Metody odkrywania nowych związków modulujących neuroprzekaźnictwo receptora kwasu gamma-aminomasłowego typu A
16 sierpnia 2018
Tutaj prezentujemy protokoły odkrywania związków aktywnych w receptorach GABAA, od wiązania po fizjologię i farmakologię.
Ogólnym celem tego filmu jest zilustrowanie kaskady badań przesiewowych, która pozwala na odkrycie nowych ligandów receptora GABA-A. Zaletą stosowania wiązania radioligandów, zapisu elektrofizjologicznego w oocytach ksenopusów i wycinkach mózgu gryzoni w sposób dosłowny jest to, że można poprawić profil związku. Ostatecznie identyfikuje się silne podtypy, selektywne i skuteczne związki.
Pokaz ten poprowadzą Kumico Kambara i Jenna Tognaccini, a także Sonia i Daniel Bertrand z HiQScreen oraz Marie Claire Pflimlin z Roche. Wstrzyknąć od 10 do 50 nanolitrów roztworu zawierającego plazmid za pomocą szklanej igły do mikroiniekcji o średnicy końcówki do 100 mikrometrów zamontowanej na mikromanipulatorze wyposażonym w system wyrzutu ciśnienia lub w automatyczny system iniekcyjny. Aby rozpocząć tę procedurę, utrzymuj oocyty w temperaturze 17 stopni Celsjusza, aby zapobiec ekspresji białek szoku cieplnego.
Przechowuj mikropłytkę w przechowywaniu w kontrolowanym termicznie. Następnie rozpuść badane związki, które dały wynik dodatni w teście wiązania w OR2, przy 0,1 i 1000 mikromolach do zapisów elektrofizjologicznych i umieść je w 96-dołkowej płaskodennej płytce polipropylenowej. Aby wykonać zapis napięcia cęgowego dwóch elektrod, umieść płytkę zawierającą oocyty na zautomatyzowanym systemie.
Zaprogramować automatyczny system rejestracji za pomocą interfejsu opartego na ikonach z tym schematem w celu odpowiedniego określenia zależności między stężeniem a aktywnością. W celu dopasowania krzywej, korzystając z ilustrowanej krzywej aktywacji stężenia, należy wykreślić amplitudę prądu w funkcji logarytmu stężenia agonisty. W celu zapisu elektrofizjologicznego należy przechowywać mózg w roztworze dACSF z bąbelkami karbogenu w temperaturze pokojowej.
Następnie rozetnij lewą formację hipokampa drobną szpatułką. Następnie przekrój poprzecznych szkiełek o grubości 400 mikrometrów od środkowej części hipokampa za pomocą rozdrabniacza tkankowego. Za pomocą pędzla malarskiego przenieś plastry do komory zapisu i utrzymuj je w temperaturze pokojowej przez 45 minut.
Następnie przeformuj plastry za pomocą rACSF bąbelkowanego karbogenem w temperaturze 35 stopni Celsjusza i z szybkością 1,5 mililitra na minutę. Aby zarejestrować pojedynczy skok populacji, umieść wycinek mózgu w komorze zamontowanej pod mikroskopem. Wypełnij plasterek za pomocą rACSF z szybkością trzech mililitrów na minutę.
Za pomocą ściągacza do pipet wyciągnij mikropipetę ze szkła borokrzemianowego o rezystancji około dwóch megaomów. Napełnij mikropipetę roztworem zawierającym dwa molowe roztwory chlorku sodu i umieść ją w uchwycie na pipety. Umieść mikropipetę rejestrującą w warstwie piramidalnej w obszarze CA1 wycinka hipokampa za pomocą prawego mikromanipulatora.
Następnie umieść izolowaną bipolarną elektrodę platynowo-irydową w uchwycie na lewym mikromanipulatorze. Umieść elektrodę stymulacyjnej w obokach Schaffera w obszarze CA1 wycinka hipokampa za pomocą lewego mikromanipulatora. Korzystając z generatora bodźców, dostarczaj impuls prądu do elektrody stymulacyjnej co 30 sekund i stopniowo zwiększaj siłę stymulacji, aż pojawi się skok populacji.
Dostosuj siłę bodźca, aby wywołać skok populacji odpowiadający 45% maksymalnej amplitudy, jaką można uzyskać. Aby wykonać sparowane hamowanie impulsów, dostarczaj dwa impulsy prądu do elektrody stymulacyjnej co 30 sekund za pomocą generatora bodźców. Ustaw siłę bodźca tak, aby wywołać skok populacji odpowiadający 45% maksymalnej amplitudy.
