowanych w warunkach niedotlenienia

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie hipoksji, takie jak endogenne i natywne interakcje między czynnikami transkrypcyjnymi i ich koregulatorami transkrypcyjnymi w warunkach niedotlenienia. Główną zaletą tej techniki jest to, że niedotlenione komórki są zbierane w warunkach niedotlenienia, a frakcje jądrowe są wykorzystywane do koimmunoprecypitacji. Protokół ten wykorzystuje ludzkie embrionalne komórki nerkowe 293A wyhodowane w czterech 10-centymetrowych szalkach.

Wysiewaj trzy do pięciu razy od 10 do szóstych komórek na naczynie w 10 mililitrach zmodyfikowanej pożywki Eagle's firmy Dulbeco uzupełnionej 10% FBS, L-glutaminą, pirogronianem sodu, penicyliną i streptomycyną. Hoduj komórki w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dwadzieścia cztery godziny po wysiewie, gdy komórki osiągną 80 do 90% zbieżności, umieść dwie szalki w komorze podciśnienia w komorze rękawicowej inkubatora z 1% tlenem i 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza na cztery godziny.

Pozostałe dwie potrawy trzymaj w normoxii. W dniu poprzedzającym pobranie komórek poddanych hipoksji należy wstępnie zrównoważyć DPBS do warunków niedotlenienia, umieszczając odkrytą 100-mililitrową szklaną butelkę z odczynnikiem eksperymentalnym wypełnioną DPBS w podkomorze hipoksji na 24 godziny. Na około godzinę przed pobraniem komórek należy umieścić pojemnik na lód zawierający lód w komorze przetwarzania w komorze rękawicowej, która została zrównoważona z 1% tlenu i 5% dwutlenku węgla.

Przenieść butelkę zawierającą wstępnie zrównoważony hipoksyjny DPBS z podkomory hipoksji do komory procesowej i umieścić ją na lodzie. Cztery godziny po zabiegu hipoksji przenieś komórki z podkomory hipoksji do komory roboczej, która została wstępnie zrównoważona z 1% tlenu i 5% dwutlenkiem węgla. Usunąć pożywkę hodowlaną przez aspirację i za pomocą 10-mililitrowej pipety przepłukać komórki raz 10 mililitrami lodowatego, wstępnie zbalansowanego, hipoksyjnego DPBS.

Za pomocą pięciomililitrowej pipety dodaj 5 mililitrów lodowatego, wstępnie zbalansowanego DPBS i usuń komórki, zeskrobując je skrobakiem do komórek. Przechylić płytkę do hodowli komórkowej, zebrać oderwane komórki za pomocą 10-mililitrowej pipety i przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Trzymaj probówkę z komórkami na lodzie.

Otwórz drzwi między komorą procesową i komorą buforową w komorze rękawicowej, z których obie zostały wstępnie zrównoważone z 1% tlenu i 5% dwutlenkiem węgla. Przenieść 15-mililitrowe stożkowe probówki na lodzie zawierające komórki poddane hipoksji z komory przetwarzania do komory buforowej. Otworzyć drzwi komory buforowej i całkowicie wyjąć ogniwa ze schowka podręcznego.

Osadzać zarówno komórki niedotlenione, jak i komórki normoksyczne przez odwirowanie w temperaturze 1000 razy g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Do tej procedury zostanie użyty zestaw do ekstrakcji jądrowej. Zacznij od delikatnego ponownego zawieszenia każdej komórki w 500 mikrolitrach buforu do lizy NL, uzupełnionego koktajlem inhibitorów proteazy 1X w 0,1 molowym DTT, kilkakrotnie pipetując w górę iw dół.

Dodaj 25 mikrolitrów roztworu detergentu NP do zawiesiny komórek i wiruj przez 10 sekund z maksymalną prędkością. Wirować 1000 razy 10 g w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Zachowaj zarówno supernatant, jak i pastylkę jądrową.

