Name: Metody odkrywania nowych związków modulujących neuroprzekaźnictwo receptora kwasu gamma-aminomasłowego typu A (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Poznaj metody odkrywania nowych ligandów receptora GABA A wykorzystujące kaskadę badań wiązania radioligandów i techniki elektrofizjologiczne w oocytach Xenopus oraz preparatach mózgu gryzoni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Judith Lengyel, Marii Karg, Grégoire Friz, Rachel Haab i Marie Claire Pflimlin z Roche oraz Tifany Schaer i Deborah Paolucci z HiQScreen za doskonałą pomoc techniczną.

Xenopus laevis są utrzymywane i obchodzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi zwierząt kantonu Genewa.
1. Wiązanie radioliganda
<ol>
	<li>Przygotowanie płytki do analizy
	<ol>
		<li>Przygotować 1,5 l buforu do analizy zawierającego 5 mM KCl i 1,25 mM CaCl22, 1,25 mM MgCl22, 120 mM NaCl i 15 mM Tris; pH należy dostosować do wartości 7,4 za pomocą HCl.</li>
		<li>Przygotować związki do przebadania w stężeniu 50.76 µM (np., a 5 µL związek w stężeniu 10 mM do 980 µL bufor do testu w probówce do mikrocentryfugi). Wymieszać dokładnie za pomocą wstrząsarki typu vortex z dużą prędkością przez 2–5 s.</li>
		<li>Przygotuj wstępne rozcieńczenie związku referencyjnego flumazenilu poprzez pipetowanie 1 µL związku (10 mM) do 1,970 µL buforu do analizy. Wymieszać dokładnie za pomocą wortexa przy wysokiej prędkości przez 2–5 s.</li>
		<li>Rozcieńczyć [3roztwór zapasowy flumazenilu z buforem do analizy w stosunku 4 °C do 4 nM w 50 ml polipropylenowej probówce.</li>
		<li>Pipeta 50 µL/well buforu do analizy do kolumn 1 i 3–11 mikropłytki 96-dołkowej, zgodnie z układem płyty przedstawionym w Rysunek 2.</li>
		<li>Pipeta 73.2 µL związków rozcieńczonych w stężeniu 50.76 µM (patrz krok 1.1.2) do kolumny 12 płytki.</li>
		<li>Rozcieńcz każdy związek, stosując progresję geometryczną w 9 krokach (1E-10 – 1E-06 M), z 23.12 µL odmień odpowiednią objętość i napełnij kolumny 3–11. Dokładnie wymieszaj rozcieńczenie. Zmieniaj końcówkę po każdym rozcieńczeniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńć błony komórkowe
	<ol>
		<li>Rozmrozić błony komórkowe wcześniej wyizolowane z komórek HEK293 nadekspresujących ludzki GABAA receptora (0,025–0,15 mg/ml), aby otrzymać 80 ml w temperaturze pokojowej (RT), a następnie przenieść zawiesinę do buforu do analizy w 4 °C.</li>
		<li>Ponownie zawiesić roztwór błon, nadal przy 4 °C za pomocą homogenizatora do tkanek przez 30–40 s przy 10 000–12 000 obr./min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcień diazepam do kontroli nieswoistego wiązania (NSB)
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć roztwór zapasowy diazepamu o stężeniu 4 mM buforem do analizy do stężenia 40 µM w 5 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpocznij reakcję
	<ol>
		<li>Pipeta 50 µL o stężeniu 4 nM [3Wprowadzić flumazenil do każdej studzienki płytki 96-dołkowej i przechowywać ją w pojemniku z wodą z lodem.</li>
		<li>Dodaj 100 µL GABAA przygotowanie membran podtypów receptorów o stężeniu białka 0,5 mg/ml.</li>
		<li>Pipeta 50 µL z 40 µM diazepam do kolumny 2.</li>
		<li>Inkubować płytkę przez 1 h na lodzie.</li>
		<li>Dodaj 50 µL buforu do analizy do każdej studzienki 96-dołkowej płytki filtrującej w celu późniejszej separacji membranowej i pomiaru radioaktywności, a następnie zatrzymania reakcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zatrzymać reakcję
	<ol>
		<li>Przygotować bufor płuczący zawierający 50 mM Tris-HCl o pH 7,4.</li>
		<li>Przefiltruj roztwór, używając zbiornika do zbierania komórek z 96 dołkami. Przemyj płytkę 3 razy za pomocą 300 µL lodowatego buforu do płukania na każdą dołkę.</li>
		<li>Uszczelnij dno płytki folią plastikową i dodaj 40 µL koktajlu scyntylacyjnego do pomiaru w metodzie ciekłoscyntylacyjnej w każdej studzience, a następnie przemyć ją 70% etanolem.</li>
		<li>Delikatnie wstrząsaj płytką przez co najmniej 1 h w temperaturze pokojowej. Pozostaw ją na co najmniej kolejną godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zmierzć radioaktywność (w CPM), umieszczając płytkę w liczniku scyntylacyjnym. Czas pomiaru dla każdej studzienki powinien wynosić 3 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza danych
	<ol>
		<li>Oblicz średnią dla 8 powtórzeń wiązania nieswoistego (NSB) i wiązania całkowitego (TB), a także dla powtórzeń (dubletów lub tripletów) próbek. Oblicz procent wiązania swoistego (% SB) dla średniej z każdej próbki zgodnie z następującym równaniem: 
		<img alt="Wzór na równowagę statyczną, obliczanie %SB; analiza równań dla badań naukowych i interpretacji danych." src="/files/ftp_upload/57842/57842eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 
		Tutaj, 
		całkowite SB = średnia TB minus średnie NSB.</li>
		<li>Nanieś na oś odciętych wartość % SB kontra Uporządkuj stężenia inhibitora. Dopasuj dane, stosując równanie analizy konkurencji w jednym miejscu wiązania: 
		<img alt="Równanie wzrostu logistycznego, y = A+(B–A)/(1+(X/C)^D), formuła do modelowania i analizy danych." src="/files/ftp_upload/57842/57842eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2"> 
		Tutaj, 
		y = % SB, 
		A = minimum z y, 
		B maksimum z y, 
		C = IC50, 
		X dziennik wpisów10 stężenia związku konkurującego, 
		D = nachylenie krzywej (współczynnik Hilla).</li>
		<li>Oblicz powinowactwo wiązania (Ki), wykorzystując połowiczną maksymalną stężenie hamujące (IC50)50), stała dysocjacji (Kd) [3flumazenil na odpowiednich membranach9, a także stężenie [3H] flumazenil w teście zgodnie z następującym równaniem danych: 
		<img alt="Równanie powinowactwa wiązania Ki=IC50/(1+radioligand/Kd); wzór do analizy farmakologicznej." src="/files/ftp_upload/57842/57842eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 3"></li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ekspresja receptorów i rejestracje w oocytach Xenopus
<ol>
	<li>Pobieranie jajników i przygotowanie oocytów
	<ol>
		<li>Przygotować sterylny roztwór Bartha zawierający 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,4 mM NaHCO33, 10 mM HEPES, 0,82 mM MgSO44.7H2O, 0,33 mM Ca(NO3)2.4H2O oraz 0,41 mM CaCl22.6H2O, przy pH 7,4, z dodatkiem 100 j./ml penicyliny, 100 µg/mL streptomycyna i 0.25 µg/mL amfoterycyny B.</li>
		<li>Przygotuj pożywkę OR2 1x (bez CaCl2)2) z 88,5 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 5 mM HEPES, 1 mM MgCl2.6H2O, przy pH 7,4.</li>
		<li>Uśmierć Xenopus laevis samicę poddano głębokiej anestezji przez 20 min w schłodzonym metansulfonian trikainy (w stężeniu 150 mg/L, z pH dostosowanym do 7,4) i wodorowęglanie sodu (300 mg/L), a następnie wykonano dekapitację.</li>
		<li>Szybko pobierz jajniki za pomocą czystych nożyczek i pęsety, a następnie umieść je w 2 szalkach Petriego (10 cm) wypełnionych 40 ml 1x roztworu Bartha oraz antybiotykami/lekiem przeciwgrzybiczym.</li>
		<li>Przechowywać niedysocjowane jajniki do 2 tygodni w roztworze Bartha w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>W celu dysocjacji, należy pociąć jajniki czystą żyletką na małe fragmenty (1–2 cm).3) i inkubować je w 50 ml pożywki OR2 bez CaCl22 (OR2-bez CaCl2)2) zawierający 0,2% kolagenazy (typu I) w temperaturze 17–19 °C w kolbie z mieszadłem o pojemności 100 mL przy wolnym mieszaniu przez 4–5 h. Należy upewnić się, że mieszadło magnetyczne znajduje się około 3–5 cm nad dnem kolby, aby uniknąć zmiażdżenia oocytów.</li>
		<li>Po 4–5 h należy sprawdzić, czy większość oocytów została uwolniona z mieszków (t. j., pływają one pojedynczo). Przemyć je 5 razy 200 ml pożywki OR2 uzupełnionej o 1,8 mM CaCl22.</li>
		<li>Przenieść odfolikulowane oocyty do płytek Petriego (10 cm) wypełnionych roztworem Bartha oraz antybiotykami/antybiotykami przeciwgrzybiczymi i przechowywać je przez co najmniej jedną noc w temperaturze 17 °C przed iniekcją cDNA lub mRNA.</li>
		<li>Następnego dnia pod stereomikroskopem wybrać zdrowy oocyt z wyraźnym i odrębnym biegunem zwierzęcym kontra biegun wegetatywny (ciemnobrązowy dla bieguna zwierzęcego) kontra jasnożółty dla bieguna wegetatywnego). Używając czystych pipet Pasteura, przenosić oocyty pojedynczo do sterylnego stożkowego 96-dołkowego podłoża do mikroiniekcji. 
		UWAGA: Przy wstrzykiwaniu mRNA nie jest wymagane szczególne rozmieszczenie oocytów; natomiast w przypadku wstrzykiwania cDNA niezbędne jest zorientowanie oocytów tak, aby biegun zwierzęcy był skierowany do góry.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Automatyczna iniekcja mRNA lub cDNA
