Name: Szybki test zjadliwości bakterii oparty na obrazie przy użyciu ameby (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Poznaj szybki test zjadliwości bakterii oparty na obrazie z użyciem ameby D. discoideum. Metoda ta pozwala ilościowo ocenić efekty zabijania komórek gospodarza w ciągu jednej godziny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

KP i AS napisali i poprawili rękopis. KP przeprowadził eksperymenty i analizę. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health (NIH) Career Transition Award (K22AI112816) dla AS.

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine.
1. i roztwory
<ol>
	<li>Przygotuj bulion lizogeniczny (LB) w szklanej butelce o pojemności 1 l, dodając 25 g mieszanki LB-Miller w 1 l podwójnie destylowanej wody (ddH2O). W przypadku szalek Petriego dodaj dodatkowe 20 g agaru. Autoklaw do sterylizacji. Wlej 25 ml stopionego podłoża agarowego do szalek Petriego o średnicy 10 cm i pozostaw do zestalenia się w temperaturze pokojowej. Przechowywać płynne podłoża w temperaturze pokojowej, a płytki agarowe w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj płytki z peptonem drożdżowym glukozy (GYP) w szklanej butelce o pojemności 1 l, mieszając 1 g D-glukozy, 2 g peptonu, 0,25 g ekstraktu drożdżowego, 4,2 g KH2PO4, 5,1 g Na2HPO47H2O i 25 g agaru w 1 l ddH2O. Autoklaw do sterylizacji. Wlej 25 ml stopionego agaru do szalek Petriego o średnicy 10 cm i pozostaw do zestalenia się w temperaturze pokojowej. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę z peptonem S (PS) w szklanej butelce o pojemności 1 l, mieszając 10 g peptonu, 7 g ekstraktu drożdżowego, 15 g D-glukozy, 0,12 g Na2HPO47H2O, 1,4 g KH2PO4, 40 μg witaminy B12 i 80 μg kwasu foliowego w 800 ml ddH2O. Skalibruj elektroniczny pH-metr za pomocą pH 4 i pH 7 standardy, jeśli pH-metr nie był używany w ciągu jednego dnia.
	<ol>
		<li>Zmierz pH pożywki PS za pomocą pH-metru. Dodać 5 M KOH lub 5 M H3PO4, aby dostosować pH do 6,5. Dostosować końcową objętość do 1 l za pomocą ddH2O. Filtr wysterylizować za pomocą filtra próżniowego 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Postępuj ostrożnie z regulacją pH, nosząc sprzęt ochronny, w tym rękawice, odzież ochronną, ochronę oczu i ochronę twarzy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 10x bufor Development Buffer Prime (DB') w szklanej butelce o pojemności 1 l, dodając 3,4 g KH2PO4, 13,4 g Na2HPO4 7H2O i ddH2O do całkowitej objętości 800 ml. Skalibruj elektroniczny pH-metr przy użyciu wzorców pH 4 i pH 7, jeśli pH-metr nie był używany w ciągu jednego dnia.
	<ol>
		<li>Zmierzyć pH buforu za pomocą elektronicznego pH-metru. Dostosuj pH do 6,5, delikatnie dodając 5 M KOH lub 5 M H3PO4 w zależności od potrzeb. Dostosować końcową objętość do 1 l za pomocą ddH2O i sterylizować w autoklawie. Przechowywać w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Postępuj ostrożnie z regulacją pH, nosząc sprzęt ochronny, w tym rękawice, odzież ochronną, ochronę oczu i ochronę twarzy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonać 1x Bufor rozwojowy (DB) mieszając 100 ml buforu 10x DB' z 1 ml sterylizowanego 2 M MgCl2 i 1 ml sterylizowanego 1 M CaCl2. Dostosować końcową objętość do 1 l w szklanej butelce o pojemności 1 litra za pomocą autoklawowanego, sterylizowanego ddH2O. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować pożywkę PS:DB w szklanej butelce o pojemności 1 l, mieszając 100 ml wysterylizowanej pożywki PS, 100 ml wysterylizowanego buforu 10x DB' i wysterylizowanego ddH2O do całkowitej objętości 1 l. Uzupełnij 1 ml wysterylizowanego 2 M MgCl2 i 1 ml wysterylizowanego 1 M CaCl2. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy kalceiny-AM, dodając 50 μl DMSO do 50 μg kalceiny-AM w plastikowym pojemniku dostarczonym przez producenta. Przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
2. Wzrost i utrzymanie ameb
<ol>
	<li>Uprawiaj szczep E. coli B/r17 jako źródło pożywienia dla ameb w początkowym okresie wzrostu. Smugi E. coli B/r z zamrożonego bulionu przechowywanego w temperaturze -80 °C na płytkę agarową LB i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc w celu uzyskania pojedynczych kolonii.</li>
	<li>Zaszczepić pojedynczą kolonię E. coli B/r w 2 ml pożywki LB i inkubować w bębnie rolkowym lub wytrząsarce w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Doprowadź nocną kulturę E. coli do temperatury pokojowej. Za pomocą drewnianego patyczka zaszczepić ameby z zamrożonego wywaru przechowywanego w temperaturze -80 °C do 750 μl nocnej kultury. 
	UWAGA: Użyj szczepu D. discoideum AX3, który jest zdolny do aksenicznego wzrostu18. Ten krok nie wymaga wzrostu aksonicznego, ale kolejne kroki będą miały jego wymóg.</li>
	<li>Natychmiast dodaj 700 μl mieszaniny ameby i E. coli na płytkę z peptonem glukozowo-drożdżowym (GYP). Rozprowadź kulturę równomiernie na powierzchni płytki, przechylając ją w przód iw tył oraz na boki w razie potrzeby. Unikaj używania rozsiewacza.</li>
	<li>Umieść płytkę GYP z agarem skierowanym do góry w pudełku o wysokiej wilgotności. Użyj dwóch jednorazowych plastikowych pojemników (183 cm x 183 cm x 91 cm) ułożonych jeden na drugim. Napełnij dolny pojemnik około 25 ml wody i umieść górny pojemnik z kilkoma otworami o średnicy 0.5 cm wywierconymi w podłodze pojemnika, aby umożliwić przepływ wilgoci ze zbiornika na wodę do górnego pojemnika.</li>
	<li>Inkubować płytkę i pudełko GYP w temperaturze 22 °C przez 4 - 5 dni, aż zaobserwuje się, że zarodniki ameba rosną w pobliżu powierzchni płytki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Do inkubacji płytek należy używać inkubatora z chłodzeniem, a nie inkubacji w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Po wyrośnięciu zarodników pozostają one żywotne na płytkach przez kilka tygodni, jeśli są przechowywane w temperaturze 4 °C. Przechowuj płytki stroną agarową skierowaną do góry. Po 3 - 4 dniach inkubacji można zaobserwować strefy oczyszczania w obrębie trawnika bakteryjnego, które wskazują na początek zarodnikowania ameby.
	<ol>
		<li>Obserwuj małe zarodniki ameb nad powierzchnią płytki po 4 - 5 dniach inkubacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). 
		UWAGA: Nie hoduj ameb dłużej niż tydzień, ponieważ jakość zarodników spada po upływie tego okresu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz zarodniki ameb, aby przygotować się do aksonicznego wzrostu ameb, przesuwając sterylną końcówkę pipety o pojemności 1 ml równolegle do powierzchni płytki. Zbierz zarodniki z połowy 10-centymetrowej szalki Petriego. 
	UWAGA: Unikaj dotykania końcówki do powierzchni płytki agarowej, ponieważ ten ruch spowoduje zebranie dużej ilości E. coli.</li>
	<li>Ponownie zawiesić amebę na końcówce pipety, zanurzając końcówkę w 1 ml pożywki PS i delikatnie pipetując w górę iw dół.</li>
	<li>Przenieść zaszczepioną mieszaninę do kolby o pojemności 250 ml zawierającej 25 ml pożywki PS uzupełnionej roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym o stężeniu 0,25x. 
	UWAGA: Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy należy przechowywać w postaci 250 μl podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Należy unikać powtarzających się cykli rozmrażania i zamrażania tego roztworu, ponieważ może to zmniejszyć jego skuteczność.</li>
	<li>Hoduj ameby osiowo w temperaturze 22 °C w obrotowej wytrząsarce z prędkością 100 obr./min. W przypadku testu wirulencji w kroku 5 hoduj komórki do gęstości optycznej mierzonej przy 600 nm (OD600) wynoszącej od 0,2 do 0,5, 
	UWAGA: Ten krok wymaga 3 - 4 dni wzrostu od momentu inokulacji (krok 2.7). Jeśli komórki urosły do większej gęstości, rozcieńczyć kulturę z powrotem w pożywce PS do OD600 0,05 lub mniej i odrosnąć z powrotem do OD600 0,2 do 0,5.</li>
</ol>
3. Wzrost P. aeruginosa
<ol>
	<li>Wybierz pojedynczą kolonię P. aeruginosa z płytki LB, zaszczep ją w kulturze 2 ml PS:DB i hoduj przez noc w temperaturze 37 °C do nasycenia. 
