Name: Charakterystyka odpowiedzi izotypu immunoglobuliny zależnej i niezależnej od grasicy u myszy przy użyciu testu immunoenzymatycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Poznaj metodę ELISA do charakteryzacji odpowiedzi izotypów immunoglobulin zależnych i niezależnych od grasicy u myszy. Technika ta umożliwia badaczom ilościowe pomiary aktywacji limfocytów B i odpowiedzi humoralnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty National Institutes of Health R01 CA158402 (P. Xie) i R21 AI128264 (P. Xie), grant Departamentu Obrony W81XWH-13-1-0242 (P. Xie), Pilot Award od Cancer Institute of New Jersey poprzez Grant numer P30CA072720 od National Cancer Institute (P. Xie), Busch Biomedical Grant (P. Xie), Victor Stollar Fellowship (A. Lalani), oraz stypendium Anne B. i Jamesa B. Leathem (S. Zhu).

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi instytucjonalnej komisji etycznej ds. badań na zwierzętach Uniwersytetu Rutgers. Wszystkie myszy są używane zgodnie z wytycznymi NIH i zgodnie z protokołem zwierzęcym zatwierdzonym przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt.
1. Przygotowanie myszy i kolekcja surowic naiwnych myszy
<ol>
	<li>Trzymaj wszystkie myszy do eksperymentów immunizacyjnych w określonym obiekcie dla zwierząt wolnym od patogenów.</li>
	<li>Do badań nad szczepieniami należy użyć dopasowanych płciowo, młodych dorosłych (8-12 tygodni) myszy kontrolnych z nokautem i rodzeństwem miotu, które mają tych samych rodziców i klatki.</li>
	<li>Zaplanuj harmonogramy szczepień i pobierania surowicy, jak pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 1.</li>
	<li>Zbierz naiwną surowicę każdej myszy na 7 dni (-7 dni) przed szczepieniem. Postępuj zgodnie z procedurami krwawienia zadoczodołowego i przygotowania surowicy, jak opisano poniżej w kroku 4.</li>
</ol>
2. Przygotowanie polisacharydu TNP (antygenu TI) i TNP-KLH (antygenu TD)
<ol>
	<li>Dokładnie rozpuścić proszki antygenowe w sterylnym PBS (pH 7,4), aby uzyskać 0,5 mg/ml polisacharydu TNP i 1 mg/ml roztworów podstawowych TNP-KLH. Każdą podstawową zawartość antygenu rozmieścić w sterylnych probówkach do mikrofuge o stężeniu 0,5 ml/probówkę i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania. Unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania podwielokrotności antygenu.</li>
	<li>W dniu wstrzyknięcia należy obliczyć potrzebną objętość polisacharydu TNP (50 μg/100 μl/mysz) lub TNP-KLH (100 μg/100 μl/mysz) w zależności od liczby myszy do wstrzyknięcia. Rozmrozić odpowiednią liczbę podwielokrotności polisacharydu TNP lub TNP-KLH w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>W przypadku wstrzykiwań TNP-KLH należy najpierw rozcieńczyć adiuwant ałunu (40 mg/ml) 3 objętościami sterylnego PBS do końcowego stężenia 10 mg/ml. Upewnij się, że mieszanina adiuwantów ałunu jest dobrze zawieszona przed rozcieńczeniem.</li>
	<li>Połączyć równą objętość 10 mg/ml zawiesiny adiuwantu ałunu z kroku 2.3 i rozmrożonego roztworu TNP-KLH (1 mg/ml) w probówce polipropylenowej o pojemności 5 ml, dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min. Przygotować tę mieszankę TNP-KLH/ałun świeżo przed wstrzyknięciem.</li>
</ol>
3. Immunizacja myszy
<ol>
	<li>Wykonaj dootrzewnowe (i.p.) wstrzyknięcie polisacharydu TNP lub TNP-KLH/ałunu, aby uodpornić myszy za pomocą strzykawek insulinowych o pojemności 1 ml w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Wprowadzić igłę pod kątem około 30°, najlepiej w prawym dolnym kwadrancie każdej myszy, aby zapobiec wstrzyknięciu do narządów wewnętrznych.</li>
	<li>Wstrzyknąć i.p. 100 μL polisacharydu TNP na mysz w dniu 0 w celu immunizacji TI Ag (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A).</li>
	<li>Wstrzyknąć i.p. 200 μl mieszanki TNP-KLH/ałunu (świeżo przygotowanej w kroku 2.4) na mysz w dniu 0 w celu immunizacji TD Ag. Powtórz to samo wstrzyknięcie w dniu 21 jako szczepienie przypominające do badań pamięci (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B).</li>
	<li>Po wstrzyknięciu należy umieścić każdą mysz z powrotem w klatce i utrzymywać wszystkie myszy, którym wstrzyknięto implanty, w określonym stanie wolnym od patogenów.</li>
</ol>
4. Krwawienie retro-orbitalne i przygotowanie surowicy
<ol>
	<li>Zbierz surowice myszy w różnych punktach czasowych: w przypadku immunizacji polisacharydowej TNP, zbierz surowice myszy w dniu -7 i 7 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A); w przypadku immunizacji TNP-KLH/ałunu, zbierz surowice myszy w dniu -7, 7, 14 i 28 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>W przypadku krwawienia zadoczodołowego znieczulenie każdej myszy 5% izofluranem przez 1–2 minuty w komorze bezpieczeństwa biologicznego25. Wykonaj odruch pedałowania, aby zapewnić odpowiednie znieczulenie każdej myszy.</li>
