Name: Test koimmunoprecypitacji z wykorzystaniem endogennych białek jądrowych z komórek hodowanych w warunkach niedotlenienia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Poznaj metodę koimmunoprecypitacji endogennych białek jądrowych w warunkach niedotlenienia przy użyciu komórek HEK293A. Technika ta pozwala badać natywne interakcje czynników transkrypcyjnych z koregulatorami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy prof. Sin Tiong za korzystanie ze stacji roboczej do hipoksji. Prace te były wspierane przez: Ministerstwo Edukacji Singapuru, MOE 1T1-02/04 i MOE2015-T2-2-087 (do Y.A.), Lee Kong Chian School of Medicine, M4230003 grantu na start na Uniwersytecie Technologicznym Nanyang (dla P.O.B.), Szwedzka Rada ds. Badań Naukowych, Fundacja Rodziny Erling-Persson, Fundacja Novo Nordisk, Fundacja Stichting af Jochnick, Szwedzkie Stowarzyszenie Diabetologiczne, Scandia Insurance Company, Diabetes Research and Wellness Foundation, Fundacja Bertha von Kantzowa, Strategiczny Program Badawczy w Cukrzycy w Karolinska Institutet, ERC ERC-2013-AdG 338936-Betalmage oraz Fundacja Knuta i Alice Wallenbergów.