	UWAGA: Nie dodawaj roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego do podłoża PS:DB.</li>
	<li>Rozcieńczyć kulturę na noc w stosunku 1:100 lub 1:1 000 na szalce Petriego o średnicy 6 cm za pomocą PS:DB. Jeśli badana jest wyłącznie zjadliwość komórek planktonowych, zamiast tego hoduj kultury przy użyciu konwencjonalnych probówek hodowlanych. Wstrząsnąć kulturą na rotatorze stołowym ustawionym na 100 obr./min w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zbieraj kultury w określonych punktach czasowych, aby zapewnić odtwarzalność. W ciągu 30 minut do 1 godziny przed oceną zwilżenia przygotować podkładkę agarową zgodnie z opisem w sekcji 4. 
	UWAGA: Wirulencja P. aeruginosa jest indukowana przez około 8 godzin wzrostu na powierzchniach.</li>
	<li>W celu wyizolowania komórek przyczepionych powierzchniowo, należy usunąć płynną pożywkę z szalki Petriego, natychmiast przemyć 1 ml buforu DB w celu usunięcia komórek planktonowych i natychmiast przejść do kroku 5.1. 
	UWAGA: Nie myj dłużej niż 30 sekund, ponieważ spowoduje to zakłócenia i oderwanie komórek przyczepionych do powierzchni i może wpłynąć na pomiar zjadliwości.</li>
	<li>W celu wyizolowania komórek planktonu należy przenieść 10 μl kultury z płytki Petriego na czystą płytkę Petriego i natychmiast przejść do kroku 5.1.</li>
</ol>
4. Mikroskopia - Przygotowanie podkładki agarowej
<ol>
	<li>Przygotuj podkładki agarowe około 30 minut do 1 godziny, zanim ameby będą gotowe do zmieszania z P. aeruginosa.</li>
	<li>Mikrofalowo 50 ml 1% (w/v) agaru w buforze DB w kolbie o pojemności 250 ml. Mieszaj co 20 s, aż znikną grudki agaru.</li>
	<li>Schłodzić stopiony agar, umieszczając go w podgrzanej łaźni wodnej o temperaturze 55 °C na 15 minut.</li>
	<li>Dodać 15 μl roztworu podstawowego kalceiny-AM do 15 ml stopionego agaru w stożkowej probówce. Wymieszaj, delikatnie odwracając rurkę 4 - 5 razy i natychmiast przejdź do następnego kroku. 
	UWAGA: Wykonaj ten krok w polipropylenowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Nie używaj grubego szklanego pojemnika, ponieważ spowoduje to zbyt szybkie zestalenie się agaru.</li>
	<li>Wlej stopioną mieszaninę agaru na szklaną płytkę o wymiarach 12 cm x 10 cm i pozwól agarowi zestalić się przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Pokrój zestaloną podkładkę agarową na mniejsze odcinki o wymiarach 1,5 cm x 1,5 cm, umieszczając szklaną płytkę na wydrukowanej siatce i przecinając wzdłuż siatki za pomocą metalowej linijki.</li>
	<li>Przechowuj żel nawodniony w wilgotnym pudełku, aż będzie gotowy do użycia.</li>
</ol>
5. Mikroskopia - Przygotowanie próbki bakterii i ameby do obrazowania
<ol>
	<li>Aby oznaczyć zjadliwość komórek bakteryjnych przyczepionych powierzchniowo, dodaj 10 μl komórek ameba z kroku 2.10 do bakterii przyczepionych powierzchniowo z kroku 3.4. 
	UWAGA: Ten krok opisuje mieszanie ameb z bakteriami.</li>
	<li>Aby oznaczyć zjadliwość komórek planktonowych, zmieszaj 10 μl komórek ameba z kroku 2.10 z 10 μl bakterii planktonowych z kroku 3.5. 
	UWAGA: Nie myj osiowo wyhodowanych komórek ameby (przy OD600 od 0,2 do 0,5) przed zmieszaniem z bakteriami. Nie zaobserwuje się wzrostu E. coli w kulturze ameby ze względu na stosowanie roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego.</li>
	<li>Natychmiast umieść podkładkę agarową o wymiarach 1,5 cm x 1,5 cm calceiny-AM z kroku 4.5 na wierzchu mieszaniny bakterii i ameby na powierzchni szalki Petriego. 
	UWAGA: Umieść podkładkę agarową na wierzchu mieszanki, wykonując szybkie, płynne ruchy. Nie opuszczaj wkładki powoli na mieszankę, ponieważ ruch ten ma tendencję do wypychania komórek w kierunku obwodu i od spodu podkładki. Ten krok zapewni, że bakterie i ameby zostaną równomiernie wymieszane, unieruchomione i że oba typy komórek będą ograniczone do tej samej płaszczyzny.</li>
	<li>Usuń nadmiar płynu, delikatnie odpipetowując pozostały płyn otaczający wacik agarowy. Pozostaw szalkę Petriego do wyschnięcia na 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przykryć szalką Petriego z pokrywką i inkubować unieruchomioną mieszaninę ameba i bakterii w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 40 minut. Przejść do kroku 6.1. 
	UWAGA: Ważne jest, aby inkubować wszystkie próbki przez ten sam czas, ponieważ fluorescencja tła wzrasta z czasem. Zalecany czas inkubacji wynosi 1 godzinę. Inkubacja trwająca dłużej niż 1 godzinę jest mniej powtarzalna, ponieważ komórki amebi mogą zacząć pękać.</li>
</ol>
6. Mikroskopia - Akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Obrazowanie ameb za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego zdolnego do pozyskiwania obrazów jasnego pola i zielonej fluorescencji. W przypadku zielonej fluorescencji należy użyć filtrów białka zielonej fluorescencji (GFP) o długości fali 474/27 nm i 525/45 nm odpowiednio do wzbudzenia i emisji. Użyj obiektywu o aperturze 10X (≥0,3 apertury), aby sfotografować ameby. 
	UWAGA: Kalceina-AM w agarze spowoduje fluorescencję umierających ameb w zielonym kanale fluorescencyjnym. Poza tym zdrowe ameby nie są fluorescencyjne.</li>
	<li>Dostosuj czasy akwizycji dla kontrastu fazowego, kanałów GFP, aby ograniczyć fototoksyczność i zoptymalizować zakres dynamiczny intensywności obrazu. W razie potrzeby zastąp kontrast fazowy kontrastu interferencji różnicowej (DIC). 
	UWAGA: Jeśli to możliwe, używaj ekspozycji 100 - 200 ms dla kontrastu fazowego i fluorescencji GFP. Utrzymuj ustawienia ekspozycji i instrumentu bez zmian przez cały czas trwania eksperymentu. Ma to kluczowe znaczenie dla obliczenia indeksu zabijania hosta.</li>
	<li>Uzyskaj obrazy dla co najmniej 100 komórek ameby, aby uzyskać dobre statystyki do obliczenia wskaźnika zabijania gospodarza.</li>
</ol>
7. Analiza obrazu i indeks zabijania gospodarzy
<ol>
	<li>Wykonaj analizę obrazu za pomocą ImageJ.</li>
	<li>Otwórz plik obrazu kontrastu fazowego w ImageJ, klikając Plik | Otwórz i wybierz obraz. Dostosuj próg, klikając Obraz | Analiza | Próg. Dostosuj dolny i górny próg, aby wybrać tylko szczyt intensywności (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A).</li>
	<li>Przekonwertuj obraz na binarny, klikając przycisk Proces | Binarny | Utwórz plik binarny. Wypełnij otwory, wybierając punkt menu Process | Binarny | Wypełnij otwory. 
	UWAGA: Używając obrazu w Rysunek 1 jako źródło, kroki 7.1 - 7.2 stworzą obraz, na którym ameby i bakterie przyczepione do powierzchni pojawiają się jako ciemne obszary (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B).</li>
	<li>Upewnij się, że pola Obszar i Średnia wartość szarości są zaznaczone w obszarze Analizuj | Ustaw wymiary. Zmierz przybliżony rozmiar ameby, wybierając narzędzie owalu na głównym pasku narzędzi. Kliknij pozycję Analizuj | Zmierz i zanotuj powierzchnię reprezentatywnych ameb.</li>
	<li>Utwórz maski dla ameb, klikając Analizuj | Analizuj cząstki. W polu rozmiaru wprowadź obszar, który będzie zawierał ameby, ale nie będzie zawierał bakterii. Wybierz Maski na pasku menu rozwijanego dla opcji Pokaż. Upewnij się, że pole Dodaj do menedżera jest zaznaczone.</li>
	<li>Kliknij OK, a pojawi się obraz przedstawiający tylko ameby i okno dialogowe Menedżera ROI (Rysunek 3C).</li>
	<li>Otwórz obraz fluorescencyjny za pomocą punktu menu Plik | Otwórz i wybierz odpowiedni plik. Wybierz wszystkie regiony w Menedżerze ROI, przytrzymując Shift i klikając każdy region na liście (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3D).</li>
	<li>Kliknij przycisk Zmierz w Menedżerze zwrotu z inwestycji. Spowoduje to otwarcie okna wyników wyświetlającego średnią wartość intensywności każdej ameby.</li>
	<li>Skopiuj wartości fluorescencji dla każdej ameby do programu arkusza kalkulacyjnego i oblicz wskaźnik zabijania żywiciela, biorąc średnią ze wszystkich wartości fluorescencji.</li>
</ol>