	<li>Przytrzymaj znieczuloną mysz w jednej ręce palcem wskazującym i kciukiem, odciągając skórę wokół gałki ocznej do tyłu, tak aby gałka oczna wystawała z oczodołu25. Włożyć nieheparynizowaną pipetę Pasteura lub rurkę kapilarną pod kątem 45° do wewnętrznego kącika oczodołu pod gałką oczną25.</li>
	<li>Delikatnie uciskaj w dół i delikatnie obracaj pipetę lub rurkę, aby wbić się do żyły i zebrać 150–200 μl krwi do pipety lub probówki. Natychmiast przenieś krew do sterylnej probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml i umieść mysz z powrotem w klatce, aby wyzdrowiała.</li>
	<li>Pozostaw próbki krwi w temperaturze pokojowej przez 1-2 godziny w celu koagulacji.</li>
	<li>Odwirować skrzepnięte próbki krwi w temperaturze 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść klarowną surowicę znajdującą się na wierzchu skrzepu krwi do nowej sterylnej probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Powtórz krok 4.6 jeszcze raz, aby usunąć resztki skrzepu krwi i zebrać przezroczystą surowicę.</li>
	<li>Podwielokrotność surowicy rozlać do sterylnych probówek do mikrofug o pojemności 1,5 ml w stężeniu 50 μl/probówkę i przechowywać surowice w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Naprzemiennie krwawienie z oka w różnych punktach czasowych tak, aby każde oko było krwawione co najwyżej dwa razy w całym eksperymencie. W przypadku krwawienia końcowego zbierz do 1 ml krwi od każdej myszy przed eutanazją. Poddaj mysz eutanazji za pomocą 5% CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy. 
	UWAGA: Limfocyty B śledziony można pobrać do analiz cytometrii przepływowej i badań hodowli in vitro. Przygotowujemy również genomowe DNA ze splenocytów, aby zweryfikować genotyp każdej myszy.</li>
</ol>
5. Test ELISA specyficzny dla izotypu myszy Ig
<ol>
	<li>Przygotować i roztwory przed testem ELISA.
	<ol>
		<li>Przygotować 500 ml buforu sprzęgającego (PBS, pH 7,4).</li>
		<li>Przygotuj 500 ml roztworu do przemywania (PBS-T (0,05% tween 20), pH 7,4).</li>
		<li>Przygotować 100 ml buforu blokującego (1% BSA w PBS, pH 7,4, przechowywany w temperaturze 4 °C).</li>
		<li>Przygotować 1 l buforu substratowego (1 M dietanoloaminy, pH 9,8 (97 ml dietanoloaminy w 1 lH2O, pH dostosowane przy użyciu 10 M HCl) i 0,5 mM MgCl2). Chroń bufor podłoża przed światłem, owijając butelkę folią aluminiową. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować 100 ml roztworu zatrzymującego (3 M NaOH).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pokryj płytki ELISA:
	<ol>
		<li>W przypadku całkowitego izotypu Ig w surowicy ELISA, pokryj 96-dołkowe płytki immunologiczne 10 μg/ml specyficznych dla izotypu poliklonalnych kozich anty-mysich Ig (M, G1, G2a, G2b, G3, A lub E) Abs w buforze sprzęgającym (PBS) w stężeniu 100 μl/basenik.</li>
		<li>W przypadku specyficznego dla TNP izotypu Ig ELISA, pokryj 96-dołkowe płytki immunologiczne 10 μg/ml TNP(38)-BSA w PBS w 100 μl/basenik.</li>
		<li>W przypadku izotypu Ig ELISA o wysokim powinowactwie specyficznym dla TNP, pokryj 96-dołkowe płytki immunologiczne 10 μg/ml TNP(3)-BSA w PBS przy 100 μL/base26. Inkubować płytki w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po inkubacji powlekania przemyć płytki 2 razy 200 μl/studzienkę PBS-T. Wyrzuć bufor do mycia i osusz talerze (postukaj każdą płytką do góry nogami o stos ręczników papierowych) po każdym praniu.</li>
	<li>Zablokować płytki: dodać 200 μl/basenik buforu blokującego (1% BSA w PBS) do powlekanych płytek i inkubować płytki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Podczas gdy płytki się blokują, przygotować rozcieńczenia wzorców izotypu Ig i próbek surowicy w buforze blokującym na oddzielnej, niepoddanej działaniu 96-dołkowej płytce w temperaturze 150 μl/basenik.
	<ol>
		<li>Przygotować wzorce izotypu Ig 250 ng/ml jako wyjściowe stężenie wzorcowe (St01) i wykonać 7 do 10 seryjnych rozcieńczeń wzorców Ig w stosunku 1:2 (St02 do St07 lub St10, <klasa silna = "xfig">Rysunek 2A).</li>
		<li>Przygotować próbki surowicy myszy przy współczynniku rozcieńczenia 1:100 lub 1:500 jako rozcieńczeniu początkowym i wykonać 3 lub 4 seryjne rozcieńczenia 1:10 dla całkowitego izotypu Ig lub seryjne rozcieńczenia 1:5 dla izotypu Ig specyficznego dla TNP dla każdej próbki surowicy (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2A). W przypadku testu IgE ELISA należy przygotować próbki surowicy myszy o współczynniku rozcieńczenia 1:2 jako rozcieńczeniu początkowym i wykonać 3 z następujących po sobie seryjnych rozcieńczeń 1:5 każdej próbki surowicy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zablokowaniu umyć płytki z kroku 5.4 trzykrotnie 200 μl/studzienkę PBS-T i osuszyć płytki po każdym myciu.</li>
