Name: Metoda oparta na końcówkach pipet do wysiewu komórek do kropelkowych platform mikroprzepływowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Poznaj metodę wysiewu rzadkich komórek do kroplowych platform mikroprzepływowych za pomocą końcówek pipet. Technika zwiększa wydajność enkapsulacji komórek Jurkat i innych typów rzadkich komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Politechnice w Eindhoven za hojne wsparcie.

1. Produkcja urządzeń z 3 wlotami polidimetylosiloksanu (PDMS)
<ol>
	<li>Odmierz 40 g bazy PDMS w kubku miksera kondycjonującego i ostrożnie dodaj 4 g utwardzacza PDMS do odczynnika bazowego w kubku, używając zakraplacza.</li>
	<li>Umieść filiżankę w uchwycie miksera kondycjonującego i zmierz całkowitą wagę filiżanki za pomocą uchwytu. Ustaw odpowiednio wartość ciężaru wyważenia wirówki na mieszalniku kondycjonującym.</li>
	<li>Mieszać bazę i utwardzacz w mieszalniku kondycjonującym z prędkością 2 000 obr./min przez 2 min, a następnie odpieniać przy 2 000 obr./min przez 2 min.</li>
	<li>Przygotuj aluminiową łódkę o średnicy mniej więcej tej samej wielkości, co płytka krzemowa o średnicy 100 mm. Umieść wafel krzemowy, wyprodukowany w procesie formowania repliki, w aluminiowej łodzi i umieść ten zestaw na szalce Petriego (średnica = 120 mm, wysokość = 20 mm). 
	UWAGA: Rozmiar płytki Petriego zależy od wielkości płytki krzemowej.</li>
	<li>Wyjmij kubek z uchwytu i ostrożnie wlej wstępnie utwardzoną mieszaninę PDMS (zawartość kubka) na wafel silikonowy.</li>
	<li>Umieścić szalkę Petriego, zawierającą płytkę krzemową ze wstępnie utwardzoną mieszaniną PDMS, w eksykatorze na około 20 minut, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Wyjmij szalkę Petriego po 20 minutach i sprawdź, czy nie pozostały pęcherzyki powietrza, które można usunąć.</li>
	<li>Umieścić szalkę Petriego w piekarniku nastawionym na 65 °C na co najmniej 3 godziny.</li>
	<li>Po 3 godzinach wyjmij szalkę Petriego z piekarnika i ostrożnie obierz utwardzony PDMS z wafla silikonowego.</li>
	<li>Urządzenia PDMS należy ciąć wzdłuż linii cięcia za pomocą noża lub skalpela. Przebij otwory na wlotach i wylotach każdego urządzenia za pomocą dziurkacza 1.2 mm. Wyczyść każde urządzenie PDMS taśmą klejącą, aby usunąć kurz lub resztki PDMS.
	<ol>
		<li>Opcjonalnie przedmuchać azotem, aby usunąć resztki kawałków PDMS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować szkiełka podstawowe, czyszcząc je wodą z mydłem, a następnie izopropanolem i osuszyć azotem.</li>
	<li>Połącz czyste urządzenie PDMS z czystym szkiełkiem podstawowym w asherze plazmowym, aby zamknąć przewody przepływu. Użyj następujących ustawień: Moc: 50 W, Czas: 45 s, Czas opóźnienia odpowietrzania: 2 s, Gaz procesowy: Gaz 1 (Powietrze), Odpowietrznik: Oba zawory, Ograniczony czas odpowietrzania: 60 s, Czas odkręcania pompy: 10 s, Czas podtrzymania odpowietrznika: 0 s, Czas odcięcia gazu: 1 s, Pompowanie turbo włączone: 0. Odłącz wszystkie inne przewody gazowe. 
	UWAGA: Ustawienia używane dla ashera plazmowego mogą się różnić w zależności od marki używanej ashera plazmowego.</li>
	<li>Przygotować roztwór silanu, dodając 50 μl silanu (1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltriethoxysilane) do 950 μl oleju fluorowanego. 
	UWAGA: Silan jest toksyczny. Proszę pracować pod wyciągiem.</li>
	<li>Przygotowany roztwór silanu narysuj w strzykawce, która jest podłączona do rurki teflonowej.</li>
	<li>Zasolić urządzenie, przepłukując przygotowany roztwór silanu przez wylot urządzenia.</li>
	<li>Umieść urządzenie w piekarniku nastawionym na 65 °C na 30 minut.</li>
	<li>Wyjmij zasolone urządzenie z piekarnika i wypłucz nadmiar silanu z urządzenia olejem fluorowanym.</li>
	<li>Umieść urządzenie z powrotem w piekarniku nastawionym na 65 °C na co najmniej 1 godzinę, aby zakończyć proces klejenia. 
	Uwaga: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu.</li>
</ol>
2. Bezstratna enkapsulacja komórek
<ol>
	<li>Pobieranie komórek
	<ol>
		<li>Ponownie zawiesić limfocyty T Jurkat w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) w stężeniach 1,0x106 komórek/ml, 2,0x106 komórek/ml, 4,0x106 komórek/ml i 8,0x106 komórek/ml; pDC w pożywkach hodowlanych wolnych od surowicy krwiotwórczej (np. X-VIVO 15) w stężeniach 1,3x106 komórek/ml, 3,0x106 komórek/ml i 13,0x106 komórek/ml; Komórki A549 w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) w stężeniu 1,0x106 komórek/ml. 
		UWAGA: Rodzaj komórek i koncentracja komórek mogą się różnić w zależności od eksperymentu. Na podstawie eksperymentu można również przeprowadzić znakowanie komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ładowanie końcówką do wytwarzania kropel wodnych
	<ol>
		<li>Przygotować olej fluorowany z 3% biokompatybilną mieszaniną środków powierzchniowo czynnych, dodając 3 ml środka powierzchniowo czynnego do 2 ml oleju fluorowanego. 
		UWAGA: Stężenie środka powierzchniowo czynnego dodawanego do oleju fluorowanego decyduje o stabilności emulsji dla różnych okresów inkubacji. Stężenie środka powierzchniowo czynnego różni się w zależności od pożywki użytej dla określonych typów komórek.</li>
		<li>Narysuj mieszaninę fazy olejowej do strzykawki (1 ml). Usunąć pęcherzyki powietrza ze strzykawki i podłączyć ją do rurki teflonowej o odpowiedniej długości.</li>
		<li>Przygotować strzykawkę z próbką, pobierając do niej biokompatybilny olej mineralny. Usunąć pęcherzyki powietrza i podłączyć strzykawkę do rurki teflonowej o odpowiedniej długości.</li>
		<li>Przebić zatyczkę PDMS o średnicy 5 mm z utwardzonej płyty PDMS. 
		UWAGA: Utwardzoną płytę PDMS można przygotować, wykonując kroki od 1.1 do 1.9. Użyj zwykłej płytki krzemowej zamiast sfabrykowanej płytki krzemowej.</li>
		<li>Przebij kolejny otwór w środku wtyczki za pomocą dziurkacza 1 mm.</li>
		<li>Włóż zatyczkę do końcówki pipety o pojemności 200 μl, od większego końca, tak aby ściśle przylegała. 
		UWAGA: Użyj końcówki do pipety o pojemności 1 000 μl, aby uzyskać większą objętość próbki i większe komórki. Do końcówek do pipet o pojemności 1 000 μl można stosować zatyczki o średnicy od 5 mm do 7 mm. Za pomocą korka o średnicy 5 mm można zassać próbkę o objętości około 400 μl do końcówki pipety. W przypadku zastosowania zatyczki o większej średnicy (7 mm) można zassać większą objętość próbki (około 900 μl).</li>
		<li>Włożyć rurkę, która jest podłączona do strzykawki, do zatyczki PDMS, która została włożona do końcówki pipety. Powoli naciskać tłok strzykawki, aby napełnić podłączoną końcówkę pipety olejem mineralnym. Wypchnij całe resztki powietrza z końcówki pipety.</li>
		<li>Opuścić końcówkę pipety, połączoną ze strzykawką, w roztworze próbki i zassać około 150 μl próbki do końcówki.</li>
		<li>Powtórzyć kroki od 2.2.4 do 2.2.8 w celu przygotowania drugiej strzykawki z próbką.</li>
		<li>Ostrożnie umieścić wszystkie trzy przygotowane strzykawki na pompie strzykawkowej.</li>
		<li>Włożyć obie końcówki pipet, zawierające próbkę, do dwóch wewnętrznych wlotów chipa PDMS. Włóż rurkę zawierającą mieszaninę fazy olejowej do zewnętrznego wlotu.</li>
		<li>Ustawić wartość natężenia przepływu na pompie strzykawkowej w następujący sposób: roztwór fazy ciągłej: 600 μL/h, próbki komórek: 100 μL/h każda. Wprowadź i ustaw wymiary strzykawki. 
		UWAGA: Ustawienia średnicy będą się różnić w zależności od typu strzykawki.</li>
		<li>Uruchomić pompę, aby przepłukać roztwór próbki przez wewnętrzne kanały urządzenia, a fazę olejową przez zewnętrzny kanał urządzenia.</li>
		<li>Podłącz rurkę o odpowiedniej długości do wylotu, aby rozpocząć zbieranie kropel, gdy tworzenie się kropel jest stabilne. Czas zbierania różni się w zależności od eksperymentu.</li>
		<li>Zbieraj kropelki w probówce z zamkiem. Dodać 200 μl pożywki RPMI (bez surowicy) na zebrane kropelki i inkubować próbkę. 
		UWAGA: Czas inkubacji zebranych kropelek różni się w zależności od eksperymentu. Kropelki są zbierane w probówce blokującej, gdy analiza lub izolacja oparta na cytometrii przepływowej jest wykonywana po odzyskaniu komórek z kropel przez rozbicie emulsji. Możliwe jest zebranie kropelek w szklanej komorze, jeśli eksperyment wymaga analizy mikroskopowej w kropelce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozbijanie emulsji i pobieranie komórek do analizy metodą cytometrii przepływowej
	<ol>
		<li>Przygotować 20% roztwór 1H,1H,2H,2H-perfluoro-1-oktanolu (PFO) (v/v) w oleju fluorowanym, dodając 2 ml PFO w 10 ml oleju fluorowanego.</li>
		<li>Usunąć nadmiar oleju z dna probówki zbiorczej, zawierającej kropelki, za pomocą strzykawki.</li>
		<li>Dodać 100 μl 20% roztworu PFO do emulsji, aby rozbić emulsję i uwolnić zamknięte komórki do fazy wodnej. Dotknij i krótko wymieszaj. W tym momencie nie wiruj. Inkubować przez 1-2 min. 
		UWAGA: Ilość dodanego PFO zależy od ilości wytworzonych kropel. Dodawaj dodatkowo PFO, aż warstwa oleju całkowicie się rozpuści. Należy pamiętać, że PFO jest toksyczny dla komórek, a zbyt wysokie stężenia PFO lub zbyt długa inkubacja w PFO mogą prowadzić do zwiększonej śmierci komórek.</li>
		<li>Krótko wiruj roztwór przy najniższej możliwej wartości rcf przez 30 sekund.</li>
		<li>Przygotuj 100 ml zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) uzupełnionego 2% surowicą cielęcą płodu (FCS) (2 ml FCS w 98 ml PBS).</li>
		<li>Natychmiast po odwirowaniu odpipetować 550 μl frakcji wodnej i przenieść ją do nowej probówki zamykającej zawierającej 500 μl zimnego roztworu PBS uzupełnionego 2% FCS, jak przygotowano w kroku 2.3.5. Niech resztki oleju opadną na dno nowej rurki blokującej.</li>
		<li>Ostrożnie odessać 950 μl fazy wodnej zawierającej komórki z tej rurki blokującej, nie zasysając resztek oleju i przenieść roztwór do nowej rurki blokującej.</li>
		<li>Obracaj komórki w nowej rurze blokującej przez 10 minut.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 300 μl zimnego roztworu PBS uzupełnionego 2% FCS, jak przygotowano w kroku 2.3.5. 
		UWAGA: W zależności od eksperymentu, ogniwa można również ponownie zawiesić w dowolnym innym odpowiednim roztworze, takim jak pożywka. Wybarwić komórki, na podstawie eksperymentu, do analizy za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Parowanie komórek
<ol>
	<li>Pobieranie i barwienie komórek
	<ol>
		<li>Policz limfocyty T Jurkat z kolby hodowlanej i odwiruj komórki z prędkością 1500 obr./min przez 5 minut.</li>
		<li>Usuń supernatant i ponownie zawieś 1,0x106 komórek w 1 ml PBS, aby uzyskać stężenie 1,0x106 komórek/ml. Ilość dodanego PBS zależy od liczby komórek.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 3.1.1-3.1.2 w celu przygotowania drugiej próbki limfocytów T Jurkat o tym samym stężeniu komórek.</li>
		<li>Przemyć obie próbki dwukrotnie 1 ml PBS przy 1 500 obr./min przez 5 minut.</li>
		<li>Ponownie zawiesić jedną próbkę komórkową barwnikiem 1,25 μM estru sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CFSE), a drugą próbkę komórkową barwnikiem 1,25 μM dalekiej czerwieni lub barwnikiem proliferacji komórek 1,25 μM przy stężeniu komórek 1,0x106 komórek/ml. Całkowity roztwór barwiący wynosi 1 ml na 1,0x106 komórek. 
		UWAGA: Komórki mogą być znakowane różnymi barwnikami w zależności od filtrów dostępnych w cytometrze przepływowym lub w mikroskopie fluorescencyjnym.</li>
		<li>Inkubować próbki komórek z barwnikami przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zatrzymaj reakcję barwienia, dodając 1 ml lodowatego FCS po 10 minutach.</li>
		<li>Przemyć próbki komórek dwukrotnie 1 ml PBS przy 1 500 obr./min przez 5 minut.</li>
		<li>Ponownie zawiesić próbki komórek w pożywce RPMI w stężeniu 10,0x106 komórek/ml dla każdego koloru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ładowanie końcówką do produkcji kropelek hydrożelu agarozowego do parowania komórek 
	Uwaga: W przypadku parowania komórek za pomocą kropelek hydrożelu agarozowego należy utrzymywać temperaturę systemu między 27 °C a 37 °C przez cały proces wytwarzania i zbierania kropel, aby zapobiec żelowaniu hydrożeli i zagwarantować żywotność komórek9.
