Name: Połączenie analizy DNA w surowej ekstrakcji wirionu z analizą RNA z zakażonych liści w celu odkrycia nowych genomów wirusów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Odkryj metodę izolacji i sekwencjonowania wirusów roślinnych z zakażonych liści przy użyciu ekstrakcji DNA i RNA. Technika ta umożliwia identyfikację nowych genomów wirusów z rodziny Caulimoviridae.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania zostały sfinansowane przez Oklahoma Center for Advancement of Science and Technology Applied Research Program Phase II AR 132-053-2; oraz przez Oklahoma Department of Agriculture Specialty Crops Research Grant Program. Dziękujemy dr HongJin Hwang i OSU Bioinformatics Core Facility, który był wspierany przez granty z NSF (EOS-0132534) i NIH (2P20RR016478-04, 1P20RR16478-02 i 5P20RR15564-03).

<ol><li>Dijkstra, J., Jager, C. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDijkstra%2C+J+%22Practical+Plant+Virology+%3A+Protocols+and+Exercises%22">Practical Plant Virology : Protocols and Exercises</a>. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 1 edn (1998).</li>
<li>Roossinck, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+virus+metagenomics%3A+biodiversity+and+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Plant virus metagenomics: biodiversity and ecology.</a> Annu Rev Genet. 46, 359-369 (2012).</li>
<li>Melcher, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+novel+viruses+by+analysis+of+nucleic+acids+in+virus-like+particle+fractions+from+Ambrosia+psilostachya%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Evidence for novel viruses by analysis of nucleic acids in virus-like particle fractions from Ambrosia psilostachya.</a> J Virol Methods. 152 (1-2), 49-55 (2008).</li>
<li>Stobbe, A. H., Schneider, W. L., Hoyt, P. R., Melcher, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+metagenomic+data+for+viruses+using+the+e-probe+diagnostic+nucleic+Acid+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Screening metagenomic data for viruses using the e-probe diagnostic nucleic Acid assay.</a> Phytopathology. 104 (10), 1125-1129 (2014).</li>
<li>Borah, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacilliform+DNA-containing+plant+viruses+in+the+tropics%3A+commonalities+within+a+genetically+diverse+group%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Bacilliform DNA-containing plant viruses in the tropics: commonalities within a genetically diverse group.</a> Mol Plant Pathol. 14 (8), 759-771 (2013).</li>
<li>Bousalem, M., Douzery, E. J., Seal, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxonomy%2C+molecular+phylogeny+and+evolution+of+plant+reverse+transcribing+viruses+%28family+Caulimoviridae%29+inferred+from+full-length+genome+and+reverse+transcriptase+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Taxonomy, molecular phylogeny and evolution of plant reverse transcribing viruses (family Caulimoviridae) inferred from full-length genome and reverse transcriptase sequences.</a> Arch Virol. 153 (6), 1085-1102 (2008).</li>
<li>Geering, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Banana+contains+a+diverse+array+of+endogenous+badnaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Banana contains a diverse array of endogenous badnaviruses.</a> J Gen Virol. 86, Pt 2 511-520 (2005).</li>
<li>Kunii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+putative+DNA+virus+from+endogenous+rice+tungro+bacilliform+virus-like+sequences+in+the+rice+genome%3A+implications+for+integration+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of putative DNA virus from endogenous rice tungro bacilliform virus-like sequences in the rice genome: implications for integration and evolution.</a> BMC Genomics. 5, 80(2004).</li>
<li>Laney, A. G., Hassan, M., Tzanetakis, I. E. <a target="_blank" href="https://apsjournals.apsnet.org/doi/abs/10.1094/PHYTO-12-11-0351">An integrated badnavirus is prevalent in Figure germplasm.</a> Phytopathology. 102 (12), 1182-1189 (2012).</li>
<li>Gambley, C. F., Geering, A. D., Steele, V., Thomas, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+viral+and+non-viral+reverse+transcribing+elements+in+pineapple+%28Ananas+comosus%29%2C+including+members+of+two+new+badnavirus+species%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of viral and non-viral reverse transcribing elements in pineapple (Ananas comosus), including members of two new badnavirus species.</a> Arch Virol. 153 (8), 1599-1604 (2008).</li>
<li>Gayral, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+Banana+streak+virus+integration+event+in+the+banana+genome+as+the+origin+of+infectious+endogenous+pararetrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A single Banana streak virus integration event in the banana genome as the origin of infectious endogenous pararetrovirus.</a> J Virol. 82 (13), 6697-6710 (2008).</li>
<li>Lyttle, D. J., Orlovich, D. A., Guy, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+analysis+of+endogenous+badnaviruses+in+the+New+Zealand+flora%5BTitle%5D)+AND+%22AoB+Plants%22%5BJournal%5D)">Detection and analysis of endogenous badnaviruses in the New Zealand flora.</a> AoB Plants. 2011, 008(2011).</li>
<li>Le Provost, G., Iskra-Caruana, M. L., Acina, I., Teycheney, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+detection+of+episomal+Banana+streak+viruses+by+multiplex+immunocapture+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved detection of episomal Banana streak viruses by multiplex immunocapture PCR.</a> J Virol Methods. 137 (1), 7-13 (2006).</li>
<li>Singh, K., Talla, A., Qiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA+profiling+of+virus-infected+grapevines%3A+evidences+for+virus+infection-associated+and+variety-specific+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Funct+Integr+Genomics%22%5BJournal%5D)">Small RNA profiling of virus-infected grapevines: evidences for virus infection-associated and variety-specific miRNAs.</a> Funct Integr Genomics. 12 (4), 659-669 (2012).</li>
<li>Alfson, K. J., Beadles, M. W., Griffiths, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+determining+whole+viral+genomic+sequences+including+termini+using+a+single+deep+sequencing+run%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A new approach to determining whole viral genomic sequences including termini using a single deep sequencing run.</a> J Virol Methods. 208, 1-5 (2014).</li>
<li>Kreuze, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+viral+genome+sequence+and+discovery+of+novel+viruses+by+deep+sequencing+of+small+RNAs%3A+a+generic+method+for+diagnosis%2C+discovery+and+sequencing+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Complete viral genome sequence and discovery of novel viruses by deep sequencing of small RNAs: a generic method for diagnosis, discovery and sequencing of viruses.</a> Virology. 388 (1), 1-7 (2009).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VirusDetect%3A+An+automated+pipeline+for+efficient+virus+discovery+using+deep+sequencing+of+small+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">VirusDetect: An automated pipeline for efficient virus discovery using deep sequencing of small RNAs.</a> Virology. 500, 130-138 (2017).</li>
<li>James, A. P., Geijskes, R. J., Dale, J. L., Harding, R. M. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1744-7348.2011.00466.x">Molecular characterisation of six badnavirus species associated with leaf streak disease of banana in East Africa.</a> Annals of Applied Biology. 158 (3), 346-353 (2011).</li>
<li>Baranwal, V. K., Sharma, S. K., Khurana, D., Verma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+analysis+of+shorter+than+genome+length+episomal+Banana+streak+OL+virus+like+sequences+isolated+from+banana+in+India%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Genes%22%5BJournal%5D)">Sequence analysis of shorter than genome length episomal Banana streak OL virus like sequences isolated from banana in India.</a> Virus Genes. 48 (1), 120-127 (2014).</li>
<li>Sukal, A., Kidanemariam, D., Dale, J., James, A., Harding, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+badnaviruses+infecting+Dioscorea+spp.+in+the+Pacific+reveals+two+putative+novel+species+and+the+first+report+of+dioscorea+bacilliform+RT+virus+2%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of badnaviruses infecting Dioscorea spp. in the Pacific reveals two putative novel species and the first report of dioscorea bacilliform RT virus 2.</a> Virus Res. 238, 29-34 (2017).</li>
<li>BÖmer, M., Turaki, A. A., Silva, G., Kumar, P. L., Seal, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sequence-independent+strategy+for+amplification+and+characterisation+of+episomal+badnavirus+sequences+reveals+three+previously+uncharacterised+yam+badnaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">A sequence-independent strategy for amplification and characterisation of episomal badnavirus sequences reveals three previously uncharacterised yam badnaviruses.</a> Viruses. 8 (7), (2016).</li>
<li>Momol, M. T., Lockhart, B. E. L., Dankers, H., Adkins, S. <a target="_blank" href="https://www.plantmanagementnetwork.org/pub/php/brief/2004/canna/">Canna yellow mottle virus detected in Canna in Florida.</a> Plant Health Progress. , August 2-4 (2004).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Canna+yellow+mottle+virus+in+a+new+host%2C+Alpinia+purpurata%2C+in+Hawaii%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Canna yellow mottle virus in a new host, Alpinia purpurata, in Hawaii.</a> Phytopathology. 107 (6), 791-799 (2017).</li>
<li>Wijayasekara, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+two+badnavirus+genomes+associated+with+Canna+yellow+mottle+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of two badnavirus genomes associated with Canna yellow mottle disease.</a> Virus Res. 243, 19-24 (2018).</li>
<li>Covey, S. N., Noad, R. J., al-Kaff, N. S., Turner, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caulimovirus+isolation+and+DNA+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Caulimovirus isolation and DNA extraction.</a> Methods Mol Biol. 81, 53-63 (1998).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+A+laboratory+manual.+2nd+edn%22">Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd edn</a>. , Cold Spring Harbor Press. (1989).</li>
<li>Radford, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+next-generation+sequencing+technologies+in+virology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Application of next-generation sequencing technologies in virology.</a> J Gen Virol. 93, Pt 9 1853-1868 (2012).</li>