<ol><li>Rasko, D. A., Sperandio, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-virulence+strategies+to+combat+bacteria-mediated+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 9 (2), 117-128 (2010).</li>
<li>Coburn, B., Grassl, G. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella%2C+the+host+and+disease%3A+a+brief+review%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Salmonella, the host and disease: a brief review.</a> Immunology and Cell Biology. 85 (2), 112-118 (2007).</li>
<li>Alibaud, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+virulence+genes+identified+in+a+Dictyostelium+host+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa virulence genes identified in a Dictyostelium host model.</a> Cellular Microbiology. 10 (3), 729-740 (2008).</li>
<li>Pukatzki, S., Kessin, R. H., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+pathogen+Pseudomonas+aeruginosa+utilizes+conserved+virulence+pathways+to+infect+the+social+amoeba+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The human pathogen Pseudomonas aeruginosa utilizes conserved virulence pathways to infect the social amoeba Dictyostelium discoideum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (5), 3159-3164 (2002).</li>
<li>Cosson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+Virulence+Analyzed+in+a+Dictyostelium+discoideum+Host+System%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa Virulence Analyzed in a Dictyostelium discoideum Host System.</a> Journal of Bacteriology. 184 (11), 3027-3033 (2002).</li>
<li>Pukatzki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+conserved+bacterial+protein+secretion+system+in+Vibrio+cholerae+using+the+Dictyostelium+host+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of a conserved bacterial protein secretion system in Vibrio cholerae using the Dictyostelium host model system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 103 (5), 1528-1533 (2006).</li>
<li>Steinert, M., Heuner, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15679834">Dictyostelium as host model for pathogenesis.</a> Cellular Microbiology. 7 (3), 307-314 (2005).</li>
<li>Hagele, S., Kohler, R., Merkert, H., Schleicher, M., Hacker, J., Steinert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dictyostelium+discoideum%3A+a+new+host+model+system+for+intracellular+pathogens+of+the+genus+Legionella%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dictyostelium discoideum: a new host model system for intracellular pathogens of the genus Legionella.</a> Cellular Microbiology. 2 (2), 165-171 (2000).</li>
<li>Matz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+uses+type+III+secretion+system+to+kill+biofilm-associated+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa uses type III secretion system to kill biofilm-associated amoebae.</a> ISME Journal. 2 (8), 843-852 (2008).</li>
<li>Hauser, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+type+III+secretion+system+of+Pseudomonas+aeruginosa%3A+infection+by+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The type III secretion system of Pseudomonas aeruginosa: infection by injection.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 654-665 (2009).</li>
<li>Moore, P. L., MacCoubrey, I. C., Haugland, R. P. A rapid pH insensitive, two color fluorescence viability (cytotoxicity) assay. Journal of Cell Biology. 111, Abstract 304 58(1990).</li>
<li>Kaneshiro, E. S., Wyder, M. A., Wu, Y. -P., Cushion, M. T. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167701293800104">Reliability of calcein acetoxy methyl ester and ethidium homodimer or propidium iodide for viability assessment of microbes.</a> Journal of Microbiological Methods. 17 (1), 1-16 (1993).</li>
<li>Siryaporn, A., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A., Gitai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+attachment+induces+Pseudomonas+aeruginosa+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Surface attachment induces Pseudomonas aeruginosa virulence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (47), 16860-16865 (2014).</li>
<li>Decherchi, P., Cochard, P., Gauthier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+staining+assessment+of+Schwann+cell+viability+within+whole+peripheral+nerves+using+calcein-AM+and+ethidium+homodimer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Dual staining assessment of Schwann cell viability within whole peripheral nerves using calcein-AM and ethidium homodimer.</a> Journal of Neuroscience Methods. 71 (2), 205-213 (1997).</li>
<li>Braut-Boucher, F., Pichon, J., Rat, P., Adolphe, M., Aubery, M., Font, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-isotopic%2C+highly+sensitive%2C+fluorimetric%2C+cell-cell+adhesion+microplate+assay+using+calcein+AM-labeled+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes.</a> Journal of Immunological Methods. 178 (1), 41-51 (1995).</li>
<li>Grieshaber, P., Lagrèze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+of+fluorogold-prelabeled+retinal+ganglion+cells+with+calcein-AM%3A+A+new+method+for+assessing+cell+vitality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality.</a> Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 233-239 (2010).</li>
<li>Witkin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherited+Differences+in+Sensitivity+to+Radiation+in+Escherichia+Coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inherited Differences in Sensitivity to Radiation in Escherichia Coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 32 (3), 59-68 (1946).</li>
<li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+Dictyostelium+discoideum+to+nucleic+acid+analogues%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of Dictyostelium discoideum to nucleic acid analogues.</a> Experimental Cell Research. 64 (2), 484-486 (1971).</li>
<li>Rahme, L. G., Stevens, E. J., Wolfort, S. F., Shao, J., Tompkins, R. G., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+virulence+factors+for+bacterial+pathogenicity+in+plants+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals.</a> Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).</li>
<li>O'Loughlin, C. T., Miller, L. C., Siryaporn, A., Drescher, K., Semmelhack, M. F., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quorum-sensing+inhibitor+blocks+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+and+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A quorum-sensing inhibitor blocks Pseudomonas aeruginosa virulence and biofilm formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (44), 17981-17986 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje szybką i ilościową metodę oznaczania zjadliwości P. aeruginosa. Protokół ten może być testowany z innymi bakteriami. Należy jednak pamiętać, że podłoże powinno być zgodne z warunkami wzrostu ameby. W szczególności zoptymalizowaliśmy protokół, wykorzystując PS:DB jako pożywkę do hodowli bakterii. Jeżeli stosowane są inne pożywki, konieczne może być przeprowadzenie kontroli z użyciem samych pożywek wzrostowych, w których nie ma komórek bakteryjnych, w celu sprawdzenia, czy pożywka jest kompaty...