Ta sekcja protokołu, która wykorzystuje ludzką embrionalną komórkę nerki 293A (HEK293A), jest zgodna z wytycznymi komisji etyki badań na ludziach na Uniwersytecie Technologicznym Nanyang w Singapurze.
1. Indukcja niedotlenienia w komórkach HEK293A
<ol>
	<li>Przygotuj cztery 10-centymetrowe szalki i wysiej 3–5 x 106 HEK293A komórek na talerzu w 10 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's Dulbecco (DMEM, 4,5 g/l glukozy) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM L-glutaminy, 110 mg/l pirogronianu sodu, 100 U/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny. Hodować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 . 
	UWAGA: Wysiew komórek powinien być przeprowadzany w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC). Powierzchnie wszystkich materiałów, które mają być umieszczone w BSC, należy przetrzeć 70% etanolem.</li>
	<li>24 godziny po wysianiu, gdy komórki osiągną zbieżność 80–90%, umieścić dwie szalki w komorze podbrzusza inkubatora w komorze rękawicowej inkubatora (patrz tabela materiałów) z 1%O2 i 5% CO2 w temperaturze 37 °C, a pozostałe dwie szalki przechowywać w temperaturze normoksji (21%O2, 5% CO2 w temperaturze 37 °C) przez 4 godziny. Użyj jednego zestawu komórek normoksycznych i niedotlenionych do oceny leczenia hipoksji za pomocą Western blot i wykorzystaj drugi zestaw komórek do eksperymentów z koimmunoprecypitacją. 
	UWAGA: Poziom tlenu można ustawić na poziomie 0–5%, a czas trwania leczenia hipoksji można zmieniać w zależności od typu komórki i celu badania.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja całych komórek i jądra
UWAGA: Zobacz Tabelę 1, aby uzyskać informacje na temat używanych w tym protokole.
<ol>
	<li>Zbierz komórki kontrolne normoksji.
	<ol>
		<li>Usunąć pożywkę hodowlaną przez aspirację i przepłukać komórki 10 ml DPBS (pH 7,0–7,2) za pomocą pipety 10 mL. 
		UWAGA: Unikaj dotykania pipetą monowarstwy komórek. Podczas mycia delikatnie odpipetuj DPBS w dół ścianki płytki do hodowli komórkowej, aby uniknąć utraty komórek.</li>
		<li>Odpipetować 5 ml lodowatego DPBS do płytki i zeskrobać komórki z powierzchni płytki w lodowatym PBS za pomocą skrobaka do komórek.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę komórkową do stożkowych probówek o pojemności 15 ml i przechowywać na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zebrać komórki hodowane w warunkach niedotlenienia.
	<ol>
		<li>Wstępnie zrównoważyć DPBS do warunków hipoksji, umieszczając odkrytą szklaną butelkę z odczynnikiem o pojemności 100 ml wypełnioną DPBS w podkomorze hipoksji (1 %O2 i 5 % CO2 w temperaturze 37 °C) na 24 godziny wcześniej.</li>
		<li>Około 1 godzinę przed pobraniem komórek poddanych działaniu hipoksji należy umieścić pojemnik na lód zawierający lód w komorze przetwarzania w komorze rękawicowej, która została zrównoważona z 1%O2 i 5% CO2 . Przenieść butelkę zawierającą wstępnie zrównoważony hipoksyjny DPBS z podkomory hipoksji do komory procesowej i umieścić ją na lodzie.</li>
		<li>Po 4 godzinach od zabiegu hipoksji przenieść komórki z podkomory hipoksji do komory roboczej, która została wstępnie zrównoważona z 1%O2 i 5% CO2 .</li>
		<li>Usunąć pożywkę hodowlaną przez aspirację i przepłukać komórki raz 10 ml lodowatego, wstępnie zbalansowanego, hipoksyjnego DPBS za pomocą pipety o pojemności 10 ml.</li>
		<li>Dodać 5 ml lodowatego, wstępnie zbalansowanego DPBS za pomocą pipety o pojemności 5 ml i usunąć komórki przez skrobanie za pomocą skrobaka do komórek.</li>
		<li>Przechylić płytkę do hodowli komórkowej i zebrać oderwane komórki za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Przenieść zawiesinę komórek w DPBS do stożkowych probówek o pojemności 15 ml i przechowywać na lodzie.</li>
		<li>Otworzyć drzwi między komorą przetwarzania i komorą buforową komory rękawicowej, z których obie zostały wstępnie zrównoważone z 1% O2 i 5% CO2 . Przenieść stożkowe probówki o pojemności 15 ml na lodzie zawierające komórki poddane działaniu hipoksji z komory przetwarzania do komory buforowej. Otworzyć drzwi komory buforowej i całkowicie wyjąć ogniwa ze schowka podręcznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadzać zarówno komórki normoksyczne z 2,1, jak i komórki niedotlenione z 2,2 przez odwirowanie przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj ekstrakty z całych komórek.
	<ol>
		<li>Zawiesić osady komórkowe w 500 μl lodowatego buforu do lizy testu immunoprecypitacji radiowej (RIPA) zawierającego 50 mM chlorowodorku trisaminometanu (Tris-HCl) pH 8,0, 150 mM chlorku sodu (NaCl), 1% NP-40 typu tergitolu (NP-40), 0,5% deoksycholanu sodu i 0,1% dodecylosiarczanu sodu (SDS), uzupełnionego 1x koktajlem inhibitorów proteazy (patrz Tabela materiałów), kilkakrotnie pipetując granulki komórek w górę iw dół.</li>
		<li>Przenieś lizaty komórkowe do nowych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i trzymaj na lodzie przez 30 minut, od czasu do czasu wirując.</li>
		<li>Odwirować lizaty komórkowe przy 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zebrać sklarowany nad osadem, podwielokrotność 50 μl supernatantu do probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować ekstrakty jądrowe za pomocą zestawu do ekstrakcji jądrowej (patrz tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Delikatnie ponownie zawiesić granulki komórkowe w 500 μl buforu do lizy NL uzupełnionego 1x koktajlem inhibitorów proteazy i 0,1 M ditiotreitolem (DTT), kilkakrotnie pipetując granulki komórek w górę iw dół.</li>
		<li>Dodać 25 μl roztworu detergentu NP do zawiesiny komórek i wirować przez 10 s z maksymalną prędkością.</li>
		<li>Wirować przy 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zebrać sklarowany nad osadem (ekstrakty cytoplazmatyczne), podatkować 50 μl supernatantu do probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Zawiesić osad zawierający jądra komórkowe w 500 μl buforu do lizy NL uzupełnionego 1x koktajlem inhibitorów proteazy i 0,1 M DTT poprzez wirowanie przez 5 s z maksymalną prędkością.</li>
		<li>Wirować przy 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i zachować pastylkę jądrową.</li>
		<li>Zawiesić pastylkę jądrową w 50 μl buforu ekstrakcyjnego NX1 uzupełnionego koktajlem 1x inhibitora proteazy, kilkakrotnie pipetując osad w górę iw dół.</li>
		<li>Inkubować przez 30 minut na lodzie, wirując przez 10 s co 5 minut z maksymalną prędkością.</li>
		<li>Wirować przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odsolić ekstrakty jądrowe.
	<ol>
		<li>Zebrać supernatant z kroku 2.5.9 i przenieść do miniurządzeń do dializy o maksymalnej objętości 100 μl na jednostkę.</li>
		<li>Zakryj mini urządzenia do dializy i umieść je w urządzeniu do flotacji.</li>
		<li>Umieścić urządzenie flotacyjne w zlewce zawierającej 500 ml wstępnie schłodzonego buforu do dializy (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 20% glicerolu, 100 mM chlorku potasu (KCl), 0,2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 0,2 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) i 0,5 mM DTT) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając. 
		Uwaga: PMSF jest niebezpieczny. Unikać bezpośredniego kontaktu ze skórą lub wdychania.</li>
		<li>Pobrać próbki z rogu mini urządzeń do dializy i przenieść do nowych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Wirować przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, podatkować 25 μl każdego supernatantu do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ocena leczenia niedotlenienia poprzez wykrycie ekspresji białka i subkomórkowej lokalizacji HIF-1α
<ol>
	<li>Określić stężenie białka w całej komórce lub ekstraktach jądrowych/cytoplazmatycznych za pomocą testu mikropłytki zestawu do oznaczania białek z kwasem bicinchoninowym (BCA) zgodnie z instrukcjami producenta18.</li>
	<li>Rozcieńczyć lizaty komórkowe w 1x bufor do próbek Laemmli zawierający 5% 2-merkaptoetanolu i gotować w temperaturze 95 °C przez 5 min. 
	Uwaga: Nie dotykaj powierzchni bloku grzewczego, ponieważ może to spowodować oparzenia.</li>
	<li>Oddzielić białka za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE).
	<ol>
		<li>Załaduj równe ilości białka (25 μg) do każdej studzienki prefabrykowanych żeli gradientowych SDS-PAGE (4–20%) wraz z 3 μl markera masy cząsteczkowej.</li>
		<li>Uruchom żel w buforze roboczym zawierającym 2,5 mM Tris, 19,2 mM glicyny, 0,01% SDS, PH8,3 przez 30 minut przy 200 V.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś białka z żelu do błony nitrocelulozowej.
	<ol>
		<li>Zmontuj kanapkę transferową (bibuła filtracyjna-żel-membrana-bibuła filtracyjna) z żelem po stronie anody i membraną po stronie katody kasety.</li>
		<li>Umieść kasetę w zbiorniku transferowym wypełnionym buforem transferowym zawierającym 2.5 mM trisaminometan (Tris), 19.2 mM glicynę i 20% metanolu. 
		UWAGA: Metanol jest łatwopalny i powinien być przechowywany w szafie do przechowywania cieczy łatwopalnych.</li>
		<li>Przenoszenie należy przeprowadzać przez 1 godzinę przy napięciu 100 V w chłodni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zablokować blot w 10 ml buforze blokującym zawierającym 50 mM Tris-Cl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,1 Tween 20 i 5% mleka beztłuszczowego przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na shakerze.</li>
	<li>Inkubować blot z przeciwciałem anty-HIF-1α (rozcieńczenie 1/500) w tym samym buforze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyj blot 3 razy przez 5 minut za każdym razem 50 ml TBS-T.</li>
	<li>Inkubować blot z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) (rozcieńczenie 1/1 000) w 10 ml TBS-T zawierającego 5% odtłuszczonego mleka w proszku przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj blot 3 razy przez 5 minut za każdym razem 50 ml TBS-T.</li>
	<li>Wymieszać po 500 μl odczynników A i B o zwiększonej chemiluminescencji (ECL) w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i krótko przemieszać.</li>
	<li>Nanieść substrat ECL na blot i inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przechwytywanie sygnałów chemiluminescencyjnych za pomocą systemu obrazowania opartego na kamerze ze sprzężeniem ładunkowym (CCD).
	<ol>
		<li>Nadmiar podłoża ECL należy odsączyć, dotykając krawędzi membrany bibułką i umieścić membranę w osłonie arkusza.</li>
		<li>Umieść membranę na tacy na próbkę systemu obrazowania opartego na kamerze CCD.</li>
		<li>Uruchom oprogramowanie do przetwarzania obrazu (patrz Spis materiałów) i przechwyć obrazy z następującymi ustawieniami: Plik → Nowy protokół → Konfiguracja protokołu jednokanałowego → → Obrazowanie żelowe (Zastosowanie: Chemi; Obszar obrazowania: żel Bio-Rad Ready; Obrazowanie Ekspozycja: Oprogramowanie automatycznie zoptymalizuje czas ekspozycji dla intensywnych pasm) → Uruchom protokół 
		UWAGA: Czas naświetlania można ustawić ręcznie, aby uzyskać optymalne obrazy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Immunoprecypitacja i wykrywanie białek immunoprecypitowanych
<ol>
	<li>Przemyć 50 μl kulek białka A/G sefarozy w 500 μl buforu TBS w 1,5 ml probówek do mikrowirówek i granulować kulki przez odwirowanie przy 3 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić kulki w 100 μl buforu TBS.</li>
	<li>Dodać 2 μl mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-ARNT (1,4 mg/ml) lub mysiej immunoglobuliny G (IgG) (1,4 mg/ml), która została przygotowana przez rozpuszczenie 0,7 mg mysiej IgG w 500 μl buforu TBS.</li>
	<li>Umieścić probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml zawierające kulki w rotatorze probówek i inkubować przez 2 godziny z prędkością 10 obr./min w chłodni. 
	UWAGA: Z rurkami należy obchodzić się delikatnie i utrzymywać zawiesinę zawierającą koraliki na dnie tubki.</li>
	Granulki osadzać <li>przez odwirowanie w temperaturze 3 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatanty.</li>
	<li>Rozcieńczyć 200 μg jądrowego lizatu białkowego otrzymanego w kroku 2.6.5 w 800 μl buforu IP składającego się z 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 180 mM NaCl, 20% glicerolu, 0,2% NP-40 i 1x koktajlu inhibitorów proteazy. Inkubować lizat z kulkami sprzężonymi z przeciwciałami, otrzymanymi w kroku 4.5, przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	Granulki osadzać <li>przez odwirowanie w stężeniu 3 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatanty i przemyć kulki 3 razy 1 ml lodowatego TBS zawierającego 0,2% NP-40.</li>
	<li>Gotować kulki w 50 μl buforu do próbek Laemmli w temperaturze 95 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Odwirować kulki w temperaturze 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, zebrać supernatant i wyrzucić kulki. 
	UWAGA: Supernatant może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez krótki czas lub -20 °C przez długi czas.</li>
	<li>Wykryj obecność HIF-1α w immunoprecypitowanych kompleksach białkowych za pomocą western blot, jak opisano wcześniej w kroku 3.3 i następnych. 
	UWAGA: Na tym etapie nie jest wymagane oznaczanie ilościowe białka. Załadować pełną objętość (50 μl) supernatantu z każdej próbki do każdego dołka prefabrykowanych żeli gradientowych SDS-PAGE (4–20%)</li>
</ol>