<li>Kanagal-Shamanna, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emulsion+PCR%3A+Techniques+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Emulsion PCR: Techniques and Applications.</a> Methods Mol Biol. 1392, 33-42 (2016).</li>
<li>Getts, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+blockade+in+lethal+West+Nile+virus+encephalitis+indicates+a+crucial+role+for+very+late+antigen+%28VLA%29-4-dependent+recruitment+of+nitric+oxide-producing+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Targeted blockade in lethal West Nile virus encephalitis indicates a crucial role for very late antigen (VLA)-4-dependent recruitment of nitric oxide-producing macrophages.</a> J Neuroinflammation. 9, 246(2012).</li>
<li>van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+preparation+methods+for+next-generation+sequencing%3A+tone+down+the+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias.</a> Exp Cell Res. 322 (1), 12-20 (2014).</li>
<li>Gel filtration principles and methods. <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma-Aldrich/General_Information/1/ge-gel-filtration.pdf">GE Healthcare</a>. , (2010).</li>
<li>Goff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iPlant+Collaborative%3A+Cyberinfrastructure+for+Plant+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">The iPlant Collaborative: Cyberinfrastructure for Plant Biology.</a> Frontiers in Plant Science. 2, (2011).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+and+bioinformatic+approaches+to+detect+and+analyze+influenza+virus+in+ferrets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dev+Ctries%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing and bioinformatic approaches to detect and analyze influenza virus in ferrets.</a> J Infect Dev Ctries. 8 (4), 498-509 (2014).</li>
<li>Artimo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExPASy%3A+SIB+bioinformatics+resource+portal%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">ExPASy: SIB bioinformatics resource portal.</a> Nucleic Acids Res. 40, Web Server issue 597-603 (2012).</li>
<li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUSCLE%3A+a+multiple+sequence+alignment+method+with+reduced+time+and+space+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MUSCLE: a multiple sequence alignment method with reduced time and space complexity.</a> BMC Bioinformatics. 5, 113(2004).</li>
<li>Hung, J. H., Weng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+Alignment+and+Homology+Search+with+BLAST+and+ClustalW%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Sequence Alignment and Homology Search with BLAST and ClustalW.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2016 (11), (2016).</li>
<li>Sohpal, V. K., Dey, A., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEGA+biocentric+software+for+sequence+and+phylogenetic+analysis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Bioinform+Res+Appl%22%5BJournal%5D)">MEGA biocentric software for sequence and phylogenetic analysis: a review.</a> Int J Bioinform Res Appl. 6 (3), 230-240 (2010).</li>
<li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3--new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Res. 40 (15), 115(2012).</li>
<li>Dhaliwa, A. DNA extraction and purification. Mater Methods. 3, 191(2013).</li>
<li>Moeller, J. R., Moehn, N. R., Waller, D. M., Givnish, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paramagnetic+cellulose+DNA+isolation+improves+DNA+yield+and+quality+among+diverse+plant+taxa%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Paramagnetic cellulose DNA isolation improves DNA yield and quality among diverse plant taxa.</a> Appl. Plant Sci. 2 (10), (2014).</li>
<li>Moeller, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paramagnetic+cellulose+DNA+isolation+improves+DNA+yield+and+quality+among+diverse+plant+taxa%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Paramagnetic cellulose DNA isolation improves DNA yield and quality among diverse plant taxa.</a> Appl. Plant Sci. 2 (10), (2014).</li>
<li>Grooms, K. <a target="_blank" href="https://www.semanticscholar.org/paper/Review%3A-Improved-DNA-Yield-and-Quality-from-Diverse-Grooms/b0a1299cacd7451cbbb9270caf72762379cd8e5d">Review: Improved DNA Yield and Quality from Diverse Plant Taxa</a>. , (2015).</li>
<li>Nishimori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+antivirus+activity+of+an+anti-programmed+death-ligand+1+%28PD-L1%29+rat-bovine+chimeric+antibody+against+bovine+leukemia+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo antivirus activity of an anti-programmed death-ligand 1 (PD-L1) rat-bovine chimeric antibody against bovine leukemia virus infection.</a> PLoS One. 12 (4), 0174916(2017).</li>
<li>Rojas, M. R., Gilbertson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9783540757627">Plant Virus Evolution</a>. Roossinck, M. J. 1, Springer-Verlag. 27-51 (2008).</li>
<li>Roossinck, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+big+unknown%3A+plant+virus+biodiversity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Virol%22%5BJournal%5D)">The big unknown: plant virus biodiversity.</a> Curr Opin Virol. 1 (1), 63-67 (2011).</li>
<li>Roossinck, M. J., Martin, D. P., Roumagnac, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+Virus+Metagenomics%3A+Advances+in+Virus+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Plant Virus Metagenomics: Advances in Virus Discovery.</a> Phytopathology. 105 (6), 716-727 (2015).</li>
<li>Momol, M. T., Lockhart, B. E. L., Dankers, H., Adkins, S. <a target="_blank" href="NULL">Plant Health Progress</a>. , Online (2004).</li>
<li>Eni, A., Hughes, J. D., Asiedu, R., Rey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+diversity+among+badnavirus+isolates+infecting+yam+%28Dioscorea+spp.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Sequence diversity among badnavirus isolates infecting yam (Dioscorea spp.).</a> Archives of Virology. 153 (12), Ghana, Togo, Benin and Nigeria. 2263-2272 (2008).</li>
<li>Harper, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diversity+of+Banana+streak+virus+isolates+in+Uganda%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">The diversity of Banana streak virus isolates in Uganda.</a> Arch Virol. 150 (12), 2407-2420 (2005).</li>
<li>Muller, E., Sackey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+variability+analysis+of+five+new+complete+cacao+swollen+shoot+virus+genomic+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Molecular variability analysis of five new complete cacao swollen shoot virus genomic sequences.</a> Arch Virol. 150 (1), 53-66 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W ostatnich latach do badania różnorodności biologicznej wirusów roślinnych w środowisku naturalnym zastosowano różne metody, które obejmują wzbogacanie o cząsteczki wirusopodobne (VLP) lub RNA lub DNA specyficzne dla wirusa 2,3,44,45,46 . Po tych metodach stosuje się NGS i analizę bioinformatyczną. Celem tego badania było znalezienie czynnika wywołującego powszechną chorobę w uprawianej roślinie. Doniesiono, że choroba jest wynikiem nieznanego wirusa, który ma bezotoczkowe cząsteczki pałeczek i dla którego sklonowano tylko fragment o długości 565 pz47. Informacje te były wystarczające dla wcześniejszych badaczy, aby hipotetycznie przypisać wirusa do rodzaju Badnavirus w rodzinie Caulimoviridae. Podczas gdy wcześniejsze doniesienia stawiały hipotezę, że choroba plamistości konopi w liliach kanciastych była wynikiem pojedynczego badnawirusa, stosując podejście metagenomiczne przedstawione w tym badaniu, ustaliliśmy, że choroba była spowodowana przez dwa wstępnie zidentyfikowane gatunki badnawirusa24. Tak więc mocną stroną stosowania podejścia metagenomowego do odkrycia czynnika przyczynowego choroby jest to, że możemy teraz zidentyfikować sytuacje, w których może istnieć więcej niż jedna przyczyna.
Nasze podejście łączące dane sekwencjonowania DNA i RNA jest dokładne i pokazuje również, że wyniki przy użyciu dwóch podejść przyniosły spójne wyniki i potwierdziły obecność dwóch pokrewnych wirusów. Zastosowaliśmy zmodyfikowaną procedurę izolacji kalalimowirusów i wyprodukowaliśmy próbkę, która została wzbogacona o kwasy nukleinowe związane z wirusem i które były chronione w kapsydzie wirusa. Do przeprowadzenia sekwencjonowania DNA zlecono laboratorium serwisowemu. Podstawową koncepcją sekwencjonowania de novo jest to, że polimeraza DNA włącza znakowane fluorescencyjnie nukleotydy do nici matrycowej DNA podczas sekwencyjnych cykli syntezy DNA. Złożone kontigi, a następnie NGS zostały poddane bioinformatycznemu procesowi pracy, w wyniku którego powstało kilka kontigów, które zostały zidentyfikowane jako kontigi wirusów. Dalsze potwierdzenie dwóch genomów wirusa 10,24,48,49,50 uzyskano poprzez analizę bioinformatyczną danych sekwencyjnych RNA uzyskanych z preparatów RNA zubożonych w rybo. Jednym z interesujących wyników było dowiedzenie się, że populacje sekwencji odzyskanych przez sekwencjonowanie DNA i RNA zapewniają podobne rozkłady niewirusowych i wirusowych kwasów nukleinowych. W przypadku sekwencjonowania DNA i RNA < 0,5% sekwencji było pochodzenia wirusowego. W populacji sekwencji wirusa 78-82% należało do rodziny Caulimoviridae. Porównując złożone kontigi wirusa z sekwencjonowania DNA i RNA, potwierdziliśmy, że dwa złożone genomy wystąpiły w obu zestawach danych.
Problem związany z używaniem tylko sekwencjonowania DNA do identyfikacji nowych genomów wirusa polega na tym, że genom badnawirusa jest otwartym okrągłym DNA. Przypuszczaliśmy, że sekwencje nakładające się na nieciągłości w genomie mogą stanowić przeszkodę w składaniu genomu z kontigów. Wstępne badanie wyników sekwencjonowania DNA ujawniło dwa podobne genomy wirusa. Postawiliśmy hipotezę, że genomy te albo reprezentują różnorodność genetyczną gatunku, który nie był badany, albo reprezentują dwa gatunki jednocześnie infekujące tę samą roślinę24. W związku z tym zbiorowa analiza bioinformatyczna zbiorów danych uzyskanych za pomocą sekwencjonowania DNA i RNA NGS, umożliwiła potwierdzenie obecności dwóch genomów o pełnej długości.
W innym raporcie opracowano alternatywną metodę ekstrakcji VLP i kwasów nukleinowych z homogenatów roślinnych do badań metagenomicznych, opartą na procedurach odzyskiwania DNA z wirusa mozaiki kalafiora (CaMV; kalafiowirusa)3. W ramach tego podejścia zidentyfikowano nowe sekwencje wirusów RNA i DNA w roślinach nieuprawianych. Etapy wyprowadzone z procedury izolacji kalafimowirusa zastosowanej w tym badaniu w celu wykrycia czynnika wywołującego chorobę roślin uprawnych różnią się od etapów wyznaczonych do ekstrakcji VLP z naturalnie zakażonych roślin24. Sukces obu zmodyfikowanych metod sugeruje, że ramowa procedura izolacji kaulimowirusa może być cennym punktem wyjścia dla badań metagenomicznych wirusów roślinnych w ogóle.