Infekcja bakteryjna jest jedną z głównych przyczyn śmiertelności u ludzi i zwierząt1,2. Możliwość pomiaru zjadliwości bakterii w kulturach lub biofilmach jest ważna w opiece zdrowotnej i badaniach. W tym miejscu opisujemy wszechstronną, szybką i stosunkowo prostą metodę ilościowego określania zjadliwości bakterii. Organizm eukariotyczny Dictyostelium discoideum (ameba) jest używany jako modelowy organizm gospodarza. D. discoideum został użyty jako gospodarz do identyfikacji czynników wirulencji u Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)3,4,5 i innych bakterii6,7,8 i jest podatny na te same czynniki wirulencji, które zabijają komórki ssaków, w tym wydzielanie typu III9,10. Poprzednie testy wirulencji z użyciem D. discoideum obejmowały długotrwałą ekspozycję bakterii na komórki D. discoideum w ciągu kilku godzin3,4,5. Protokół przedstawia tutaj szybką metodę określania zjadliwości przy użyciu tej ameby. Ten protokół (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) opisuje, jak: (1) hodować ameby aksenicznie (pod nieobecność bakterii), (2) hodować bakterie do testu, (3) przygotowywać bakterie i komórki gospodarza do mikroskopii, (4) wykonywać mikroskopię epifluorescencyjną i (5) analizować fluorescencję ameby.
Amoeby są początkowo wyjmowane z zamrożonych zapasów i hodowane na trawniku Escherichia coli (E. coli), gdzie ameby produkują zarodniki. Zarodniki te są zbierane i zaszczepiane we wzbogaconym pożywce w celu wzrostu aksenowego. Ameby są utrzymywane przez wzrost akseniczny w warunkach bogatych w składniki odżywcze, dopóki nie będą gotowe do zmieszania z bakteriami w celu oceny zjadliwości bakteryjnej. Przeżycie lub śmierć ameb określa się ilościowo, mierząc fluorescencję kalceiny-acetoksymetylu (kalceiny-AM), która jest rozszczepiana przez wewnątrzkomórkowe esterazy i w ten sposób aktywowana do fluorescencji11,12. Żywe ameby wykazują niewielką lub żadną fluorescencję, podczas gdy zestresowane i umierające komórki intensywnie fluoryzują. Wynik ten wynika z niewielkiego lub żadnego włączenia kalceiny-AM do zdrowych ameb oraz włączenia i rozszczepienia substratu w zestresowanych amebach13. To zachowanie wyraźnie różni się od fluorescencji kalceiny-AM w komórkach ssaków11,14,15,16.
Bakterie, które będą oceniane pod kątem zjadliwości, są hodowane oddzielnie. W tym miejscu opisujemy, jak zmierzyć zjadliwość oportunistycznego patogenu P. aeruginosa i szczegółowo opisano, jak określić ilościowo zjadliwość subpopulacji planktonowych (pływających) i przyczepionych do powierzchni. Protokół ten może być dostosowany do badania zjadliwości innych bakterii. W sekcji Reprezentatywne wyniki pokazujemy, że wirulencja jest aktywowana w komórkach przyczepionych powierzchniowo i jest niska w komórkach planktonowych, co zostało zgłoszone wcześniej13. Aktywowany przez zjadliwość P. aeruginosa zabija ameby, podczas gdy niezjadliwe komórki planktonowe są konsumowane przez ameby. Jeśli zjadliwość bakterii planktonowych jest wyłącznie badana, bakterie można hodować w zwykłych probówkach hodowlanych, a nie na szalkach Petriego, jak opisano w protokole.
Wzrost kultur ameb i P. aeruginosa musi być skoordynowany tak, aby kultury P. aeruginosa osiągnęły zamierzoną fazę wzrostu, podczas gdy ameby rosną w stanie stabilnym w warunkach bogatych w składniki odżywcze. Ten stan zazwyczaj wymaga, aby kultury ameb były rozcieńczone co najmniej 1 dzień przed zmieszaniem ich z bakteriami. Ameby i bakterie są unieruchamiane za pomocą podkładek agarowych, są wspólnie inkubowane przez 1 godzinę i obrazowane za pomocą obiektywu o niskiej rozdzielczości (10X, apertura numeryczna 0,3), filtrów białka zielonej fluorescencji (GFP) i kamery obrazującej. Analizę można przeprowadzić za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania ImageJ lub niestandardowego oprogramowania do analizy obrazu. Nasza analiza została przeprowadzona przy użyciu naszego autorskiego oprogramowania napisanego przy użyciu pakietu do analizy naukowej13. Oprogramowanie powinno utworzyć maskę przy użyciu obrazu kontrastu fazowego i wyodrębnić wartości fluorescencji z zamaskowanych obszarów na obrazie fluorescencyjnym. Wartości fluorescencji są uśredniane dla co najmniej 100 komórek, co daje liczbowy wskaźnik zabijania gospodarza.

