Charakterystyka odpowiedzi izotypu immunoglobuliny zależnej i niezależnej od grasicy u myszy przy użyciu testu immunoenzymatycznego

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii dotyczące indukowanej immunizacją antygenową, zależnych i niezależnych odpowiedzi przeciwciał, a także aktywacji limfocytów B i reakcji centrum rozrodczego. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona wiarygodne i ilościowe pomiary odpowiedzi izotypu Ig z bezpośrednim porównaniem aktywacji komórek B i odporności humoralnej u myszy. W przypadku immunizacji polisacharydowej TNP należy załadować jedną mililitrową strzykawkę insulinową na mysz ze 100 mikrolitrami świeżo przygotowanego roztworu antygenu i wprowadzić igłę do prawego dolnego kwadrantu każdego zwierzęcia pod kątem około 30 stopni, aby uniknąć wstrzyknięcia dolnego narządu.

Po wstrzyknięciu wszystkim myszom należy umieścić zwierzęta z powrotem w klatkach w celu umieszczenia ich w określonym obiekcie wolnym od patogenów. W odpowiednich punktach doświadczalnych należy pobrać od 150 do 200 mikrolitrów krwi od każdego uodparnionego zwierzęcia przez krwawienie zaoczodołowe i pozostawić próbki do koagulacji w temperaturze pokojowej przez jedną do dwóch godzin. Pod koniec inkubacji odwirować zakrzepłe próbki krwi i przenieść klarowną surowicę z górnej części każdego skrzepu krwi do sterylnej 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki.

Po drugim odwirowaniu w celu usunięcia wszelkich resztek skrzepu krwi, przenieś 50 mikrolitrów surowicy do pojedynczych sterylnych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 mililitra w celu przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Przed posiewem pokryć poszczególne 96-dołkowe płytki immunologiczne odpowiednim stężeniem mysich przeciwciał wychwytujących specyficznych dla izotypu Ig dla całkowitego izotypu Ig w surowicy antygenu TNP-38BSA dla izotypu Ig swoistego dla TNP lub antygenu TNP-3BSA dla izotypu Ig specyficznego dla TNP o wysokim powinowactwie i inkubować powlekane płytki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka umyj płytki dwa razy 200 mikrolitrami buforu do płukania na studzienkę.

Wyrzuć bufor do mycia i osusz talerze na stosie ręczników papierowych po każdym praniu. Następnie zablokuj płytki 200 mikrolitrami buforu blokującego na studzienkę na godzinną inkubację w temperaturze pokojowej. Podczas blokowania płytek należy przygotować odpowiedni roztwór wzorcowy i rozcieńczenia surowicy oraz bufor blokujący w oddzielnej, niepoddanej działaniu substancji 96-dołkowej płytce o objętości 150 mikrolitrów na dołek, jak wskazano.

Następnie przemyć płytkę ELISA buforem do przemywania zgodnie z demonstracją i dodać 100 mikrolitrów każdego rozcieńczonego wzorca izotypu Ig i próbki surowicy do odpowiednich dołków płytki ELISA. Po całonocnej inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza umyć płytki, jak pokazano, i dodać 100 mikrolitrów odpowiedniego przeciwciała swoistego dla izotypu sprzężonego z fosfatazą alkaliczną, rozcieńczonego w buforze blokującym, do każdej studzienki na jedną do dwóch godzin inkubacji w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji umyć płytki i dodać 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu substratu do każdej studzienki.

Monitorowanie reakcji w miarę jej rozwoju w ciągu następnych kilku minut w temperaturze pokojowej. Gdy reakcja jest wystarczająco solidna, aby można ją było przeanalizować, umieść płytkę w czytniku mikropłytek i kliknij ustawienia, aby ustawić długość fali na 405 nanometrów. Kliknij przycisk OK, a następnie kliknij przycisk szablon, aby przypisać odpowiednie puste, standardowe i nieznane studzienki zgodnie z konfiguracją płytki 96-dołkowej.

Następnie, gdy najbardziej skoncentrowany wzorzec osiągnie gęstość optyczną około jednego, 1,5, dwóch i 2,5, kliknij odczyt, aby odczytać płytkę i zapisać wynikowy plik danych po każdej analizie. W przypadku braku immunizacji obserwuje się wzrost podstawowych poziomów IgM, IgG2a, IgG2b, IgG3 i IgA w surowicy u myszy z nokautem czynnika trzeciego lub B-TRAF3 związanych z receptorem TNF swoistych dla komórek B, w porównaniu z dopasowanymi płciowo i wiekowo zwierzętami kontrolnymi B-TRAF3 wystarczającymi do miotu. Siedem dni po immunizacji polisacharydem TNP lub TNP-KLH, jak właśnie wykazano, analiza odpowiedzi izotypu Ig niezależnego od grasicy na szczepienie ujawnia znacznie wyższe poziomy IgG3 specyficzne dla TNP swoiste dla grasicy, a także podwyższone poziomy IgG2b specyficzne dla TNP w grasicy u myszy z nokautem TRAF3 specyficznych dla komórek szpikowych w porównaniu z kontrolami z miotu.

Ponadto ocena odpowiedzi pierwotnych i pamięciowych myszy zależnych od grasicy na immunizację TNP-KLH wskazuje na obecność częściowo zmniejszonych pierwotnych odpowiedzi IgM zależnych od grasicy oraz wadliwych odpowiedzi pierwotnych i pamięciowych IgG1 u myszy z nokautem TRAF3 specyficznych dla komórek T. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że test ELISA ma granice wykrywalności, które są zwykle definiowane przez liniowy zakres krzywych standardowych, a zatem może być wymagane wielokrotne rozcieńczenie próbki. Po tej procedurze można wykonać inne metody uzupełniające, takie jak cytometria przepływowa lub punkt L, aby uzyskać kompleksowe zrozumienie odpowiedzi przeciwciał w danym środowisku eksperymentalnym.