Pojawiające się choroby roślin skłaniają badaczy do opracowania nowych narzędzi do identyfikacji właściwego czynnika sprawczego. Wstępne doniesienia o nowych lub nawracających chorobach wirusowych opierają się na powszechnie występujących objawach, takich jak mozaika i wady rozwojowe liści, oczyszczanie żył, karłowatość, więdnięcie, zmiany chorobowe, martwica lub inne objawy. Standardem zgłaszania nowego wirusa jako czynnika wywołującego chorobę jest oddzielenie go od innych zanieczyszczających patogenów, rozmnażanie go w odpowiednim żywicielu i rozmnażanie choroby poprzez zaszczepienie zdrowych roślin pierwotnego gatunku gospodarza. Ograniczeniem w tym podejściu jest to, że wiele rodzajów wirusów roślinnych zależy od owada lub innych wektorów w celu przeniesienia się na odpowiedniego gospodarza lub z powrotem na pierwotny gatunek żywiciela. W takim przypadku poszukiwania odpowiedniego wektora mogą się przedłużyć, mogą wystąpić trudności z założeniem laboratoryjnych kolonii wektora i konieczne są dalsze wysiłki w celu opracowania protokołu eksperymentalnej transmisji. Jeśli nie można osiągnąć warunków do udanych badań laboratoryjnych dotyczących transmisji wirusowej, oznacza to, że praca nie spełnia standardu zgłaszania nowej choroby wirusowej. W przypadku wirusów, które występują w swoich naturalnych gospodarzach przy bardzo niskich mianach, naukowcy muszą zidentyfikować alternatywnych gospodarzy do rozmnażania, aby utrzymać wystarczające zasoby zakaźne do prowadzenia badań. Dla gatunków wirusów, które infekują tylko kilka roślin, może to również stanowić przeszkodę w uprawie kultur podstawowych1.
W ostatnich latach naukowcy coraz częściej stosują wysokoprzepustowe NGS i podejścia metagenomiczne do odkrywania sekwencji wirusów obecnych w środowisku, które mogą istnieć niezwiązane ze znaną chorobą, ale mogą być przypisane do gatunków i rodzajów taksonomicznych2,3,4. Takie podejścia do odkrywania i kategoryzacji materiałów genetycznych w odrębnym środowisku umożliwiają opisanie różnorodności wirusów w przyrodzie lub ich obecności w określonym ekosystemie, ale niekoniecznie potwierdzają ramy definiowania czynników przyczynowych dla widocznej choroby.
Rodzaj Badnavirus należy do rodziny Caulimoviridae pararetrowirusów. Wirusy te mają kształt pałeczek z okrągłymi dwuniciowymi genomami DNA o wielkości około 7 do 9 kb. Wszystkie pararetrowirusy replikują się przez produkt pośredni RNA. Pararetrowirusy występują jako episomy i replikują się niezależnie od DNA chromosomalnego rośliny5,6. Badania terenowe populacji wirusów wskazują, że te populacje wirusów są genetycznie złożone. Ponadto informacje uzyskane w różnych genomach roślinnych za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości ujawniły liczne przykłady fragmentów genomu badnawirusa wprowadzonych w wyniku nielegalnych zdarzeń integracji do genomów roślinnych. Te endogenne sekwencje badnawirusa niekoniecznie są związane z infekcją7,8,9,10,11. Następnie, zastosowanie NGS do identyfikacji nowych badnawirusów jako czynnika wywołującego chorobę jest skomplikowane ze względu na różnorodność subpopulacji genomów epizodycznych, a także występowanie sekwencji endogennych12,13.
Chociaż nie ma jednego optymalnego sposobu na odkrycie nowych genomów pararetrowirusów, istnieją dwa powszechne podejścia do identyfikacji tych wirusów jako czynników wywołujących choroby. Jedną z metod jest wzbogacenie o małe sekwencje RNA z zakażonych liści, a następnie złożenie tych sekwencji w celu odtworzenia genomu (genomów)14,15,16,17. Innym podejściem jest amplifikacja toczącego się koła (RCA) w celu amplifikacji kolistych genomów wirusów DNA18. Powodzenie RCA zależy od wieku liścia i miana wirusa w wybranej tkance. Produkty RCA są poddawane trawieniu restrykcyjnemu i klonowane do plazmidów w celu bezpośredniego sekwencjonowania19,20,21.
Wirus Canna yellow mottle virus (CaYMV) jest badnawirusem i jest opisany jako etiologiczna przyczyna choroby żółtej pstrości w Canna, chociaż tylko 565 pz fragment genomu został wcześniej wyizolowany z zakażonych Cannas22. Współczesne badanie zidentyfikowało CaYMV w Alpinia purpurata (kwitnący imbir; CaYMV-Ap)23. Celem tego badania było odzyskanie kompletnych sekwencji genomu badnawirusa z zakażonych lilii konopnych. Opisujemy protokół oczyszczania wirusa z zanieczyszczeń roślinnych, a następnie izolowania wirusowego DNA z tego preparatu oraz przygotowania biblioteki DNA do zastosowania w NGS. Takie podejście eliminuje potrzebę pośrednich etapów amplifikacji molekularnej. Izolujemy również mRNA z zakażonych roślin pod kątem sekwencjonowania RNA. NGS, który obejmuje sekwencję RNA, przeprowadzono przy użyciu każdego preparatu kwasu nukleinowego. Stwierdzono, że złożone kontigi odnoszą się do taksonu Badnavirus w obu zestawach danych przy użyciu podstawowego narzędzia do wyszukiwania lokalnych dopasowań kwasów nukleinowych (BLASTn) przez Narodowe Centrum Biotechnologii i Informacji (NCBI). Zidentyfikowaliśmy genomy dwóch gatunków badnawirusów24.