<table><tbody><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar, odwodniony</td><td>BD Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>15240062</td><td>Aliquot < 1 ml i przechowywać w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Ester kalceinowo-acetoksymetylowy (calceina-AM)</td><td>Life Technologies</td><td>C34852</td><td>Calcein Acetoxymethyl (AM)</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia, bezwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16500</td><td>Dekstroza</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Kwas foliowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8758</td><td></td></tr><tr><td>LB-Miller</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>Specjalny pepton</td><td>Oxoid</td><td>LP0072</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek potasu</td><td>Fisher Chemical</td><td>P250</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodny</td><td>Fisher Chemical</td><td>S373</td><td></td></tr><tr><td>Witamina B12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2876</td><td></td></tr><tr><td>szczepy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dictyostelium discoideum</td><td>Siryaporn lab</td><td>Szczep AX318</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>Siryaporn lab</td><td>Szczep B/r17</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa</td><td>Siryaporn lab</td><td>PA14</td><td>szczep19</td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa &Delta; lasR</td><td>Siryaporn lab</td><td>AFS20.1</td><td>Szczep pochodzący z PA1420</sup</td></tr><tr><td>>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,22 &micro; Filtr M&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SCGPT01RE</td><td>Do sterylizacji filtra Rurka</td></tr><tr><td>stożkowa, 15 ml</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Szklane butelki do przechowywania</td><td>Pyrex</td><td>13951L</td><td>250 mL, 500 mL, 1000 mL</td></tr><tr><td>szalka Petriego, średnica 6 cm</td><td>Corning</td><td>351007</td><td>Płytki styropianowe 60 x 15 mm</td></tr><tr><td>szalka Petriego, średnica 10 cm</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>Płytki styropianowe 100 x 15 mm</td></tr><tr><td>Pojemniki plastikowe z pokrywką</td><td>Ziploc</td><td>2.57E+09</td><td>Kwadratowe pojemniki na 3 filiżanki</td></tr><tr><td>Talerze szklane</td><td>Bio-Rad</td><td>1653308</td><td>Do przygotowania wacików agarowych. Możliwe jest zastosowanie innych płyt szklanych o podobnych wymiarach.</td></tr><tr><td>Patyczki drewniane</td><td>Fisher</td><td>23-400-102&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Eclipse Ti-E&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MEA53100</td><td>Konfiguracja mikroskopu</td></tr><tr><td>10X Plan Fluor Ph1 obiektyw&nbsp; 0.3 NA</td><td>Nikon</td><td>MRH20101</td><td>Konfiguracja mikroskopu</td></tr><tr><td>Źródło wzbudzenia fluorescencji</td><td>Silnik świetlny Lumencor</td><td>Sola</td><td>Konfiguracja mikroskopu</td></tr><tr><td>Zestaw filtrów fluorescencyjnych</td><td>Semrock</td><td>LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000&nbsp;</td><td>Konfiguracja mikroskopu</td></tr><tr><td>Orca Flash 4.0 V2 Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>77054098</td><td>Konfiguracja mikroskopu</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>v. 1.49</td><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2013</td><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsarką orbitalną</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td>Do wzrostu bakterii w temperaturze 37 stopni; C</td></tr><tr><td>Wytrząsarka platformowa</td><td>Fisher</td><td>13-687-700</td><td>Do wzrostu ameb w temperaturze 22 & stopni; C</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Biochrom</td><td>Ultrospec 10</td><td></td></tr><tr><td>Podblatowy inkubator z chłodzeniem</td><td>Fisher</td><td>97990E</td><td>Do wzrostu ameb w temperaturze 22 & stopni; C</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna Isotemp&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>15-462-21Q</td><td>Do mediów chłodzących do 55 & deg; Z</td></tr></tbody></table>

