Metoda oparta na końcówkach pipet do wysiewu komórek do kropelkowych platform mikroprzepływowych

Integracja tej metodologii z mikrofluidyką opartą na kropelkach pomaga odpowiedzieć na kluczowe pytania związane z dziedziną immunologii systemowej w celu kodowania heterogeniczności komórkowej i komunikacji między pojedynczymi komórkami lub patogenami. Główną zaletą tej techniki, którą opracowaliśmy, jest to, że ta procedura ładowania końcówką pozwala na enkapsulację rzadkich komórek w kropelkach ściśle pasujących do przewidywanego rozkładu procentowego. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia, jak używać końcówek pipet do ładowania komórek do kropelek o różnej płci i pobierania komórek z kropel.

W celu naładowania końcówką do wytwarzania kropel wodnych, najpierw dodaj trzy mililitry środka powierzchniowo czynnego do dwóch mililitrów oleju fluorowanego i wciągnij mieszaninę fazy olejowej do strzykawki o pojemności 2,5 mililitra. Usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza ze strzykawki i podłączyć strzykawkę do kawałka rurki teflonowej o odpowiedniej długości. Załadować dwie strzykawki z próbkami odpowiednim bi-kompatybilnym olejem mineralnym i podłączyć strzykawkę do drugiego kawałka rurki teflonowej o odpowiedniej długości.

Następnie przebij zatyczkę polidimetylosiloksanu lub PDMS o średnicy pięciu milimetrów z utwardzonej płyty EDMS i przebij jednomilimetrowy otwór przez środek wtyczki. Włóż szczelnie zatyczkę do górnego końca końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów i włóż rurkę dołączoną do bi-kompatybilnej strzykawki z olejem mineralnym do korka. Powoli wciskać tłok strzykawki, aby napełnić końcówkę pipety olejem mineralnym, wypychając całe resztki powietrza.

Ostrożnie umieścić obie strzykawki z próbką i strzykawkę z olejem fluorowanym na pompie strzykawkowej. Po usunięciu całego powietrza opuść każdą końcówkę pipety do roztworu próbki i zassaj około 100 mikrolitrów próbki komórek do końcówek. Następnie włóż obie końcówki pipet zawierające próbkę do dwóch wewnętrznych wlotów chipa PDMS i włóż rurkę zawierającą mieszaninę fazy olejowej do zewnętrznego wlotu.

Ustaw natężenia przepływu na pompie strzykawkowej zgodnie z opisem A następnie wprowadź i ustaw wymiary każdej strzykawki. Uruchomić pompę, aby przepłukać roztwór próbki przez wewnętrzne kanały urządzenia, a fazę olejową przez zewnętrzny kanał urządzenia. Następnie podłącz kawałek rurki o odpowiedniej długości do wylotu, aby rozpocząć zbieranie kropel, gdy tworzenie się kropel jest stabilne, zbierając kropelki w rurce blokującej.

Po zebraniu wszystkich kropel dodać 200 mikrolitrów pożywki RPMI, bez surowicy, na wierzch kropelek i inkubować próbkę z otworem w pokrywie rurki blokującej przez odpowiedni okres czasu doświadczalnego. W celu rozbicia emulsji najpierw dodaj dwa mililitry PFO do ośmiu mililitrów flouinowanego oleju i użyj strzykawki, aby usunąć nadmiar oleju z dna probówki do zbierania kropel. Następnie dodaj 100 mikrolitrów 20% roztworu PFO do emulsji, aby uwolnić zamknięte komórki w fazie wodnej i krótko postukaj w probówkę, aby wymieszać.

Nie zapominaj, że PFO może być szkodliwe dla komórek. Dlatego należy ograniczyć kontakt z PFO do minimum. Po jednej do dwóch minut wirować roztwór przy najmniejszej możliwej względnej sile odśrodkowej przez 30 sekund i natychmiast przenieść 550 mikrolitrów frakcji wodnej do nowej zamkniętej probówki zawierającej 500 mikrolitrów zimnego PBS, uzupełnionego 2% płodową surowicą cielęcą lub FCS.

Pozwól, aby resztki oleju opadły na dno nowej rurki blokującej i ostrożnie przenieś 950 mikrolitrów ogniwa zawierającego fazę wodną do nowej rurki blokującej. Upewnij się, że olej nie jest przenoszony wraz z fazą wodną do nowej rurki blokującej. Następnie zbierz komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w 300 mikrolitrach świeżego zimnego PBS uzupełnionego 2% FCS.

Stosując podejście do ładowania końcówki, jak właśnie pokazano, można uzyskać współczynniki enkapsulacji limfocytów T Jurkat zbieżne z wartościami przewidywanymi statystycznie. Co ciekawe, nawet w przypadku przylegających komórek, takich jak komórki nowotworowe, które mają tendencję do zlepiania się, lub rzadkich komórek, takich jak plazmocytoidalne komórki dendrytyczne, obserwuje się poprawę skuteczności enkapsulacji. Podczas tej reprezentatywnej enkapsulacji kropelki zregenerowały się przy użyciu agarozy o bardzo niskiej temperaturze żelowania i zżelowały się po wyprodukowaniu, tworząc kulki hydrożelu agarozowego, które umożliwiły późniejszą analizę za pomocą mikroskopii i cytometrii przepływowej.

Analiza mikroskopowa wykazała, że parowanie komórek osiągnięto w różnych kombinacjach, co wskazuje na parowanie komórek o wysokiej przepustowości, a analiza tej samej populacji kulek hydrożelowych za pomocą cytometrii przepływowej ujawniła, że kulki bez komórek można oddzielić od kulek z komórkami na podstawie ich odrębnych wzorów rozpraszania do przodu i na boki. Rzeczywiście, bramkowanie na populacji koralików bez komórek potwierdziło brak enkapsulacji komórek przez brak sygnałów fluorescencyjnych, podczas gdy bramkowanie na populacji koralików z komórkami ujawniło istnienie wielu subpopulacji wskazujących na enkapsulację inaczej znakowanych limfocytów T Jurkat. Podczas pracy z tą metodą należy pamiętać, że stężenie komórek jest czynnikiem ograniczającym i musi być zoptymalizowane, aby zapewnić wydajną enkapsulację komórek i parowanie komórek.

Po tej procedurze nie tylko jedna lub dwie komórki mogą być zamknięte w kropelkach z wysoką wydajnością, ale wiele komórek lub typów komórek może być zamkniętych w kapsułkach w celu dokładniejszej replikacji mikrośrodowiska komórkowego. Technika ta utoruje drogę naukowcom z dziedziny immunologii i dyscyplin pokrewnych do optymalnego wykorzystania populacji komórek bliznowatych i ich efektywnej enkapsulacji w kropelkach, w celu zbadania zachowania komórek w środowisku wolnym od szumów.