<table><tbody><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich St. Louis MO</td><td>S5976</td><td>Bufor mielący do oczyszczania wirusów</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S0751</td><td>Bufor mielący do oczyszczania wirusów</td></tr><tr><td>Na2SO3</td><td>Thermo-Fisher Waltham, MA</td><td>28790</td><td>Bufor mielący do oczyszczania</td></tr><tr><td>wirusów mocznik</td><td>Thermo-Fisher</td><td>PB169-212</td><td>Ekstrakcja homogenatu&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Ekstrakcja homogenatu</td> <td>X-100</td>&nbsp;</tr><tr><td>Gaza</td><td>VWR Radnor, PA</td><td>21910-107</td><td>Homogenat filtracyjny&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP152-5</td><td>Zawieszenie peletów i do resuspension DNA&nbsp;</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Spectrum, Gardena, CA</td><td>M1035</td><td>Bufor do resuspension w postaci granulek</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Spectrum</td><td>E1045</td><td>Zatrzymuje reakcje enzymatyczne</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Thermo-Fisher</td><td>25530</td><td>Bufor do resuspension DNA</td></tr><tr><td>fenol:chloroform:alkohol izoamylowy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2069</td><td>Rozpuszczanie białek wirionu</td></tr><tr><td>DNAza I</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>Degradacja DNA komórkowego z ekstraktów</td></tr><tr><td>95% etanolu</td><td>Wirus Sigma-Aldrich</td><td>6B-100</td><td>Wytrącanie DNA Blender</td></tr><tr><td>laboratoryjny</td><td>VWR</td><td>58984-030</td><td>Mielenie próbek liści</td></tr><tr><td>Model podłogowy ultrawirówka&nbsp; & Wirnik Ti70</td><td>Beckman Coulter, Irving TX&nbsp;</td><td>A94471</td><td>Separacja ekstraktów komórkowych</td></tr><tr><td>Wirówka podłogowa i wirnik JA-14</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>369001</td><td>Separacja ekstraktów komórkowych</td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>VWR</td><td>75876-022</td><td>Mieszanie mocznika z próbkami przez noc</td></tr><tr><td>Gumowy policjant</td><td>VWR</td><td>470104-462</td><td>Rozpuść granulkę wirusa</td></tr><tr><td>&nbsp; Bioanalizator 2100 Instrument</td><td>Agilent Genomics, Santa Clare, CA</td><td>G2939BA</td><td>Czułe wykrywanie jakości i ilości DNA i RNA</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer RNA-Picochip</td><td></td><td>5067-1513</td><td>Chip mikroprzepływowy służący do przenoszenia, barwienia i pomiaru jakości RNA w 2100 Bioanalyzer</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer Chip</td><td></td> DNA-High Sensitive <td>5067-4626</td><td>Chip mikrofluidyczny używany do przenoszenia, barwienia i pomiaru jakości DNA w bioanalizatorze 2100</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Nanodrop Thermo-Fisher</td><td>ND-2000</td><td>Analiza jakości DNA/RNA na pośrednich etapach procedur</td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji całkowitego RNA roślin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>STRN50-1KT</td><td>Izolat RNA do sekwencji</td></tr><tr><td>RNaz bez wody&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10128-514</td><td>Ponowne zawieszenie DNA i RNA do</td></tr><tr><td>kolumny wirowej koncentratora RNA</td> NGS <td>Zymo Research, Irvine, CA</td><td>R1013</td><td>Przygotowanie RNA do</td></tr><tr><td>zestawu do usuwania rRNA</td><td>sekwencyjnego Illumina, San Diego, CA</td><td>MRZPL116</td><td>Przygotowanie RNA do sekwencji RNA</td></tr><tr><td>Magnes DynaMag-2</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td>Przygotowanie RNA do sekwencjonowania RNA</td></tr><tr><td>&nbsp; RNA&nbsp; system wzbogacania</td><td>Roche</td><td>7277300001</td><td>Przygotowanie RNA dla sekwencji RNA</td></tr><tr><td>Agarozy&nbsp;</td><td>Thermo-Fisher</td><td>16500100</td><td>Żel analiza jakości DNA/RNA na pośrednich etapach zabiegów</td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15585011</td><td>Barwienie żelem agarozowym</td></tr><tr><td>kompetentne komórki pGEM-T + JM109 Promega</td><td>, Madison, WI</td><td>A3610</td><td>Klonowane fragmenty genomu</td></tr><tr><td>polimeraza pFU Taq</td><td>Promega</td><td>M7741</td><td>PCR amplifikacja genomu wirusa</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1511</td><td>PCR amplifikacja genomu wirusa</td></tr><tr><td>Oligonukleotydy</td><td>PCR IDT, Coralvill, IA</td><td>Niestandardowe zamówienie</td><td>PCR amplifikacja genomu wirusa</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania DNA Miniprep</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td>Oczyszczanie plazmidowego DNA przed sekwencjonowaniem</td></tr><tr><td>Zestaw do czyszczenia PCR</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>Przygotuj produkty PCR do klonowania</td></tr><tr><td>oprogramowania pDRAW32</td><td>ACAClone</td><td></td><td>Komputerowa analiza kolistego DNA i motywów</td></tr><tr><td>MEGA6.0 oprogramowanie</td><td>MEGA</td><td></td><td>Analiza genetyki ewolucyjnej molekularnej</td></tr><tr><td>Elementarz 3.0</td><td>Simgene.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT&trade; RiboGreen&handel; Zestaw do oznaczania RNA</td><td>Thermo-Fisher</td><td>R11490</td><td>Fluorometryczne oznaczanie ilości RNA</td></tr><tr><td>GS Junior&trade System pirosekwencjonowania</td><td>Platforma sekwencjonowania Roche</td><td>5526337001</td><td>Zestaw do sekwencjonowania</td></tr><tr><td>GS Junior Titanium EmPCR (Lib-A)</td><td>5996520001Odczynniki</td> do <td></td><td>emulsji PCR</td></tr><tr><td>GS Jr EmPCR Odczynniki do odzyskiwania kulek</td><td>Roche</td><td>5996490001</td><td>Odczynniki do emulsji PCR</td></tr><tr><td>Odczynniki GS Junior EmPCR (Lib-A)</td><td>Odczynniki 5996538001 Roche</td><td></td><td>do emulsji PCR</td></tr><tr><td>GS Jr EmPCR Oil & Zestaw do łamania</td><td>Odczynniki do</td><td>emulsji PCR</td><td></td></tr><tr><td>5996511001 Zestaw do sekwenikowania tytanu GS Jr</td>*<td>Roche</td><td>5996554001</td><td>Zawiera odczynniki do sekwencjonowania, enzymy, i kulki do pakowania</td></tr><tr><td>GS Jr. Zestaw tytanowych płytek pikotytowych Roche</td><td></td><td>5996619001</td><td>Płytka sekwencyjna z powiązanymi odczynnikami i uszczelkami</td></tr><tr><td>Mieszalnik</td><td></td> IKA Turrax <td>3646000</td><td>Specjalny mieszalnik używany z Turrax Probówki</td></tr><tr><td>IKA Turrax Tube (specjalistyczny mieszalnik)</td><td></td><td>20003213</td><td>Specjalistyczne rurki mieszające z wewnętrznym wirnikiem do tworzenia emulsji</td></tr><tr><td>GS Nebulizatory Kit</td><td>Roche</td><td>5160570001</td><td>Frakcjonator wielkości kwasu nukleinowego do stosowania podczas przygotowań bibliotecznych</td></tr><tr><td>GS Junior emPCR Bead Counter</td><td>Roche</td><td>05 996 635 001</td><td>Biblioteczny licznik koralików</td></tr><tr><td>GS Junior Urządzenie do osadzania koralików</td><td>Roche</td><td>05 996 473 001</td><td>Uchwyt na płytkę Pikotitera podczas wirowania</td></tr><tr><td>Przeciwwaga i Adapter do urządzeń do osadzania kulek</td><td>Roche</td><td>05 889 103 001</td><td>Służy do równoważenia urządzenia do osadzania z wirowaniem płytkowym pikotitera</td></tr><tr><td>Oprogramowanie GS Junior</td><td>Roche</td><td>05 996 643 001</td><td>Pakiet oprogramowania do sterowania instrumentem, zbierania i analizowania danych</td></tr><tr><td>GS Junior Sequencer Control v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td> <td>(zawarty w pozycji 05 996 643 001 powyżej)</td></tr> <tr><td>GS Run Processor v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Zawarte w pozycji 05 996 643 001 powyżej)</td></tr><tr><td>GS De Novo Assembler v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td> <td>(Zawarte w pozycji 05 996 643 001 powyżej)</td></tr><tr><td>GS Reference Mapper v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td> <td>(Zawarte w pozycji 05 996 643 001 powyżej)</td></tr><tr><td>GS Amplicon Variant Analyzer v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td> <td>(Zawarte w pozycji 05 996 643 001 powyżej)</td></tr></tbody></table>