	<ol>
		<li>Rozpuścić agarozę o bardzo niskiej temperaturze żelowania, podgrzewając ją do 75 °C w PBS o stężeniu 4% (w/v) i mieszać mieszaninę przez 20 minut.</li>
		<li>Wymieszać roztwór agarozy ze znakowanymi limfocytami T Jurkat, aby uzyskać stężenie agarozy 2% (w/v). Powtórz to dla drugiej próbki z inaczej oznakowanymi komórkami.</li>
		<li>Przygotować olej fluorowany z 2% mieszaniną środków powierzchniowo czynnych, dodając 20 ml środka powierzchniowo czynnego do 30 ml oleju fluorowanego (mieszanina fazy olejowej).</li>
		<li>Wykonaj kroki 2.2.2 - 2.2.14. 
		UWAGA: Ze względu na lepki charakter agarozy o niskiej temperaturze topnienia i w celu zapewnienia stabilnej produkcji kropel, należy ustawić wartość natężeń przepływu na pompach strzykawkowych w następujący sposób: mieszanina fazy olejowej: 2 000 μL/h, próbki komórek: 200 μL/h. Wprowadź i ustaw wymiary strzykawki.</li>
		<li>Zebrać kropelki do probówki blokującej i inkubować kropelki w temperaturze 4 °C przez 60 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozbijanie emulsji i pobieranie kulek agarozy do analizy FACS
	<ol>
		<li>Po inkubacji kropel przez 60 minut, usunąć nadmiar oleju z rurki blokującej, zawierającej kropelki, za pomocą strzykawki.</li>
		<li>Dodać 200 μl PFO, aby usunąć interfazę oleju z kropel. 
		UWAGA: Ilość PFO dodawanego do probówki zależy od ilości wytwarzanych kropel. Dodawaj dodatkowo PFO, aż warstwa oleju całkowicie się rozpuści.</li>
		<li>Zebrane kulki agarozy przemyć dwukrotnie 1 ml zimnego PBS, aby całkowicie usunąć olej przez odwirowanie z prędkością 1,500 obr./min przez 10 min.</li>
		<li>Analizuj zebrane kulki agarozy za pomocą cytometrii przepływowej. 
		UWAGA: Możliwe jest również obserwowanie koralików pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Yin, H., Marshall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+single+cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for single cell analysis.</a> Current Opinion in Biotechnology. 23 (1), 110-119 (2012).</li>
<li>Meyvantsson, I., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Culture+Models+in+Microfluidic+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cell Culture Models in Microfluidic Systems.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 1, 423-429 (2008).</li>
<li>Yi, C., Li, C. W., Ji, S., Yang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+technology+for+manipulation+and+analysis+of+biological+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Microfluidics technology for manipulation and analysis of biological cells.</a> Analytica Chimica Acta. 560, 1-23 (2006).</li>
<li>Wang, H. Y., Bao, N., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+cell+array+with+individually+addressable+culture+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">A microfluidic cell array with individually addressable culture chambers.</a> Biosensors and Bioelectronics. 24, 613-617 (2008).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+microenvironment+for+cellular+studies+via.+microfluidics-generated+double+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A programmable microenvironment for cellular studies via. microfluidics-generated double emulsions.</a> Biomaterials. 34 (19), 4564-4572 (2013).</li>
<li>Teh, S. -Y., Lin, R., Hung, L. -H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidics.</a> Lab on a chip. 8 (2), 198-220 (2008).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+cell+pairing+in+droplets+using+dual-color+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Efficient cell pairing in droplets using dual-color sorting.</a> Lab Chip. 15 (20), 3989-3993 (2015).</li>
<li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li>
<li>Chokkalingam, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cellular+heterogeneity+in+cytokine-secreting+immune+cells+using+droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Probing cellular heterogeneity in cytokine-secreting immune cells using droplet-based microfluidics.</a> Lab on a Chip. 13 (42), 4740(2013).</li>
<li>den Haan, J. M. M., Arens, R., van Zelm, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activation+of+the+adaptive+immune+system%3A+Cross-talk+between+antigen-presenting+cells%2C+T+cells+and+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">The activation of the adaptive immune system: Cross-talk between antigen-presenting cells, T cells and B cells.</a> Immunology Letters. 162 (2), 103-112 (2014).</li>
<li>Shah, G. J., Ohta, A. T., Chiou, E. P. -Y., Wu, M. C., Kim, C. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EWOD-driven+droplet+microfluidic+device+integrated+with+optoelectronic+tweezers+as+an+automated+platform+for+cellular+isolation+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">EWOD-driven droplet microfluidic device integrated with optoelectronic tweezers as an automated platform for cellular isolation and analysis.</a> Lab on a Chip. 9 (12), 1732(2009).</li>
<li>Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturising+the+laboratory+in+emulsion+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Miniaturising the laboratory in emulsion droplets.</a> Trends in Biotechnology. 24 (9), 395-402 (2006).</li>
<li>Lagus, T. P., Edd, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+co-encapsulation+of+self-ordered+cell+trains%3A+cell+pair+interactions+in+microdroplets%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">High-throughput co-encapsulation of self-ordered cell trains: cell pair interactions in microdroplets.</a> RSC Advances. 3, 43(2013).</li>
<li>Moon, S., Ceyhan, E., Gurkan, U. A., Demirci, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+modeling+of+single+target+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Statistical modeling of single target cell encapsulation.</a> PLoS ONE. 6 (7), (2011).</li>
<li>Abate, A. R., Chen, C. -H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beating+Poisson+encapsulation+statistics+using+close-packed+ordering%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering.</a> Lab on a Chip. 9 (18), 2628(2009).</li>
<li>Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. -Q., Ai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Poisson+distribution+and+beyond%3A+methods+for+microfluidic+droplet+production+and+single+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation.</a> Lab Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).</li>
<li>Kemna, E. W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+cell+ordering+and+deterministic+cell-in-droplet+encapsulation+using+Dean+flow+in+a+curved+microchannel%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">High-yield cell ordering and deterministic cell-in-droplet encapsulation using Dean flow in a curved microchannel.</a> Lab on a Chip. 12 (16), 2881(2012).</li>
<li>Köster, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drop-based+microfluidic+devices+for+encapsulation+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Drop-based microfluidic devices for encapsulation of single cells.</a> Lab on a Chip. 8 (7), 1110(2008).</li>
<li>Mazutis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+and+sorting+using+droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics.</a> Nature Protocols. 8 (5), 870-891 (2013).</li>
<li>Sun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+ex+vivo.+blood+myeloid+and+plasmacytoid+dendritic+cells+after+infection+with+dengue+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of ex vivo. blood myeloid and plasmacytoid dendritic cells after infection with dengue virus.</a> Virology. 383 (2), 207-215 (2009).</li>
<li>Tel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotherapeutic+drug+oxaliplatin+differentially+affects+blood+DC+function+dependent+on+environmental+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">The chemotherapeutic drug oxaliplatin differentially affects blood DC function dependent on environmental cues.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 61 (7), 1101-1111 (2012).</li>
<li>Wimmers, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+reveals+that+stochasticity+and+paracrine+signaling+control+interferon-alpha+production+by+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis reveals that stochasticity and paracrine signaling control interferon-alpha production by plasmacytoid dendritic cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 3317(2018).</li>
<li>Gong, J., Kim, C. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-electronic+droplet+generation+on-chip+with+real-time+feedback+control+for+EWOD+digital+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">All-electronic droplet generation on-chip with real-time feedback control for EWOD digital microfluidics.</a> Lab on a Chip. 8 (6), 898(2008).</li>
<li>Demirci, U., Montesano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+epitaxy+by+acoustic+picolitre+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Single cell epitaxy by acoustic picolitre droplets.</a> Lab on a Chip. 7 (9), 1139(2007).</li>
<li>Rho, H. S., Yang, Y., Veltkamp, H. -W., Gardeniers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Delivery+of+Reagents+from+a+Pipette+Tip+to+a+PDMS+Microfluidic+Device%5BTitle%5D)+AND+%22Chips+and+Tips%22%5BJournal%5D)">Direct Delivery of Reagents from a Pipette Tip to a PDMS Microfluidic Device.</a> Chips and Tips. , (2015).</li>
<li>Paul, P. H., Garguilo, M. G., Rakestraw, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+Pressure-+And+Electrokinetically+Driven+Flows+through+Open+Capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Imaging of Pressure- And Electrokinetically Driven Flows through Open Capillaries.</a> Analytical Chemistry. 70 (13), 2459-2467 (1998).</li>
<li>Whitesides, G. M., Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+methods+for+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+Today%22%5BJournal%5D)">Flexible methods for microfluidics.</a> Physics Today. 54, 42(2001).</li>
<li>Mita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-proinflammatory+Effects+of+Iodixanol+%28OptiPrep%29-Based+Density+Gradient+Purification+on+Human+Islet+Preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Anti-proinflammatory Effects of Iodixanol (OptiPrep)-Based Density Gradient Purification on Human Islet Preparations.</a> Cell Transplant. 19 (12), 1537-1546 (2013).</li>
<li>Dura, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+lymphocyte+interactions+at+the+single-cell+level+by+microfluidic+cell+pairing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Profiling lymphocyte interactions at the single-cell level by microfluidic cell pairing.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-13 (2015).</li>
<li>Dura, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+multiparameter+assay+of+lymphocyte+interactions+from+onset+by+microfluidic+cell+pairing+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Longitudinal multiparameter assay of lymphocyte interactions from onset by microfluidic cell pairing and culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 3599-3608 (2016).</li>
<li>Yamanaka, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+the+dynamics+and+functional+outcomes+of+interactions+between+human+natural+killer+cells+and+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of the dynamics and functional outcomes of interactions between human natural killer cells and target cells.</a> Integrative Biology. 4 (10), 1175(2012).</li>
<li>Satija, R., Shalek, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+immune+responses%3A+From+populations+to+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in immune responses: From populations to single cells.</a> Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

