Połączenie analizy DNA w surowej ekstrakcji wirionu z analizą RNA z zakażonych liści w celu odkrycia nowych genomów wirusów

Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu wirusologii środowiskowej, takie jak powstawanie nowych chorób. Główną zaletą tej metody jest oczyszczanie wariantów z komponentów komórkowych i wykorzystanie tych wariantów do ekstrakcji DNA w celu sekwencjonowania. Po raz pierwszy wpadłem na ten pomysł, gdy odkryliśmy, że rośliny w naszych szklarniach są zainfekowane jednym lub więcej nieznanych Badnaviruses. Osoby początkujące w tej metodzie mogą napotkać trudności z trzech powodów. Po pierwsze, homogenizacja jest krytycznym krokiem zapewniającym wysoką jakość uzyskanego materiału. Po drugie, wirowanie różnicowe może prowadzić do powstania wielu osadów i konieczna jest umiejętność ich identyfikacji oraz oddzielenia. Po trzecie, wyniki z analizatora bio-analyzer mogą być trudne do interpretacji.

Podczas wszystkich etapów tej procedury należy nosić fartuch laboratoryjny i rękawiczki. Należy rozpocząć od odcięcia 80 do 100 gramów liści z chorych roślin, które wcześniej zamrożono w temperaturze -20 °C. Następnie liście należy zmielić w blenderze Waringa, używając 200 mililitrów buforu do mielenia oraz 0,5% siarczynu sodu. Homogenat należy przenieść do zlewki o pojemności jednego litra.

Nadal używając odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej, dodać 18 g mocznika oraz 25 ml 10% niejonowego detergentu do homogenatu i przykryć zlewkę folią. Mieszać za pomocą mieszadła magnetycznego przez noc. Następnego dnia przenieść homogenat do butelek do wirówek o pojemności 250 ml i wirować w wirówce z kątem stałym z przyspieszeniem 4000 ×g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Zebrać nadsącz i przefiltrować przez cztery warstwy gazy. Zmierzyć objętość odzyskanego ciekłego homogenatu, a następnie rozdzielić go do polipropylenowych probówek do wirówek o pojemności 38,5 ml. Wirować homogenat z przyspieszeniem 40 000 ×g w temperaturze 4 °C przez 2,5 godziny. Po zakończeniu wirowania sprawdzić obecność zielonego osadu na dnie probówki oraz białego osadu wzdłuż ścianki probówki. Odlać nadsącz, zachowując oba osady, i umieścić próbki w lodzie.

Oddzielenie białego osadu od zielonego jest jednym z najtrudniejszych etapów procedury. Wymaga ono cierpliwości i wprawy.

Pracując w dygestorium, należy użyć gumowej szpatułki (tzw. policemana), aby oddzielić pellety. Zebrać i przenieść pellety do różnych butelek wirnikowych. Butelki wirnikowe zawierające białe pellety umieścić na lodzie. Do każdej butelki dodać 1 mL wody i wymieszać poprzez pipetowanie. Przez okres od jednej do dwóch godzin, co pięć minut, pipetować mieszaninę, aby ponownie zawiesić pellet. Po ponownym zawieszeniu białych pelletów, zawiesiny przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.

Następnego dnia zawiesinę należy odwirować przy 6000 ×g w temperaturze 4°C przez 10 minut, aby usunąć pozostałe zanieczyszczenia. Skoncentrowane zawiesiny przenieść do nowych probówek i wirować przy 136 000 ×g w temperaturze 4°C przez dwie godziny w celu osadzenia wirionów. Usunąć nadsącz i ponownie zawiesić osad w 1 mL buforu.

Procedurę należy rozpocząć od rozbicia wirionów. Do zawiesin osadu należy dodać 40 µL roztworu proteinazy K o stężeniu 2 µg/µL i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Do każdej próbki należy dodać objętość fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego równą objętości próbki, a następnie wstrząsać ręcznie przez 20 sekund.