szybki test zjadliwości bakterii oparty na obrazie przy użyciu ameby

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Tradycyjne testy zjadliwości bakterii polegają na długotrwałym wystawianiu bakterii na komórki gospodarza przez kilka godzin. W tym czasie bakterie mogą ulegać zmianom w fizjologii ze względu na ekspozycję na środowisko wzrostu gospodarza i obecność komórek gospodarza. Opracowaliśmy test do szybkiego pomiaru stanu wirulencji bakterii, który minimalizuje stopień, w jakim bakterie rosną w obecności komórek gospodarza. Bakterie i ameby są mieszane ze sobą i unieruchamiane na jednej płaszczyźnie obrazowania za pomocą podkładki agarowej. Procedura wykorzystuje obrazowanie fluorescencyjne pojedynczych komórek za pomocą estru kalceinowo-acetoksymetylowego (calcein-AM) jako wskaźnika zdrowia komórek gospodarza. Fluorescencję komórek gospodarza analizuje się po 1 godzinie ekspozycji komórek gospodarza na bakterie za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej. Oprogramowanie do analizy obrazu służy do obliczania indeksu zabijania hosta. Metoda ta została wykorzystana do pomiaru zjadliwości w subpopulacjach planktonowych i przyczepionych powierzchniowo Pseudomonas aeruginosa w początkowej fazie tworzenia biofilmu i może być dostosowana do innych bakterii i innych etapów wzrostu biofilmu. Protokół ten zapewnia szybką i solidną metodę pomiaru zjadliwości i pozwala uniknąć wielu zawiłości związanych ze wzrostem i utrzymaniem linii komórkowych ssaków. Fenotypy wirulencji mierzone tutaj za pomocą ameb zostały również potwierdzone przy użyciu makrofagów myszy. W szczególności test ten został wykorzystany do ustalenia, że przyleganie powierzchniowe zwiększa zjadliwość u P. aeruginosa.