W tym protokole zademonstrowaliśmy wydajną i prostą technikę ładowania i hermetyzowania komórek w kropelkach w celu wysokoprzepustowej analizy pojedynczych komórek oraz wykonywania kontrolowanego parowania komórek w badaniach interakcji komórkowych. Ponadto porównaliśmy kilka konwencjonalnych podejść do ogniw obciążnikowych z urządzeniami mikroprzepływowymi i wykazaliśmy, że nasze podejście do ładowania końcówek jest bardziej wydajną techniką w porównaniu z innymi metodami.
Badanie próbek klinicznych lub rzadkich typów komórek, których liczba jest rzadka w mikrofluidyce kropelkowej, wiąże się z pewnymi nieodłącznymi wyzwaniami. Jak również wykazaliśmy, komórki mają tendencję do osadzania się w strzykawkach i na powierzchni rurki, uniemożliwiając w ten sposób enkapsulację komórkową w celu dostosowania się do przewidywanych wartości. Aby uniknąć tego problemu, niektóre grupy używają mieszadeł w strzykawkach. Jednak w przypadku stosowania rzadkich i ograniczonych populacji komórek, całkowita objętość komórek jest również ograniczona, co ogranicza użycie dużych strzykawek i mieszadełek. Co więcej, zastąpiliśmy również częściej używane rurki rurkami pokrytymi teflonem, aby zapobiec przyczepianiu się komórek, ale ta metoda nie poprawiła wyników, a jeśli rurka jest zbyt długa, problem przyczepiania się komórek pogarsza się (dane nie pokazane). Alternatywnie zastosowaliśmy pionowe ładowanie rurki, w którym komórki były ładowane do rurki, a nie do strzykawki, aby zapobiec utracie komórek w dużych objętościach strzykawek. Za pomocą tej techniki można załadować komórki o małej objętości próbki, np. pDC, które są rzadkie i ograniczone. Ponadto próbka z rurki jest ładowana do urządzenia pionowo, aby zapobiec sedymentacji komórek. Rurka używana do wysiewu komórek ma niewielkie wymiary i można ją porównać do mikrokanałów. Przepływ w rurze jest napędzany ciśnieniem i podąża za parabolicznym profilem prędkości26. Oznacza to, że maksymalna prędkość przepływu znajduje się w środku rurki, a minimalna prędkość znajduje się na krawędziach rurki27. Podczas przepłukiwania populacji komórek przez rurkę, gradient prędkości powoduje, że komórki są popychane w kierunku krawędzi, na których się osiadają, ponieważ prędkość na granicy jest bliska zeru. Sedymentacja lub osiadanie komórek w rurkach zmniejsza w ten sposób skuteczność enkapsulacji, jak pokazano w reprezentatywnych wynikach, w których dane eksperymentalne nie zgadzały się z przewidywanym modelem.
Innym powszechnie stosowanym rozwiązaniem stosowanym przez naukowców, pracujących z mikrofluidyką kropelkową, jest zwiększenie gęstości pożywki do hodowli komórkowej poprzez dodanie odczynników dopasowujących gęstość, takich jak jodinaksol, aby zapobiec sedymentacji komórek w strzykawkach19. Jednak odczynniki dopasowujące gęstość mogą wpływać na zachowanie komórek i niekorzystnie wpływać na wydzielanie cytokin przez komórki (dane nie pokazane)28.
Mimo że kilka małych i dużych modyfikacji konwencjonalnych technik ładowania komórek wykazało nieznaczną poprawę wydajności enkapsulacji, uzyskane wyniki eksperymentalne nadal nie zgadzały się z obliczeniami teoretycznymi. Jednak dzięki podejściu do ładowania końcówek mogliśmy przezwyciężyć ograniczenia poprzednich metod i skuteczność enkapsulacji regulowaną przez statystyki Poissona. Technika ta jest korzystna nie tylko do ładowania komórek zawiesinowych, ale może być również stosowana do ładowania komórek przylegających, takich jak pierwotne keratynocyty i A549, do chipów mikroprzepływowych. W przypadku stosowania licznych linii komórkowych, na przykład A549, K562 itp., Można użyć większej objętości próbki. W związku z tym, w zależności od objętości próbki, można również stosować końcówki do pipet o różnych rozmiarach, a tę prostą technikę można dostosować zarówno do enkapsulacji jednokomórkowej, jak i wielokomórkowej.
Podczas gdy niskie stężenie komórek jest wymagane, aby zapewnić zamknięcie pojedynczych komórek w kropelkach, pożądane są wyższe stężenia komórek, aby zwiększyć średnią liczbę komórek zamkniętych w każdej kropli w badaniach związanych z parowaniem komórek. Istnieje kilka opisanych wcześniej metod łączenia komórek odpornościowych w pary na chipach mikroprzepływowych lub mikrofabrykowanych nanodołkach 29,30,31. W mikrofluidyce kropelkowej statystyka Poissona mówi, że parowanie komórek 1:1 dla dwóch różnych typów komórek można osiągnąć przy optymalnych stężeniach komórek. Opierając się na przewidywaniach Poissona, istnieje również prawdopodobieństwo, że kropelki mogą zawierać inne kombinacje. Podczas gdy parowanie komórek 1:1 może być pożądane do badania interakcji komórkowych na poziomie pojedynczej komórki i skutkuje lepszym zrozumieniem komórek, parowanie wielu komórek ma również poważne zalety. Pozwala zrozumieć wpływ wielu komórek jednego typu komórek na drugi typ komórek. Wzajemne oddziaływanie między różnymi komórkami odpornościowymi pomaga wygenerować skuteczną odpowiedź immunologiczną przeciwko wielu infekcjom i patogenom, a także zwiększa wytrzymałość naszego układu odpornościowego32. W związku z tym komunikacja komórkowa może być badana z dużą precyzją w różnych kontekstach, np. 1:1, 2:1, 1:2, 2:2, 3:1 itp. Pozwoliło to lepiej zrozumieć, w jaki sposób pojedyncze komórki lub pary komórek kontrolują indukcję odpowiedzi immunologicznej. Jest to szczególnie interesujące dla badania na przykład zdolności komórek NK lub cytotoksycznych limfocytów T do seryjnego zabijania odpowiednich komórek docelowych.
Jak wspomniano, w przypadku wielokrotnej enkapsulacji komórek w kropelkach pożądane są wyższe stężenia komórek. Jednak podczas ładowania komórek z jednego wlotu w celu enkapsulacji komórek, wyższe stężenia próbki komórek mogą powodować agregację komórek na wlocie. Skutkuje to niższymi wskaźnikami enkapsulacji i większymi odchyleniami od wartości teoretycznych. Aby uniknąć tego problemu, ogniwa można również ładować z dwóch oddzielnych wlotów. Teoretycznie możliwe byłoby opracowanie innych urządzeń mikroprzepływowych z wieloma wlotami, aby osiągnąć jeszcze wyższe poziomy enkapsulacji komórek, gdy uzasadniona jest średnia na x komórek. W tym badaniu zbadaliśmy skuteczność enkapsulacji limfocytów T Jurkat po załadowaniu zarówno z jednego wlotu, jak i dwóch wlotów przy użyciu tego samego całkowitego stężenia i uzyskaliśmy podobną skuteczność enkapsulacji. Ta modyfikacja pozwala naukowcom sparować różne typy komórek na chipie.
Chociaż ta metoda pomaga w ładowaniu komórek do urządzeń mikroprzepływowych bez znacznej utraty komórek, istnieją pewne środki ostrożności, o których należy pamiętać. Podczas napełniania strzykawek olejem mineralnym i zasysania próbki komórek do końcówek pipet należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza, a cały system powinien być wolny od powietrza. Należy również pamiętać, że olej mineralny nie powinien mieszać się z próbką. Końcówki pipet, zawierające próbki, powinny być mocno włożone we wloty urządzenia mikroprzepływowego, z zachowaniem najwyższych środków ostrożności, aby zapobiec wyciekom i dalszemu wprowadzaniu się pęcherzyków powietrza. Podsumowując, ładowanie końcówek jest prostą, ale solidną techniką, która pozwala na wysokoprzepustową analizę zachowania komórek poprzez enkapsulację komórek bez znacznych strat komórek w opłacalny sposób. W przypadku stosowania z optymalnymi stężeniami próbki na wlocie, to podejście polegające na ładowaniu komórek końcówkami do pipet jest bardzo elastyczne i może być dostosowane do różnych typów komórek, zwłaszcza do rzadkich pierwotnych komórek odpornościowych, w celu uzyskania wyższej skuteczności enkapsulacji, zbliżonej do przewidywanych modeli.