	<ol>
		<li>Zsyntetyzować mRNA, używając dostępnego komercyjnie zestawu zgodnie z zalecanymi instrukcjami. Oczyścić instrumenty i stół preparacyjny środkiem usuwającym RNazy oraz założyć odpowiednie rękawice ochronne. 
		UWAGA: Jakość mRNA ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dobrej ekspresji; niezbędne jest zapobieganie degradacji mRNA podczas procedury wtryskiwania.</li>
		<li>Przygotować cDNA przy użyciu komercyjnie dostępnego zestawu i rozpuścić wymaganą ilość w wodzie bidestylowanej do stężenia 0.2 µg/µL.</li>
		<li>Wstrzyknąć 10–50 nL roztworu mRNA o stężeniu 0.2 µg/µLlub 10 nL roztworu cDNA o stężeniu w zakresie 0,02–0.2 µg/µLnajlepiej w partiach po 95 oocytów.</li>
		<li>W przypadku białek błonowych wymagających wielu podjednostek (tj., heteromeryczny receptor GABA $\alpha1\beta2\gamma2$A receptory), zmieszaj odpowiednie mRNA lub cDNA w pożądanym stosunku (t. j., 1:1:1 lub 1:10:1).</li>
		<li>Utrzymać oocyt w temperaturze 17 °C aby zapobiec ekspresji białek szoku termicznego przez oocyty, przechowywać płytkę mikrotitracyjną w obszarze magazynowym z kontrolą temperatury.</li>
		<li>Rozpuścić związki testowe, które dały wynik dodatni w teście wiązania z OR2, w stężeniu 0,1–1,000 µM do rejestracji elektrofizjologicznej, a następnie umieść je w 96-dołkowej polipropylenowej płytce z płaskim dnem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Plazmidy do ekspresji
	<ol>
		<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami obsługi komercyjnie dostępnych zestawów do syntezy mRNA z bakteryjnymi promotorami T7 lub T6 i przygotuj 20 µL roztworu w 0.2 µg/µL w wodzie wolnej od RNaz.</li>
		<li>Przygotuj co najmniej 20 µL roztworu zawierającego wektor ekspresyjny eukariotyczny dla ekspresji cDNA, zazwyczaj w stężeniu 0.2 µg/µL rozpuszczone w wodzie bidestylowanej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mikroiniekcja do oocytu i wizualizacja jego jakości
	<ol>
		<li>Wstrzyknąć 10–50 nL roztworu zawierającego plazmid (patrz krok 2.3.1 lub 2.3.2), używając szklanej igły do mikroiniekcji o średnicy końcówki wynoszącej do 100 µm zamontowany na mikromanipulatorze wyposażonym w system wyrzutu ciśnieniowego lub w zautomatyzowany system iniekcyjny. 
		UWAGA: W omawianym tutaj przykładzie oocyty są wstrzykiwane w partiach po 95 sztuk za pomocą zautomatyzowanego systemu odpowiedniego do pracy z cDNA lub mRNA.</li>
		<li>Napełnij igłę wstrzykującą preparatem 1 µL barwnika, takiego jak błękit metylenowy w stężeniu 1%, i wstrzyknąć go do oocytów zgodnie ze standardową procedurą (do jądra w przypadku cDNA lub do cytoplazmy w przypadku mRNA).</li>
		<li>Poddać wstrzyknięte oocyty działaniu wrzącej wody przez około 1 minutę. Przeciąć oocyty na pół za pomocą żyletki pod mikroskopem stereoskopowym. 
		UWAGA: Barwnik pozostaje zlokalizowany, jak pokazano w Rycina 3Eco pozwala na precyzyjną obserwację wstrzyknięcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rejestracje metodą clampy napięciowej z użyciem dwóch elektrod
	<ol>
		<li>Umieść płytkę wielodołkową zawierającą oocyty w systemie zautomatyzowanym, który wykorzystuje zasadę przedstawioną w Rycina 4. 
		UWAGA: W przeciwieństwie do systemu patch clamp przedstawionego w Rycina 5elektroda napięciowa odczytuje rzeczywisty potencjał błonowy komórki.</li>
		<li>Zaprogramuj zautomatyzowany system rejestracji za pomocą interfejsu opartego na ikonach, stosując na przykład schemat przedstawiony w Rysunek 6 do wyznaczenia zależności między stężeniem a aktywnością.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dopasowanie krzywej
	<ol>
		<li>Przeanalizuj wyniki przy użyciu odpowiedniego oprogramowania; wykorzystując przedstawioną krzywą aktywacji stężeń, wykreśl amplitudę prądu jako funkcję logarytmu stężenia agonisty.</li>
		<li>Obserwuj krzywą sigmoidalną, którą można następnie dopasować do empirycznego równania Hilla w formie: 
		<img alt="Wzór równania Hilla; Y=1/(1+(EC50/x)^nH) do analizy zależności dawka-odpowiedź w farmakologii." src="/files/ftp_upload/57842/57842eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 4"> 
		Tutaj, 
		Y= ułamek prądu wywołanego, 
		EC50 stężenie powodujące 50% aktywację, 
		Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. = stężenie związku, 
		nH = współczynnik Hilla lub pozorna kooperatywność.</li>
		<li>Znormalizuj prądy do jedności, dzieląc amplitudę każdej odpowiedzi kontra wartość odnotowana przy najwyższym stężeniu w celu analizy danych uzyskanych z serii komórek.</li>
		<li>Oblicz średnie oraz błędy standardowe, a następnie wykonaj dopasowanie krzywej przy użyciu standardowo dostępnego oprogramowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Rejestracje elektrofizjologiczne w skrawkach mózgu
UWAGA: Przekroje hipokampa szczura są przygotowywane zgodnie z krajowymi i instytucjonalnymi wytycznymi.
<ol>
	<li>Przygotowanie skrawków hipokampa
	<ol>
		<li>Przygotować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy do sekcji (dACSF) zawierający 124 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2,5 mM CaCl2 2H2O, 26 mM NaHCO3, 10 mM glukozy oraz 4 mM sacharozy, napowietrzony w butelce mieszaniną 95% O2 i 5% CO2.</li>
		<li>Przygotować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy do rejestracji (rACSF) zawierający 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2,5 mM CaCl2 2H2O, 25 mM NaHCO3 oraz 10 mM glukozy, napowietrzony w butelce mieszaniną 95% O2 i 5% CO2.</li>
		<li>Zanestetyzować szczury, stosując mieszaninę 2,5% izofluranu i czystego tlenu, a następnie przeprowadzić dekapitację.</li>
		<li>Naciąć skórę głowy wzdłuż linii środkowej za pomocą precyzyjnych nożyczek. Przeciąć czaszkę wzdłuż linii środkowej, nie uszkadzając tkanki podległej. Usunąć czaszkę pęsetą i za pomocą cienkiej szpatułki delikatnie wydobyć mózg.</li>
		<li>Umieścić mózg w napowietrzonym roztworze dACSF w temperaturze pokojowej (RT) i wypreparować lewą formację hipokampa za pomocą cienkiej szpatułki.</li>
		<li>Za pomocą krojarki do tkanek (tissue chopper) wyciąć skrawki poprzeczne (o grubości 400 µm) z części środkowej hipokampa i przenieść je do komory rejestracyjnej za pomocą pędzla. Przechowywać skrawki w temperaturze pokojowej przez 45 min.</li>
		<li>Perfundować skrawki napowietrzonym rACSF w temperaturze 35 °C z prędkością 1,5 mL/min. Napowietrzać roztwór mieszaniną 95% O2 i 5% CO2. 
		UWAGA: Po tym kroku skrawki są gotowe do eksperymentów elektrofizjologicznych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rejestracja pojedynczego potencjału populacyjnego
	<ol>
		<li>Umieścić skrawka mózgu w komorze zamontowanej na mikroskopie.</li>
		<li>Perfundować skrawek rACSF z prędkością 3 mL/min.</li>
		<li>Wytвориć borokrzemową mikropipetę szklaną za pomocą wypalarki do pipet, tak aby oporność wynosiła ~2 MΩ. 
		UWAGA: Mikropipeta ta służy jako elektroda rejestrująca i jest podłączona elektrycznie do wzmacniacza.</li>
		<li>Napełnić mikropipetę roztworem zawierającym 2 M NaCl i umieścić ją w uchwycie pipety wzmacniacza.</li>
		<li>Za pomocą prawego mikromanipulatora ustawić mikropipetę rejestrującą w stratum pyramidale w obszarze CA1 skrawka hipokampa. 
		UWAGA: Lokalizacja jest przedstawiona schematycznie na Rysunku 7.</li>
		<li>Umieścić izolowaną bipolarną elektrodę platynowo-irydową w uchwycie lewego mikromanipulatora. 
		UWAGA: Elektroda ta służy jako elektroda stymulująca i jest podłączona elektrycznie do generatora impulsów.</li>
		<li>Za pomocą prawego mikromanipulatora ustawić elektrodę stymulującą w obrębie kolaterali Schaffera w obszarze CA1 skrawka hipokampa. 
		UWAGA: Lokalizacja jest przedstawiona schematycznie na Rysunku 7.</li>
		<li>Za pomocą generatora impulsów dostarczać impuls prądu do elektrody stymulującej co 30 s (czas trwania 100 µs, zaczynając od 10 µA) i stopniowo zwiększać natężenie stymulacji, aż do pojawienia się potencjału populacyjnego (PS).</li>
		<li>Dostosować natężenie bodźca tak, aby wywołać PS odpowiadający 45% maksymalnej możliwej amplitudy. Sygnały PS są filtrowane przy 2,4 KHz i digitalizowane przy 20 KHz przy użyciu wzmacniacza sygnału.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hamowanie parzystych impulsów
	<ol>
		<li>Przygotować skrawki mózgu (krok 3.1) i postępować zgodnie z opisem powyżej (kroki 3.2.1–3.2.7).</li>
		<li>Za pomocą generatora impulsów dostarczać co 30 s dwa impulsy prądu (czas trwania 100 µs w odstępie 20 ms) do elektrody stymulującej. Ustawić natężenie bodźca tak, aby wywołać PS odpowiadający 45% maksymalnej amplitudy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Testowanie związków