połączenie analizy dna w surowej ekstrakcji wirionu z analizą rna z zakażonych liści w celu odkrycia nowych genomów wirusów

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

To podejście metagenomowe służy do identyfikacji wirusów roślinnych z kolistymi genomami DNA i ich transkryptami. Często wirusy DNA roślin, które występują w niskich mianach u swojego gospodarza lub nie mogą być mechanicznie inokulowane intonacji innemu gospodarzowi, są trudne do rozmnażania w celu uzyskania większego miana materiału zakaźnego. Zainfekowane liście są mielone w łagodnym buforze o optymalnym pH i składzie jonowym, zalecanym do oczyszczania większości retrowirusów Para prątkowatych. Mocznik służy do rozbijania ciał inkluzyjnych, które zatrzymują wiriony i rozpuszczania składników komórkowych. Wirowanie różnicowe zapewnia dalszą separację wirionów od zanieczyszczeń roślinnych. Następnie leczenie proteinazą K usuwa kapsydy. Następnie DNA wirusa jest zagęszczane i wykorzystywane do sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Dane NGS są wykorzystywane do łączenia kontigów, które są przesyłane do NCBI-BLASTn w celu zidentyfikowania podzbioru sekwencji wirusów w wygenerowanym zbiorze danych. W równoległym rurociągu RNA jest izolowane z zainfekowanych liści przy użyciu standardowej metody ekstrakcji RNA opartej na kolumnach. Następnie przeprowadza się zubożenie rybosomów w celu wzbogacenia o podzbiór transkryptów mRNA i wirusa. Złożone sekwencje pochodzące z sekwencjonowania RNA (sekwencjonowanie RNA) przesłano do NCBI-BLASTn w celu zidentyfikowania podzbioru sekwencji wirusa w tym zestawie danych. W naszym badaniu zidentyfikowaliśmy dwa powiązane genomy badnawirusa o pełnej długości w dwóch zestawach danych. Metoda ta jest preferowana w stosunku do innego powszechnego podejścia, które polega na ekstrakcji zagregowanej populacji małych sekwencji RNA w celu odtworzenia sekwencji genomowych wirusów roślinnych. Ten ostatni potok metagenomiczny odzyskuje sekwencje związane z wirusem, które są elementami retrotranskrypcji wprowadzonymi do genomu rośliny. Jest to sprzężone z testami biochemicznymi lub molekularnymi w celu dalszego rozpoznania aktywnie zakaźnych czynników. Podejście udokumentowane w tym badaniu pozwala na odzyskanie sekwencji reprezentatywnych dla replikujących się wirusów, które prawdopodobnie wskazują na aktywną infekcję wirusową.