W ostatnich latach gwałtownie wzrosło wykorzystanie mikrofluidyki jako solidnej i wszechstronnej platformy do analizy komórkowej na poziomie pojedynczej komórki1. Platformy te zapewniają wysokoprzepustowe badania przesiewowe pojedynczych komórek i cząsteczek biologicznych z wysoką precyzją i czułością przy użyciu bardzo małej objętości próbki2,3,4. Wśród różnych typów konstrukcji mikroprzepływowych, platformy oparte na kropelkach umożliwiają wysokoprzepustową analizę pojedynczych komórek poprzez izolowanie ich w kropelce fazy wodnej otoczonej niemieszającą się fazą, która umożliwia precyzyjną i dokładną kontrolę nad mikrośrodowiskiem komórkowym5,6. Mikrofluidyka oparta na kropelkach zapewnia elastyczność izolowania pojedynczych lub wielu komórek, zarówno w kropelkach wodnych, jak i hydrożelowych, i jest cenna w badaniu złożonych zachowań komórkowych, takich jak wydzielanie białek lub interakcje komórkowe7,8,9. Na sygnalizację i przesłuch między komórkami odpornościowymi mogą wpływać interakcje z innymi komórkami w mikrośrodowisku10. Izolacja pojedynczych komórek w kropelkach zapewnia efektywne laboratorium analityczne wolne od zakłóceń, wolne od wpływu zewnętrznych czynników środowiskowych, co zapewnia bardziej wydajne i dokładne wyniki11,12. Modyfikacja konstrukcji platformy kropelkowo-mikroprzepływowej z wieloma wlotami umożliwia enkapsulację wielu typów komórek w celu badania interakcji komórkowych poprzez parowanie komórek12,13.
Proces enkapsulacji komórek w kropelkach jest losowy, a szybkość enkapsulacji komórek można statystycznie określić za pomocą wzoru na rozkład Poissona14,15. Tę szybkość enkapsulacji można oszacować, biorąc pod uwagę średnią szybkość docierania komórek do połączenia kropel i zakładając, że przybycie każdej komórki jest niezależne od nadejścia innych komórek16. Nawet jeśli nie można zagwarantować niezależnego przybycia komórek, w przypadku słabo rozmieszczonych komórek można rozważyć założenie niezależności i prawdopodobieństwo wystąpienia kropli zawierającej jedną lub więcej komórek można przewidzieć jako funkcję liczby komórek obecnych w każdej kropli i średniej liczby komórek w kropli16, 17. Ponieważ to oszacowanie enkapsulacji komórkowej w kropelkach zależy od liczby komórek obecnych w każdej kropli, można zasugerować, że zwiększenie stężenia komórek na wlocie zwiększy średnią liczbę komórek obecnych w każdej kropli16. Dlatego, aby zapewnić hermetyzację pojedynczej komórki, należy zmniejszyć stężenie komórek, ale często prowadzi to do dużej liczby pustych kropel18.
Utrata komórek podczas ładowania przez przyłączanie, sedymentację i/lub zbijanie się w strzykawce, rurki lub urządzeniu produkcyjnym jest częstym wadą odpowiedzialną za odchylenie rzeczywistych wartości enkapsulacji od przewidywanych wartości enkapsulacji19. Problem ten staje się jeszcze bardziej wyolbrzymiony podczas wysiewu rzadkich komórek odpornościowych lub próbek klinicznych, ponieważ są one już rzadkie w populacji, a enkapsulacja tylko kilku komórek, znacznie niższa niż oczekiwano, nie dostarcza wystarczających danych do analizy eksperymentalnej. Plazmocytoidalne komórki dendrytyczne (pDC) to rzadki podzbiór komórek odpornościowych, który stanowi tylko około 0,2 - 0,6 procent całej populacji białych krwinek20. Komórki te wydzielają ogromne ilości interferonów typu I po aktywacji i tym samym odgrywają kluczową rolę w odpowiedziach immunologicznych21. Badając zachowanie komórkowe tak rzadkich komórek w kropelkach, konieczne jest zapobieganie utracie komórek podczas wysiewu komórek i enkapsulacji22. Istnieje kilka rozwiązań związanych z projektem, które zapewniły hermetyzację pojedynczych komórek w kropelkach przy użyciu metod aktywnej enkapsulacji, które wykorzystują różne siły fizyczne, takie jak siły akustyczne lub elektryczne, do generowania kropel zawierających pojedyncze komórki23,24. Metody te mają jednak swoje własne ograniczenia w zakresie produkcji kropel16.
W tym badaniu opracowaliśmy solidną i prostą metodę, która pozwala obejść niedociągnięcia tradycyjnych metod ładowania pojedynczych lub wielu komórek do urządzeń mikroprzepływowych. Nasza metoda, zainspirowana przez Rho i wsp., wykorzystuje końcówki pipet o różnych rozmiarach do wysiewania małych objętości rzadkich komórek odpornościowych do kropelkowych platform mikroprzepływowych bez znacznej utraty próbki i daje wyniki, które są spójne z przewidywaniami teoretycznymi25. Metodologia ta może być łatwo i z powodzeniem zaadaptowana do wielu zastosowań obejmujących mikrofluidykę na bazie kropelek i stosowana do szerokiej gamy typów komórek, a nawet mikrocząstek.