W celu zbadania związków należy rozcieńczyć związki, które mają być badane w ACSF, tak aby końcowe stężenie DMSO nie było wyższe niż 0,1% Dodać DMSO do roztworu kontrolnego w tym samym stężeniu, co w roztworze złożonym. Rejestruj pojedynczy lub sparowany skok populacji impulsów wywołany przez stymulacje poboczne Schaffera co 30 sekund przez co najmniej 30 minut. Kształt skoku populacji powinien być stabilny w tym okresie odniesienia.
Następnie należy przygotować zlewkę z karbogenowanym rACSF zawierającym stałe stężenie badanego związku i perfować wycinek hipokampa roztworem podczas rejestrowania pojedynczych lub sparowanych skoków populacji impulsów. Oceń również powrót do zdrowia po efekcie związku, perfundując plasterek karbogenicznym rACSF bez tego związku. Pokazano tutaj schematyczną reprezentację wycinka hipokampa szczura, z pobocznymi zabezpieczeniami Schaffera pochodzącymi z aksonów komórek piramidalnych CA3 rzutujących na arboryzację dendrytyczną neuronów piramidowych CA1.
Mikropipety umieszczono w warstwie piramidalnej w celu zarejestrowania skoków populacji oraz w warstwie radiatum w celu dendrytycznych zapisów pobudzających potencjałów postsynaptycznych pola. Elektroda stymulująca została umieszczona w zabezpieczeniach Schaffera. Rysunek ten pokazuje skoki populacji wywołane przez sparowane bodźce zastosowane przez tę samą elektrodę stymulującą w odstępie 20 milisekund.
Odpowiedź populacji na drugi bodziec ma mniejszą amplitudę niż odpowiedź na pierwszy bodziec. Skoki populacji odnotowano przy braku i obecności beta CCM, nieselektywnego receptora GABA A NAM. Beta CCM zwiększyła amplitudę drugiego skoku populacji poprzez częściowe zablokowanie jakiegokolwiek hamowania gabaergicznego typu feed-forward.
Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak farmakokinetyka, zajętość receptorów i skuteczność in vivo oraz farmakologia bezpieczeństwa, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak potencjał rozwoju klinicznego zidentyfikowanych związków.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokoły wyszukiwania związków oddziałujących z receptorami GABA A, wykorzystując kaskadę przesiewową łączącą wiązanie radioligandów z technikami elektrofizjologicznymi. Podejście to ma na celu zidentyfikowanie selektywnych i skutecznych związków poprzez iteracyjne testy w oocytach Xenopus oraz w skrawkach mózgu gryzoni.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Farmakologia
- Elektrofizjologia
Wprowadzenie
- Zrozumienie aktywności receptorów GABA A jest kluczowe dla zastosowań farmakologicznych.
- Związki oddziałujące z tymi receptorami mogą wywierać działanie terapeutyczne w zaburzeniach neurologicznych.
- Rejestracje elektrofizjologiczne dostarczają informacji o fizjologicznym wpływie tych związków.
- Iteracyjny screening usprawnia optymalizację profilu związków.
Cel badania
- Opracowanie systematycznego podejścia do odkrywania nowych ligandów receptorów GABA A.
- Udoskonalenie możliwości testów wiązania oraz analiz elektrofizjologicznych.
- Ułatwienie identyfikacji związków o potencjalnym znaczeniu klinicznym.
Zastosowane metody
- Badania wykorzystują preparaty skrawków mózgu ex vivo oraz oocyty Xenopus do testowania związków.
- W celu pomiaru odpowiedzi w skrawkach mózgu i oocytach oraz oceny aktywności ligandów przeprowadzane są rejestracje elektrofizjologiczne.
- W badaniu określono szczegółowe harmonogramy dla procedur takich jak utrzymanie oocytów i perfuzja związków.
- Opisano szczegółowe techniki wstrzykiwania w celu dostarczenia plazmidów do oocytów oraz konfiguracje aparatury rejestrującej dla preparatów skrawkowych.
Główne wyniki
- Badanie przedstawia skuteczną identyfikację związków selektywnie modulujących aktywność receptora GABA A.
- Rejestracje elektrofizjologiczne wykazały zmiany w amplitudach kolców populacyjnych w odpowiedzi na aplikację liganda.
- Uzyskano wiedzę na temat mechanistycznej roli inhibicji receptora GABA A oraz efektów dawkowania związków.
- Walidacja wyników za pomocą rygorystycznych metod statystycznych w celu ustalenia wiarygodności otrzymanych danych.
Wnioski
- Niniejsze badanie umożliwia identyfikację selektywnych ligandów receptora GABA A o potencjalnych zastosowaniach terapeutycznych.
- Podkreśla ono znaczenie łączenia testów wiązania z rejestracją fizjologiczną w celu oceny związków.