	<ol>
		<li>Przygotować rozcieńczenia badanych związków w napowietrzonym ACSF w taki sposób, aby końcowe stężenie DMSO nie przekraczało 0,1%.</li>
		<li>Dodać DMSO do roztworu kontrolnego w takim samym stężeniu, jak w roztworze związku.</li>
		<li>Rejestrować pojedynczy (krok 3.2) lub parzysty (krok 3.3) PS wywołany stymulacją kolaterali Schaffera co 30 s przez co najmniej 30 min. Kształt PS powinien być stabilny podczas tego okresu bazowego.</li>
		<li>Przygotować zlewkę z napowietrzonym rACSF zawierającym określone stężenie badanego związku.</li>
		<li>Perfundować skrawek hipokampa tym roztworem, kontynuując rejestrację pojedynczego lub parzystego PS.</li>
		<li>Ocenić powrót do stanu wyjściowego po działaniu związku poprzez perfuzję skrawka napowietrzonym rACSF bez związku. 
		UWAGA: W przypadku efektów odwracalnych, PS powraca do pierwotnego kształtu zaobserwowanego w okresie bazowym przed aplikacją związku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza danych
	<ol>
		<li>Uśrednić zapisy PS zarejestrowane podczas eksperymentu w blokach po 4 przy użyciu oprogramowania do analizy danych.</li>
		<li>Zmierzyć amplitudy PS uśrednionych zapisów.</li>
		<li>Znormalizować amplitudy jako procent wartości bazowych zarejestrowanych 10 min przed perfuzją związku.</li>
		<li>Przedstawić dane jako średnia ± SEM.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Rudolph, U., Knoflach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+classical+benzodiazepines%3A+novel+therapeutic+potential+of+GABAA+receptor+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 685-697 (2011).</li>
<li>Sieghart, W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7568326">Structure and pharmacology of g-aminobutyric acidA receptor subtypes.</a> Pharmacological Reviews. 47, 181-234 (1995).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19090692">A high-throughput functional assay for characterization of g-aminobutyric acidA channel modulators using cryopreserved transiently transfected cells.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 781-786 (2008).</li>
<li>Mennerick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+voltage-sensitive+dyes+modulate+GABAA+receptor+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function.</a> Journal of Neuroscience. 30, 2871-2879 (2010).</li>
<li>Hevers, W., Luddens, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diversity+of+GABAA+receptors.+Pharmacological+and+electrophysiological+properties+of+GABAA+channel+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The diversity of GABAA receptors. Pharmacological and electrophysiological properties of GABAA channel subtypes.</a> Molecular Neurobiology. 18, 35-86 (1998).</li>
<li>Macdonald, R. L., Olsen, R. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7516126">GABAA receptor channels.</a> Annual Review of Neuroscience. 17, 569-602 (1994).</li>
<li>Kemp, J. A., Marshall, G. R., Wong, E. H., Woodruff, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+affinities%2C+potencies+and+efficacies+of+some+benzodiazepine-receptor+agonists%2C+antagonists+and+inverse-agonists+at+rat+hippocampal+GABAA-receptors%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The affinities, potencies and efficacies of some benzodiazepine-receptor agonists, antagonists and inverse-agonists at rat hippocampal GABAA-receptors.</a> British Journal of Pharmacology. 91, 601-608 (1987).</li>
<li>Prenosil, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+subtypes+of+GABAA+receptors+mediate+phasic+and+tonic+forms+of+inhibition+in+hippocampal+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Specific subtypes of GABAA receptors mediate phasic and tonic forms of inhibition in hippocampal pyramidal neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96, 846-857 (2006).</li>
<li>Ballard, T. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18936916">RO4938581, a novel cognitive enhancer acting at GABAA a5 subunit-containing receptors.</a> Psychopharmacology. 202, 207-223 (2009).</li>
<li>Knoflach, F., Hernandez, M. C., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAA+receptor-mediated+neurotransmission%3A+Not+so+simple+after+all%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">GABAA receptor-mediated neurotransmission: Not so simple after all.</a> Biochemical Pharmacology. 115, 10-17 (2016).</li>
<li>Gielen, M. C., Lumb, M. J., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzodiazepines+modulate+GABAA+receptors+by+regulating+the+preactivation+step+after+GABA+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Benzodiazepines modulate GABAA receptors by regulating the preactivation step after GABA binding.</a> Journal of Neuroscience. 32, 5707-5715 (2012).</li>
<li>Bergmann, R., Kongsbak, K., Sorensen, P. L., Sander, T., Balle, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23308109">A unified model of the GABAA receptor comprising agonist and benzodiazepine binding sites.</a> PLoS One. 8, 52323(2013).</li>
<li>Richter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diazepam-bound+GABAA+receptor+models+identify+new+benzodiazepine+binding-site+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Diazepam-bound GABAA receptor models identify new benzodiazepine binding-site ligands.</a> Nature Chemical Biology. 8, 455-464 (2012).</li>
<li>Rudolph, U., Crestani, F., Mohler, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11282419">GABAA receptor subtypes: dissecting their pharmacological functions.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22, 188-194 (2001).</li>
<li>Wisden, W., Seeburg, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAA+receptor+channels%3A+from+subunits+to+functional+entities%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">GABAA receptor channels: from subunits to functional entities.</a> Current Opinion in Neurobiology. 2, 263-269 (1992).</li>
<li>Davies, C. H., Davies, S. N., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired-pulse+depression+of+monosynaptic+GABA-mediated+inhibitory+postsynaptic+responses+in+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Paired-pulse depression of monosynaptic GABA-mediated inhibitory postsynaptic responses in rat hippocampus.</a> The Journal of Physiology. 424, 513-531 (1990).</li>
<li>Karnup, S., Stelzer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+overlap+of+excitatory+and+inhibitory+afferent+input+in+guinea-pig+CA1+pyramidal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Temporal overlap of excitatory and inhibitory afferent input in guinea-pig CA1 pyramidal cells.</a> The Journal of Physiology. 516, Pt 2 485-504 (1999).</li>
<li>Turner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feed-forward+inhibitory+potentials+and+excitatory+interactions+in+guinea-pig+hippocampal+pyramidal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Feed-forward inhibitory potentials and excitatory interactions in guinea-pig hippocampal pyramidal cells.</a> The Journal of Physiology. 422, 333-350 (1990).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflügers Archiv. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Adelsberger, H., Brunswieck, S., Dudel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Block+by+picrotoxin+of+a+GABAergic+chloride+channel+expressed+on+crayfish+muscle+after+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Block by picrotoxin of a GABAergic chloride channel expressed on crayfish muscle after axotomy.</a> European Journal of Neuroscience. 10, 179-187 (1998).</li>
<li>Hapfelmeier, G., et al. <a target="_blank" href="https://dokupdf.com/download/isoflurane-slows-inactivation-kinetics-of-rat-recombinant-122l-gabaa-receptors-enhancement-of-gabaergic-transmission-despite-an-open-channel-block-_5a034a51d64ab2b9bdf8bbd0_pdf">Isoflurane slows inactivation kinetics of rat recombinant a1b2g2L GABAA receptors: enhancement of GABAergic transmission despite an open-channel block.</a> Neuroscience Letters. 307, 97-100 (2001).</li>
<li>Bertrand, S., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+electrophysiological+characterization+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Overview of electrophysiological characterization of neuronal nicotinic acetylcholine receptors.</a> Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 11, Unit11 17(2004).</li>
</ol>