<table><tbody><tr><td>1H,1H,2H,2H-perfluoro-1-oktanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>171468-5G</td><td></td></tr><tr><td>1H,1H,2H,2H-Perfluorooktyltrietoksysilan</td><td>Fluorochem/UK</td><td>S13150</td><td>Silan (toksyczny)</td></tr><tr><td>Agaroza (bardzo niska temperatura żelowania)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; 9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp; Wegwerpspuiten met Luer-Lok-punten</td><td>Fisher Scientific</td><td>10630694</td><td>Strzykawka</td></tr> do <tr><td>biopsji 1,2 mm</td><td>Harris Uni-Core</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Proliferation Dye eFluro 670</td><td>eBioscience</td><td>65-0840-85</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Far Red Cell</td><td>Invitrogen</td><td>C34564</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Eppendorf</td> Probówki <td></td><td>Eppendrof</td><td>Probówki Safe-Lok 1 ml i 2 ml</td></tr><tr><td>Szkiełko szkiełkowe</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS294775X38-72EA</td><td>Corning, gładkie L i razy; W 75&nbsp; mm i razy; 38&nbsp; mm</td></tr><tr><td>Pompy Harvard</td><td>Aparatura Harvarda</td><td>C-400750; C-400727</td><td>Pompy strzykawkowe</td></tr><tr><td>HFE-7500 3M Novec Płyn inżynieryjny</td><td>Fluorochem/UK</td><td>51243</td><td>Olej fluorowany</td></tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji Kai 5 mm</td><td>Amstel Medical</td><td>1980130</td><td></td></tr><tr><td>Luer stub</td><td>Instechlabs/USA</td><td>LS20S</td><td>Króciec Luer, 20ga (różowy) x 0,5 cala (12 mm), niesterylny</td></tr><tr><td>Olej mineralny (lekki)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8410-1L</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan buforowana sól fizjologiczna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-50TAB</td><td>Tabletki</td></tr><tr><td>Pico-Surf 1 (5%in Novec 7500)</td><td>Sphere Fluidics</td><td>020317-09</td><td>Surfaktant</td></tr><tr><td>Plasma Asher</td><td>Emitech</td><td>K1050X&nbsp;</td><td>Pył plazmowy</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Silikonowa baza elastomerowa 184</td><td>Sylgard</td><td>9355218</td><td>PDMS</td></tr><tr><td>Środek utwardzający z elastomeru silikonowego&nbsp;</td><td>Sylgard</td><td>9355218</td><td>Utwardzacz&nbsp;</td></tr><tr><td>Łącznik cewnika ze stali nierdzewnej</td><td>Instechlab/USA</td><td>SC20/15</td><td>20ga x 15mm, niesterylny</td></tr><tr><td>rurki teflonowe TFE Rurka</td> PTFE <td>Sigma-Aldrich</td><td>58696-U</td><td>&nbsp; L i razy; O.D. & czasy; ID 50 stóp i razy; 1/16 cala &czasy; 0,031 cala</td></tr><tr><td>Thinky mikser ARE-250</td><td></td><td>EX-4025F</td><td>Mieszanka kondycjonująca</td></tr></tbody></table>

metoda oparta na końcówkach pipet do wysiewu komórek do kropelkowych platform mikroprzepływowych

A Pipette-Tip Based Method for Seeding Cells to Droplet Microfluidic Platforms

Wśród różnych projektów platform mikroprzepływowych często używanych do analizy komórkowej, mikrofluidyka kropelkowa dostarcza solidnego narzędzia do izolowania i analizowania komórek na poziomie pojedynczej komórki, eliminując wpływ czynników zewnętrznych na mikrośrodowisko komórkowe. Enkapsulacja komórek w kropelkach jest podyktowana rozkładem Poissona jako funkcją liczby komórek obecnych w każdej kropli i średniej liczby komórek na objętość kropli. Komórki pierwotne, zwłaszcza komórki odpornościowe lub próbki kliniczne mogą być rzadkie, a bezstratna enkapsulacja komórek pozostaje wyzwaniem. W tym artykule przedstawiamy nową metodologię, która wykorzystuje końcówki pipet do ładowania komórek do kropelkowych urządzeń mikroprzepływowych bez znacznej utraty komórek. W przypadku różnych typów komórek wykazujemy wydajną enkapsulację komórek w kropelkach, która ściśle odpowiada wydajności enkapsulacji przewidywanej przez rozkład Poissona. Nasza metoda zapewnia bezstratne ładowanie komórek na platformy mikroprzepływowe i może być łatwo dostosowana do dalszej analizy pojedynczych komórek, np. w celu dekodowania interakcji komórkowych między różnymi typami komórek.