	<li>Przenieść 100 μl/basenik rozcieńczonych wzorców izotypu Ig (odpowiednich do wychwytywania i wykrywania Abs) i rozcieńczonych próbek surowicy z etapu 5.5 na płytki przygotowane w kroku 5.6. Inkubować płytki z wzorcami i próbkami w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Umyj płytki 3 razy 200 μl/dołek PBS-T i osusz płytki po każdym myciu.</li>
	<li>Do każdej płytki dodać 100 μl/basenik 10 μg/ml odpowiedniego skoniugowanego z fosfatazą alkaliczną (AP) koziego anty-mysiego Ig (M, G1, G2a, G2b, G3, A lub E) Abs rozcieńczonego w buforze blokującym.</li>
	<li>Inkubować płytki z Abs sprzężonym z AP przez 1 - 2 godziny w temperaturze pokojowej. W celu wykrycia IgE inkubować płytki przez 1–2 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przygotować 1 mg/ml roztworu substratu, rozpuszczając dwie tabletki substratu fosfatazy 5 mg w 10 ml buforu substratowego.</li>
	<li>Umyj każdą płytkę 5 razy 200 μl/dołek PBS-T i osusz płytki po każdym myciu.</li>
	<li>Dodać 100 μl/studzienkę roztworu substratu do każdej płytki. Pozwól, aby reakcja rozwinęła się w temperaturze pokojowej, co zwykle trwa tylko kilka minut.</li>
	<li>Odczyt każdej płytki przy długości fali 405 nm za pomocą czytnika mikropłytek wraz z powiązanym z nim oprogramowaniem.
	<ol>
		<li>Kliknij "Ustawienia", aby ustawić długości fal "Lm1" na "405 nm" i kliknij "OK".</li>
		<li>Kliknij "Szablon", aby przypisać "Puste" studnie, "Standardowe" i "Nieznane" studnie zgodnie z konfiguracją 96-dołkowej płytki.</li>
		<li>W przypadku dołków "Standardy" kliknij "Seria", aby ustawić "Pierwszą próbkę" jako "St01", wybierz "Rozpocznij od" na "Górze" i ustaw "Replikacje" na "2". Zaznacz "Przykładowy deskrypt"i wprowadź "Wartość standardowa": wybierz "Jednostki" jako "ng/ml", ustaw "Wartość początkową" na "250", ustaw "Krok przez" na "2". Kliknij "OK".</li>
		<li>Kliknij "Odczyt", aby odczytać płytkę, gdy najbardziej skoncentrowany wzorzec osiągnie gęstość optyczną (OD) ~1.</li>
		<li>Kliknij menu "Plik" i kliknij "Zapisz", aby zapisać plik.</li>
		<li>Kliknij "Odczyt", aby ponownie odczytać tabliczkę, gdy najbardziej skoncentrowany wzorzec zbliży się do OD405 odpowiednio ~1.5, 2 i 2.5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zatrzymać reakcję, dodając 25 μL/basenik 3M NaOH. Wykonaj kroki od 5.12 do 5.15 dla jednej płytki na raz.</li>
	<li>Analizuj dane ELISA za pomocą oprogramowania powiązanego z czytnikiem mikropłytek:
	<ol>
		<li>Sprawdź wartości OD405 wzorców izotypu Ig odczytywanych plików i wybierz odpowiedni odczyt z dobrym zakresem liniowym wzorców do szczegółowej analizy danych.</li>
		<li>Wybierz program dopasowania 4-parametrowego, aby wykreślić krzywe standardowe. Należy sprawdzić współczynnik krzywej wzorcowej (R2), który musi wynosić > 0,98, aby zapewnić dobrą jakość danych.</li>
		<li>Sprawdzić, czy wartości OD405 w każdej próbce zmniejszają się wraz ze wzrostem współczynników rozcieńczenia. Pobierz stężenie wszystkich rozcieńczonych studzienek na próbki, klikając "Nieznane".</li>
		<li>Wybrać odpowiedni studzienek dla każdej próbki z OD405 w zakresie liniowym krzywej wzorcowej izotypu Ig do obliczenia stężenia.</li>
		<li>Obliczyć stężenie izotypu Ig w surowicy każdej próbki, korzystając ze wzoru: stężenie Ig w surowicy = stężenie w wybranym dołku x współczynnik rozcieńczenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rysuj wykresy i wykonuj analizy statystyczne za pomocą odpowiedniego oprogramowania9,10,11. Wykonaj pionowe wykresy punktowe poziomów izotypu Ig w surowicy, aby porównać odpowiedzi Ig w tym samym punkcie czasowym. W przypadku badań odpowiedzi pamięci TD należy wykonać krzywe odpowiedzi w czasie, aby zbadać odpowiedzi izotypu Ig przed i po szczepieniu przypominającym. Użyj słupków błędów, aby pokazać odchylenie standardowe (SD) każdej grupy próbek. Aby porównać odpowiedzi izotypu Ig między dwoma genotypami myszy, należy użyć niesparowanego testu t dla danych dwustronnych w celu określenia istotności statystycznej. Ustaw wartość p < 0,05 jako znacząco różną.</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym miejscu opisujemy protokół charakterystyki odpowiedzi izotypu TD i TI Ig u myszy za pomocą testu ELISA. Pomyślne wdrożenie tego protokołu wymaga użycia materiałów określonych w tabeli 1, w tym płytek testowych ELISA, Ags do immunizacji, przeciwciał i wzorców specyficznych dla izotypu Ig myszy. Należy zachować ostrożność, aby nie używać płytek poddanych działaniu kultur tkankowych w celu uzyskania testu ELISA. Rozcieńczenia wzorców i próbek surowicy należy przeprowadzić na oddzielnych płytkach niepo...