Wiruj w temperaturze pokojowej przy 16 000 ×g przez pięć minut. Usuń górną fazę wodną i przenieś ją do nowej probówki. Powtórz tę ekstrakcję dwa lub więcej razy.

Skoncentruj DNA za pomocą wytrącania etanolem. Użyj 0,3 M octanu sodu o pH 5,2 oraz 2,5 objętości 95% etanolu. Przechowuj próbki w temperaturze -20 °C przez 30 do 60 minut. Następnie wiruj z prędkością 13 000 ×g przez 10 do 20 minut, aby wytrącić DNA w formie osadu.

Pracując przy stole laboratoryjnym, resuspenduj osad DNA w 1 mL 0,1 mM buforu TE. Przefiltruj zawiesinę przez komercyjną kolumnę do filtracji żelowej za pomocą wirowania. Przeanalizuj próbki za pomocą elektroforezy w 1% żelu agarozowym z barwieniem bromkiem etydyny, aby sprawdzić przygotowane preparaty i ocenić jakość DNA zgodnie z opisem w tekście.

Podczas badania za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej w białym osadzie uzyskanym poprzez wstępne frakcjonowanie zainfekowanych liści kanny stwierdzono obecność cząsteczek wirusa. Elektroforeza żelu agarozowego DNA odzyskanego z osadów zielonego i białego pozwoliła zidentyfikować dwa pasma DNA o wysokiej masie cząsteczkowej w frakcji białej, wskazane czerwonym i żółtym punktem.

Integralność RNA wyizolowanego z zainfekowanych liści została również zweryfikowana za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Ten wykres przedstawia liczność i rozkład taksonomiczny kontigów zmontowanych z surowego preparatu wirusa. Z kolei ten wykres obrazuje proporcje kontigów wirusowych powiązanych z rodziną Caulimoviridae, rodzajem Badnavirus oraz kontigów powiązanych z trzema blisko spokrewnionymi gatunkami.

Dwa poniższe wykresy przedstawiają liczebność kontigów pochodzących z sekwencjonowania RNA w zależności od ich rozkładu taksonomicznego. Wykres po prawej stronie obrazuje liczebność kontigów w obrębie populacji kontigów wirusowych powiązanych z rodziną Caulimoviridae, rodzajem Badnavirus oraz trzema blisko spokrewnionymi gatunkami. Porównanie kontigów o długości genomu wirusa, uzyskanych poprzez sekwencjonowanie DNA i RNA jako wzajemne rusztowanie (scaffold), potwierdza obecność dwóch pełnowymiarowych genomów wirusowych.

Wreszcie, analiza RT-PCR z wykorzystaniem RNA wyizolowanego z liści zainfekowanych wirusem wykazała obecność obu genomów wirusowych.

Po opanowaniu techniki procedura ta może zająć dwa dni, natomiast osobie początkującej może zająć trzy dni. Podczas pierwszego wykonywania tej procedury ważne jest prowadzenie zapisów objętości homogenatu w każdej z nadfaz, aby na koniec procedury móc porównać końcową wydajność DNA z początkową ilością materiału wyjściowego.

Po opracowaniu metoda ta otworzyła przed badaczami w dziedzinie wirusologii roślin drogę do identyfikacji nowych wirusów DNA w środowisku. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadaćH dobrą wiedzę na temat tego, jak homogenizować materiał roślinny, zagęszczać warianty i uzyskiwać wysoką wydajność DNA, które można wykorzystać do sekwencjonowania następnej generacji. Pamiętaj, że praca z mocznikiem oraz fenolo-chloroformem jest niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas pracy z tymi odczynnikami należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak gogle, rękawice, fartuch laboratoryjny i maseczkę. W celu bezpiecznego przeprowadzania ultrawirowania ważne jest prawidłowe zbalansowanie probówek; należy je zważyć i umieścić naprzeciw siebie w uchwycie, a różnica w ich wadze nie powinna przekraczać 0,01 g.