W naszych eksperymentach wykorzystaliśmy oparty na PDMS układ mikrofluidyczny z trzema wlotami o wysokości 25 mikronów (Rycina 1). W tej konfiguracji urządzenia zewnętrzny wlot służył do przepływu oleju z surfaktantem, a dwa wewnętrzne wloty do przepływu faz wodnych z zawiesinami komórek lub pożywkami. Po wygenerowaniu i zebraniu krople inkubowano przez kilka godzin poza układem przed przeprowadzeniem analizy za pomocą cytometrii przepływowej. W okresie inkubacji składniki surowicy obecne w pożywkach mogą oddziaływać z surfaktantem, co może prowadzić do niestabilności i rozpadu kropel. Dlatego ważne jest dodanie zoptymalizowanego stężenia surfaktantu do oleju fluorowanego. Przetestowaliśmy stabilność monodyspersyjnych kropel zawierających bezsurowicze pożywki do hodowli komórek krwi uzupełnione 2% ludzką surowicą przy różnych stężeniach surfaktantu w oleju fluorowanym. Z Ryciny 2 wynika, że monodyspersyjne krople te pozostają wysoce stabilne do 24 godzin, gdy do fazy olejowej dodano co najmniej 3% surfaktantu. Podobne wyniki uzyskano w przypadku pożywek RPMI z dodatkiem i bez dodatku 10% FCS (dane niepokazane). Zatem stabilność kropel jest silnie uzależniona od optymalnych stężeń surfaktantu przy pracy z różnymi rodzajami pożywek hodowlanych i składnikami surowicy.
Aby zademonstrować wydajność enkapsulacji naszej metody, najpierw dokonaliśmy zasiewu komórek za pomocą rurek podłączonych do strzykawek, co stanowi najbardziej konwencjonalne podejście do zasiewu komórek (Rycina 3A). Zebraliśmy komórki T Jurkat w różnych stężeniach: 1,0x106 cells/mL, 2,0x106 cells/mL oraz 4,0x106 cells/mL, uzyskując wydajność enkapsulacji niższą od wartości przewidywanych (Rycina 3B). Przy stężeniu 1,0x106 cells/mL odsetek kropli zawierających pojedynczą komórkę wynosił 2,5%, co nie uległo zwiększeniu nawet przy zastosowaniu wyższych stężeń komórek. Aby zwiększyć wydajność ładowania komórek, zmodyfikowaliśmy nasze poprzednie podejście i zamontowaliśmy rurkę o połowę krótszą do podwyższonego statywu, a następnie wprowadziliśmy zawiesinę komórkową do części przyłączonej do urządzenia PDMS (Rycina 4A). Stosując tę metodę, enkapsulowaliśmy komórki T Jurkat w różnych stężeniach: 1,0x106 cells/mL, 2,0x106 cells/mL i 4,0x106 cells/mL, a także rzadkie pDCs w różnych stężeniach: 1,0x106 cells/mL, 2,0x106 cells/mL i 12,0x106 cells/mL. Oczekiwaliśmy poprawy wskaźników enkapsulacji dzięki zapobieganiu sedymentacji komórek za pomocą tej metody. Jednak we wszystkich badanych stężeniach wyniki eksperymentalne były znacznie niższe od przewidywanych wartości rozkładu Poissona (Rycina 4B oraz Rycina 4C).
Stosując naszą metodę ładowania przez końcówkę, zoptymalizowaliśmy szybkość enkapsulacji komórek w celu uzyskania wyników doświadczalnych zgodnych z wartościami przewidywanymi statystycznie (Rycina 5A). Dla różnych stężeń limfocytów T Jurkat uzyskana wydajność enkapsulacji odpowiadała naszym obliczonym wartościom przy wszystkich stężeniach (Rycina 5B). Co istotne, nawet w przypadku komórek adherentnych, takich jak komórki nowotworowe A549, które mają tendencję do agregowania się, zaobserwowaliśmy nieznacznie wyższą wydajność enkapsulacji przy stężeniu komórkowym 1,0x106 cells/mL (Rycina 5C). Oceniliśmy również skuteczność naszego systemu w enkapsulacji trudniej dostępnych i rzadkich pDC przy różnych stężeniach komórek: 1,0x106 cells/mL, 3,0x106 cells/mL oraz 13,0x106 cells/mL (Rycina 5D). Aby umożliwić ładowanie potencjalnie większych objętości przekraczających 200 µL, np. podczas pracy z liniami komórkowymi lub bardziej licznymi pierwotnymi komórkami odpornościowymi, zbadaliśmy również wydajność enkapsulacji komórek przy użyciu końcówek 1000 µL (niebieskich). Wykazaliśmy, że końcówki 1000 µL zapewniają podobną wydajność enkapsulacji w porównaniu z końcówkami 200 µL (żółtymi) (Rycina 5E).
W zależności od konstrukcji chipa i badanego problemu badawczego, nasza technika ładowania końcówką może być stosowana do wprowadzania komórek albo przez jeden wlot, w celu badania heterogeniczności komórkowej, albo przez wiele wlotów równolegle, w celu rozszyfrowania oddziaływań komórkowych. Porównaliśmy ładowanie komórek T Jurkat (przy stężeniu 10,0x106 cells/mL) z jednego wlotu z ładowaniem dwóch różnie oznakowanych populacji komórek T Jurkat (przy łącznym stężeniu 10,0 x106 cells/mL) z dwóch wlotów (Rycina 6A i Rycina 6B). Podczas enkapsulacji krople generowano przy użyciu agarozy o ultraniskiej temperaturze żelowania, a po wytworzeniu poddano je żelowaniu w celu utworzenia kulek hydrożelu agarozowego, co umożliwiło późniejszą analizę via mikroskopia i cytometria przepływowa (Rycina 6C i Rycina 6D). Analiza mikroskopowa wykazała, że parowanie komórek osiągnięto przy różnych kombinacjach, co wskazuje na wysokoprzepustowe parowanie komórek (Rycina 6C). Ponadto analiza tej samej populacji kulek hydrożelowych za pomocą cytometrii przepływowej wykazała, że kulki bez komórek można oddzielić od kulek z komórkami na podstawie wyraźnego wzorca rozproszenia przedniego (FSC, wielkość) i bocznego (SSC, ziarnistość) (Rycina 6D). Gating populacji kulek bez komórek potwierdził brak enkapsulacji komórek poprzez brak sygnałów fluorescencyjnych. Dodatkowo gating populacji kulek z komórkami ujawnił istnienie wielu subpopulacji, co wskazuje na enkapsulację różnie oznakowanych komórek T Jurkat. Nasze wyniki demonstrują, że na podstawie analizy mikroskopowej i cytometrycznej można osiągnąć efektywne parowanie komórek, a wydajność enkapsulacji była nieco wyższa w porównaniu do przewidywań rozkładu Poissona (Rycina 6E).
<img alt="Schemat układu mikrofluidycznego do generowania kropel; przepływ oleju, medium i komórek; zaznaczone rozmiary kanałów i filtrów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57848/57848fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Mikrofluidyczne urządzenie do generowania kropel oparte na PDMS z trzema wlotami i jednym wylotem. Urządzenie składa się z trzech wlotów służących odpowiednio do wprowadzenia ciągłej fazy olejowej, pożywki do hodowli komórek oraz zawiesiny komórek. Wygenerowane krople są zbierane na wylocie. Próbki przepływają laminarnie do złącza skupiającego przepływ, gdzie zostają zamknięte w kropelkach. Na wlotach struktury filtrujące zatrzymują duże cząstki, takie jak agregaty białek lub komórek. Średnica szczelin w strukturze filtra jest zaznaczona niebieskimi liniami. Średnica kanałów przy dyszy produkcyjnej jest zaznaczona czerwonymi liniami. Wysokość kanałów na całym chipie wynosiła 25 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57848/57848fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza powierzchni kropli w czasie; wykresy porównują stężenia surfaktantu w badaniu mikrofluidyki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57848/57848fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Stabilność kropli w ciągu 24 godzin. Wykresy przedstawiają powierzchnię kropli zawierających bezsurowicze podłoże hodowlane dla komórek krwiotwórczych + 2% surowicy ludzkiej w czasie dla trzech różnych stężeń surfaktantu A) 0.5% B) 3% C) 5%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57848/57848fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Konfiguracja urządzenia mikrofluidycznego z chipem PDMS oraz wykresem stężenia komórek w funkcji liczby kropli." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57848/57848fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Metoda załadunku komórek z wykorzystaniem rurek. Komórki Jurkat-T są ładowane do urządzenia w różnych stężeniach przy użyciu strzykawki połączonej z rurkami. A) Ilustracja przedstawia układ doświadczalny. B) Wydajność enkapsulacji komórek określona za pomocą mikroskopii świetlnej. Kropki: wartości wyznaczone doświadczalnie; linie ciągłe: rozkład Poissona. Słupek błędu reprezentuje błąd standardowy średniej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57848/57848fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces enkapsulacji komórek, mikrofluidyczny układ PDMS, analiza wykresu kropel, wpływ stężenia komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57848/57848fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Enkapsulacja różnych typów komórek przy różnych stężeniach z wykorzystaniem metody załadunku przez pionową rurkę. W celu określenia wydajności enkapsulacji komórek przeprowadzono enkapsulację limfocytów T Jurkat oraz pDC (o różnych stężeniach). A) Ilustracja przedstawia układ eksperymentalny dla metody załadunku przez pionową rurkę. B) Wykres przedstawia wydajność enkapsulacji limfocytów T Jurkat. C) Wykres przedstawia wydajność enkapsulacji pDC. Kropki: wartości określone eksperymentalnie; Linie ciągłe: rozkład Poissona. Słupek błędu reprezentuje błąd standardowy średniej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57848/57848fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ urządzenia mikrofluidycznego i wykres generowania kropel; analiza stężenia komórek; system PDMS." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57848/57848fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Metoda ładowania przez końcówkę w celu enkapsulacji różnych typów komórek. A) Schematyczne przedstawienie techniki ładowania przez końcówkę. B) Wykres przedstawia wydajność enkapsulacji komórek Jurkat. C) Wykres przedstawia wydajność enkapsulacji komórek A549. D) Wykres przedstawia wydajność enkapsulacji pDCs. E) Wykres przedstawia wydajność enkapsulacji limfocytów T Jurkat przy użyciu końcówek do pipet 200 µL (żółte) i końcówek do pipet 1 000 µL (niebieskie). Kropki: wartości wyznaczone eksperymentalnie; linie ciągłe: rozkład Poissona. Słupek błędu reprezentuje błąd standardowy średniej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57848/57848fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza mikrofluidyki kropelkowej; schemat, wykres, mikroskopia; rozkład Poissona, liczenie komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57848/57848fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Parowanie komórek w kropelkach. A) Schematyczne przedstawienie metody ładowania przez końcówkę w celu parowania różnych komórek z 2 wlotów w kropelkach. B) Wykres przedstawia enkapsulację komórek T Jurkat z wykorzystaniem jednego wlotu lub dwóch wlotów równolegle. Stężenie komórek dla jednej końcówki wynosi 2.0x106 cells/mL, a stężenie komórek dla dwóch końcówek wynosi dla obu 1.0x106 cells/mL. Kropki: wartości określone eksperymentalnie; linie ciągłe: rozkład Poissona. C) Nałożone obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej kulek hydrożelowych i znakowanych komórek T Jurkat. D) Wykres przedstawia analizę cytometryczną komórek sparowanych w hydrożelowych kuleczkach agarozowych. Wykres pokazuje zarówno rozproszenie przednie (forward scatter), jak i boczne (sideward scatter). E) Porównanie liczby komórek w hydrożelowych kuleczkach agarozowych wykrytych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej. Słupki: wartość średnia; wąsy: błąd standardowy średniej, n ≥ 4. Słupek błędu reprezentuje błąd standardowy średniej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57848/57848fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Ten artykuł przedstawia protokół do zasiewania rzadkiej populacji komórek za pomocą końcówek pipet do kropelkowych urządzeń mikroprzepływowych w celu zapewnienia wyższej efektywności enkapsulacji komórek w kropelkach.