Ta zmodyfikowana metoda oczyszczania wirusów zapewniła wzbogacenie w wirusowe DNA, co było użyteczne do identyfikacji dwóch gatunków wirusów za pomocą NGS i bioinformatyki. Po odwirowaniu homogenatu z prędkością 40,000 x g przez 2,5 h, na dnie probówki pojawił się zielony osad, a wzdłuż jej ścianek biały osad. Zielony osad zawieszono ponownie w jednej probówce do mikrocentryfugi, a biały osad w dwóch probówkach do mikrocentryfugi. Reakcję PCR przeprowadzono z użyciem standardowych diagnostycznych starterów PCR dla CaYMV; produkty wykryto w rozpuszczonym białym osadzie, a nie w zielonym (Rycina 1A). Próbkę surowego preparatu zbadano za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej, w której zaobserwowano cząstki pałeczkowate o długości 124-133 nm (Rycina 1B). Mieści się to w przewidywanej modalnej długości większości badnawirusów. DNA wyekstrahowano z białego i zielonego osadu, a następnie zawieszono osobno. Na Rycynie 1C naniesiono 5 µL DNA wyekstrahowanego z próbek zielonego i białego osadu (1,6 µg DNA dla frakcji zielonej i 3,1 µg DNA dla frakcji białej) na żel agarozowy 0,8% do elektroforezy i przeanalizowano DNA po barwieniu bromkiem etydyny. Frakcja zielona zawierała DNA o niskiej masie cząsteczkowej, natomiast frakcja biała wytworzyła dwa prążki DNA o wyższej masie cząsteczkowej, a także DNA o niższej masie cząsteczkowej (Rycina 1C). Żel przedstawiony na Rycynie 1C był prowadzony przez 40 min przy 100 V, a rozmazanie w ścieżce 3 sugeruje, że napięcie żelu powinno zostać obniżone w celu uzyskania wyraźniejszych prążków. Dane te sugerują, że biały osad był wzbogacony w wiriony. Stężenie DNA (0,6 µg/mL) wyekstrahowanego z białej próbki było niskie, ale wystarczające dla NGS, który do przeprowadzenia wymaga minimum 10 ng DNA. Pofragmentowane DNA wykorzystano do przygotowania biblioteki do NGS.
Równolegle, z zakażonych roślin kanny (Rysunek 1D) wyekstrahowano RNA do wysokoprzepustowego sekwencjonowania RNA-seq. Przeprowadzono standardowy proces przygotowania bibliotek, NGS, tworzenia kontigów oraz identyfikacji sekwencji genomu wirusa (Rysunek 1E). Porównano wyniki uzyskane przy zastosowaniu DNA oraz RNA jako materiałów wyjściowych.
Za pomocą NGS uzyskano 188 626 surowych odczytów DNA z DNA wyizolowanego z surowego preparatu wirusa. Odczyty zmontowano w 13 269 kontigów, a następnie wykorzystano BLASTn do przeszukania zbioru sekwencji nukleotydowych NCBI (przy ograniczaniu organizmów do Viridplantae TaxID: 33090 oraz Virus TaxID: 10239) (Ryc. 1E). Wyniki NCBI-BLASTn wykazały, że 93% kontigów zmontowanych de novo stanowiły sekwencje komórkowe, 22% było nieznanych, a 0,3% stanowiły kontigi wirusowe (Ryc. 2A). Większość kontigów sklasyfikowanych jako sekwencje komórkowe zidentyfikowano jako DNA mitochondrialne lub chloroplastowe. W zbiorze kontigów wirusowych 32% było spokrewnionych z przedstawicielami Caulimoviridae (które nie były sekwencjami Badnavirus), a 58% z nich było spokrewnionych z Badnavirus. Spośród kontigów wirusowych 29% wykazało wysoką相似ność (e &lt; 1 x 10-30) z genem ORF3 izolatu V17 CaYMV (EF189148.1), pełnym genomem izolatu Batavia D Sugarcane bacilliform virus (FJ439817.1) oraz pełnym genomem Banana streak CA virus (KJ013511). W tej populacji znajdowały się długie kontigi przypominające dwa pełne genomy.
Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie RNA-seq pozwoliło uzyskać 153 488 oczyszczonych odczytów sekwencji o średniej długości &lt; 500 bp. Montaż kontigów zredukował tę liczbę do 8 243 kontigów. Zostały one poddane analizie w NCBI-BLASTn (przy zastosowaniu Viridplantae TaxID: 33090 oraz Virus TaxID: 10239 jako organizmów ograniczających), a wyniki wykazały, że 76% kontigów należało do kategorii sekwencji komórkowych roślin, 23% pozostało nieznanych, a 0,1% zaklasyfikowano jako kontigi wirusowe (Rysunek 2B). Szczegółowa analiza populacji 0,1% kontigów wirusowych wykazała, że 68% z nich przypisano do Caulimoviridae (Rysunek 2B). Trzy duże kontigi w tej populacji wykazano wysoką podobieństwo (e &lt; 1 X 10-30) do genu ORF3 izolatu V17 CaYMV (EF189148.1), pełnego genomu izolatu Batavia D Sugarcane bacilliform virus (FJ439817.1) oraz pełnego genomu Banana streak CA virus (KJ013511). Po analizie trzech kontigów ręcznie połączyliśmy dwa z nich, aby uzyskać pełny genom wirusa.
Porównaliśmy kontigi długości genomu wirusa uzyskane z sekwencjonowania DNA i RNA jako wzajemne rusztowanie, aby potwierdzić obecność dwóch pełnych genomów wirusowych. Jeden pełny genom wirusa o długości 6 966 bp został roboczo nazwany Canna yellow mottle associated virus 1 (CaYMAV-1) (Rycina 3A). Drugi genom miał długość 7 385 bp i był wariantem CaYMV infekującym Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01) (Rycina 3A).
Na koniec zastosowano startery PCR, zaprojektowane w celu sklonowania fragmentu o długości ~1 000 bp każdego z wirusów, aby różnicowo wykryć oba genomy w populacji 227 roślin kanny reprezentujących dziewięć odmian handlowych. W wielu przypadkach poszczególne rośliny były zainfekowane oboma wirusami. Przedstawiamy przykład detekcji RT-PCR CaYMAV-1 i CaYMV-Ap01 w 12 roślinach. Trzy z nich były dodatnie tylko w kierunku CaYMV-Ap01, a dziewięć było dodatnich w kierunku obu wirusów (Rycina 3B).
<img alt="Schemat elektroforezy żelowej; schemat oczyszczania DNA; przygotowywanie biblioteki; sekwencjonowanie wirusowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przygotowanie kwasów nukleinowych wirusa i schemat NGS. (A) Elektroforeza żelowa na agarozie (1,0%) fragmentów PCR genomów CaYMV o długości 565 bp. Dwa produkty PCR wykryto w próbkach przygotowanych z białego osadu (ścieżki 1, 2), ale nie w próbce z zielonego osadu (ścieżka 3). Kontrola pozytywna (+) przedstawia produkt PCR amplifikowany z DNA zainfekowanej rośliny, wyizolowany metodą zautomatyzowaną z wykorzystaniem standardowych paramagnetycznych cząsteczek celulozy. Ścieżka L zawiera drabinę DNA służącą jako standard do pomiaru wielkości liniowych pręg DNA w ścieżkach z próbkami. (B) Przykład cząsteczki wirusa obserwowanej za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego w białym osadzie odzyskanym poprzez wstępne frakcjonowanie zainfekowanych liści kanny. (C) Elektroforeza żelowa na agarozie (0,8%) DNA odzyskanego z zielonego (ścieżka 1) i białego (ścieżka 2) osadu, które dały wynik pozytywny w teście PCR w panelu A. Czerwone i żółte kropki obok ścieżki 2 identyfikują dwie pręgi DNA o wysokiej masie cząsteczkowej występujące w frakcji białej. (D) Elektroforeza żelowa na agarozie (1%) całkowitego RNA odzyskanego za pomocą kolumnowego oczyszczania RNA. Ścieżka L zawiera drabinę DNA służącą jako standard do pomiaru wielkości liniowych pręg w ścieżkach z próbkami. Ścieżki 1-6 zawierają RNA wyizolowane z zainfekowanych liści kanny, które zostały połączone w jedną próbkę do usuwania rybosomalnego RNA (ribo-depletion) i RNA-seq. (E) Schematyczny przebieg izolacji kwasów nukleinowych, przygotowania biblioteki, sekwencjonowania, składania kontigów i odkrywania genomu wirusa. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza składu wirusów za pomocą diagramów kołowych; rozkład taksonomiczny; podzielony na kategorie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Wykresy Krona wizualizujące kategorie taksonomiczne kontigów. (A) Wykres po lewej stronie przedstawia obfitość i rozkład taksonomiczny kontigów zmontowanych z surowego preparatu wirusowego. Wykres po prawej stronie przedstawia proporcje kontigów wirusowych powiązanych z rodziną Caulimoviridae, rodzajem Badnavirus oraz trzema blisko spokrewnionymi gatunkami. (B) Panel po lewej stronie pokazuje obfitość kontigów pochodzących z RNA-seq w zależności od ich rozkładu taksonomicznego. Po prawej stronie znajduje się wykres przedstawiający obfitość kontigów w populacji kontigów wirusowych powiązanych z rodziną Caulimoviridae, rodzajem Badnavirus oraz trzema blisko spokrewnionymi gatunkami. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces edycji genów; schematy genomów CaYMaV; wyniki elektroforezy; analiza DNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Charakterystyka genomów CaYMAV-1 i CaYMV-Ap01. (A) Schematyczne przedstawienie Canna yellow mottle associate virus 1 (CaYMAV) oraz wirusa podobnego do Canna yellow mottle virus wyizolowanego z Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01). Pozycje nukleotydowe 1-10 zidentyfikowano jako początek genomu, który zawiera miejsce antykodonu tRNAmet typowe dla większości genomów badnavirusów. Pozycje stop i start dla translacji otwartych ramek odczytu (ORF) 1 i 2 są sąsiadujące. Białka te pełnią nieznane funkcje. ORF3 to poliproteina zawierająca domeny palca cynkowego (ZnF), proteazy (Pro), odwrotnej transkryptazy (RT) oraz RNazy H. Sekwencja sygnału poli(A) 3' jest zachowana w obu genomach wirusowych. (B) Analizę RT-PCR przeprowadzono z wykorzystaniem RNA wyizolowanego z liści zainfekowanych wirusem oraz starterów wykrywających CaYMAV i CaYMV-Ap01. W tej samej populacji 12 roślin, trzy były zainfekowane wyłącznie CaYMV-Ap01, natomiast pozostałe były zainfekowane zarówno CaYMAV, jak i CaYMV-Ap01. (+) oznacza kontrolę pozytywną, a (-) kontrolę negatywną. Rycina została powielona/zmodyfikowana z pracy Wijayasekara et al.24 za zgodą autorów. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj prezentujemy nowe podejście do identyfikacji wirusów roślinnych za pomocą dwuniciowych genomów DNA. Stosujemy standardowe metody ekstrakcji DNA i RNA z zakażonych liści oraz przeprowadzamy sekwencjonowanie nowej generacji. Narzędzia bioinformatyczne łączą sekwencje w kontigi, identyfikują kontigi reprezentujące genomy wirusów i przypisują genomy do grup taksonomicznych.