Hodowano szczep dziki P. aeruginosa PA1419 lub szczep ΔlasR20 w tym samym tle genetycznym PA14 w szalkach Petri o średnicy 6 cm, a następnie oceniano zjadliwość komórek planktonicznych oraz przylegających do powierzchni. Kultury szczepiono z pojedynczych kolonii do pożywek PS:DB, inkubowano przez noc w probówkach w bębnie obrotowym w temperaturze 37 °C do osiągnięcia fazy nasycenia, rozcieńczano w stosunku 1:100 w PS:DB, ho...

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru zjadliwości bakterii planktonowych lub przyczepionych powierzchniowo przy użyciu D. discoideum (ameba) jako gospodarza. Wirulencję mierzy się przez okres 1 godziny, a zabijanie gospodarza określa się ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i analizy obrazu. Demonstrujemy ten protokół za pomocą bakterii P. aeruginosa.

Szybki test zjadliwości bakterii oparty na obrazie przy użyciu ameby

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie patogenezy bakterii, takie jak to, kiedy w komórkach bakteryjnych dochodzi do ekspresji zabijających gospodarza efektorów wirulencji i jakie są stany wirulencji komórek implantonicznych przyczepionych powierzchniowo? Główną zaletą tej techniki jest to, że jest szybka, ilościowa, a komórki gospodarza są stosunkowo łatwe w obsłudze. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zauważyliśmy, że przyczepiona powierzchniowo subpopulacja implantonów Pseudomonas ma różne fenotypy zabijające gospodarza.Aby rozpocząć uprawę szczepu E.coli BR przez noc, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie doprowadź kulturę E. coli do temperatury pokojowej. Za pomocą drewnianego patyczka zatruj amebę w 750 l kultury.Natychmiast dodaj 700 l mieszaniny ameby E.coli do płytki GYP. Przechyl płytkę, aby równomiernie rozprowadzić kulturę na powierzchni płytki. Następnie umieść talerz w pudełku, które utrzymuje wysoką wilgotność.Inkubować płytkę wewnątrz pudełka w temperaturze 22 °C przez cztery do pięciu dni. Po zakończeniu okresu inkubacji użyj sterylnej końcówki pipety, aby zebrać zarodniki ameby z połowy płytki. Następnie pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić amebę na końcówce pipety w 1 ml pożywki PS.Przenieść mieszaninę inokulatu do kolby o pojemności 250 ml z 25 ml pożywki PS uzupełnionej antybiotykowym roztworem przeciwmikotycznym. Hoduj amebę w temperaturze 22 C w obrotowej wytrząsarce z prędkością 100 obr./min. Po wyhodowaniu Pseudomonas aeruginosa przez noc rozcieńczyć kulturę pożywką PSB na 6 cm szalce Petriego.Następnie wstrząśnij kulturą na rotatorze stołowym ustawionym na 100 obr./min w temperaturze 37 °C. Najpierw kuchenkę mikrofalową 50 ml 1% agaru w buforze DB w kolbie o pojemności 250 ml. Dodaj 15 l wapnia AM do 15 ml stopionego agaru i delikatnie wymieszaj. Wlej stopioną mieszaninę agaru do szklanej płytki o wymiarach 12 na 10 cm i pozwól agarowi zestalić się na dziesięć minut w temperaturze pokojowej.Następnie za pomocą metalowej linijki i wydrukowanej siatki pokrój zestaloną podkładkę agarową na mniejsze odcinki o wymiarach 1,5 na 1,5 cm. Upewnij się, że żel pozostaje nawilżony, dopóki nie będzie gotowy do użycia. Następnie, aby wyizolować komórki przyczepione do powierzchni, usuń płynne podłoże z szalki Petriego.Następnie umyj naczynie 1 ml buforu rozwojowego, aby usunąć komórki planktonowe. Aby oznaczyć zjadliwość komórek bakteryjnych przyczepionych powierzchniowo, należy dodać 10 l komórek ameby z wcześniej uzyskanych komórek bakteryjnych przyczepionych powierzchniowo. Aby wyizolować komórki planktonowe, przenieś 10 l kultury na świeżą szalkę Petriego.Następnie należy oznaczyć zjadliwość komórek planktonowych poprzez zmieszanie 10 l komórek ameby z wcześniej uzyskanymi bakteriami planktonowymi. Natychmiast umieść małą podkładkę agarową na odpowiedniej mieszance bakterii i ameby na powierzchni szalki Petriego. Następnie usuń nadmiar płynu, delikatnie pipetując nadmiar płynu i pozostaw naczynie do wyschnięcia na 20 minut.Przykryj naczynie pokrywką i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 40 minut. Na koniec użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby uzyskać obrazy dla co najmniej 100 komórek ameby. W tym protokole oznaczono zjadliwość planktonu i przyczepionych powierzchniowo komórek Pseudomonas aeruginosa.Przyczepiony powierzchniowo dziki typ Pseudomonas aeruginosa zabił amebę, na co wskazuje okrągły kształt komórki ameby i obecność fluorescencji kalceiny. W porównaniu z komórkami planktonowymi, przyczepiony do powierzchni typ dziki Pseudomonas aeruginosa miał wysoki wskaźnik zabijania gospodarza. Komórki planktonowe zostały skonsumowane przez amebę, na co wskazują amorficzne kształty komórek ameby i stosunkowo niewielka fluorescencja kalceiny.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o użyciu świeżego zapasu kalceiny AM i komórek ameby oraz uważnie śledzić gęstość optyczną ameby. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak profilowanie transkrypcji, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: Które geny są aktywowane w subpopulacji planktonowej i przyczepionej powierzchniowo? Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić szybki test wirulencji oparty na obrazie.

a-rapid-image-based-bacterial-virulence-assay-using-amoeba

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Źródło: Chen, Y. i inni. Ocena zjadliwości i patogenezy infekcji Aeromonas w modelu Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2018).Ten film demonstruje test toksyczności cieczy C. elegans z użyciem Aeromonas, metodę służącą do oceny zjadliwości bakterii poprzez pomiar przeżywalności robaków w środowisku ciekłym o ograniczonym zawartości składników odżywczych. Test wykazuje patogenność specyficzną dla szczepu na podstawie zakresu uszkodzeń i śmiertelności wywołanej toksynami u C. elegans.