- Wyniki przyczyniają się do lepszego zrozumienia oddziaływań ligand-receptor oraz ich wpływu na opracowywanie leków.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta kaskada przesiewowa umożliwia iteracyjną ocenę ligandów receptora GABAA w systemach rekombinowanych i natywnych, wspierając walidację celu oraz optymalizację wiodących związków w procesie odkrywania leków działających na OUN. Dzięki integracji wiązania radioligandów, elektrofizjologii oocytów oraz rejestracji z przekrojów mózgu, metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w zakresie selektywności i skuteczności związków. Przepływ pracy wspiera wczesne ograniczanie ryzyka hipotez mechanistycznych i dostarcza informacji niezbędnych do priorytetyzacji portfolio terapeutyków celujących w receptor GABAA.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez ocenę wiązania związków oraz ich aktywności funkcjonalnej w obrębie podtypów receptora GABAA.
- Wartość operacyjna: Umożliwia profilowanie selektywności podtypów poprzez wiązanie radioligandów na błonach rekombinowanych wykazujących ekspresję głównych podtypów GABAA.
- Wartość prognostyczna: Wspiera identyfikację związków wiodących poprzez powiązanie powinowactwa wiązania z modulacją funkcjonalną w heterologicznych systemach ekspresyjnych.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Dostarcza ilościowych pomiarów zmiennych zależnych (np. amplitudy prądu, amplitudy kolca populacyjnego) w celu charakterystyki zależności dawka-odpowiedź.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje warunki analizy dla oocytów Xenopus oraz skrawków mózgu gryzoni, umożliwiając powtarzalną ocenę związków.
- Skalowalność: Ułatwia przygotowanie do screeningu dzięki zautomatyzowanym systemom rejestracji i formatom płytek 96-dołkowych do profilowania elektrofizjologicznego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy dane dotyczące receptorów rekombinowanych z fizjologią receptorów natywnych w skrawkach hipokampa gryzoni, wspierając walidację systemu w kontekście chorobowym.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Wyjaśnia wpływ związków na pobudliwość neuronalną za pomocą analiz hamowania podwójnego impulsu oraz odzyskiwania odpowiedzi populacyjnej (population spike recovery).
- Dostosowanie do modelu przedklinicznego: Wykorzystuje rejestrację pozakomórkową w określonych obwodach neuronalnych do oceny aktywności związku w fizjologicznie istotnym kontekście.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta sytuuje przesiewy związków w obrębie kontinuum odkrywania – od walidacji celu po ocenę przedkliniczną, umożliwiając iteracyjne udoskonalanie profili ligandów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez izolowanie zmiennych (np. podtypu receptora, stężenia związku), aby wyjaśnić zależności struktura-aktywność.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy dzięki standaryzowanym protokołom perfuzji, rejestracji i aplikacji związków w oocytach i skrawkach tkankowych.
- Analityka: Generuje krzywe koncentracja-odpowiedź oraz wskaźniki regeneracji, które umożliwiają porównania między różnymi warunkami i modelowanie zależności struktura-aktywność.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki in vitro z odpowiedziami natywnej tkanki, wspierając decyzje o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem oceny ryzyka.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia reużywalną kaskadę przesiewową, którą można dostosować do innych celów w postaci kanałów jonowych poza receptory GABAA.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: zwiększa pewność co do celu poprzez korelację danych o wiązaniu z wynikami funkcjonalnymi w wielu systemach eksperymentalnych.
- Wartość operacyjna: poprawia powtarzalność dzięki kontrolowanemu przechowywaniu oocytów, szybkości perfuzji oraz parametrom stymulacji.
- Wartość strategiczna: usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez wczesną identyfikację związków silnych, wykazujących selektywność podtypową i wysoką skuteczność w kaskadzie.
- Wpływ na portfolio: umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez filtrowanie związków na podstawie powinowactwa wiązania, potencji elektrofizjologicznej oraz aktywności natywnego receptora.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie biologii molekularnej (izolacja mRNA, mikroiniekcja), elektrofizjologii (metoda clampy napięciowej dwuelektrodowej, rejestracje polowe) oraz przygotowania tkanek (utrzymywanie żywotności skrawków hipokampa).
- Zależność od aparatury, w tym mikromanipulatorów, zautomatyzowanych systemów rejestracyjnych, generatorów bodźców oraz układów perfuzyjnych dla oocytów i skrawków mózgu.
- Konieczność standaryzacji pomiędzy zespołami w zakresie rozcieńczania związków, kontroli DMSO oraz czasu perfuzji w celu zapewnienia spójności danych pomiędzy laboratoriami.
- Kwestie adaptacyjne przy przenoszeniu protokołów z oocytów Xenopus do komórek HEK 293 lub innych systemów ekspresyjnych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują umiejętności techniczne wymagane do mikroiniekcji, utrzymanie żywotności skrawków oraz stabilną rejestrację linii bazowej przed aplikacją związku.