Po zebraniu i przechowywaniu supernatantu zgodnie z opisem w protokole tekstowym, ponownie zawieś jądra komórkowe zawierające osady w 500 mikrolitrach buforu do lizy NL, uzupełnionego koktajlem inhibitora proteazy 1X i 0,1 molowym DTT przez wirowanie przez pięć sekund z maksymalną prędkością. Ponownie zawiesić osad jądrowy w 50 mikrolitrach buforu ekstrakcyjnego NX1, uzupełnionego koktajlem inhibitora proteazy 1X, kilkakrotnie pipetując osad w górę iw dół. Inkubować na lodzie przez 30 minut.

Co pięć minut wiruj przez 10 sekund z maksymalną prędkością. Wirować przy 12 000 x g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Zebrać supernatant i przenieść do mini urządzeń do dializy o maksymalnej objętości 100 mikrolitrów na jednostkę w celu odsalania.

Zakryj mini urządzenia do dializy i umieść je w urządzeniu do flotacji. Umieścić urządzenie flotacyjne w zlewce zawierającej 500 mililitrów wstępnie schłodzonego buforu do dializy. Należy uważać, aby unikać bezpośredniego kontaktu ze skórą lub wdychania buforu do dializy, ponieważ zawiera on PMSF.

Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie mieszając przez 30 minut. Po 30 minutach zbierz próbki z rogu mini urządzeń do dializy i przenieś do nowych 1,5-mililitrowych probówek do mikrowirówek. Wirować 12 tysięcy razy g w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut.

Porcję 25 mikrolitrów każdego supernatantu do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mikrolitra i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Przygotować kulki sefarozy białkowej AG do użycia w immunoprecypacji. Odpipetować 50 mikroliter kulek do każdej z czterech 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych i dodać 500 mikrolitrów buforu DPBS na probówkę.

Granulki osadzać przez odwirowanie. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić kulki w 100 mikrolitrach buforu TBS. Dodać dwa mikrolitry mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-ARNT lub mysiej immunoglobuliny G, która została przygotowana przez rozpuszczenie 0,7 miligrama mysiej IgG w 500 mikrolitrach buforu TBS.

Probówki do mikrowirówek zawierające kulki należy przenieść do chłodni. Umieść je w rotatorze probówki i inkubuj z prędkością 10 obr./min przez dwie godziny. Po dwóch godzinach osadki osadkować przez odwirowanie i wyrzucić supernatanty.

Rozcieńczyć 200 mikrogramów przygotowanego wcześniej lizatu białka jądrowego w 800 mikrolitrach buforu immunoprecypitacyjnego. Inkubować lizat z kulkami sprzężonymi z przeciwciałami w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia granulki osadzać przez odwirowanie w ilości 3000 razy g przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odrzucić supernatant. Dodaj jeden mililitr lodowatego TBS zawierającego 0,2% NP-40 do każdej probówki i odwiruj. W ten sposób umyj koraliki trzykrotnie lodowatym TBS zawierającym 0,2% NP-40.

Gotuj kulki w 50 mikrolitrach buforu do próbek Laemmli w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Odwiruj kulki 10 tysięcy razy g w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Zebrać supernatant i wyrzucić koraliki.

Poziomy ekspresji w lokalizacji subkomórkowej składników kompleksu HIF-1 po leczeniu hipoksją badano w HEK293A komórkach. Zgodnie z oczekiwaniami, całkowite poziomy HIF-1a były regulowane w górę przez niedotlenienie, podczas gdy poziomy ARNT w całkowitych lizatach komórkowych nie uległy znaczącym zmianom. Ponadto niedotlenienie indukowało akumulację jądrową zarówno HIF-1a, jak i ARNT.

Eksperymenty z koimmunoprecypitacją przeprowadzono przy użyciu ekstraktów jądrowych z komórek HEK293A wystawionych na warunki normoksyjne lub niedotlenione. Jak pokazano tutaj, HIF-1a był koimmunoprecypitowany razem z ARNT z ekstraktów jądrowych niedotlenionych komórek HEK293A, co wskazuje, że HIF-1a oddziałuje z ARNT w warunkach niedotlenienia. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się hipoksją do zbadania interakcji endogennych białek jądrowych i ich warunków niedotlenienia.