<ol><li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factors+in+physiology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine.</a> Cell. 148 (3), 399-408 (2012).</li>
<li>Bartels, K., Grenz, A., Eltzschig, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+inflammation+are+two+sides+of+the+same+coin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and inflammation are two sides of the same coin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18351-18352 (2013).</li>
<li>Jiang, B. H., Rue, E., Wang, G. L., Roe, R., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimerization%2C+DNA+binding%2C+and+transactivation+properties+of+hypoxia-inducible+factor+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1.</a> J Biol Chem. 271 (30), 17771-17778 (1996).</li>
<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIF-1%3A+mediator+of+physiological+and+pathophysiological+responses+to+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia.</a> J Appl Physiol. 88 (4), 1474-1480 (2000).</li>
<li>Kallio, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+in+hypoxic+cells%3A+Inducible+nuclear+translocation+and+recruitment+of+the+CBP%2Fp300+coactivator+by+the+hypoxia-inducible+factor-1alpha%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Signal transduction in hypoxic cells: Inducible nuclear translocation and recruitment of the CBP/p300 coactivator by the hypoxia-inducible factor-1alpha.</a> EMBO J. 17 (22), 6573-6586 (1998).</li>
<li>Ke, Q., Costa, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16887934">Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1).</a> Mol Pharmacol. 70 (5), 1469-1480 (2006).</li>
<li>Gustafsson, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+requires+notch+signaling+to+maintain+the+undifferentiated+cell+state%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state.</a> Dev Cell. 9 (5), 617-628 (2005).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+factor+inhibiting+HIF-1+defines+an+additional+mode+of+cross-coupling+between+the+Notch+and+hypoxia+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interaction with factor inhibiting HIF-1 defines an additional mode of cross-coupling between the Notch and hypoxia signaling pathways.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3368-3373 (2008).</li>
<li>D'Ignazio, L., Bandarra, D., Rocha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB+and+HIF+crosstalk+in+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB and HIF crosstalk in immune responses.</a> FEBS J. 283 (3), 413-424 (2016).</li>
<li>Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor+1+is+a+basic-helix-loop-helix-PAS+heterodimer+regulated+by+cellular+O2+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (12), 5510-5514 (1995).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+regulation+of+degradation+of+hypoxia-inducible+factor+1+alpha%3A+Role+of+subcellular+compartmentalization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific regulation of degradation of hypoxia-inducible factor 1 alpha: Role of subcellular compartmentalization.</a> Mol Cell Biol. 26 (12), 4628-4641 (2006).</li>
<li>Depping, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+translocation+of+hypoxia-inducible+factors+%28HIFs%29%3A+involvement+of+the+classical+importin+alpha%2Fbeta+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Nuclear translocation of hypoxia-inducible factors (HIFs): involvement of the classical importin alpha/beta pathway.</a> Biochim Biophys Acta. 1783 (3), 394-404 (2008).</li>
<li>Wei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+induces+oncogene+yes-associated+protein+1+nuclear+translocation+to+promote+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+invasion+via+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Tumour+Biol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia induces oncogene yes-associated protein 1 nuclear translocation to promote pancreatic ductal adenocarcinoma invasion via epithelial-mesenchymal transition.</a> Tumour Biol. 39 (5), (2017).</li>
<li>Chang, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+promotes+nuclear+translocation+and+transcriptional+function+in+the+oncogenic+tyrosine+kinase+RON%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Hypoxia promotes nuclear translocation and transcriptional function in the oncogenic tyrosine kinase RON.</a> Cancer Res. 74 (16), 4549-4562 (2014).</li>
<li>Moriya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+nature+of+overexpression+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative nature of overexpression experiments.</a> Mol Biol Cell. 26 (22), 3932-3939 (2015).</li>
<li>Prelich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+overexpression%3A+Uses%2C+mechanisms%2C+and+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene overexpression: Uses, mechanisms, and interpretation.</a> Genetics. 190 (3), 841-854 (2012).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Notch-independent+mechanism+contributes+to+the+induction+of+Hes1+gene+expression+in+response+to+hypoxia+in+P19+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A Notch-independent mechanism contributes to the induction of Hes1 gene expression in response to hypoxia in P19 cells.</a> Exp Cell Res. 358 (2), 129-139 (2017).</li>
<li>Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+quantitative+assays+for+detection+and+characterization+of+protein+antimicrobials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials.</a> J Vis Exp. (110), e53819(2016).</li>
<li>Chilov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+nuclear+translocation+of+hypoxia-inducible+factor-1+%28HIF-1%29%3A+heterodimerization+with+ARNT+is+not+necessary+for+nuclear+accumulation+of+HIF-1alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Induction and nuclear translocation of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1): heterodimerization with ARNT is not necessary for nuclear accumulation of HIF-1alpha.</a> J Cell Sci. 112 (Pt 8), 1203-1212 (1999).</li>
<li>Yin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arylsulfonamide+KCN1+inhibits+in+vivo+glioma+growth+and+interferes+with+HIF+signaling+by+disrupting+HIF-1alpha+interaction+with+cofactors+p300%2FCBP%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Arylsulfonamide KCN1 inhibits in vivo glioma growth and interferes with HIF signaling by disrupting HIF-1alpha interaction with cofactors p300/CBP.</a> Clin Cancer Res. 18 (24), 6623-6633 (2012).</li>
<li>Holmquist-Mengelbier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+HIF-1alpha+and+HIF-2alpha+to+common+target+genes+is+differentially+regulated+in+neuroblastoma%3A+HIF-2alpha+promotes+an+aggressive+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Recruitment of HIF-1alpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2alpha promotes an aggressive phenotype.</a> Cancer Cell. 10 (5), 413-423 (2006).</li>
<li>Koh, M. Y., Powis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passing+the+baton%3A+The+HIF+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Passing the baton: The HIF switch.</a> Trends Biochem Sci. 37 (9), 364-372 (2012).</li>
<li>Dumetz, A. C., Snellinger-O'brien, A. M., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+protein+protein+interactions+in+salt+solutions+and+implications+for+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Patterns of protein protein interactions in salt solutions and implications for protein crystallization.</a> Protein Sci. 16 (9), 1867-1877 (2007).</li>
<li>Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+endothelial+cell+glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase+expression+by+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia.</a> J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).</li>
<li>Caradec, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desperate+house+genes%27%3A+The+dramatic+example+of+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Desperate house genes': The dramatic example of hypoxia.</a> Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Kompleks HIF-1 jest głównym regulatorem homeostazy tlenu komórkowego i reguluje mnóstwo genów zaangażowanych w różne komórkowe reakcje adaptacyjne na niedotlenienie. Identyfikacja nowych białek oddziałujących z HIF-1 jest ważna dla zrozumienia hipoksyjnej transdukcji sygnału. Eksperymenty z koimmunoprecypitacją są powszechnie stosowane w badaniach IPP w celu wyznaczenia szlaków transdukcji sygnału komórkowego. Jednak nadekspresja białek jest nadal szeroko stosowana, co może prowadzić do eksperymentalnych artefaktów. Pona...