B limfocyty są głównym czynnikiem odporności humoralnej i jedynym typem komórek u ssaków, które są zdolne do wytwarzania przeciwciał, określanych również jako immunoglobuliny (Ig)1,2. Przeciwciała wydzielane przez limfocyty B zapewniają potężną obronę przed atakującymi patogenami poprzez różne mechanizmy, w tym neutralizację, opsonizację i aktywację dopełniacza, co prowadzi do odporności ochronnej3. Wydzielanie przeciwciał przez limfocyty B osiąga się dopiero po pełnej aktywacji określonych limfocytów B, co zwykle wymaga dwóch odrębnych sygnałów3. Sygnał 1 jest przekazywany przez bezpośrednie wiązanie antygenu (Ag) z receptorem limfocytów B (BCR) wyrażającym się na powierzchni określonych naiwnych limfocytów B3. W zależności od źródła Sygnału 2, aktywację limfocytów B można podzielić na zależną od grasicy (TD) lub niezależną od grasicy (TI)3,4. W odpowiedzi antygenu TD sygnał 2 jest dostarczany przez aktywowane pokrewne komórki pomocnicze T CD4 (TH), które wyrażają CD154, ligand dla receptora kostymulującego CD40 wyrażonego na komórkach B1,2,3. W odpowiedzi antygenu TI sygnał 2 pochodzi albo z zaangażowania receptorów Toll-podobnych (TLR w przypadku typu 1 TI Ag), albo z rozległego sieciowania BCR (w przypadku typu 2 TI Ag) na limfocytach B3,4. Antygeny TI typu 1 (TI-1) to mikrobiologiczne ligandy TLR, w tym lipopolisacharydy bakteryjne (LPS), wirusowe RNA i mikrobiologiczne DNA CpG4,5. Antygeny typu 2 TI (TI-2) mają wysoce powtarzalną strukturę i są w stanie dostarczać przedłużoną i trwałą sygnalizację do komórki B poprzez wielokrotne sieciowanie BCRs4,6. Typowymi przykładami antygenów TI-2 są polisacharydy pneumokokowe i polisacharydy sprzężone z haptenami6,7. Zarówno antygeny TD, jak i TI mogą wywoływać silne odpowiedzi IgM specyficzne dla antygenu, a także mogą indukować produkcję przeciwciał z przełączanymi izotypami (IgG, IgA i IgE) z pomocą komórek prezentujących antygen (APC), takich jak komórki dendrytyczne (DCs)1,2,3. Co więcej, zarówno antygeny TD, jak i TI są w stanie indukować odpowiedzi pamięciowe za pomocą APC, ale antygeny TD są bardziej wydajne w indukowaniu generowania komórek B pamięci3,8.
W tym protokole, odpowiedzi TD i TI Ig są wywoływane u myszy przez dootrzewnową (i.p.) immunizację za pomocą haptenów skoniugowanych z antygenami modelowymi 2,4,6-trinitrofenyl-keyhole limpet hemocyjanin (TNP-KLH) i TNP-polisacharyd (neutralny, silnie rozgałęziony i o dużej masie), odpowiednio9,10,11. Antygeny TD są zwykle używane z adiuwantem w celu zwiększenia produkcji przeciwciał12. W naszym protokole TNP-KLH jest wstrzykiwany z ałunem, powszechnie stosowanym adiuwantem w badaniach nad szczepieniami12. Inne przykłady adiuwantów, które można zastosować, obejmują kompletny lub niekompletny adiuwant Freunda (CFA lub IFA), monofosforylowo-lipidowy A/trehalozy dicorynomykolan (adiuwant "Ribi") i oligodeoksynukleotydy CpG itp.13,14. Po immunizacji surowice myszy są zbierane w różnych punktach czasowych, a przeciwciała specyficzne dla TNP w surowicach są oznaczane ilościowo za pomocą testu immunoenzymatycznego specyficznego dla izotypu Ig (ELISA)9,10,11.
ELISA to test oparty na płytce, który jest szeroko stosowany jako narzędzie diagnostyczne w medycynie, a także jako narzędzie analityczne w badaniach biomedycznych15,16. Służy do wykrywania i ilościowego oznaczania analitów, w tym przeciwciał, hormonów, cytokin, chemokin i różnych antygenów itp. Test ELISA można wykonać w kilku różnych formatach, w tym bezpośrednim, pośrednim, kanapkowym i konkurencyjnym ELISA15,16. Ogólnie rzecz biorąc, polega na unieruchomieniu antygenu na stałej powierzchni, zwykle 96-dołkowej płytce mikromiareczkowej, która jest inkubowana z przeciwciałem pierwotnym. Po inkubacji niezwiązane przeciwciało jest wypłukiwane. W bezpośrednim teście ELISA pierwszorzędowe przeciwciało jest bezpośrednio sprzężone z enzymem (zazwyczaj peroksydazą chrzanową lub fosfatazą alkaliczną), który może rozszczepić substrat chromogenny, aby uzyskać widoczną zmianę koloru wykrytą przez przyrząd do wykrywania sygnału, taki jak spektrofotometr15,16. W przeciwieństwie do tego, jeśli przeciwciało drugorzędowe sprzężone z enzymem jest używane do wiązania przeciwciała pierwszorzędowego, jest to uważane za pośrednie ELISA15,16. Bezpośredni test ELISA jest szybszy, podczas gdy pośredni test ELISA jest bardziej czuły15,16. W teście ELISA typu sandwich płytki są pokryte przeciwciałem "wychwytującym" używanym do unieruchomienia antygenu będącego przedmiotem zainteresowania w próbkach, a następnie przechwycony antygen może być wykryty przez inne przeciwciało "wykrywające" w sposób bezpośredni lub pośredni15,16. Test ELISA typu sandwich zapewnia wysoką swoistość, ponieważ antygen jest wykrywany przez dwa różne przeciwciała antygenu. W konkurencyjnym teście ELISA ustala się konkurencję między antygenem próbki a antygenem związanym z płytką w celu wiązania się z przeciwciałem pierwszorzędowym, a następnie stężenie antygenu w próbce określa się ilościowo, mierząc redukcję sygnału z substratu15,16. Konkurencyjny test ELISA może być wykonywany przy użyciu wyżej wymienionego formatu bezpośredniego lub pośredniego i jest przydatny do wykrywania małych antygenów z tylko jednym epitopem15,16.
Alternatywne techniki pomiaru przeciwciał obejmują test radioimmunologiczny (RIA), test elektrochemiluminescencji (ECL) i test powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR)17. RIA był pierwszym opracowanym testem immunologicznym, który mierzy obecność antygenu (lub przeciwciała) o wysokiej swoistości i czułości przy użyciu odczynników znakowanych radioizotopem18,19. Jednak ze względu na obawy związane z toksycznością radioaktywną, kosztami utylizacji, okresem trwałości i specjalnymi licencjami na pracę z materiałami promieniotwórczymi, ELISA jest lepszą i wygodniejszą techniką do powszechnych zastosowań20,21. ECL jest bardzo czułym testem, w którym reakcje chemiluminescencyjne są inicjowane przy użyciu energii elektrycznej w celu wygenerowania wysoce reaktywnych form ze stabilnych prekursorów na powierzchni elektrody i mogą być używane do pomiaru ilości analitów (takich jak antygeny lub przeciwciała)22. Jednak ECL wymaga specjalnego instrumentu i dlatego nie jest tak szeroko stosowany jak ELISA23. SPR to test bezpośredni, który może być używany do pomiaru wiązania ligandów (np. przeciwciał) z unieruchomionymi cząsteczkami (np. antygenami) na powierzchni chipa czujnika24. SPR wykrywa interakcje w czasie rzeczywistym bardzo dokładnie i nie wymaga użycia znakowanych odczynników, jak w przypadku testu ELISA. Jednak SPR wymaga również specjalnego sprzętu i ma niższą czułość niż ELISA17. Biorąc pod uwagę ograniczenia metod alternatywnych, ELISA jest najbardziej odpowiednią i wygodną techniką dla naszych celów w tym protokole. W tym miejscu opisano zastosowanie testu sandwich ELISA do analizy całkowitych poziomów izotypu Ig oraz procedury pośredniego testu ELISA do analizy izotypów Ig specyficznych dla antygenu.

