Metody odkrywania nowych związków modulujących neuroprzekaźnictwo receptora kwasu gamma-aminomasłowego typu A

Ogólnym celem tego filmu jest zilustrowanie kaskady badań przesiewowych, która pozwala na odkrycie nowych ligandów receptora GABA-A. Zaletą stosowania wiązania radioligandów, zapisu elektrofizjologicznego w oocytach ksenopusów i wycinkach mózgu gryzoni w sposób dosłowny jest to, że można poprawić profil związku. Ostatecznie identyfikuje się silne podtypy, selektywne i skuteczne związki.

Pokaz ten poprowadzą Kumico Kambara i Jenna Tognaccini, a także Sonia i Daniel Bertrand z HiQScreen oraz Marie Claire Pflimlin z Roche. Wstrzyknąć od 10 do 50 nanolitrów roztworu zawierającego plazmid za pomocą szklanej igły do mikroiniekcji o średnicy końcówki do 100 mikrometrów zamontowanej na mikromanipulatorze wyposażonym w system wyrzutu ciśnienia lub w automatyczny system iniekcyjny. Aby rozpocząć tę procedurę, utrzymuj oocyty w temperaturze 17 stopni Celsjusza, aby zapobiec ekspresji białek szoku cieplnego.

Przechowuj mikropłytkę w przechowywaniu w kontrolowanym termicznie. Następnie rozpuść badane związki, które dały wynik dodatni w teście wiązania w OR2, przy 0,1 i 1000 mikromolach do zapisów elektrofizjologicznych i umieść je w 96-dołkowej płaskodennej płytce polipropylenowej. Aby wykonać zapis napięcia cęgowego dwóch elektrod, umieść płytkę zawierającą oocyty na zautomatyzowanym systemie.

Zaprogramować automatyczny system rejestracji za pomocą interfejsu opartego na ikonach z tym schematem w celu odpowiedniego określenia zależności między stężeniem a aktywnością. W celu dopasowania krzywej, korzystając z ilustrowanej krzywej aktywacji stężenia, należy wykreślić amplitudę prądu w funkcji logarytmu stężenia agonisty. W celu zapisu elektrofizjologicznego należy przechowywać mózg w roztworze dACSF z bąbelkami karbogenu w temperaturze pokojowej.

Następnie rozetnij lewą formację hipokampa drobną szpatułką. Następnie przekrój poprzecznych szkiełek o grubości 400 mikrometrów od środkowej części hipokampa za pomocą rozdrabniacza tkankowego. Za pomocą pędzla malarskiego przenieś plastry do komory zapisu i utrzymuj je w temperaturze pokojowej przez 45 minut.

Następnie przeformuj plastry za pomocą rACSF bąbelkowanego karbogenem w temperaturze 35 stopni Celsjusza i z szybkością 1,5 mililitra na minutę. Aby zarejestrować pojedynczy skok populacji, umieść wycinek mózgu w komorze zamontowanej pod mikroskopem. Wypełnij plasterek za pomocą rACSF z szybkością trzech mililitrów na minutę.

Za pomocą ściągacza do pipet wyciągnij mikropipetę ze szkła borokrzemianowego o rezystancji około dwóch megaomów. Napełnij mikropipetę roztworem zawierającym dwa molowe roztwory chlorku sodu i umieść ją w uchwycie na pipety. Umieść mikropipetę rejestrującą w warstwie piramidalnej w obszarze CA1 wycinka hipokampa za pomocą prawego mikromanipulatora.

Następnie umieść izolowaną bipolarną elektrodę platynowo-irydową w uchwycie na lewym mikromanipulatorze. Umieść elektrodę stymulacyjnej w obokach Schaffera w obszarze CA1 wycinka hipokampa za pomocą lewego mikromanipulatora. Korzystając z generatora bodźców, dostarczaj impuls prądu do elektrody stymulacyjnej co 30 sekund i stopniowo zwiększaj siłę stymulacji, aż pojawi się skok populacji.

Dostosuj siłę bodźca, aby wywołać skok populacji odpowiadający 45% maksymalnej amplitudy, jaką można uzyskać. Aby wykonać sparowane hamowanie impulsów, dostarczaj dwa impulsy prądu do elektrody stymulacyjnej co 30 sekund za pomocą generatora bodźców. Ustaw siłę bodźca tak, aby wywołać skok populacji odpowiadający 45% maksymalnej amplitudy.

W celu zbadania związków należy rozcieńczyć związki, które mają być badane w ACSF, tak aby końcowe stężenie DMSO nie było wyższe niż 0,1% Dodać DMSO do roztworu kontrolnego w tym samym stężeniu, co w roztworze złożonym. Rejestruj pojedynczy lub sparowany skok populacji impulsów wywołany przez stymulacje poboczne Schaffera co 30 sekund przez co najmniej 30 minut. Kształt skoku populacji powinien być stabilny w tym okresie odniesienia.

Następnie należy przygotować zlewkę z karbogenowanym rACSF zawierającym stałe stężenie badanego związku i perfować wycinek hipokampa roztworem podczas rejestrowania pojedynczych lub sparowanych skoków populacji impulsów. Oceń również powrót do zdrowia po efekcie związku, perfundując plasterek karbogenicznym rACSF bez tego związku. Pokazano tutaj schematyczną reprezentację wycinka hipokampa szczura, z pobocznymi zabezpieczeniami Schaffera pochodzącymi z aksonów komórek piramidalnych CA3 rzutujących na arboryzację dendrytyczną neuronów piramidowych CA1.

Mikropipety umieszczono w warstwie piramidalnej w celu zarejestrowania skoków populacji oraz w warstwie radiatum w celu dendrytycznych zapisów pobudzających potencjałów postsynaptycznych pola. Elektroda stymulująca została umieszczona w zabezpieczeniach Schaffera. Rysunek ten pokazuje skoki populacji wywołane przez sparowane bodźce zastosowane przez tę samą elektrodę stymulującą w odstępie 20 milisekund.

Odpowiedź populacji na drugi bodziec ma mniejszą amplitudę niż odpowiedź na pierwszy bodziec. Skoki populacji odnotowano przy braku i obecności beta CCM, nieselektywnego receptora GABA A NAM. Beta CCM zwiększyła amplitudę drugiego skoku populacji poprzez częściowe zablokowanie jakiegokolwiek hamowania gabaergicznego typu feed-forward.

Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak farmakokinetyka, zajętość receptorów i skuteczność in vivo oraz farmakologia bezpieczeństwa, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak potencjał rozwoju klinicznego zidentyfikowanych związków.