Autorzy, Frédéric Knoflach i Maria-Clemencia Hernandez, są pracownikami firmy farmaceutycznej F. Hoffmann-La Roche AG, 4070 Bazylea, Szwajcaria. Autor Daniel Bertrand jest pracownikiem HiQScreen Sàrl 6, rte de Compois, 1222 Vésenaz Genewa, Szwajcaria, dostarczającym zaplecze do badań przesiewowych firmom farmaceutycznym.

Opracowanie nowych związków aktywnych w kanale jonowym bramkowanym ligandem, takich jak receptory GABAA , wymaga zastosowania wielu podejść. Zazwyczaj pierwszy etap jest często przeprowadzany przy użyciu testów wiążących; Pomiary te są jednak niewystarczające do scharakteryzowania fizjologicznej aktywności związku lub jego precyzyjnej farmakologii. W szczególności związek, który wiąże się z receptorem, może wzmacniać lub hamować jego funkcję, a nawet nie wywoływać żadnego efektu funkcjonalnego (być cichym) (tj. wiązać się z receptorem bez modyfikowania jego funkcji). W związku z tym do pełnej charakterystyki związku wymagany jest test funkcjonalny.
Testy wiążące: Główną zaletą testu wiązania jest to, że można go skutecznie przeprowadzić na dużej liczbie próbek, sięgającej kilku tysięcy, oraz że zapewnia powinowactwo do wiązania cząsteczek aktywnych. Jak opisano w niniejszym dokumencie, pierwszy krok polega na ustaleniu metody oceny pożądanych podtypów receptorów. Mianowicie, podczas gdy wiązanie może być prowadzone na receptorach natywnych z frakcji lub całych mózgów, taka metoda uniemożliwi określenie powinowactwa do określonych podtypów receptorów. W związku z tym konieczne jest stosowanie układów rekombinowanych do badania przesiewowego cząsteczek w pożądanym celu. Obecnie przejściowa lub stabilna transfekcja pożądanych podjednostek receptorowych cDNA w liniach komórkowych oferuje wydajną i niezawodną metodę ekspresji podtypów receptorów będących przedmiotem zainteresowania (np. GABAA α5β3γ2). Tradycyjne testy wiązania wykorzystują radioligandy, ale obecnie dostępne są techniki, które pozwalają uniknąć niedogodności związanych z obchodzeniem się z radioaktywnością (np. ilościowe wiązanie ligandów na podstawie fluorescencji).
Wyrażenie funkcyjne w systemie hosta: Aby uzyskać ekspresję genów w systemie gospodarza, sekwencja kodująca, która jest przedmiotem zainteresowania, musi zostać wprowadzona do plazmidu, który zawiera odpowiednie promotory. Zazwyczaj do syntezy mRNA in vitro stosuje się bakteryjne promotory T7 lub T6. W przypadku ekspresji cDNA transkrypcja genu będącego przedmiotem zainteresowania musi być regulowana przez promotor eukariontowy, taki jak CMV (wirus cytomegalii) lub równoważny. Obecnie dostępnych jest kilka plazmidów, w tym dwa promotory (tj. pUNIV, pCMV-6AC, psf-CMV / T7, pCI-neo, pcDNA), umożliwiające syntezę mRNA in vitro lub ekspresję cDNA, jak pokazano na rysunku 15. Ekspresję receptorów GABAA można wiernie uzyskać zarówno w liniach komórkowych, jak i w oocytach Xenopus . Głównymi zaletami tych ostatnich są brak endogennej ekspresji receptora, prostota manipulacji oraz dostępność zautomatyzowanego systemu do mikroiniekcji i zapisów. Procedury opisane w tym protokole obrazują skuteczność zautomatyzowanego systemu, który pozwala na wstrzyknięcie 96 komórek jajowych w ciągu około 7 minut i nie wymaga umiejętności mikromanipulacji. Biorąc pod uwagę, że pojedynczy jajnik z Xenopus zawiera od 10 000 do 30 000 oocytów, jasne jest, że na jednym preparacie można przeprowadzić dużą liczbę pomiarów komórek. Ponadto, ponieważ ekspresję można przeprowadzić za pomocą iniekcji cDNA, te same plazmidy zawierające interesujące geny, które są opracowywane do eksperymentów wiązania, mogą być wykorzystane do charakterystyki funkcjonalnej bez potrzeby dalszych manipulacji biologii molekularnej.
Biorąc pod uwagę jego duży rozmiar i wysoką ekspresję powierzchniową, pojedynczy oocyt wytwarza liczbę receptorów, która jest w przybliżeniu równoważna zbiegającym się komórkom na szalce Petriego o średnicy 35 mm. Jednak przygotowanie i wstrzyknięcie oocytów stanowi ułamek kosztu linii komórkowej, ponieważ eksperymenty nie wymagają specjalnej pożywki hodowlanej i sterylnych manipulacji. Aktywacja pojedynczego kanału GABAA daje kilka pikoamperów (10-12), a prądy sięgające nawet kilkudziesięciu mikroamperów (10-6) są łatwo rejestrowane w pojedynczym oocycie, co potwierdza jednoczesną aktywność kilku milionów receptorów podczas jednej odpowiedzi.
Pierwszym krokiem w charakterystyce kanałów jonowych bramkowanych ligandem jest często określenie pozornego powinowactwa receptorów. Eksperymenty, które należy przeprowadzić, polegają na zastosowaniu serii krótkich impulsów testowych agonistów i wykreśleniu amplitudy wywołanego prądu lub, w niektórych przypadkach, pola pod krzywą (AUC) w funkcji logarytmu stężenia agonisty. Ponieważ łatwo jest mikrowstrzykiwać plazmidy o różnych stężeniach i proporcjach w tej samej partii oocytów, ten system ekspresji jest szczególnie odpowiedni dla takiej charakterystyki. Co więcej, porównanie poszczególnych partii wykazało wysoki stopień stabilności dla różnych EC50s. Wpływ składu podjednostki na pozorne powinowactwo receptora można łatwo zobrazować za pomocą wykresu pająka, jak pokazano na rycinie 10.
Wyniki dwuelektrodowego zacisku napięciowego uzyskane w oocytach Xenopus są często porównywane z zapisami wykonanymi przy użyciu elektrod patch clamp. Jakkolwiek szczegółowe porównanie tych dwóch systemów wykraczałoby poza zakres niniejszej pracy, można poruszyć kilka kwestii. Podczas gdy klamra punktowa w komórkach oferuje korzyści w charakterystyce biofizycznej z szybkim zastosowaniem leku, jego wymagania są bardziej złożone niż w przypadku zapisów dwuelektrodowych w oocytach Xenopus . Pierwszą i istotną trudnością jest ekspresja danego białka z koniecznością hodowli komórkowej, transfekcji przejściowej lub stabilnej oraz identyfikacja komórek, które wyrażają pożądany konstrukt. Ponadto niezbędne jest zbadanie możliwego udziału ekspresji endogennej w rozważanej komórce. Co więcej, zapis za pomocą zacisku krosowego wymaga wykwalifikowanej osoby przeprowadzenia mikromanipulacji pod mikroskopem o dużym powiększeniu, przy czym osoba ta musi również przeprowadzić odpowiednią analizę podczas eksperymentu, aby ocenić np. jakość uszczelki, opór dostępu itp. Natomiast zapis cęgowy napięciowy z dwiema elektrodami, zwłaszcza przy użyciu zautomatyzowanego systemu elektrofizjologicznego, Nie wymaga żadnych szczególnych umiejętności i może być przeprowadzana przez techników laboratoryjnych.
Przy zakupie zestawu elektrofizjologicznego rozważenie kosztów jest z pewnością ważnym czynnikiem, który należy dokładnie przeanalizować. Na przykład, podczas gdy koszt zautomatyzowanego systemu jest stosunkowo wysoki, bliższe porównanie pokazuje, że instalacja kompletnego zestawu elektrofizjologicznego obejmuje zakup sprzętu, takiego jak dobre mikromanipulatory, soczewka lornetkowa, wzmacniacz, system perfuzyjny i stół antywibracyjny, a także pozyskiwanie danych i przeprowadzanie analizy. Porównanie kosztów między konfiguracją cęgów napięciowych z dwiema elektrodami a konfiguracją z zaciskiem krosowym ujawnia jeszcze dalsze rozbieżności. Co więcej, zautomatyzowany system ma tę zaletę, że jest w pełni zautomatyzowanym sprzętem i działa bez nadzoru w dzień iw nocy.
Właściwości farmakologiczne związku zależą od jego sposobu działania na receptor. Na przykład inhibitory kompetycyjne to cząsteczki, które mogą dostać się do tej samej kieszeni wiążącej lub miejsca ortosterycznego, ponieważ sam agonista powoduje konkurencję. Inhibitory niekonkurencyjne to związki, które hamują receptory poprzez interakcję w innym miejscu, a w przypadku kanału jonowego bramkowanego ligandem, które mogą na przykład wnikać i blokować pory jonowe. Zbadanie różnych mechanizmów interakcji wykraczałoby poza zakres tej pracy, ale dalsze informacje można uzyskać z podręcznika farmakologicznego i/lub z innych prac, takich jak22 Bertranda i Bertranda.
W przypadku modulatorów allosterycznych związek wiąże się w miejscu, które jest odrębne od miejsca ortosterycznego, ale obecność cząsteczki modyfikuje barierę energetyczną między stanem aktywnym a innymi stanami. Dodatnie modulatory allosteryczne (PAM) to związki, które zmniejszają barierę energetyczną ze stanu spoczynku do stanu aktywnego, a tym samym wzmacniają działanie agonisty. Aby scharakteryzować możliwe efekty PAM, konieczne jest zatem określenie, czy narażenie na ten związek wzmacnia odpowiedź na agonistę, a jeśli tak, to w jakim stężeniu. Eksperymenty przedstawione na rycinach 11 i 14 ilustrują protokoły, które mogą być z powodzeniem stosowane do charakterystyki PAM w receptorach GABAA .
W niektórych przypadkach sama ekspozycja na PAM może być wystarczająca do aktywacji receptorów. Taką aktywność można określić poprzez nieznaczną modyfikację przedstawionego tu protokołu eksperymentalnego. Mianowicie, zamiast stosować jednoczesne stosowanie modulatora podczas ekspozycji na GABA, protokół może być zmodyfikowany pod kątem zastosowania najpierw samego związku, a następnie w obecności GABA. Charakterystyka bezpośredniej aktywności agonistycznej zostanie dokonana poprzez określenie amplitudy odpowiedzi wywołanej przez sam związek i porównanie z prądem wywołanym przez GABA.
Eksperymenty przeprowadzone na wycinkach mózgu, takie jak zilustrowane na rycinie 7, są wykorzystywane do potwierdzenia aktywności związku w natywnych receptorach w określonym obwodzie hamującym, zanim przejdą dalej w modelach zwierzęcych i na ścieżce do badań klinicznych. Stosunkowo prosty protokół rejestracji i analizy danych pozwala na klasyfikację wielu związków poprzez ocenę ich różnicowego wpływu modulacyjnego na amplitudę PS. Niespecyficzne działanie związków, które nie są związane z układem GABA, może być również wykrywane (np. gdy obserwuje się zmiany w kształcie PS). Bezpośrednie, GABA-ergiczne neuroprzekaźnictwo można ocenić w tych przypadkach, mierząc wpływ związków na hamujące prądy postsynaptyczne (IPSC) przy użyciu techniki całokomórkowego patch clamp8.