<table><tbody><tr><td>Przestrajalny czytnik mikropłytek VersaMax</td><td>MDS Technologie analityczne</td><td>VERSAMAX</td><td>Sprzęt do odczytu płytek</td></tr><tr><td>SOFTmax PRO 5.3</td><td>MDS Technologie analityczne</td><td>SOFTmax PRO 5.3</td><td>Oprogramowanie do czytnika płytek</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Prism Oprogramowanie do tworzenia wykresów i statystyk</td></tr><tr><td>TNP-AECM-polisacharyd (FICOLL)</td><td>Technologie</td> <td>biowyszukiwaniaF-1300-10</td><td>A TI Ag do immunizacji</td></tr><tr><td>TNP-KLH</td><td>Biosearch Technologies</td><td>T-5060-5</td><td>A TD Ag do immunizacji</td></tr><tr><td>TNP(38)-BSA</td><td>Biosearch Technologies</td><td>T-5050-10 (współczynnik koniugacji: 38)</td><td>Powłoka Ag do specyficznego dla TNP ELISA</td></tr><tr><td>TNP(3)-BSA</td><td>Biosearch Technologies</td><td>T-5050-10 (współczynnik koniugacji: 3)</td><td>Powłoka Ag dla wysokiego powinowactwa specyficznego dla TNP</td></tr><tr><td>Ig Imject Alum</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>PI-77161</td><td>Adiuwant ałunu do immunizacji</td></tr><tr><td>Falcon Rurki polipropylenowe</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-959-11A Do</td> inkubacji strzykawki <td>insulinowej TNP-KLH/ałun</td></tr><tr><td>BD</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-829-1B</td><td>Do wstrzykiwania i.p. myszom</td></tr><tr><td>Immuno 96-dołkowe płytki, płaskodenne</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-245-61</td><td>Do 96-dołkowych mikropłytek ELISA</td></tr><tr><td>bez obróbki, okrągłodenne</td><td>VWR</td><td>82050-622</td><td>Do seryjnych rozcieńczeń wzorców i próbek</td></tr><tr><td>Substrat fosfatazy, tabletki 5 mg Podłoże</td><td>Sigma</td><td>S0942-200TAB</td><td>Podłoże AP</td></tr><tr><td>Dietanoloamina</td><td>VWR</td><td>IC15251690</td><td>Składnik buforu substratowego</td></tr><tr><td>AP Kozioł anty-mysi IgM</td><td>SouthernBiotech</td><td>1020-01</td><td>Capture Ab dla myszy IgM</td></tr><tr><td>Goat anty-mysz IgG1</td><td>SouthernBiotech</td><td>1070-01</td><td>Capture Ab dla myszy IgG1</td></tr><tr><td>Goat anty-mysz IgG2a</td><td>SouthernBiotech</td><td>1080-01</td><td>Capture Ab dla myszy IgG2a</td></tr><tr><td>Koza anty-mysz IgG2b</td><td>SouthernBiotech</td><td>1090-01</td><td>Capture Ab dla myszy IgG2b</td></tr><tr><td>Goat anty-mysz IgG3</td><td>SouthernBiotech</td><td>1100-01</td><td>Capture Ab dla mysz IgG3</td></tr><tr><td>Koza anty-mysz IgA</td><td>SouthernBiotech</td><td>1040-01</td><td>Capture Ab dla myszy IgA</td></tr><tr><td>Koza anty-mysz IgE</td><td>SouthernBiotech</td><td>1110-01</td><td>Capture Ab dla myszy IgE</td></tr><tr><td>AP-Goat anty-mysia IgM</td><td>SouthernBiotech</td><td>1020-04</td><td>Detekcja Ab dla myszy IgM</td></tr><tr><td>AP-Goat anty-mysz IgG1</td><td>SouthernBiotech</td><td>1070-04</td><td>Wykrywanie Ab dla myszy IgG1</td></tr><tr><td>AP-Goat anty-mysie IgG2a</td><td>SouthernBiotech</td><td>1080-04</td><td>Detekcja Ab dla myszy IgG2a</td></tr><tr><td>AP-Goat anty-mysia IgG2b</td><td>SouthernBiotech</td><td>1090-04</td><td>Detekcja Ab dla myszy IgG2b</td></tr><tr><td>AP-Goat anty-mysia IgG3</td><td>SouthernBiotech</td><td>1100-04</td><td>Detekcja Ab dla myszy IgG3</td></tr><tr><td>AP-Goat anty-mysia IgA</td><td>SouthernBiotech</td><td>1040-04</td><td>Detekcja Ab dla myszy IgA</td></tr><tr><td>AP-Goat anty-mysie IgE</td><td>SouthernBiotech</td><td>1110-04</td><td>Wykrywanie Ab dla myszy IgE</td></tr><tr><td>Mysz IgM standard</td><td>BD Biosciences</td><td>553472</td><td>IgM specyficzne dla TNP, klon&nbsp; G155-228</td></tr><tr><td>Mysi standard IgG1</td><td>BD Biosciences</td><td>554054</td><td>IgG1 specyficzny dla TNP, klon&nbsp; 107.3</td></tr><tr><td>Mysi standard IgG2a</td><td>BD Biosciences</td><td>556651</td><td>IgG2a specyficzny dla TNP, klon&nbsp; G155-178</td></tr><tr><td>Mysi standard IgG2b</td><td>BD Biosciences</td><td>554055</td><td>IgG2b specyficzny dla TNP, klon&nbsp; 49.2</td></tr><tr><td>Mysi standard IgG3</td><td>BD Biosciences</td><td>553486</td><td>IgG3 specyficzny dla KLH, klon&nbsp; A112-3</td></tr><tr><td>Mysi standard IgA</td><td>BD Biosciences</td><td>550924</td><td>IgA indukowane olejem mineralnym, klon&nbsp; MOPC-320</td></tr><tr><td>Mysi standard IgE</td><td>BD Biosciences</td><td>557079</td><td>IgE specyficzne dla TNP, klon&nbsp; Zobacz materiał C38-2</td></tr></tbody></table>