Niedotlenienie występuje, gdy do komórek i tkanek ciała dostarczana jest niewystarczająca ilość tlenu. Odgrywa kluczową rolę w różnych procesach fizjologicznych i patologicznych, takich jak różnicowanie komórek macierzystych, stany zapalne i nowotwory1,2. Czynniki indukowane hipoksją (HIF) działają jako heterodimery złożone z regulowanej tlenem podjednostki α i konstytutywnie wyrażonej podjednostki β, znanej również jako ARNT3. Do tej pory zidentyfikowano trzy izoformy podjednostek HIF-α (HIF-1α, HIF-2α i HIF-3α) oraz trzy podjednostki HIF-β (ARNT/HIF-1β, ARNT2 i ARNT3). HIF-1α i ARNT są powszechnie wyrażane, podczas gdy HIF-2α, HIF-3α, ARNT2 i ARNT3 mają bardziej ograniczone wzorce ekspresji4. Kompleks białkowy HIF-1 jest kluczowym regulatorem odpowiedzi na niedotlenienie. W warunkach niedotlenienia HIF-1α stabilizuje się, a następnie przemieszcza się do jądra i dimeryzuje z ARNT5. Następnie kompleks ten wiąże się ze specyficznymi nukleotydami znanymi jako elementy reagujące na hipoksję (HRE) i reguluje ekspresję docelowych genów zaangażowanych w różne procesy, w tym angiogenezę, erytropoezę i glikolizę6. Oprócz tej "kanonicznej" odpowiedzi, szlak sygnalizacji niedotlenienia jest również znany z tego, że komunikuje się z wieloma szlakami sygnałowymi odpowiedzi komórkowej, takimi jak Notch i czynnik jądrowy-kappa B (NF-κB)7,8,9.
Identyfikacja nowych białek oddziałujących z HIF-1 jest ważna dla lepszego zrozumienia szlaku sygnalizacji niedotlenienia. W przeciwieństwie do ARNT, który jest niewrażliwy na poziom tlenu i ulega konstytutywnej ekspresji, poziomy białka HIF-1α są ściśle regulowane przez komórkowy poziom tlenu. W normoksji (21% tlenu) białka HIF-1α ulegają szybkiej degradacji10,11. Krótki okres półtrwania HIF-1α w normoksji stwarza szczególne wyzwania techniczne dla wykrywania białka z ekstraktów komórkowych, a także dla identyfikacji białek oddziałujących z HIF-1α. Ponadto kilka czynników transkrypcyjnych, w tym te należące do kompleksu HIF-1, przemieszcza się do jądra w warunkach niedotlenienia12,13,14. Większość obecnych metod stosowanych w badaniach IPP jest wykonywana z wykorzystaniem niefizjologicznej nadekspresji białek. Doniesiono, że taka nadekspresja białka powoduje różne defekty komórkowe poprzez wiele mechanizmów, w tym przeciążenie zasobów, nierównowagę stechiometryczną, rozwiązłe interakcje i modulację szlaku15,16. Jeśli chodzi o badania IPP, nadekspresja białek może prowadzić do wyników fałszywie dodatnich, a nawet fałszywie ujemnych, w zależności od właściwości i funkcji białek o nadekspresji. W związku z tym obecne metody badań IPP muszą zostać zmodyfikowane w celu ujawnienia fizjologicznie istotnych IPP w warunkach niedotlenienia. Wcześniej wykazaliśmy interakcję między HIF-1 a białkiem wiążącym czynnik transkrypcyjny GA rodziny Ets (GABP) w niedotlenionych komórkach P19, co przyczynia się do odpowiedzi promotora Hes1 na hipoksję17. W tym miejscu opisujemy protokół koimmunoprecypitacji w celu zbadania IPP między endogennymi białkami jądrowymi w warunkach niedotlenienia. Interakcja między HIF-1α i ARNT jest pokazana jako dowód słuszności koncepcji. Protokół ten jest odpowiedni do demonstrowania interakcji między czynnikami transkrypcyjnymi a współregulatorami transkrypcji w warunkach niedotlenienia, w tym między innymi do identyfikacji białek oddziałujących z HIF-1.