Metoda oparta na końcówkach pipet do wysiewu komórek do kropelkowych platform mikroprzepływowych

Amongst various microfluidic platform designs frequently used for cellular analysis, droplet-microfluidics provides a robust tool for isolating and ...

Integracja tej metodologii z mikrofluidyką opartą na kropelkach pomaga odpowiedzieć na kluczowe pytania związane z dziedziną immunologii systemowej w celu kodowania heterogeniczności komórkowej i komunikacji między pojedynczymi komórkami lub patogenami. Główną zaletą tej techniki, którą opracowaliśmy, jest to, że ta procedura ładowania końcówką pozwala na enkapsulację rzadkich komórek w kropelkach ściśle pasujących do przewidywanego rozkładu procentowego. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia, jak używać końcówek pipet do ładowania komórek do kropelek o różnej płci i pobierania komórek z kropel.W celu naładowania końcówką do wytwarzania kropel wodnych, najpierw dodaj trzy mililitry środka powierzchniowo czynnego do dwóch mililitrów oleju fluorowanego i wciągnij mieszaninę fazy olejowej do strzykawki o pojemności 2,5 mililitra. Usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza ze strzykawki i podłączyć strzykawkę do kawałka rurki teflonowej o odpowiedniej długości. Załadować dwie strzykawki z próbkami odpowiednim bi-kompatybilnym olejem mineralnym i podłączyć strzykawkę do drugiego kawałka rurki teflonowej o odpowiedniej długości.Następnie przebij zatyczkę polidimetylosiloksanu lub PDMS o średnicy pięciu milimetrów z utwardzonej płyty EDMS i przebij jednomilimetrowy otwór przez środek wtyczki. Włóż szczelnie zatyczkę do górnego końca końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów i włóż rurkę dołączoną do bi-kompatybilnej strzykawki z olejem mineralnym do korka. Powoli wciskać tłok strzykawki, aby napełnić końcówkę pipety olejem mineralnym, wypychając całe resztki powietrza.Ostrożnie umieścić obie strzykawki z próbką i strzykawkę z olejem fluorowanym na pompie strzykawkowej. Po usunięciu całego powietrza opuść każdą końcówkę pipety do roztworu próbki i zassaj około 100 mikrolitrów próbki komórek do końcówek. Następnie włóż obie końcówki pipet zawierające próbkę do dwóch wewnętrznych wlotów chipa PDMS i włóż rurkę zawierającą mieszaninę fazy olejowej do zewnętrznego wlotu.Ustaw natężenia przepływu na pompie strzykawkowej zgodnie z opisem A następnie wprowadź i ustaw wymiary każdej strzykawki. Uruchomić pompę, aby przepłukać roztwór próbki przez wewnętrzne kanały urządzenia, a fazę olejową przez zewnętrzny kanał urządzenia. Następnie podłącz kawałek rurki o odpowiedniej długości do wylotu, aby rozpocząć zbieranie kropel, gdy tworzenie się kropel jest stabilne, zbierając kropelki w rurce blokującej.Po zebraniu wszystkich kropel dodać 200 mikrolitrów pożywki RPMI, bez surowicy, na wierzch kropelek i inkubować próbkę z otworem w pokrywie rurki blokującej przez odpowiedni okres czasu doświadczalnego. W celu rozbicia emulsji najpierw dodaj dwa mililitry PFO do ośmiu mililitrów flouinowanego oleju i użyj strzykawki, aby usunąć nadmiar oleju z dna probówki do zbierania kropel. Następnie dodaj 100 mikrolitrów 20% roztworu PFO do emulsji, aby uwolnić zamknięte komórki w fazie wodnej i krótko postukaj w probówkę, aby wymieszać.Nie zapominaj, że PFO może być szkodliwe dla komórek. Dlatego należy ograniczyć kontakt z PFO do minimum. Po jednej do dwóch minut wirować roztwór przy najmniejszej możliwej względnej sile odśrodkowej przez 30 sekund i natychmiast przenieść 550 mikrolitrów frakcji wodnej do nowej zamkniętej probówki zawierającej 500 mikrolitrów zimnego PBS, uzupełnionego 2% płodową surowicą cielęcą lub FCS.Pozwól, aby resztki oleju opadły na dno nowej rurki blokującej i ostrożnie przenieś 950 mikrolitrów ogniwa zawierającego fazę wodną do nowej rurki blokującej. Upewnij się, że olej nie jest przenoszony wraz z fazą wodną do nowej rurki blokującej. Następnie zbierz komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w 300 mikrolitrach świeżego zimnego PBS uzupełnionego 2% FCS.Stosując podejście do ładowania końcówki, jak właśnie pokazano, można uzyskać współczynniki enkapsulacji limfocytów T Jurkat zbieżne z wartościami przewidywanymi statystycznie. Co ciekawe, nawet w przypadku przylegających komórek, takich jak komórki nowotworowe, które mają tendencję do zlepiania się, lub rzadkich komórek, takich jak plazmocytoidalne komórki dendrytyczne, obserwuje się poprawę skuteczności enkapsulacji. Podczas tej reprezentatywnej enkapsulacji kropelki zregenerowały się przy użyciu agarozy o bardzo niskiej temperaturze żelowania i zżelowały się po wyprodukowaniu, tworząc kulki hydrożelu agarozowego, które umożliwiły późniejszą analizę za pomocą mikroskopii i cytometrii przepływowej.Analiza mikroskopowa wykazała, że parowanie komórek osiągnięto w różnych kombinacjach, co wskazuje na parowanie komórek o wysokiej przepustowości, a analiza tej samej populacji kulek hydrożelowych za pomocą cytometrii przepływowej ujawniła, że kulki bez komórek można oddzielić od kulek z komórkami na podstawie ich odrębnych wzorów rozpraszania do przodu i na boki. Rzeczywiście, bramkowanie na populacji koralików bez komórek potwierdziło brak enkapsulacji komórek przez brak sygnałów fluorescencyjnych, podczas gdy bramkowanie na populacji koralików z komórkami ujawniło istnienie wielu subpopulacji wskazujących na enkapsulację inaczej znakowanych limfocytów T Jurkat. Podczas pracy z tą metodą należy pamiętać, że stężenie komórek jest czynnikiem ograniczającym i musi być zoptymalizowane, aby zapewnić wydajną enkapsulację komórek i parowanie komórek.Po tej procedurze nie tylko jedna lub dwie komórki mogą być zamknięte w kropelkach z wysoką wydajnością, ale wiele komórek lub typów komórek może być zamkniętych w kapsułkach w celu dokładniejszej replikacji mikrośrodowiska komórkowego. Technika ta utoruje drogę naukowcom z dziedziny immunologii i dyscyplin pokrewnych do optymalnego wykorzystania populacji komórek bliznowatych i ich efektywnej enkapsulacji w kropelkach, w celu zbadania zachowania komórek w środowisku wolnym od szumów.

