Szybki test zjadliwości bakterii oparty na obrazie przy użyciu ameby
27 czerwca 2018
Tutaj prezentujemy protokół pomiaru zjadliwości bakterii planktonowych lub przyczepionych powierzchniowo przy użyciu D. discoideum (ameba) jako gospodarza. Wirulencję mierzy się przez okres 1 godziny, a zabijanie gospodarza określa się ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i analizy obrazu. Demonstrujemy ten protokół za pomocą bakterii P. aeruginosa.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie patogenezy bakterii, takie jak to, kiedy w komórkach bakteryjnych dochodzi do ekspresji zabijających gospodarza efektorów wirulencji i jakie są stany wirulencji komórek implantonicznych przyczepionych powierzchniowo? Główną zaletą tej techniki jest to, że jest szybka, ilościowa, a komórki gospodarza są stosunkowo łatwe w obsłudze. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zauważyliśmy, że przyczepiona powierzchniowo subpopulacja implantonów Pseudomonas ma różne fenotypy zabijające gospodarza.
Aby rozpocząć uprawę szczepu E.coli BR przez noc, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie doprowadź kulturę E. coli do temperatury pokojowej. Za pomocą drewnianego patyczka zatruj amebę w 750 l kultury.
Natychmiast dodaj 700 l mieszaniny ameby E.coli do płytki GYP. Przechyl płytkę, aby równomiernie rozprowadzić kulturę na powierzchni płytki. Następnie umieść talerz w pudełku, które utrzymuje wysoką wilgotność.
Inkubować płytkę wewnątrz pudełka w temperaturze 22 °C przez cztery do pięciu dni. Po zakończeniu okresu inkubacji użyj sterylnej końcówki pipety, aby zebrać zarodniki ameby z połowy płytki. Następnie pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić amebę na końcówce pipety w 1 ml pożywki PS.
Przenieść mieszaninę inokulatu do kolby o pojemności 250 ml z 25 ml pożywki PS uzupełnionej antybiotykowym roztworem przeciwmikotycznym. Hoduj amebę w temperaturze 22 C w obrotowej wytrząsarce z prędkością 100 obr./min. Po wyhodowaniu Pseudomonas aeruginosa przez noc rozcieńczyć kulturę pożywką PSB na 6 cm szalce Petriego.
Następnie wstrząśnij kulturą na rotatorze stołowym ustawionym na 100 obr./min w temperaturze 37 °C. Najpierw kuchenkę mikrofalową 50 ml 1% agaru w buforze DB w kolbie o pojemności 250 ml. Dodaj 15 l wapnia AM do 15 ml stopionego agaru i delikatnie wymieszaj. Wlej stopioną mieszaninę agaru do szklanej płytki o wymiarach 12 na 10 cm i pozwól agarowi zestalić się na dziesięć minut w temperaturze pokojowej.
Następnie za pomocą metalowej linijki i wydrukowanej siatki pokrój zestaloną podkładkę agarową na mniejsze odcinki o wymiarach 1,5 na 1,5 cm. Upewnij się, że żel pozostaje nawilżony, dopóki nie będzie gotowy do użycia. Następnie, aby wyizolować komórki przyczepione do powierzchni, usuń płynne podłoże z szalki Petriego.
Następnie umyj naczynie 1 ml buforu rozwojowego, aby usunąć komórki planktonowe. Aby oznaczyć zjadliwość komórek bakteryjnych przyczepionych powierzchniowo, należy dodać 10 l komórek ameby z wcześniej uzyskanych komórek bakteryjnych przyczepionych powierzchniowo. Aby wyizolować komórki planktonowe, przenieś 10 l kultury na świeżą szalkę Petriego.
Następnie należy oznaczyć zjadliwość komórek planktonowych poprzez zmieszanie 10 l komórek ameby z wcześniej uzyskanymi bakteriami planktonowymi. Natychmiast umieść małą podkładkę agarową na odpowiedniej mieszance bakterii i ameby na powierzchni szalki Petriego. Następnie usuń nadmiar płynu, delikatnie pipetując nadmiar płynu i pozostaw naczynie do wyschnięcia na 20 minut.
Przykryj naczynie pokrywką i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 40 minut. Na koniec użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby uzyskać obrazy dla co najmniej 100 komórek ameby. W tym protokole oznaczono zjadliwość planktonu i przyczepionych powierzchniowo komórek Pseudomonas aeruginosa.
Przyczepiony powierzchniowo dziki typ Pseudomonas aeruginosa zabił amebę, na co wskazuje okrągły kształt komórki ameby i obecność fluorescencji kalceiny. W porównaniu z komórkami planktonowymi, przyczepiony do powierzchni typ dziki Pseudomonas aeruginosa miał wysoki wskaźnik zabijania gospodarza. Komórki planktonowe zostały skonsumowane przez amebę, na co wskazują amorficzne kształty komórek ameby i stosunkowo niewielka fluorescencja kalceiny.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o użyciu świeżego zapasu kalceiny AM i komórek ameby oraz uważnie śledzić gęstość optyczną ameby. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak profilowanie transkrypcji, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: Które geny są aktywowane w subpopulacji planktonowej i przyczepionej powierzchniowo? Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić szybki test wirulencji oparty na obrazie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół pomiaru wirulencji bakterii z wykorzystaniem ameby D. discoideum jako gospodarza. Metoda ta pozwala na szybką i ilościową ocenę efektów zabijania gospodarza w ciągu jednej godziny, z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej do analizy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Patogeneza
- Biologia komórki
Wprowadzenie
- Zrozumienie wirulencji bakteryjnej jest kluczowe dla opracowywania metod leczenia.