Połączenie analizy DNA w surowej ekstrakcji wirionu z analizą RNA z zakażonych liści w celu odkrycia nowych genomów wirusów

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu wirusologii środowiskowej, takie jak powstawanie nowych chorób. Główną zaletą tej metody jest oczyszczanie wariantów z komponentów komórkowych i wykorzystanie tych wariantów do ekstrakcji DNA w celu sekwencjonowania. Po raz pierwszy wpadłem na ten pomysł, gdy odkryliśmy, że rośliny w naszych szklarniach są zainfekowane jednym lub więcej nieznanych Badnaviruses. Osoby początkujące w tej metodzie mogą napotkać trudności z trzech powodów. Po pierwsze, homogenizacja jest krytycznym krokiem zapewniającym wysoką jakość uzyskanego materiału. Po drugie, wirowanie różnicowe może prowadzić do powstania wielu osadów i konieczna jest umiejętność ich identyfikacji oraz oddzielenia. Po trzecie, wyniki z analizatora bio-analyzer mogą być trudne do interpretacji.Podczas wszystkich etapów tej procedury należy nosić fartuch laboratoryjny i rękawiczki. Należy rozpocząć od odcięcia 80 do 100 gramów liści z chorych roślin, które wcześniej zamrożono w temperaturze -20 °C. Następnie liście należy zmielić w blenderze Waringa, używając 200 mililitrów buforu do mielenia oraz 0,5% siarczynu sodu. Homogenat należy przenieść do zlewki o pojemności jednego litra.Nadal używając odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej, dodać 18 g mocznika oraz 25 ml 10% niejonowego detergentu do homogenatu i przykryć zlewkę folią. Mieszać za pomocą mieszadła magnetycznego przez noc. Następnego dnia przenieść homogenat do butelek do wirówek o pojemności 250 ml i wirować w wirówce z kątem stałym z przyspieszeniem 4000 ×g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Zebrać nadsącz i przefiltrować przez cztery warstwy gazy. Zmierzyć objętość odzyskanego ciekłego homogenatu, a następnie rozdzielić go do polipropylenowych probówek do wirówek o pojemności 38,5 ml. Wirować homogenat z przyspieszeniem 40 000 ×g w temperaturze 4 °C przez 2,5 godziny. Po zakończeniu wirowania sprawdzić obecność zielonego osadu na dnie probówki oraz białego osadu wzdłuż ścianki probówki. Odlać nadsącz, zachowując oba osady, i umieścić próbki w lodzie.Oddzielenie białego osadu od zielonego jest jednym z najtrudniejszych etapów procedury. Wymaga ono cierpliwości i wprawy.Pracując w dygestorium, należy użyć gumowej szpatułki (tzw. policemana), aby oddzielić pellety. Zebrać i przenieść pellety do różnych butelek wirnikowych. Butelki wirnikowe zawierające białe pellety umieścić na lodzie. Do każdej butelki dodać 1 mL wody i wymieszać poprzez pipetowanie. Przez okres od jednej do dwóch godzin, co pięć minut, pipetować mieszaninę, aby ponownie zawiesić pellet. Po ponownym zawieszeniu białych pelletów, zawiesiny przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.Następnego dnia zawiesinę należy odwirować przy 6000 ×g w temperaturze 4°C przez 10 minut, aby usunąć pozostałe zanieczyszczenia. Skoncentrowane zawiesiny przenieść do nowych probówek i wirować przy 136 000 ×g w temperaturze 4°C przez dwie godziny w celu osadzenia wirionów. Usunąć nadsącz i ponownie zawiesić osad w 1 mL buforu.Procedurę należy rozpocząć od rozbicia wirionów. Do zawiesin osadu należy dodać 40 µL roztworu proteinazy K o stężeniu 2 µg/µL i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Do każdej próbki należy dodać objętość fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego równą objętości próbki, a następnie wstrząsać ręcznie przez 20 sekund.Wiruj w temperaturze pokojowej przy 16 000 ×g przez pięć minut. Usuń górną fazę wodną i przenieś ją do nowej probówki. Powtórz tę ekstrakcję dwa lub więcej razy.Skoncentruj DNA za pomocą wytrącania etanolem. Użyj 0,3 M octanu sodu o pH 5,2 oraz 2,5 objętości 95% etanolu. Przechowuj próbki w temperaturze -20 °C przez 30 do 60 minut. Następnie wiruj z prędkością 13 000 ×g przez 10 do 20 minut, aby wytrącić DNA w formie osadu.Pracując przy stole laboratoryjnym, resuspenduj osad DNA w 1 mL 0,1 mM buforu TE. Przefiltruj zawiesinę przez komercyjną kolumnę do filtracji żelowej za pomocą wirowania. Przeanalizuj próbki za pomocą elektroforezy w 1% żelu agarozowym z barwieniem bromkiem etydyny, aby sprawdzić przygotowane preparaty i ocenić jakość DNA zgodnie z opisem w tekście.Podczas badania za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej w białym osadzie uzyskanym poprzez wstępne frakcjonowanie zainfekowanych liści kanny stwierdzono obecność cząsteczek wirusa. Elektroforeza żelu agarozowego DNA odzyskanego z osadów zielonego i białego pozwoliła zidentyfikować dwa pasma DNA o wysokiej masie cząsteczkowej w frakcji białej, wskazane czerwonym i żółtym punktem.Integralność RNA wyizolowanego z zainfekowanych liści została również zweryfikowana za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Ten wykres przedstawia liczność i rozkład taksonomiczny kontigów zmontowanych z surowego preparatu wirusa. Z kolei ten wykres obrazuje proporcje kontigów wirusowych powiązanych z rodziną Caulimoviridae, rodzajem Badnavirus oraz kontigów powiązanych z trzema blisko spokrewnionymi gatunkami.Dwa poniższe wykresy przedstawiają liczebność kontigów pochodzących z sekwencjonowania RNA w zależności od ich rozkładu taksonomicznego. Wykres po prawej stronie obrazuje liczebność kontigów w obrębie populacji kontigów wirusowych powiązanych z rodziną Caulimoviridae, rodzajem Badnavirus oraz trzema blisko spokrewnionymi gatunkami. Porównanie kontigów o długości genomu wirusa, uzyskanych poprzez sekwencjonowanie DNA i RNA jako wzajemne rusztowanie (scaffold), potwierdza obecność dwóch pełnowymiarowych genomów wirusowych.Wreszcie, analiza RT-PCR z wykorzystaniem RNA wyizolowanego z liści zainfekowanych wirusem wykazała obecność obu genomów wirusowych.Po opanowaniu techniki procedura ta może zająć dwa dni, natomiast osobie początkującej może zająć trzy dni. Podczas pierwszego wykonywania tej procedury ważne jest prowadzenie zapisów objętości homogenatu w każdej z nadfaz, aby na koniec procedury móc porównać końcową wydajność DNA z początkową ilością materiału wyjściowego.Po opracowaniu metoda ta otworzyła przed badaczami w dziedzinie wirusologii roślin drogę do identyfikacji nowych wirusów DNA w środowisku. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadaćH dobrą wiedzę na temat tego, jak homogenizować materiał roślinny, zagęszczać warianty i uzyskiwać wysoką wydajność DNA, które można wykorzystać do sekwencjonowania następnej generacji. Pamiętaj, że praca z mocznikiem oraz fenolo-chloroformem jest niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas pracy z tymi odczynnikami należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak gogle, rękawice, fartuch laboratoryjny i maseczkę. W celu bezpiecznego przeprowadzania ultrawirowania ważne jest prawidłowe zbalansowanie probówek; należy je zważyć i umieścić naprzeciw siebie w uchwycie, a różnica w ich wadze nie powinna przekraczać 0,01 g.