Ocena zjadliwości bakteryjnej za pomocą testu toksyczności płynnej C. elegans

Źródło: Perinbam, K., i Siryaporn, A. Szybki test wirulencji bakteryjnej oparty na obrazach z użyciem ameby. J. Vis. Exp. (2018)Ten film demonstruje szybką, opartą na obrazach metodę oceny zjadliwości bakterii poprzez inkubację ameb z bakteriami przytwierdzonymi do powierzchni lub planktonicznymi, zastosowanie podkładki kalcein-acetoxymetyloesterowej (kalcein-AM) agarozy oraz obrazowanie fluorescencji w celu wykrycia uszkodzeń komórek gospodarza.

Szybki test obrazowy do wykrywania zjadliwości bakteryjnej indukowanej powierzchnią

Source: Dubois, V., et al. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the procedure of co-culturing amoebae with mutant bacterial strains to evaluate their intracellular survival and identify virulence markers through differences in colony counts.

Detecting Bacterial Virulence Using Amoeba as a Host System

Ten film demonstruje test do ilościowego określenia wewnątrzkomórkowego wzrostu pasożytów w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego (BMM). Komórki makrofagów są zakażone ruchliwymi i nieruchliwymi stadiami inwazyjnymi Leishmania, odpowiednio promastigotykami metacyklicznymi i amastigotami. Pasożyty atakują makrofagi, uwewnętrzniając się w parazytoforycznej wakuoli i namnażając się w środku. Wewnątrzkomórkowy wzrost pasożyta określa się ilościowo za pomocą mikroskopu po fluorescencyjnym...

Test in vitro w celu ilościowego określenia wewnątrzkomórkowego wzrostu pasożyta w makrofagach

Opisujemy jakościowy test do monitorowania konkurencji bakteryjnej, w której pośredniczy system sekrecji Pseudomonas aeruginosa typu VI (T6SS). Test opiera się na przeżyciu/zabiciu komórek docelowych Escherichia coli zawierających lacZ-reporter. Technika ta jest regulowana w celu oceny aktywności bakteriobójczej/bakteriostazy mikroorganizmów biegłych w T6SS.

Test wizualny do monitorowania konkurencji bakteryjnej za pośrednictwem T6SS

Opisujemy metodę śledzenia pęknięcia błony wewnętrznej wywołanego przez wewnątrzkomórkowe bakterie Shigella flexneri i Mycobacterium tuberculosis po inwazji komórek gospodarza. Nasz test wykorzystuje CCF4, cytoplazmatyczną sondę FRET gospodarza w żywych lub utrwalonych komórkach. Ten reporter jest degradowany przez aktywność enzymatyczną obecną na powierzchni bakterii.

Pomiary pojedynczych komórek pęknięcia wakuolarnego spowodowanego przez patogeny wewnątrzkomórkowe

Ta technika dostarcza metody zbierania, normalizacji i ilościowego określania wzrostu wewnątrzkomórkowego patogenów bakteryjnych, które są wstępnie hodowane w naturalnych komórkach gospodarza pierwotniaków przed infekcjami komórek ssaków. Metodę tę można zmodyfikować w celu uwzględnienia szerokiej gamy komórek gospodarza na etapie zasysania, a także typów komórek docelowych.

Możliwe do leczenia infekcje komórek ssaków bakteriami zaszczepionymi przez pierwotniaki

Kokultura amemalu to system hodowli komórkowej wykorzystujący przylegające ameby do selektywnego wzrostu wewnątrzkomórkowych patogenów, które są odporne na komórki fagocytarne, takie jak ameby i makrofagi. Stanowi zatem kluczowe narzędzie do odkrywania nowych czynników zakaźnych. Wzbogacenie amebalu pozwala na odkrycie nowych gatunków ameb i ich specyficznych bakterii wewnątrzkomórkowych.

Odkrycie nowych patogenów wewnątrzkomórkowych za pomocą kokultury amebalnej i metod wzbogacania amebalu

Opisujemy tutaj najnowsze osiągnięcia w izolacji wirusów w celu scharakteryzowania nowych genotypów wirusa Faustowirusa, nowej linii gigantycznych wirusów związanej z asfarwirusem. Protokół ten może być stosowany do wysokoprzepustowej izolacji wirusów, zwłaszcza gigantycznych wirusów infekujących ameby.

Szybka strategia izolacji nowych faustowirusów z próbek środowiskowych przy użyciu Vermamoeba vermiformis

Ta procedura opisuje, jak wizualizować, śledzić i określać ilościowo Acanthamoeba spp. Ruchliwość.

Oznaczanie ilościowe Acanthamoeba spp. Ruchliwość

Oporność na antybiotyki wśród szczepów Escherichia coli adhezywno-inwazyjnych stanowi wyzwanie dla oceny inwazji bakteryjnej przy użyciu tradycyjnego testu ochrony gentamycyną. Opisano ulepszoną metodę oceny ilościowej inwazji bakteryjnej poprzez liczenie jednostek tworzących kolonie i oceny jakościowej poprzez wizualizację zakażonych komórek za pomocą konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej.

Test ochrony amikacyny do ilościowego i wizualnego określenia Escherichia coli inwazji komórkowej

Poznaj szybki test zjadliwości bakterii oparty na obrazie z użyciem ameby D. discoideum. Metoda ta pozwala ilościowo ocenić efekty zabijania komórek gospodarza w ciągu jednej godziny.

Szybki test zjadliwości bakterii oparty na obrazie przy użyciu ameby

Przeglądaj więcej filmów