charakterystyka odpowiedzi izotypu immunoglobuliny zależnej i niezależnej od grasicy u myszy przy użyciu testu immunoenzymatycznego

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Przeciwciała, określane również jako immunoglobuliny (Ig), wydzielane przez zróżnicowane limfocyty B, plazmablasty/komórki plazmatyczne, w odporności humoralnej zapewniają potężną obronę przed atakującymi patogenami za pomocą różnych mechanizmów. Jednym z głównych celów szczepień jest indukcja ochronnych przeciwciał specyficznych dla antygenu, aby zapobiec zagrażającym życiu zakażeniom. Zarówno antygeny grasicze zależne (TD), jak i niezależne od grasicy (TI) mogą wywoływać silne odpowiedzi IgM specyficzne dla antygenu, a także mogą indukować produkcję przeciwciał z przełączaniem izotypów (IgG, IgA i IgE), a także wytwarzanie komórek B pamięci za pomocą komórek prezentujących antygen (APC). W tym miejscu opisujemy protokół charakteryzujący odpowiedzi izotypów TD i TI Ig u myszy za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA). W tym protokole odpowiedzi TD i TI Ig są wywoływane u myszy przez immunizację dootrzewnową (ip) za pomocą sprzężonych haptenów antygenów modelowych TNP-KLH (w ałun) i polisacharydów TNP (w PBS). W celu wywołania odpowiedzi pamięciowej TD, szczepienie przypominające TNP-KLH w ałun podaje się po 3 tygodniach od pierwszego szczepienia tym samym antygenem/adiuwantem. Surowice myszy są zbierane w różnych punktach czasowych przed i po szczepieniu. Całkowite poziomy Ig w surowicy i przeciwciała specyficzne dla TNP są następnie oznaczane ilościowo za pomocą odpowiednio specyficznego dla izotypu Ig Sandwich i pośredniego testu ELISA. W celu prawidłowego ilościowego określenia stężenia w surowicy każdego izotypu Ig, próbki muszą być odpowiednio rozcieńczone, aby mieściły się w liniowym zakresie krzywych wzorcowych. Korzystając z tego protokołu, konsekwentnie uzyskiwaliśmy wiarygodne wyniki o wysokiej swoistości i czułości. W połączeniu z innymi uzupełniającymi metodami, takimi jak cytometria przepływowa, hodowla in vitro komórek B śledziony i barwienie immunohistochemiczne (IHC), protokół ten pozwoli naukowcom uzyskać kompleksowe zrozumienie odpowiedzi przeciwciał w danym środowisku eksperymentalnym.

Użyliśmy tego protokołu do zbadania roli krytycznego regulatora układu odpornościowego, TRAF3, w odpowiedziach izotypów TI i TD Ig9,10,11. TRAF3 bezpośrednio lub pośrednio reguluje transdukcję sygnału wielu wrodzonych i nabytych receptorów immunologicznych, w tym między innymi nadrodziny receptorów TNF, receptorów Toll-podobnych i receptora limfocytów T/CD2827,<...

W tym artykule opisujemy protokół charakteryzujący odpowiedzi immunoglobuliny (Ig) zależnej od T i niezależnej od T u myszy za pomocą testu ELISA. Ta metoda stosowana samodzielnie lub w połączeniu z cytometrią przepływową pozwoli naukowcom zidentyfikować różnice w odpowiedziach izotypu Ig za pośrednictwem komórek B u myszy po immunizacji antygenu T zależnej i niezależnej od T.