combining-analysis-dna-crude-virion-extraction-with-analysis-rna-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Łączenie analizy DNA w surowej ekstrakcji wirionów z analizą RNA z zakażonych liści w celu odkrycia nowych genomów wirusów

Protokół infekcji komórek HeLa wirusem Vaccinia oraz analizy ekspresji genów gospodarza i wirusa. Część 1 z 3.

Infekcja wirusem vaccinia oraz analiza czasowa ekspresji genów wirusa: Część 1

Protokół infekcji komórek HeLa wirusem Vaccinia oraz analizy ekspresji genów gospodarza i wirusa. Część 2 z 3.

Infekcja wirusem vaccinia i analiza czasowa ekspresji genów wirusa: część 2

Protokół infekcji komórek HeLa wirusem Vaccinia oraz analizy ekspresji genów gospodarza i wirusa. Część 3 opisuje proces znakowania fluorescencyjnego namnożonego RNA z próbek gospodarza i wirusa poprzez sprzęganie barwników za pomocą grup aminoallilowych. Część 3 z 3.

Infekcja wirusem vaccinia i analiza czasowa ekspresji genów wirusowych: Część 3

Opisujemy proces izolacji wysokiej czystości DNA nukleokapsydu herpeswirusa z zainfekowanych komórek. Końcowe DNA odzyskane z roztworu charakteryzuje się wysokim stężeniem i czystością, co czyni je idealnym do sekwencjonowania wysokoprzepustowego, reakcji PCR o wysokiej wierności oraz transfekcji w celu otrzymania nowych rekombinantów wirusowych.

Przygotowanie viralnego DNA z nukleokapsydów

Opisano prosty, wydajny i niezawodny sposób synchronizacji dostarczania wielu komponentów wirusowych do komórek roślinnych za pomocą przejściowej ekspresji pośredniczonej przez Agrobacterium. Podejście to umożliwia badanie replikacji i enkapsydacji, a następnie ponowne składanie komponentów niewirusowych in vitro w pozbawione genomu optyczne „duchy” wirusowe (viral ghosts), odpowiednie do zastosowań biomedycznych.

Prosta i niezawodna metoda in vivo oraz in vitro do badania składania wirusów

Genomika pojedynczych wirusów (SVG) to metoda izolacji i amplifikacji genomów pojedynczych wirionów. Zawiesiny wirusowe mieszaniny różnych szczepów są sortowane za pomocą cytometrii przepływowej na preparat mikroskopowy z osobnymi studzienkami zawierającymi agarozę, co pozwala na przechwycenie wirionu i ograniczenie fragmentacji genomu podczas dalszej obróbki. Amplifikacja całego genomu jest przeprowadzana za pomocą wielokrotnej amplifikacji z wypieraniem (MDA), w wyniku czego otrzymuje się...

Izolacja i analiza genomu pojedynczych wirionów z wykorzystaniem metody „Single Virus Genomics”

Tutaj przedstawiono protokół tworzenia zakaźnego bakteryjnego sztucznego chromosomu zawierającego pełnowymiarowe cDNA pozytywnej nici genomowego RNA wirusa japońskiego zapalenia mózgu. Protokół ten może być wykorzystany do skonstruowania funkcjonalnego cDNA innych wirusów o dodatniej nici RNA, co czyni go potężnym narzędziem genomicznym do badania biologii wirusów.

Sztuczne chromosomy bakteryjne: funkcjonalne narzędzie genomiczne do badania wirusów o dodatniej nici RNA

Oferujemy nowatorską strategię izolowania przedziałów replikacyjnych wirusa (RC) od komórek ludzkich zakażonych adenowirusem (Ad). Podejście to reprezentuje system bezkomórkowy, który może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów molekularnych regulujących replikację i ekspresję genomu wirusa, a także regulację interakcji wirus-gospodarz ustalonych w RC.

Izolacja frakcji subjądrowych wzbogaconych w przedziały replikacji wirusa z normalnych komórek ludzkich zakażonych adenowirusem

Celem tego protokołu jest specyficzne oznaczanie i selektywne izolowanie wirusowego DNA z zakażonych komórek w celu scharakteryzowania białek związanych z genomem wirusa.

Oczyszczanie DNA wirusa w celu identyfikacji powiązanych białek wirusowych i komórkowych

Tutaj prezentujemy podejście do głębokiego sekwencjonowania, które zapewnia bezstronne określenie powstających 3'-końców, jak również profili mutacyjnych jednoniciowych cząsteczek DNA. Głównym zastosowaniem jest charakterystyka powstających retrowirusowych komplementarnych DNA (cDNA), produktów pośrednich powstających w procesie retrowirusowej odwrotnej transkrypcji.

Oznaczanie 3'-końców i sekwencji powstających jednoniciowych cząsteczek wirusowego DNA podczas odwrotnej transkrypcji HIV-1 w zakażonych komórkach

Ten protokół opisuje, jak ustalić infekcję wirusową in vivo u Drosophila melanogaster przy użyciu metody nanoiniekcji i podstawowych technik analizy interakcji wirus-gospodarz.

Ustalenie infekcji wirusowej i analiza interakcji gospodarz-wirus u Drosophila melanogaster

Odkryj metodę izolacji i sekwencjonowania wirusów roślinnych z zakażonych liści przy użyciu ekstrakcji DNA i RNA. Technika ta umożliwia identyfikację nowych genomów wirusów z rodziny Caulimoviridae.

Połączenie analizy DNA w surowej ekstrakcji wirionu z analizą RNA z zakażonych liści w celu odkrycia nowych genomów wirusów

Przeglądaj więcej filmów