<table><tbody><tr><td><mocny>Materiał</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,0 M Bufor Tris-HCl, pH 7,4&nbsp;</td><td>1st BASE</td><td>1415</td><td></td></tr><tr><td>Białko A/G Koraliki sefarozy</td><td>Abcam</td><td>ab193262</td><td></td></tr><tr><td>Naturalne białko IgG myszy</td><td>Abcam</td><td>ab198772</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio-Rad</td><td>1610729</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli Bufor do próbek</td><td>Bio-Rad</td><td>1610737</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710</td><td></td></tr><tr><td>Nitroceluloza Membrana &nbsp; &nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>Blotting-Grade Blocker</td><td>Bio-Rad</td><td>1706404</td><td>Odtłuszczone mleko w proszku do zastosowań western blotting</td></tr><tr><td>10x Tris Sól fizjologiczna buforowana (TBS)</td><td>Bio-Rad</td><td>1706435</td><td></td></tr><tr><td>10% Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>1610781</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine Buffer&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610771</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Dwukolorowe standardy białkowe</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>IgG przeciw królictwom, Przeciwciało sprzężone z HRP</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw myszy, Przeciwciało sprzężone z HRP&nbsp;</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>7076</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik SignalFire ECL</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>6883</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)</td><td>Przeciwciało Merck Millipore</td><td>52332</td><td></td></tr><tr><td>ARNT/HIF-1 beta&nbsp;</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-124&nbsp;</td><td>Stężenie: 1,4 mg/ml</td></tr><tr><td>Przeciwciało alfa HIF-1</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-479</td><td>Stężenie: 1,0 mg / ml</td></tr><tr><td>YY1</td><td>Przeciwciało Novus Biologicals</td><td>NBP1-46218</td><td>Stężenie: 0,2 mg / ml</td></tr><tr><td>Qproteome Nuclear Protein Kit</td><td>Qiagen</td><td>37582</td><td>Bufor do lizy NL i bufor ekstrakcyjny NX1 są dostarczane w zestawie</td></tr><tr><td>GAPDH Przeciwciało</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-47724</td><td>Stężenie: 0,2 mg / ml</td></tr><tr><td>Glicerol (&ge; 99%)</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Bufor RIPA</td><td>Sigma</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>127087-87-0</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM, 4,5 g/L glukozy)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>HEK293A linia komórkowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R70507</td><td></td></tr><tr><td>Metanol&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki z inhibitorem proteazy Pierce&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88660</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>QSP końcówka ładująca żel&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>QSP#010-R204-Q-PK</td><td>1-200 uL</td></tr><tr><td><mocny>Sprzęt/Instrument</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna o grubej plamie, wstępnie przycięta, 7,5 x 10 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&nbsp; Pionowa komórka elektroforetyczna Tetra do mini żeli prefabrykowanych, z Mini Trans-Blot&nbsp; Moduł i zasilacz PowerPac Basic</td><td>Bio-Rad</td><td>1658034</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; 15% prefabrykowane żele białkowe Mini-PROTEAN TGX</td><td>Bio-Rad</td><td>4561083</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc XRS+ System</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>Rękawica</td><td>BioSpherix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy HTX Multi-Mode Czytnik mikropłytek&nbsp;</td><td>Pipety</td> serologiczne BioTek <td>BTS1LFTA</td><td></td></tr><tr><td>Costar 5 ml</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>Costar 10 ml Pipety serologiczne pasiaste</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Costar 25 ml pipety serologiczne</td><td>Corning</td><td>4251</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96-dołkowe przezroczyste dno czarne mikropłytki polistyrenowe</td><td>Corning</td><td>3631</td><td></td></tr><tr><td>15 ml wysokie Stożkowe probówki wirówkowe Clarity PP</td><td>Corning</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Skrobak do małych komórek</td><td>Corning</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Gilson&nbsp; Zestaw 4 pipet Pipetman L&nbsp;</td><td>Gilson</td><td>F167370</td><td>P2, P20, P200, P1000 i akcesoria</td></tr><tr><td>1,5 ml polipropylenowe probówki wirówkowe</td><td>Greiner Bio-One&nbsp;</td><td></td><td></td>616201</tr><tr><td>PIPETBOY acu 2 Pipetor</td><td>INTEGRA Biosciences</td><td>155 000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Justrite Szafy do przechowywania płynów łatwopalnych</td><td>Justrite Manufacturing Co.</td><td>896000</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>Labnet</td><td>S0200</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>NuAire</td><td>NU-5820</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarki orbitalne</td><td>Stuart</td><td>SSL1</td><td></td></tr><tr><td>Rotator rurowy SB3</td> Mikrowirówka <td>Stuart</td><td>SB3</td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 21R</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002470</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Sorvall ST 16 Thermo</td><td> Fisher Scientific</td><td>75004240</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli tkankowych (100 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer MINI urządzenie do dializy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69580</td><td>10K MWCO, boje pływakowe 0,1 ml</td></tr><tr><td>do 0,1 ml Slide-A-Lyzer MINI Urządzenia do dializy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69588</td><td></td></tr><tr><td>LSE Cyfrowe podgrzewacze do suchej kąpieli</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>1168H25</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Naukowy&nbsp; Seria 1300 A2 klasa II, typ A2 Szafy bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-261-308</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Lab Oprogramowanie</td><td>Bio-Rad</td><td>1709691</td><td></td></tr></tbody></table>