Charakterystyka odpowiedzi izotypu immunoglobuliny zależnej i niezależnej od grasicy u myszy przy użyciu testu immunoenzymatycznego

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii dotyczące indukowanej immunizacją antygenową, zależnych i niezależnych odpowiedzi przeciwciał, a także aktywacji limfocytów B i reakcji centrum rozrodczego. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona wiarygodne i ilościowe pomiary odpowiedzi izotypu Ig z bezpośrednim porównaniem aktywacji komórek B i odporności humoralnej u myszy. W przypadku immunizacji polisacharydowej TNP należy załadować jedną mililitrową strzykawkę insulinową na mysz ze 100 mikrolitrami świeżo przygotowanego roztworu antygenu i wprowadzić igłę do prawego dolnego kwadrantu każdego zwierzęcia pod kątem około 30 stopni, aby uniknąć wstrzyknięcia dolnego narządu.Po wstrzyknięciu wszystkim myszom należy umieścić zwierzęta z powrotem w klatkach w celu umieszczenia ich w określonym obiekcie wolnym od patogenów. W odpowiednich punktach doświadczalnych należy pobrać od 150 do 200 mikrolitrów krwi od każdego uodparnionego zwierzęcia przez krwawienie zaoczodołowe i pozostawić próbki do koagulacji w temperaturze pokojowej przez jedną do dwóch godzin. Pod koniec inkubacji odwirować zakrzepłe próbki krwi i przenieść klarowną surowicę z górnej części każdego skrzepu krwi do sterylnej 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki.Po drugim odwirowaniu w celu usunięcia wszelkich resztek skrzepu krwi, przenieś 50 mikrolitrów surowicy do pojedynczych sterylnych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 mililitra w celu przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Przed posiewem pokryć poszczególne 96-dołkowe płytki immunologiczne odpowiednim stężeniem mysich przeciwciał wychwytujących specyficznych dla izotypu Ig dla całkowitego izotypu Ig w surowicy antygenu TNP-38BSA dla izotypu Ig swoistego dla TNP lub antygenu TNP-3BSA dla izotypu Ig specyficznego dla TNP o wysokim powinowactwie i inkubować powlekane płytki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka umyj płytki dwa razy 200 mikrolitrami buforu do płukania na studzienkę.Wyrzuć bufor do mycia i osusz talerze na stosie ręczników papierowych po każdym praniu. Następnie zablokuj płytki 200 mikrolitrami buforu blokującego na studzienkę na godzinną inkubację w temperaturze pokojowej. Podczas blokowania płytek należy przygotować odpowiedni roztwór wzorcowy i rozcieńczenia surowicy oraz bufor blokujący w oddzielnej, niepoddanej działaniu substancji 96-dołkowej płytce o objętości 150 mikrolitrów na dołek, jak wskazano.Następnie przemyć płytkę ELISA buforem do przemywania zgodnie z demonstracją i dodać 100 mikrolitrów każdego rozcieńczonego wzorca izotypu Ig i próbki surowicy do odpowiednich dołków płytki ELISA. Po całonocnej inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza umyć płytki, jak pokazano, i dodać 100 mikrolitrów odpowiedniego przeciwciała swoistego dla izotypu sprzężonego z fosfatazą alkaliczną, rozcieńczonego w buforze blokującym, do każdej studzienki na jedną do dwóch godzin inkubacji w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji umyć płytki i dodać 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu substratu do każdej studzienki.Monitorowanie reakcji w miarę jej rozwoju w ciągu następnych kilku minut w temperaturze pokojowej. Gdy reakcja jest wystarczająco solidna, aby można ją było przeanalizować, umieść płytkę w czytniku mikropłytek i kliknij ustawienia, aby ustawić długość fali na 405 nanometrów. Kliknij przycisk OK, a następnie kliknij przycisk szablon, aby przypisać odpowiednie puste, standardowe i nieznane studzienki zgodnie z konfiguracją płytki 96-dołkowej.Następnie, gdy najbardziej skoncentrowany wzorzec osiągnie gęstość optyczną około jednego, 1,5, dwóch i 2,5, kliknij odczyt, aby odczytać płytkę i zapisać wynikowy plik danych po każdej analizie. W przypadku braku immunizacji obserwuje się wzrost podstawowych poziomów IgM, IgG2a, IgG2b, IgG3 i IgA w surowicy u myszy z nokautem czynnika trzeciego lub B-TRAF3 związanych z receptorem TNF swoistych dla komórek B, w porównaniu z dopasowanymi płciowo i wiekowo zwierzętami kontrolnymi B-TRAF3 wystarczającymi do miotu. Siedem dni po immunizacji polisacharydem TNP lub TNP-KLH, jak właśnie wykazano, analiza odpowiedzi izotypu Ig niezależnego od grasicy na szczepienie ujawnia znacznie wyższe poziomy IgG3 specyficzne dla TNP swoiste dla grasicy, a także podwyższone poziomy IgG2b specyficzne dla TNP w grasicy u myszy z nokautem TRAF3 specyficznych dla komórek szpikowych w porównaniu z kontrolami z miotu.Ponadto ocena odpowiedzi pierwotnych i pamięciowych myszy zależnych od grasicy na immunizację TNP-KLH wskazuje na obecność częściowo zmniejszonych pierwotnych odpowiedzi IgM zależnych od grasicy oraz wadliwych odpowiedzi pierwotnych i pamięciowych IgG1 u myszy z nokautem TRAF3 specyficznych dla komórek T. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że test ELISA ma granice wykrywalności, które są zwykle definiowane przez liniowy zakres krzywych standardowych, a zatem może być wymagane wielokrotne rozcieńczenie próbki. Po tej procedurze można wykonać inne metody uzupełniające, takie jak cytometria przepływowa lub punkt L, aby uzyskać kompleksowe zrozumienie odpowiedzi przeciwciał w danym środowisku eksperymentalnym.

characterization-thymus-dependent-thymus-independent-immunoglobulin

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje metodę oceny odpowiedzi immunologicznej przeciwciał na nową szczepionkę z adiuwantem nanoemulsyjnym u wstępnie zaszczepionych myszy. Immunizacja wzmacnia odpowiedź przeciwciał, co potwierdza się przez określenie miana przeciwciał IgG.