Tutaj prezentujemy protokoły odkrywania związków aktywnych w receptorach GABAA, od wiązania do fizjologii i farmakologii. W poszukiwaniu nowych cząsteczek specyficznych dla receptorów GABAA kluczowe jest jak najdokładniejsze zdefiniowanie podtypu zainteresowania i ocena swoistości nowo zidentyfikowanych związków (np. w celu zapoznania się z przeglądem zob. Rudolph and Knoflach1lub Sieghart2). Typowa ścieżka odkrywania leków i kroki, które należy wykonać, przedstawiono na rysunku 1.
Testy wiążące były i nadal są powszechnie stosowane jako pierwszy krok w odkrywaniu leków. W przypadku receptorów GABAA są one zoptymalizowane pod kątem identyfikacji związków, które wiążą się z miejscem wiązania benzodiazepin receptora, gdzie wiążą się użyteczne terapeutycznie i bezpieczne leki. Inne techniki, wykorzystujące czytnik płytek do obrazowania fluorometrycznego (FLIPR) testy oparte na czerwonym barwniku o potencjale błonowym3, wykrywają związki takie jak barbiturany, które wiążą się z dodatkowymi miejscami, które są mniej pożądane ze względu na ich niepożądany profil skutków ubocznych. Ponadto stosowane barwniki mogą bezpośrednio aktywować receptory GABAA, kwestionując w ten sposób przydatność tych testów do odkrywania leków4. Testy wiązania mogą dostarczyć jedynie dowodów na to, że dany związek może wiązać się z określoną klasą receptorów. Testy in vitro z błonami komórkowymi służą do identyfikacji selektywnych ludzkich ligandów receptora GABAA α5β3γ2. Przejściowo transfekowane komórki HEK293 wyrażające ludzkie receptory GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 i α3β3γ2 są wykorzystywane do przygotowania błon do tych testów. Działanie ligandów wykrywa się poprzez pomiar scyntylacji [3H]flumazenilu związanego z receptorami błonowymi (hamowanie wiązania [3H]flumazenilu). Główną zaletą tej techniki jest to, że szybkie i skuteczne określenie powinowactwa do wiązania związku w receptorze będącym przedmiotem zainteresowania jest zapewnione w receptorze będącym przedmiotem zainteresowania.
Badania funkcjonalne są niezbędne do oceny funkcjonalnej aktywności związków i zaproponowania fizjologicznego i farmakologicznego wyjaśnienia mechanizmów spowodowanych wiązaniem związków z receptorami. Obecnie powszechnie wiadomo, że funkcjonalne receptory GABAA powstają w wyniku złożenia pięciu podjednostek wokół osi pseudosymetrii utworzonej przez pory jonowe i wynikają ze złożenia pięciu identycznych podjednostek. Większość receptorów GABAA składa się z dwóch lub więcej różnych podjednostek. Na przykład główny receptor GABAA w mózgu składa się z podjednostek α1, β2 i γ2 w stechiometrii odpowiednio 2, 2 i 15,6. Rekonstytucja w systemie gospodarza, takim jak oocyty Xenopus lub komórki HEK293, daje możliwość szybkiego zbadania właściwości farmakologicznych receptorów.
Właściwości farmakologiczne związków są następnie badane za pomocą zapisów zewnątrzkomórkowych w wycinkach mózgu7. Metoda ta pozwala na zbadanie wpływu związków na przekaźnictwo nerwowe i stanowi skuteczny sposób potwierdzenia funkcjonalnego działania związków oznaczanych w heterologicznych systemach ekspresyjnych na poziomie receptorów natywnych w całym środowisku neuronalnym. Neuroprzekaźnictwo GABA-ergiczne można również ocenić na poziomie molekularnym, mierząc wpływ związków na hamujące prądy postsynaptyczne (IPSC)8. Ale zastosowany tutaj protokół oparty na zapisach klamrów krosowych całych komórek w wycinkach mózgu jest bardziej skomplikowany i zapewnia niższą przepustowość.
Na koniec, mocne i słabe strony kaskady badań przesiewowych in vitro używanej do identyfikacji selektywnych ligandów α5β3γ2 są omawiane w perspektywie różnych technik i ich wewnętrznych ograniczeń. Prace te powinny dostarczyć ekspertom i osobom niebędącym ekspertami w dziedzinie receptorów GABAA pomocnego przeglądu kombinacji różnych podejść in vitro stosowanych w celu rozwiązania problemu odkrycia nowych modulatorów tych kanałów jonowych bramkowanych ligandem.