a-pipette-tip-based-method-for-seeding-cells-to-droplet-microfluidic

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

W niniejszym artykule opisujemy prostą metodę izolacji pojedynczych komórek z pierwotnych kultur neuronalnych szczura oraz późniejszą analizę transkryptomu z wykorzystaniem amplifikacji aRNA. Metoda ta może zostać zastosowana do każdego typu komórek.

Analiza transkryptomu pojedynczych komórek

Mikrofluidyczne platformy kropelkowe są obiecującymi narzędziami do eksperymentów wysokoprzepustowych, ponieważ umożliwiają one niskokosztowe generowanie piko-litrowych, samoczynnie odseparowanych komór z częstotliwością rzędu kHz. Dzięki integracji z szybkimi, czułymi i wysokorozdzielczymi metodami spektroskopii fluorescencyjnej, duże ilości informacji generowanych w tych systemach mogą być efektywnie wydobywane, przetwarzane i wykorzystywane.

Metody detekcji fluorescencyjnej dla mikroprzepływowych platform kroplkowych

W niniejszej pracy opisujemy szybką i prostą metodę pomiaru sztywności komórek. Ogólna zasada tego podejścia polega na pomiarze deformacji błony w odpowiedzi na ściśle określone podciśnienie przyłożone do powierzchni komórki za pomocą mikropipety. Metoda ta stanowi potężne narzędzie do badania właściwości biomechanicznych komórek przytwierdzonych do podłoża.

Aspiracja mikropipetą komórek przytwierdzonych do podłoża w celu oszacowania sztywności komórek

Źródło: Sutlief, A. L. i in. Analiza naprężeń ścinających na żywych komórkach na Pseudomonas aeruginosa z wykorzystaniem zautomatyzowanego systemu mikrofluidycznego o wyższej przepustowości. J. Vis. Exp. (2019).Ten film prezentuje przygotowanie płytki mikrofluidycznej do badań naprężeń ścinających w kulturach bakteryjnych. Po przygotowaniu kanałów podłożem, komórki bakteryjne są wprowadzane do kanału eksperymentalnego i inkubowane do przyczepienia. Pozostałe nośniki i hodowla są usuwane, aby...

Przygotowanie płytki mikrofluidycznej z komórkami bakteryjnymi

Opracowaliśmy zautomatyzowaną platformę do hodowli komórek i przesłuchań do eksperymentów stymulacji komórek na mikroskalę.  Platforma oferuje prostą, wszechstronną i precyzyjną kontrolę w hodowli i stymulacji małych populacji komórek oraz odzyskiwaniu lizatów do analiz molekularnych.  Platforma doskonale nadaje się do badań, w których wykorzystuje się cenne komórki i/lub odczynniki.

Wszechstronna, zautomatyzowana platforma do eksperymentów ze stymulacją komórek w mikroskali

Bakteryjne kanały mechanowrażliwe mogą być używane jako przetworniki mechanoelektryczne w urządzeniach biomolekularnych.  Dwuwarstwy interfejsu kropelkowego (DIB), inspirowane komórkami elementami budulcowymi takich urządzeń, stanowią nowe platformy do włączania i stymulowania kanałów mechanowrażliwych.  W tym miejscu demonstrujemy nową metodę tworzenia DIB opartą na mikropipetach, umożliwiającą badanie kanałów mechanoczułych pod wpływem stymulacji mechanicznej.

Wielofunkcyjna, oparta na mikropipetach metoda wprowadzania i stymulacji mechanowrażliwych kanałów jonowych bakterii w dwuwarstwach interfejsu kropelkowego

Tutaj demonstrujemy prostą metodę produkcji mikrokropelek o kontrolowanej wielkości, monodyspersyjnych, typu woda w oleju (W/O) za pomocą kapilarnego odśrodkowego urządzenia mikroprzepływowego. Metoda ta wymaga jedynie niewielkiej objętości próbki i umożliwia produkcję o wysokiej wydajności. Spodziewamy się, że ta metoda będzie przydatna do szybkich analiz biochemicznych i komórkowych.

Kapilarne odśrodkowe urządzenie mikroprzepływowe do formowania mikrokropel monodyspersyjnych o kontrolowanej wielkości

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli pojedynczych komórek za pomocą platformy mikroprzepływowej, który wykorzystuje nową koncepcję projektowania mikrostudzienek, aby umożliwić wysokowydajną izolację pojedynczych komórek i długoterminową hodowlę klonalną.

Platforma mikroprzepływowa do wysokowydajnej izolacji i hodowli pojedynczych komórek

Protokół opisuje, jak zaprojektować perfuzyjną sieć naczyniową w sferoidzie. Mikrośrodowisko otaczające sferoidę jest zaprojektowane tak, aby indukować angiogenezę i łączyć sferoidę z mikrokanałami w urządzeniu mikroprzepływowym. Metoda pozwala na perfuzję sferoidy, co jest długo oczekiwaną techniką w kulturach trójwymiarowych.

Perfuzyjna sieć naczyniowa z modelem tkankowym w urządzeniu mikroprzepływowym

Protokół opisuje zaawansowaną platformę mikroprzepływową do ilościowego pomiaru dynamiki wydzielania cytokin w pojedynczych ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej. Platforma mierzy równolegle do trzech cytokin (IL-6, TNFα i IL-1β) dla każdej pojedynczej komórki stymulowanej lipopolisacharydem, na przykład.

Podejście mikroprzepływowe do rozwiązywania jednoczesnego i sekwencyjnego wydzielania cytokin w poszczególnych komórkach wielofunkcyjnych

Protokół ten dokumentuje wytwarzanie i montaż SPOT, wysokoprzepustowej platformy hodowlanej opartej na rusztowaniach, w formatach 96- i 384-dołkowych. Szczegółowo opisuje również proces wysiewu dla SPOT, zarówno ręczny, jak i przy użyciu dostępnego na rynku urządzenia do obsługi cieczy.

Powtarzalna produkcja SPOT jako wysokoprzepustowej platformy hodowlanej opartej na rusztowaniach

Poznaj metodę wysiewu rzadkich komórek do kroplowych platform mikroprzepływowych za pomocą końcówek pipet. Technika zwiększa wydajność enkapsulacji komórek Jurkat i innych typów rzadkich komórek.

Metoda oparta na końcówkach pipet do wysiewu komórek do kropelkowych platform mikroprzepływowych

Przeglądaj więcej filmów