Pomiar poziomu immunoglobuliny G w stosunku do testowanej szczepionki w surowicy myszy

Tutaj opisujemy skuteczną metodę izolacji, identyfikacji i oczyszczania mysich komórek nabłonka grasicy (TEC). Protokół może być wykorzystany do badań funkcji grasicy pod kątem prawidłowego rozwoju komórek T, dysfunkcji grasicy i rekonstytucji limfocytów T.

Izolacja, identyfikacja i oczyszczanie mysich komórek nabłonkowych grasicy

Analiza in vitro rekombinacji przełączników klas u myszy jest trudna ze względu na cytofilne cząsteczki IgE związane z receptorami Fc na powierzchni komórek B.  Opisujemy metodę wykrywania IgE za pomocą rozszczepienia IgE związanego powierzchniowo za pośrednictwem trypsyny przed utrwaleniem i przepuszczalnością w celu barwienia fluorescencji cytoplazmatycznej.

Wykrywanie prawdziwych mysich komórek linii B z ekspresją IgE

Ten raport zawiera szczegółowy opis przeszczepiania mysiej thymi od myszy dawców w różnym wieku pod torebkę nerkową mysich biorców z niedoborem odporności. Celem tego podejścia jest modelowanie rozwoju limfocytów T i zdarzeń selekcji grasicy in vivo.

Izolacja i przeszczep różnych wiekowych mysich przeszczepów grasicy.

Naiwne limfocyty T CD4+ polaryzują się na różne podzbiory w zależności od środowiska w momencie aktywacji.  Różnicowanie naiwnych limfocytów T CD4 + do różnych podzbiorów efektorowych można osiągnąć in vitro poprzez dodanie bodźców receptora limfocytów T i specyficznych sygnałów cytokin.

Naiwna izolacja mysich limfocytów T CD4 + i różnicowanie in vitro w podzbiory limfocytów T

Ten artykuł opisuje metodologię in vivo i in vitro do charakteryzowania przodków osiadania grasicy poprzez analizę kinetyki powstawania, fenotypu i liczby ich potomstwa limfocytów T.

Charakterystyka progenitorów osadzania się grasicy w zarodku myszy za pomocą testów in vivo i in vitro

Przedstawiono zoptymalizowany protokół generowania przeciwciał monoklonalnych opartych na technologii hybrydomy. Myszy uodporniono immunokoniugatem. Komórki śledziony zostały połączone za pomocą PEG i impulsu elektrycznego z nieśmiertelnymi komórkami szpiczaka. Komórki hybrydoma wytwarzające przeciwciała wybrano za pomocą HAT i badania przesiewowego ELISA swoistego dla antygenu.

Wytwarzanie mysich przeciwciał monoklonalnych za pomocą technologii Hybridoma

Leki oparte na przeciwciałach zrewolucjonizowały leczenie chorób zapalnych. Oprócz bezpośredniego wpływu na określone cele, przeciwciała mogą aktywować makrofagi, aby stały się przeciwzapalne. Protokół ten opisuje, w jaki sposób można ocenić aktywację makrofagów przeciwzapalnych in vitro, przy użyciu makrofagów szpiku kostnego myszy, oraz in vivo, przy użyciu makrofagów otrzewnowych.

Ocena wpływu leków opartych na przeciwciałach na mysi szpik kostny i aktywację makrofagów otrzewnowej

W tym badaniu prezentujemy nowatorski i skuteczny protokół izolacji limfocytów z plastrów Peyera (PPs), który może być następnie wykorzystany do testów funkcjonalnych in vivo i in vitro, a także do badań cytometrycznych komórek T pomocniczych pęcherzyków i komórek B centrum rozrodczego.

Odkrywanie kluczowych graczy odporności humoralnej: zaawansowany i zoptymalizowany protokół izolacji limfocytów z plastrów mysich Peyera

Opisujemy tutaj prostą analizę heterogeniczności przedziału mysich komórek odpornościowych B w tkankach otrzewnej, śledziony i szpiku kostnego za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół można dostosować i rozszerzyć na inne tkanki myszy.

Charakterystyka cytometrii przepływowej rozwoju mysich komórek B

Dostarczamy szczegółowy protokół do izolowania i identyfikacji rzadkich populacji limfocytów T specyficznych dla antygenu w płucach myszy poprzez magnetyczne wzbogacanie limfocytów T na bazie kulek magnetycznych i tetramery peptydu:głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC).

Identyfikacja rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu z płuc myszy za pomocą peptydów: głównych tetramerów kompleksu zgodności tkankowej

Poznaj metodę ELISA do charakteryzacji odpowiedzi izotypów immunoglobulin zależnych i niezależnych od grasicy u myszy. Technika ta umożliwia badaczom ilościowe pomiary aktywacji limfocytów B i odpowiedzi humoralnej.

Charakterystyka odpowiedzi izotypu immunoglobuliny zależnej i niezależnej od grasicy u myszy przy użyciu testu immunoenzymatycznego (Wideo) | JoVE Journal

Charakterystyka odpowiedzi izotypu immunoglobuliny zależnej i niezależnej od grasicy u myszy przy użyciu testu immunoenzymatycznego

Przeglądaj więcej filmów