<table><tbody><tr><td>General equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 kombajn komórkowy -(Filtermate 196)&nbsp;</td><td>Packard</td><td></td><td>Do filtracji membran ze związanym radioligandem</td></tr><tr><td>Płytka mikromiareczkowa Licznik scyntylacyjny cieczy (Top Count NXT)</td><td>Licznik scyntylacji i luminescencji mikropłytek</td> <td>Packard</td><td></td></tr><tr><td>Licznik scyntylacyjny cieczy (Beta-Couter 2500 TR)</td><td>Fiolka Packard</td><td></td><td>Licznik scyntylacji i luminescencji</td></tr><tr><td>Ciecz&nbsp; handler (Biomek 2000)</td><td>Redlica</td><td></td> <td>BeckmanDo przygotowania rozcieńczeń złożonych</td></tr><tr><td>Vortex (Vortex Genie 2)</td><td>Scientific industries Inc.</td><td></td><td>Do mieszania złożonych roztworów podstawowych</td></tr><tr><td>Homogenizator tkankowy (Polytron PT1200E)</td><td>Kinematica AG</td><td></td><td>Do ponownego zawieszenia preparatów membranowych</td></tr><tr><td>Oprogramowanie XLfit5</td><td>Microsoft Excel &nbsp; Dodatek przez IDBS</td><td></td><td>Oprogramowanie do dopasowywania krzywych</td></tr><tr><td>Smart Pull</td><td>UniPix-Electrode</td><td></td> <td>Puller</td></tr><tr><td>RoboInject</td><td>MultiChannel Systems-Automated</td><td></td> <td>Injection (Xenopus Oocytes)</td></tr><tr><td>HiClamp</td><td>MultiChannel</td> <td>Systems-Automated</td> <td>Voltage Clamp (Xenopus Ooocytes)</td></tr><tr><td>DataMining</td><td>MultiChannel</td> <td>Systems-Data</td><td> Oprogramowanie analityczne</td></tr><tr><td>DataMerger</td><td>MultiChannel</td> <td>Systems-Oprogramowanie</td> <td>do przetwarzania danych</td></tr><tr><td>Digidata 1550</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>System akwizycji danych o niskim poziomie szumów</td></tr><tr><td>CyberAmp 380 lub równoważny</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>Programowalny kondycjoner sygnału</td></tr><tr><td>Pakiet programów pClamp</td><td>Urządzenia</td><td></td> molekularne <td>Oprogramowanie do akwizycji i analizy danych oprogramowanie</td></tr><tr><td>Stół antywibracyjny&nbsp;</td><td>TMC</td><td></td><td>Aby uniknąć wibracji mikroelektrod&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikromanipulatory Patchstar</td><td>Scientifica</td><td>Do precyzyjnego pozycjonowania mikroelektrod w wycinkach mózgu</td>Klatka Faradaya<td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>Do izolowania nagrań od hałasu</td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>Campden Instruments LTD&nbsp;</td><td></td><td>Do przygotowania plastrów mózgu mikropipeta</td></tr><tr><td>ze szkła borokrzemianowego&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>GC150TF-10</td><td>Do rejestrowania potencjałów zewnątrzkomórkowych w wycinkach mózgu</td></tr><tr><td>Skrętka, elektroda stymulacyjna z drutów platynowo-irydowych</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>Do stymulacji wycinków mózgu prądem</td></tr><tr><td>Generator bodźców do stymulacji sterowanej prądem i napięciem</td><td>Systemy wielokanałowe</td><td>STG4000</td><td>Dostarcza prąd do elektrody</td></tr> <tr><td>stymulującejPlasticwarePłytka</td><td></td><td></td><td></td></tr> do <tr><td>mikromiareczkowania z okrągłym dnem</td><td>Corning</td><td>#3365</td><td>Używana do oznaczania wiązania</td></tr><tr><td>GF / C z filtrem z włókna szklanego 96-dołkowa mikropłytka z 1,2 i mikro; m Poresize, do testów pobierania komórek za pomocą filtra próżniowego z kolektorem dolewkowym&nbsp;</td><td>Packard&nbsp;</td><td>#6005174</td><td>używany do testu wiązania</td></tr><tr><td>50 ml probówki</td><td>Falcon&nbsp;</td><td>#352070</td><td>używane do testu wiążącego</td></tr><tr><td>Probówki Safe-lock 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>#0030 120086</td><td>używane do testu wiązania</td></tr><tr><td>Probówki Safe-lock 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>#0030 120094</td><td>używane do testu wiążącego</td></tr><tr><td>Probówki transportowe 180 mL&nbsp;</td><td>Semadeni Europe AG&nbsp;</td><td>#3722</td><td>używany do testu wiązania</td></tr><tr><td>Fiolka z kucykiem Polietylen 6 mL&nbsp;</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>#6013329</td><td>używany do testu wiązania</td></tr><tr><td>Top Seal&nbsp;</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>#60051859</td><td>używany do oznaczania wiązania</td></tr><tr><td>Kolba obrotowa</td><td>Bellco</td><td>BELLCO # 1965-00100</td><td>Kolba obrotowa</td></tr><tr><td>96&nbsp; Płytka studzienkowa (stożkowa)</td><td>Thermo Scientific Milian</td><td>56368</td><td>Płytka iniekcyjna do oocytów</td></tr><tr><td>96&nbsp; Płytka studzienkowa (płaskie dno)</td><td>Corning (Vitaris, Szwajcaria)</td><td>3364-cor</td><td>Płytka złożona do szklanej kapilary HiClamp</td></tr><tr><td>Glass&nbsp;</td><td>Hilgenberg (Niemcy)</td><td>-</td><td>szkło borokrzemianowe 1,2 Średnica zewnętrzna 0,76 ID z preparatem filament</td></tr><tr><td>RNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambion mMessage mMachine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>do syntezy in vitro</td></tr><tr><td>Chemikalia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor do oznaczania: KCl 5 mM; CaCl2 1,25 mM; MgCl2 1,25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH dostosuj z HCl do 7,4; przechowywać do 3 miesięcy w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td><td></td><td></td><td>Używany do oznaczania wiązania</td></tr><tr><td>Bufor do mycia: Tris 50 mM -HCl pH 7,4; przechowywać w temperaturze 4 °C.</td><td></td><td></td><td>Używany do oznaczania wiązania</td></tr><tr><td>Roztwór podstawowy badanych związków 10 mM w DMSO</td><td></td><td></td><td>Używany do oznaczania wiązania</td></tr><tr><td>Flumazenil (RO0151788) 10 mM w DMSO</td><td></td><td></td><td>Używany do oznaczania wiązania</td></tr><tr><td>Diazepam 4 mM w DMSO</td><td></td><td></td><td>Używany do oznaczania wiązania</td></tr><tr><td>[3H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol w etanolu; przechowywać w temperaturze -20 &deg; C</td><td></td><td></td><td>Służy do oznaczania wiązania</td></tr><tr><td>Microscint 40&nbsp;</td><td>Packard&nbsp;</td><td>#6013641</td><td>Służy do wiązania</td></tr><tr><td>testu Ultima Gold&nbsp;</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>#6013329</td><td>Służy do oznaczania wiązania</td></tr><tr><td>MS-222</td><td>Sigma</td><td>Sigma # A5040</td><td>MS-222</td></tr><tr><td>AB/AM</td><td>Sigma</td><td>Sigma # A5955</td><td>antybiotyki / leki przeciwgrzybicze</td></tr><tr><td>Kolagenaza</td><td>Sigma</td><td>Sigma # C1030</td><td>Kolagenaza typu I</td></tr><tr><td>Rnaza</td><td>Sigma</td><td>Sigma # R2020-250 mL</td><td>RNaseZAP</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>Qiagen # 12362</td><td></td></tr><tr><td>Sole do sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (NaCl, KCl itp.)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membranes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mrożone preparaty błonowe z przejściowych lub stabilnie transfekowanych HEK293 z nadekspresją różnych ludzkich podtypów receptorów GABAA: &alfa; 1&beta; 3&gamma; 2, &alfa; 2&beta; 3&gamma; 2, &alfa; 3&beta; 3&gamma; 2, &alfa; 5&beta; 3&gamma;2. Zobacz Ballard et al. 2009, aby zapoznać się ze szczegółowymi metodami.</td><td></td><td></td><td>Służy do oznaczania wiązania</td></tr></tbody></table>