- Różne subpopulacje bakterii mogą wykazywać zróżnicowane cechy wirulencji.
- D. discoideum służy jako modelowy gospodarz do badania interakcji bakteryjnych.
- Mikroskopia fluorescencyjna stanowi potężne narzędzie do wizualizacji efektów zabijania gospodarza.
Cel badania
- Ilościowe określenie zjadliwości bakterii planktonicznych oraz przytwierdzonych do powierzchni.
- Zbadanie ekspresji czynników zjadliwości w komórkach bakteryjnych.
- Analiza stanów zjadliwości bakterii przytwierdzonych do powierzchni.
Zastosowane metody
- Kultywuj szczep E. coli BR przez noc.
- Doprowadź kulturę do temperatury pokojowej.
- Zaszczep amebę D. discoideum do kultury E. coli.
- Zmierz efekty zabijania gospodarza za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
Główne wyniki
- Protokół ten pozwala na skuteczne ilościowe określenie zjadliwości w krótkim czasie.
- Różne fenotypy Pseudomonas wykazują odmienne zdolności do zabijania gospodarza.
- Mikroskopia fluorescencyjna umożliwia szczegółową analizę interakcji z gospodarzem.
- Metoda jest prosta i powtarzalna dla badaczy.
Wnioski
- Niniejszy protokół jest cennym narzędziem do badania patogenezy bakteryjnej.
- Umożliwia on lepsze zrozumienie ekspresji czynników wirulencji u bakterii.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie w celu eksploracji dynamiki interakcji między bakterią a gospodarzem.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Szybka, ilościowa ocena wirulencji bakterii z wykorzystaniem ameb i obrazowania fluorescencyjnego umożliwia wczesną redukcję ryzyka w programach poszukiwania leków przeciwinfekcyjnych. Metoda ta dostarcza praktycznych informacji o stanach wirulencji planktonicznych oraz przytwierdzonych do powierzchni subpopulacji bakterii, co zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów i priorytetyzacji związków wiodących. Jej szybkość i skalowalność ułatwiają efektywną selekcję potencjalnych interwencji w procesie odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia szybką analizę fenotypów wirulencji bakterii na poziomie pojedynczych komórek.
- Wspiera walidację funkcjonalną szlaków związanych z wirulencją w różnych stanach bakteryjnych.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez rozróżnienie subpopulacji przytwierdzonych do powierzchni od subpopulacji planktonicznych.
- Dostarcza ilościowe wskaźniki uśmiercania gospodarza w celu optymalizacji wyboru i selekcji celów.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia standaryzowane odczyty oparte na obrazowaniu, odpowiednie dla formatów wysokoprzepustowych badań przesiewowych.
- Zmniejsza stopień złożoności poprzez eliminację linii komórkowych ssaków, co usprawnia przygotowanie testu i zwiększa jego powtarzalność.
- Umożliwia wiarygodne porównanie wpływu związków na wirulencję bakterii w różnych subpopulacjach.
- Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy dla wielu gatunków bakterii oraz różnych etapów tworzenia biofilmu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne ze strategiami translacyjnymi w zakresie biomarkerów poprzez walidację fenotypów wirulencji zarówno w amebach, jak i w makrofagach ssaków.
- Zapewnia ciągłość od wczesnego etapu odkrywania do przedklinicznej walidacji strategii antywirulencyjnych.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju z uwzględnieniem analizy ryzyka w oparciu o ilościowe wskaźniki wirulencji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten oparty na obrazowaniu test wirulencji integruje etapy wczesnego odkrywania i identyfikacji wiodących związków, dostarczając szybkich, ilościowych danych niezbędnych do walidacji celu oraz selekcji związków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących ekspresji efektorów wirulencji i aktywacji szlaków w różnych stanach bakteryjnych.
- Przesiew: Oferuje powtarzalne, ilościowe wskaźniki uśmiercania gospodarza do oceny związków i standaryzacji testów.
- Analityka: Generuje metryki pochodne z obrazowania, umożliwiające statystyczne porównanie wirulencji w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy systemy modelowe poprzez walidację wyników zarówno w komórkach ameb, jak i ssaków.
- Zastosowania przedsiębiorstw: Adaptowalne do różnych gatunków bakterii i etapów tworzenia biofilmu, co wspiera szerokie zastosowanie w badaniach i rozwoju (R&D).
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów wirulencji i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną.
- Wartość operacyjna: Optymalizuje przepływy pracy dzięki szybkim, zestandaryzowanym i skalowalnym formatom testów.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji typu go/no-go oraz efektywne pod względem kapitałowym zarządzanie portfolio.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów na leki przeciwinfekcyjne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obrazowaniu fluorescencyjnym i ilościowej analizie obrazu.
- Wymaga dostępu do mikroskopii epifluorescencyjnej oraz kompatybilnego oprogramowania do analizy obrazu.
- Wymaga standaryzacji konfiguracji testu i interpretacji danych pomiędzy zespołami.
- Możliwość adaptacji dla różnych gatunków bakterii i etapów rozwoju biofilmu poprzez optymalizację protokołu.
- Zależność od jakości odczynników, takich jak świeży calcein-AM oraz żywe szczepy ameb.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:46
Growth and Maintenance of Amoebae
1:57
The Growth of P. aeruginosa
2:16
Preparation of Agar Pad, Preparation of Bacteria-amoeba Sample, and Image Acquisition
4:05
Results: Virulence of P. aeruginosa is Upregulated in Surface-attached Populations
4:38
Conclusion