test koimmunoprecypitacji z wykorzystaniem endogennych białek jądrowych z komórek hodowanych w warunkach niedotlenienia

Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions

Niski poziom tlenu (niedotlenienie) wyzwala różne reakcje adaptacyjne, a kompleks czynnika indukowanego hipoksją 1 (HIF-1) działa jako główny regulator. HIF-1 składa się z heterodimerycznej podjednostki α regulowanej tlenem (HIF-1α) i konstytutywnie wyrażonej podjednostki β (HIF-1β), znanej również jako translokator jądrowy receptora węglowodorów arylowych (ARNT), regulującej geny zaangażowane w różne procesy, w tym angiogenezę, erytropoezę i glikolizę. Identyfikacja białek oddziałujących z HIF-1 jest kluczem do zrozumienia szlaku sygnałowego hipoksji. Oprócz regulacji stabilności HIF-1α, niedotlenienie wyzwala również translokację jądrową wielu czynników transkrypcyjnych, w tym HIF-1α i ARNT. Warto zauważyć, że większość obecnych metod stosowanych do badania takich interakcji białko-białko (PPI) opiera się na systemach, w których poziomy białek są sztucznie zwiększane przez nadekspresję białek. Nadekspresja białek często prowadzi do niefizjologicznych skutków wynikających z artefaktów czasowych i przestrzennych. Tutaj opisujemy zmodyfikowany protokół koimmunoprecypitacji po leczeniu hipoksją przy użyciu endogennych białek jądrowych oraz jako dowód koncepcji, aby pokazać interakcję między HIF-1α i ARNT. W tym protokole niedotlenione komórki zostały zebrane w warunkach niedotlenienia, a bufor do płukania soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco został również wstępnie zrównoważony do warunków hipoksyjnych przed użyciem w celu złagodzenia degradacji białka lub dysocjacji kompleksu białkowego podczas reoksygenacji. Ponadto frakcje jądrowe zostały następnie wyekstrahowane w celu zagęszczenia i ustabilizowania endogennych białek jądrowych oraz uniknięcia możliwych fałszywych wyników, często obserwowanych podczas nadekspresji białek. Protokół ten może być wykorzystany do wykazania endogennych i natywnych interakcji między czynnikami transkrypcyjnymi a współregulatorami transkrypcji w warunkach niedotlenienia.

Aby ocenić odpowiedź komórkową na hipoksję, zbadano poziomy ekspresji i lokalizację subkomórkową komponentów kompleksu HIF-1 po zastosowaniu hipoksji. Komórki HEK293A hodowano w warunkach hipoksji przez 4 h lub utrzymywano w normoksji jako kontrolę. Poziomy białek HIF-1α oraz ARNT analizowano w ekstraktach z całych komórek lub frakcjach jądrowych/cytoplazmatycznych metodą western blot. Zgodnie z oczekiwaniami, całkowity poziom HIF-1α uległ zwiększeniu pod wpływem hipoksji, podczas gdy poz...

Tutaj opisujemy protokół koimmunoprecypitacji do badania interakcji białko-białko między endogennymi białkami jądrowymi w warunkach niedotlenienia. Metoda ta jest odpowiednia do wykazania interakcji między czynnikami transkrypcyjnymi a współregulatorami transkrypcji w warunkach niedotlenienia.

Test koimmunoprecypitacji z wykorzystaniem endogennych białek jądrowych z komórek hodowanych w warunkach niedotlenienia