metody odkrywania nowych związków modulujących neuroprzekaźnictwo receptora kwasu gamma-aminomasłowego typu a

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

Ten manuskrypt przedstawia krok po kroku protokół badania związków w receptorach kwasu gamma-aminomasłowego typu A (GABAA) i jego wykorzystanie do identyfikacji nowych cząsteczek aktywnych w testach przedklinicznych od receptora rekombinowanego in vitro do ich efektów farmakologicznych na receptory natywne w wycinkach mózgu gryzoni. W przypadku związków wiążących się w miejscu receptora benzodiazepinowego, pierwszym krokiem jest stworzenie pierwotnego badania przesiewowego, które polega na opracowaniu testów wiązania radioligandów na błonach komórkowych eksprymujących główne podtypy GABAA. Następnie, wykorzystując heterologiczną ekspresję receptorów GABAA u gryzoni i ludzi w oocytach Xenopus lub komórkach HEK 293, możliwe jest zbadanie, w testach elektrofizjologicznych, fizjologicznych właściwości różnych podtypów receptorów i właściwości farmakologicznych zidentyfikowanych związków. Przedstawiony zostanie tu układ oocytów Xenopus, począwszy od izolacji oocytów i ich mikroiniekcji różnymi mRNA, aż po charakterystykę farmakologiczną za pomocą dwuelektrodowych zacisków napięciowych. Na koniec opisane zostaną zapisy przeprowadzone w wycinkach mózgu gryzoni, które są wykorzystywane jako wtórny test fizjologiczny do oceny aktywności cząsteczek w ich natywnych receptorach w dobrze zdefiniowanym obwodzie neuronalnym. Wraz z zastosowaniem leku demonstrowane są zapisy zewnątrzkomórkowe wykorzystujące odpowiedzi populacyjne wielu neuronów.

Tutaj prezentujemy protokoły odkrywania związków aktywnych w receptorach GABAA, od wiązania po fizjologię i farmakologię.

Metody odkrywania nowych związków modulujących neuroprzekaźnictwo receptora kwasu gamma-aminomasłowego typu A

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

Ogólnym celem tego filmu jest zilustrowanie kaskady badań przesiewowych, która pozwala na odkrycie nowych ligandów receptora GABA-A. Zaletą stosowania wiązania radioligandów, zapisu elektrofizjologicznego w oocytach ksenopusów i wycinkach mózgu gryzoni w sposób dosłowny jest to, że można poprawić profil związku. Ostatecznie identyfikuje się silne podtypy, selektywne i skuteczne związki.Pokaz ten poprowadzą Kumico Kambara i Jenna Tognaccini, a także Sonia i Daniel Bertrand z HiQScreen oraz Marie Claire Pflimlin z Roche. Wstrzyknąć od 10 do 50 nanolitrów roztworu zawierającego plazmid za pomocą szklanej igły do mikroiniekcji o średnicy końcówki do 100 mikrometrów zamontowanej na mikromanipulatorze wyposażonym w system wyrzutu ciśnienia lub w automatyczny system iniekcyjny. Aby rozpocząć tę procedurę, utrzymuj oocyty w temperaturze 17 stopni Celsjusza, aby zapobiec ekspresji białek szoku cieplnego.Przechowuj mikropłytkę w przechowywaniu w kontrolowanym termicznie. Następnie rozpuść badane związki, które dały wynik dodatni w teście wiązania w OR2, przy 0,1 i 1000 mikromolach do zapisów elektrofizjologicznych i umieść je w 96-dołkowej płaskodennej płytce polipropylenowej. Aby wykonać zapis napięcia cęgowego dwóch elektrod, umieść płytkę zawierającą oocyty na zautomatyzowanym systemie.Zaprogramować automatyczny system rejestracji za pomocą interfejsu opartego na ikonach z tym schematem w celu odpowiedniego określenia zależności między stężeniem a aktywnością. W celu dopasowania krzywej, korzystając z ilustrowanej krzywej aktywacji stężenia, należy wykreślić amplitudę prądu w funkcji logarytmu stężenia agonisty. W celu zapisu elektrofizjologicznego należy przechowywać mózg w roztworze dACSF z bąbelkami karbogenu w temperaturze pokojowej.Następnie rozetnij lewą formację hipokampa drobną szpatułką. Następnie przekrój poprzecznych szkiełek o grubości 400 mikrometrów od środkowej części hipokampa za pomocą rozdrabniacza tkankowego. Za pomocą pędzla malarskiego przenieś plastry do komory zapisu i utrzymuj je w temperaturze pokojowej przez 45 minut.Następnie przeformuj plastry za pomocą rACSF bąbelkowanego karbogenem w temperaturze 35 stopni Celsjusza i z szybkością 1,5 mililitra na minutę. Aby zarejestrować pojedynczy skok populacji, umieść wycinek mózgu w komorze zamontowanej pod mikroskopem. Wypełnij plasterek za pomocą rACSF z szybkością trzech mililitrów na minutę.Za pomocą ściągacza do pipet wyciągnij mikropipetę ze szkła borokrzemianowego o rezystancji około dwóch megaomów. Napełnij mikropipetę roztworem zawierającym dwa molowe roztwory chlorku sodu i umieść ją w uchwycie na pipety. Umieść mikropipetę rejestrującą w warstwie piramidalnej w obszarze CA1 wycinka hipokampa za pomocą prawego mikromanipulatora.Następnie umieść izolowaną bipolarną elektrodę platynowo-irydową w uchwycie na lewym mikromanipulatorze. Umieść elektrodę stymulacyjnej w obokach Schaffera w obszarze CA1 wycinka hipokampa za pomocą lewego mikromanipulatora. Korzystając z generatora bodźców, dostarczaj impuls prądu do elektrody stymulacyjnej co 30 sekund i stopniowo zwiększaj siłę stymulacji, aż pojawi się skok populacji.Dostosuj siłę bodźca, aby wywołać skok populacji odpowiadający 45% maksymalnej amplitudy, jaką można uzyskać. Aby wykonać sparowane hamowanie impulsów, dostarczaj dwa impulsy prądu do elektrody stymulacyjnej co 30 sekund za pomocą generatora bodźców. Ustaw siłę bodźca tak, aby wywołać skok populacji odpowiadający 45% maksymalnej amplitudy.W celu zbadania związków należy rozcieńczyć związki, które mają być badane w ACSF, tak aby końcowe stężenie DMSO nie było wyższe niż 0,1% Dodać DMSO do roztworu kontrolnego w tym samym stężeniu, co w roztworze złożonym. Rejestruj pojedynczy lub sparowany skok populacji impulsów wywołany przez stymulacje poboczne Schaffera co 30 sekund przez co najmniej 30 minut. Kształt skoku populacji powinien być stabilny w tym okresie odniesienia.Następnie należy przygotować zlewkę z karbogenowanym rACSF zawierającym stałe stężenie badanego związku i perfować wycinek hipokampa roztworem podczas rejestrowania pojedynczych lub sparowanych skoków populacji impulsów. Oceń również powrót do zdrowia po efekcie związku, perfundując plasterek karbogenicznym rACSF bez tego związku. Pokazano tutaj schematyczną reprezentację wycinka hipokampa szczura, z pobocznymi zabezpieczeniami Schaffera pochodzącymi z aksonów komórek piramidalnych CA3 rzutujących na arboryzację dendrytyczną neuronów piramidowych CA1.Mikropipety umieszczono w warstwie piramidalnej w celu zarejestrowania skoków populacji oraz w warstwie radiatum w celu dendrytycznych zapisów pobudzających potencjałów postsynaptycznych pola. Elektroda stymulująca została umieszczona w zabezpieczeniach Schaffera. Rysunek ten pokazuje skoki populacji wywołane przez sparowane bodźce zastosowane przez tę samą elektrodę stymulującą w odstępie 20 milisekund.Odpowiedź populacji na drugi bodziec ma mniejszą amplitudę niż odpowiedź na pierwszy bodziec. Skoki populacji odnotowano przy braku i obecności beta CCM, nieselektywnego receptora GABA A NAM. Beta CCM zwiększyła amplitudę drugiego skoku populacji poprzez częściowe zablokowanie jakiegokolwiek hamowania gabaergicznego typu feed-forward.Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak farmakokinetyka, zajętość receptorów i skuteczność in vivo oraz farmakologia bezpieczeństwa, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak potencjał rozwoju klinicznego zidentyfikowanych związków.