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie hipoksji, takie jak endogenne i natywne interakcje między czynnikami transkrypcyjnymi i ich koregulatorami transkrypcyjnymi w warunkach niedotlenienia. Główną zaletą tej techniki jest to, że niedotlenione komórki są zbierane w warunkach niedotlenienia, a frakcje jądrowe są wykorzystywane do koimmunoprecypitacji. Protokół ten wykorzystuje ludzkie embrionalne komórki nerkowe 293A wyhodowane w czterech 10-centymetrowych szalkach.Wysiewaj trzy do pięciu razy od 10 do szóstych komórek na naczynie w 10 mililitrach zmodyfikowanej pożywki Eagle's firmy Dulbeco uzupełnionej 10% FBS, L-glutaminą, pirogronianem sodu, penicyliną i streptomycyną. Hoduj komórki w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dwadzieścia cztery godziny po wysiewie, gdy komórki osiągną 80 do 90% zbieżności, umieść dwie szalki w komorze podciśnienia w komorze rękawicowej inkubatora z 1% tlenem i 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza na cztery godziny.Pozostałe dwie potrawy trzymaj w normoxii. W dniu poprzedzającym pobranie komórek poddanych hipoksji należy wstępnie zrównoważyć DPBS do warunków niedotlenienia, umieszczając odkrytą 100-mililitrową szklaną butelkę z odczynnikiem eksperymentalnym wypełnioną DPBS w podkomorze hipoksji na 24 godziny. Na około godzinę przed pobraniem komórek należy umieścić pojemnik na lód zawierający lód w komorze przetwarzania w komorze rękawicowej, która została zrównoważona z 1% tlenu i 5% dwutlenku węgla.Przenieść butelkę zawierającą wstępnie zrównoważony hipoksyjny DPBS z podkomory hipoksji do komory procesowej i umieścić ją na lodzie. Cztery godziny po zabiegu hipoksji przenieś komórki z podkomory hipoksji do komory roboczej, która została wstępnie zrównoważona z 1% tlenu i 5% dwutlenkiem węgla. Usunąć pożywkę hodowlaną przez aspirację i za pomocą 10-mililitrowej pipety przepłukać komórki raz 10 mililitrami lodowatego, wstępnie zbalansowanego, hipoksyjnego DPBS.Za pomocą pięciomililitrowej pipety dodaj 5 mililitrów lodowatego, wstępnie zbalansowanego DPBS i usuń komórki, zeskrobując je skrobakiem do komórek. Przechylić płytkę do hodowli komórkowej, zebrać oderwane komórki za pomocą 10-mililitrowej pipety i przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Trzymaj probówkę z komórkami na lodzie.Otwórz drzwi między komorą procesową i komorą buforową w komorze rękawicowej, z których obie zostały wstępnie zrównoważone z 1% tlenu i 5% dwutlenkiem węgla. Przenieść 15-mililitrowe stożkowe probówki na lodzie zawierające komórki poddane hipoksji z komory przetwarzania do komory buforowej. Otworzyć drzwi komory buforowej i całkowicie wyjąć ogniwa ze schowka podręcznego.Osadzać zarówno komórki niedotlenione, jak i komórki normoksyczne przez odwirowanie w temperaturze 1000 razy g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Do tej procedury zostanie użyty zestaw do ekstrakcji jądrowej. Zacznij od delikatnego ponownego zawieszenia każdej komórki w 500 mikrolitrach buforu do lizy NL, uzupełnionego koktajlem inhibitorów proteazy 1X w 0,1 molowym DTT, kilkakrotnie pipetując w górę iw dół.Dodaj 25 mikrolitrów roztworu detergentu NP do zawiesiny komórek i wiruj przez 10 sekund z maksymalną prędkością. Wirować 1000 razy 10 g w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Zachowaj zarówno supernatant, jak i pastylkę jądrową.Po zebraniu i przechowywaniu supernatantu zgodnie z opisem w protokole tekstowym, ponownie zawieś jądra komórkowe zawierające osady w 500 mikrolitrach buforu do lizy NL, uzupełnionego koktajlem inhibitora proteazy 1X i 0,1 molowym DTT przez wirowanie przez pięć sekund z maksymalną prędkością. Ponownie zawiesić osad jądrowy w 50 mikrolitrach buforu ekstrakcyjnego NX1, uzupełnionego koktajlem inhibitora proteazy 1X, kilkakrotnie pipetując osad w górę iw dół. Inkubować na lodzie przez 30 minut.Co pięć minut wiruj przez 10 sekund z maksymalną prędkością. Wirować przy 12 000 x g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Zebrać supernatant i przenieść do mini urządzeń do dializy o maksymalnej objętości 100 mikrolitrów na jednostkę w celu odsalania.Zakryj mini urządzenia do dializy i umieść je w urządzeniu do flotacji. Umieścić urządzenie flotacyjne w zlewce zawierającej 500 mililitrów wstępnie schłodzonego buforu do dializy. Należy uważać, aby unikać bezpośredniego kontaktu ze skórą lub wdychania buforu do dializy, ponieważ zawiera on PMSF.Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie mieszając przez 30 minut. Po 30 minutach zbierz próbki z rogu mini urządzeń do dializy i przenieś do nowych 1,5-mililitrowych probówek do mikrowirówek. Wirować 12 tysięcy razy g w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut.Porcję 25 mikrolitrów każdego supernatantu do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mikrolitra i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Przygotować kulki sefarozy białkowej AG do użycia w immunoprecypacji. Odpipetować 50 mikroliter kulek do każdej z czterech 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych i dodać 500 mikrolitrów buforu DPBS na probówkę.Granulki osadzać przez odwirowanie. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić kulki w 100 mikrolitrach buforu TBS. Dodać dwa mikrolitry mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-ARNT lub mysiej immunoglobuliny G, która została przygotowana przez rozpuszczenie 0,7 miligrama mysiej IgG w 500 mikrolitrach buforu TBS.Probówki do mikrowirówek zawierające kulki należy przenieść do chłodni. Umieść je w rotatorze probówki i inkubuj z prędkością 10 obr./min przez dwie godziny. Po dwóch godzinach osadki osadkować przez odwirowanie i wyrzucić supernatanty.Rozcieńczyć 200 mikrogramów przygotowanego wcześniej lizatu białka jądrowego w 800 mikrolitrach buforu immunoprecypitacyjnego. Inkubować lizat z kulkami sprzężonymi z przeciwciałami w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia granulki osadzać przez odwirowanie w ilości 3000 razy g przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odrzucić supernatant. Dodaj jeden mililitr lodowatego TBS zawierającego 0,2% NP-40 do każdej probówki i odwiruj. W ten sposób umyj koraliki trzykrotnie lodowatym TBS zawierającym 0,2% NP-40.Gotuj kulki w 50 mikrolitrach buforu do próbek Laemmli w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Odwiruj kulki 10 tysięcy razy g w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Zebrać supernatant i wyrzucić koraliki.Poziomy ekspresji w lokalizacji subkomórkowej składników kompleksu HIF-1 po leczeniu hipoksją badano w HEK293A komórkach. Zgodnie z oczekiwaniami, całkowite poziomy HIF-1a były regulowane w górę przez niedotlenienie, podczas gdy poziomy ARNT w całkowitych lizatach komórkowych nie uległy znaczącym zmianom. Ponadto niedotlenienie indukowało akumulację jądrową zarówno HIF-1a, jak i ARNT.Eksperymenty z koimmunoprecypitacją przeprowadzono przy użyciu ekstraktów jądrowych z komórek HEK293A wystawionych na warunki normoksyjne lub niedotlenione. Jak pokazano tutaj, HIF-1a był koimmunoprecypitowany razem z ARNT z ekstraktów jądrowych niedotlenionych komórek HEK293A, co wskazuje, że HIF-1a oddziałuje z ARNT w warunkach niedotlenienia. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się hipoksją do zbadania interakcji endogennych białek jądrowych i ich warunków niedotlenienia.

co-immunoprecipitation-assay-using-endogenous-nuclear-proteins-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym materiale proponujemy proste metody indukcji hipoksji w hodowlach komórkowych oraz proste testy służące do oceny stanu hipoksyjnego hodowli.