methods-for-discovery-novel-compounds-modulating-gamma-aminobutyric

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W tym artykule opisujemy użyteczną metodę badania funkcji kanałów jonowych bramkowanych ligandem w neuronach ostro izolowanych wycinków mózgu.  Metoda ta polega na użyciu mikropipety wypełnionej lekiem do miejscowego nakładania leków na neurony zarejestrowane przy użyciu standardowych technik patch clamp.

Lokalne zastosowanie leków do badania funkcji nikotynowego receptora acetylocholiny w wycinkach mózgu myszy

Tutaj demonstrujemy użycie fluorescencyjnego barwnika Alexa sprzężonego z α-bungarotoksyną do pomiaru lokalizacji powierzchni receptora GABA A i endocytozy w neuronach hipokampa. Dzięki zastosowaniu konstruktów z krótkim znacznikiem zewnątrzkomórkowym, który wiąże α-bungarotoksynę, można uzyskać analizę transportu endocytarnego białek błony komórkowej.

Używanie znacznika miejsca wiązania α-bungarotoksyny do badania lokalizacji i transportu błony receptora GABA A

Mechanizmy molekularne, które koordynują powstawanie hamujących synaps GABA-ergicznych podczas ontogenezy, są w dużej mierze nieznane. Aby zbadać te procesy, opracowaliśmy system modelu kohodowli, który obejmuje embrionalne średnio kolczaste neurony GABA-ergiczne hodowane razem ze stabilnie transfekowanymi ludzkimi embrionalnymi komórkami nerkowymi 293 (HEK293) wyrażającymi funkcjonalne receptoryGABA A.

Hamujące tworzenie synaps w modelu kokultury obejmującym średnie neurony kolczaste GABA-ergiczne i komórki HEK293 stabilnie eksprymujące receptory GABAA

Celem tego protokołu jest ułatwienie badania receptorów NMDA (NMDAR) na większą skalę i umożliwienie badania modulacyjnych efektów małych cząsteczek i ich zastosowań terapeutycznych.

Wysokoprzepustowy test strumienia wapnia do badania receptorów NMDA z wrażliwością na glicynę/D-serynę i glutaminian

Metoda autoradiografii jest rutynowo stosowana do badania wiązania radioligandów z sekcjami tkanek w celu określenia jakościowej lub ilościowej farmakologii.

Autoradiografia jako prosta i skuteczna metoda wizualizacji i charakterystyki celów farmakologicznych

Interakcje GPCR-β-aresztin to nowa dziedzina w odkrywaniu leków GPCR. Dokładne, precyzyjne i łatwe do skonfigurowania metody są niezbędne do monitorowania takich interakcji w żywych systemach. Pokazujemy test komplementacji strukturalnej do monitorowania interakcji GPCR-β-arrestin w żywych komórkach w czasie rzeczywistym i można go rozszerzyć na dowolny GPCR.

Monitorowanie interakcji GPCR-β-arrestin1/2 w żywych systemach w czasie rzeczywistym w celu przyspieszenia odkrywania leków

Ta metoda wprowadza prostą technikę wykrywania endogennego uwalniania monoamin za pomocą ostrych wycinków mózgu. Zestaw wykorzystuje 48-dołkową płytkę zawierającą uchwyt na tkankę do uwalniania monoamin. Uwolniona monoamina jest analizowana za pomocą HPLC w połączeniu z detekcją elektrochemiczną. Ponadto technika ta zapewnia metodę przesiewową w celu odkrywania leków.

Test na płytce do pomiaru endogennego uwalniania monoamin w ostrych wycinkach mózgu

Protokół opisuje przygotowanie kolumn chromatografii powinowactwa błony komórkowej (CMAC) z unieruchomionymi fragmentami błony komórkowej zawierającymi funkcjonalne białka transbłonowego receptora B kinazy tropomiozyny. Wyjaśniono również zastosowanie kolumn CMAC w identyfikacji wyspecjalizowanych metabolitów roślinnych oddziałujących z tymi receptorami i obecnych w złożonych mieszaninach naturalnych.

Kolumny chromatograficzne powinowactwa błony komórkowej do identyfikacji wyspecjalizowanych metabolitów roślinnych oddziałujących z unieruchomionym receptorem kinazy tropomiozynowej B

Protokół pokazuje, że przeprowadzając mikroprzeszczepy błon synaptycznych do oocytów Xenopus laevis, można rejestrować spójne i niezawodne odpowiedzi receptorów kwasu α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazopropionowego i kwasu γ-aminomasłowego.

Mikrotransplantacja błon synaptycznych w celu reaktywacji ludzkich receptorów synaptycznych do badań funkcjonalnych

Test chemicznego sieciowania BS3 ujawnia zmniejszoną ekspresję receptora GABAA na powierzchni komórek w mózgach myszy w warunkach przewlekłego stresu psychospołecznego.

BS3 Chemiczny test sieciowania: ocena wpływu przewlekłego stresu na prezentację receptora GABAA na powierzchni komórki w mózgu gryzonia

Tutaj opisujemy układ drożdżowy rekonstytuujący ludzką γ-sekretazę. System ten umożliwia identyfikację i badanie mutacji wpływających na aktywność oraz badanie inhibitorów γ-sekretazy (GSI). Wykorzystując właściwości utraty funkcji u rodzinnych mutantów choroby Alzheimera, możliwe jest badanie przesiewowe pod kątem modulatorów γ-sekretazy (GSM).

Saccharomyces cerevisiae Modele choroby Alzheimera do badania genów, mutacji i substancji chemicznych wpływających na produkcję amyloidu beta przez γ-sekretazę

Poznaj metody odkrywania nowych ligandów receptora GABA A wykorzystujące kaskadę badań wiązania radioligandów i techniki elektrofizjologiczne w oocytach Xenopus oraz preparatach mózgu gryzoni.

Metody odkrywania nowych związków modulujących neuroprzekaźnictwo receptora kwasu gamma-aminomasłowego typu A

Przeglądaj więcej filmów