Indukcja i badanie hipoksji w hodowlach komórkowych

Ten film opisuje protokół testu immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), który jest klasyczną techniką demonstracji interakcji białko-DNA. Technika ta służy do identyfikacji docelowych genów w ludzkich komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej.

Test immunoprecypitacji chromatyny: technika badania interakcji białko-DNA w komórkach

Opisujemy solidną metodę immunoprecypitacji chromatyny przy użyciu pierwotnych limfocytów T. Metoda opiera się na standardowych podejściach, ale wykorzystuje określony zestaw warunków i odczynników, które poprawiają wydajność dla ograniczonej liczby komórek. Co ważne, przedstawiono szczegółowy opis fazy analizy danych.

Wydajna immunoprecypitacja chromatyny przy użyciu ograniczonych ilości biomasy

Udostępniamy szczegółowy protokół indukcji długotrwałego wzmocnienia w regionie CA1 hipokampa i późniejszej izolacji frakcji wzbogaconych jądrowo z obszaru tetanizowanego wycinka. Podejście to można wykorzystać do określenia zależnego od aktywności importu białek jądrowych w komórkowych modelach uczenia się i pamięci.

Izolacja frakcji wzbogaconych jądrami CA1 z wycinków hipokampa w celu zbadania zależnego od aktywności importu jądrowego synaptojądrowych białek przekaźnikowych

Opisujemy technikę analizy globalnej syntezy RNA w hipoksji za pomocą obrazowania. Znakowanie chemiczne RNA metodą kliknięcia nie było wcześniej wykonywane w warunkach hipoksji i umożliwia wizualizację globalnych zmian RNA na poziomie pojedynczej komórki. Podejście to uzupełnia istniejące techniki uśredniania RNA, umożliwiając bezpośrednią wizualizację zmian między komórkami w globalnej syntezie RNA.

Analiza globalnej syntezy RNA na poziomie pojedynczej komórki po niedotlenieniu

Ten manuskrypt opisuje podejście do izolacji wybranych pokrewnych RNP powstałych w komórkach eukariotycznych poprzez specyficzne wzbogacenie ukierunkowane na oligonukleotydy. Wykazujemy możliwość zastosowania tego podejścia poprzez wyizolowanie pokrewnego RNP związanego z retrowirusowym regionem 5' bez translacji, który składa się z helikazy DHX9 / RNA A.

Izolacja pokrewnych kompleksów RNA-białko z komórek za pomocą elucji kierowanej oligonukleotydami

Interakcje białko-białko mogą zachodzić zarówno w jądrze, jak i w cytoplazmie komórki. Aby zbadać te interakcje, stosuje się tradycyjną koimmunoprecypitację i nowoczesny test ligacji zbliżeniowej. W tym badaniu porównujemy te dwie metody wizualizacji rozkładu oddziaływań NF90-RBM3 w jądrze i cytoplazmie.

Wizualizacja interakcji białko-białko we frakcjach jądrowych i cytoplazmatycznych za pomocą koimmunoprecypitacji i testu ligacji zbliżeniowej in situ

Badanie wielu, endogennych modyfikacji potranslacyjnych dla docelowego białka może być niezwykle trudne. Opisane tutaj techniki wykorzystują zoptymalizowany bufor do lizy i system filtrów opracowany ze specyficznymi matrycami powinowactwa do kierowania PTM, do wykrywania modyfikacji acetylacji, ubikwitynacji, SUMOylacji 2/3 i fosforylacji tyrozyny dla białka docelowego przy użyciu jednego, usprawnionego systemu.

Wykorzystanie kompleksowego systemu wzbogacania immunoprecypitacji w celu zidentyfikowania endogennego profilu modyfikacji potranslacyjnej dla białek docelowych

Opisany jest proces proteomiki do identyfikacji partnerów interakcji białkowych z frakcji subkomórkowej jądrowej za pomocą wzbogacenia immunopowinowactwa danego białka i bezznacznikowej spektrometrii mas. Przepływ pracy obejmuje frakcjonowanie subkomórkowe, immunoprecypitację, przygotowywanie próbek wspomagane filtrem, oczyszczanie offline, spektrometrię mas i dalszy potok bioinformatyczny.

Bezznacznikowa spektrometria mas immunoprecypitacji do profilowania interaktomii jądrowej na dużą skalę

Tutaj opisujemy protokół in vitro modelujący niedotlenienie/uszkodzenia reoxygenacji w wysokometabolicznych komórkach nabłonka rurkowo-rurkowego. Model ten został zaprojektowany tak, aby wywołać uszkodzenia wywołane stresem metabolicznym, które można zmierzyć poprzez ekspresję markerów uszkodzenia kanałów bliższych oraz ocenę funkcji oddechowej mitochondriów.

Modelowanie niedotlenienia/uszkodzeń reoxygenacji w bliższych komórkach nabłonka rurkowego

Poznaj metodę koimmunoprecypitacji endogennych białek jądrowych w warunkach niedotlenienia przy użyciu komórek HEK293A. Technika ta pozwala badać natywne interakcje czynników transkrypcyjnych z koregulatorami.

Test koimmunoprecypitacji z wykorzystaniem endogennych białek jądrowych z komórek hodowanych w warunkach niedotlenienia

Przeglądaj więcej filmów