Name: Inwazyjna metoda aktywacji zakrętu zębatego myszy poprzez stymulację o wysokiej częstotliwości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Poznaj inwazyjną metodę aktywacji zakrętu zębatego myszy poprzez stymulację o wysokiej częstotliwości. Technika ta umożliwia badanie neurogenezy i aktywności neuronalnej w hipokampie z wykorzystaniem barwienia immunofluorescencyjnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin Granty 31522029, 31770929 i 31371149 (dla Haitao Wu), Program 973 (2014CB542203) z Państwowego Programu Kluczowego Rozwoju Badań Podstawowych Chin (dla Haitao Wu) oraz Grant Z161100000216154 od Miejskiej Komisji Nauki i Technologii w Pekinie (dla Haitao Wu). Autorzy dziękują wszystkim członkom laboratorium Haitao Wu za zachętę i dyskusje. Autorzy są niezmiernie wdzięczni Zhenwei Liu za jego pomoc w debugowaniu aparatury.

Procedury eksperymentalne na zwierzętach były zgodne z wytycznymi instytucjonalnymi Instytutu Podstawowych Nauk Medycznych w Pekinie (Pekin, Chiny) oraz przepisami chińskiego rządu dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Myszy (dorosły samiec, 26 ~ 30 g) były trzymane w stałej temperaturze 23 °C, z wodą i jedzeniem ad libitum, w 12-godzinnym cyklu światła/12-godzinnym cyklu ciemności (światła włączone o 7:00 rano). Wszystkie procedury eksperymentalne przeprowadzono podczas cyklu świetlnego.
1. Przygotowanie chirurgiczne
UWAGA: Niestandardowa elektroda została wykonana metodą zmodyfikowaną z raportu Halperna23.
<ol>
	<li>Użyj 2 mikrodrutów miedzianych (o średnicy zewnętrznej 200 μm) jako równoległej elektrody bipolarnej. Owiń elektrody wokół siebie, tworząc cylindryczne elektrody do stymulacji. 
	UWAGA: W tym przypadku długość elektrody w PP lub DG była zróżnicowana w zależności od głębokości anatomicznej jądra.</li>
	<li>Wysterylizuj elektrody za pomocą szafki do dezynfekcji tlenkiem etylenu. Przenoś i przechowuj domowe 2-kanałowe elektrody mikrodrutowe bez żadnych zanieczyszczeń. Elektrody powinny być ściśle wysterylizowane przed jakąkolwiek implantacją chirurgiczną.</li>
	<li>Autoklaw narzędzi chirurgicznych.</li>
	<li>Przed zabiegiem należy wstrzyknąć myszu pentobarbital (20 - 50 mg/kg) dootrzewnowo, aby uzyskać chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia.</li>
	<li>Wstrzyknij myszy sterylną zawiesinę prokainy penicyliny G (75 000 j.m.) i środek przeciwbólowy (karprofen, 0,05 - 1 mg/kg, SC), aby zmniejszyć ryzyko infekcji i bólu, odpowiednio24.</li>
	<li>Po znieczuleniu zwierzęcym nałóż smar do oczu na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu oczu. Upewnij się, że indukcja sedacji i głębokość znieczulenia są spowodowane odruchami zwierzęcia w odpowiedzi na szczypanie palca u nogi i kontynuuj operację tylko wtedy, gdy nie wystąpi żadna reakcja. 
	UWAGA: Maść weterynaryjna to kolejna opcja zapobiegania suchości oczu.</li>
	<li>Ogol większość futra na czubku głowy myszy za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia włosów lub żyletki, wysterylizuj ogolony obszar trzema naprzemiennymi peelingami z 70% roztworem alkoholu i betadyny i kontynuuj operację po wyschnięciu betadyny na skórze.</li>
</ol>
2. Chirurgia stymulacji wysokiej częstotliwości25,26
UWAGA: Na tym etapie, elektroda jest jednostronnie wszczepiana do grzbietowego obszaru DG lub przyśrodkowego PP, części hipokampa odgrywającej kluczową rolę w epizodycznym uczeniu się i pamięci.
<ol>
	<li>Umieść znieczuloną mysz na ramce stereotaktycznej. Aby utrzymać głowę myszy w bezruchu, odpowiednio wyrównaj nauszniki i szybko je zainstaluj. Delikatnie dokręć nauszniki tak, aby podtrzymywały wyśrodkowaną głowę i lekko zabezpieczyły mysz.</li>
	<li>Użyj podkładki termostatycznej, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37 ± 0,5 °C.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby chwycić skórę przed uszami myszy i przeciąć ją wysterylizowanymi nożyczkami, aby usunąć około 1cm2 obszaru skóry na czubku czaszki myszy. 
	UWAGA: Wzdłuż krawędzi przeciętej skóry można zaobserwować niewielkie krwawienie.</li>
	<li>Usuń mięsień i inne przyczepy leżące nad czaszką za pomocą bawełnianego wacika, aby odsłonić powierzchnię czaszki. Użyj bawełnianego wacika i dłuta preparacyjnego, aby całkowicie oczyścić całą okostną, ścięgna i tkankę łączną z powierzchni czaszki, aby zidentyfikować linie szwów strzałkowych i lambda.</li>
	<li>Zidentyfikuj punkt bregma i lambda. Przecięcie szwu koronalnego i szwu strzałkowego w górnej środkowej części kalwarii to miejsce, w którym znajduje się bregma. Przecięcie szwu lambdoidalnego przez szew strzałkowy to miejsce, w którym widoczna jest lambda. Użyj bregmy jako oryginalnego punktu, aby ustawić pozycję drugiego jądra.</li>
	<li>Po zidentyfikowaniu pozycji bregmy i lambdy na czaszce, wyreguluj te dwa punkty na poziomie poziomym. Upewnij się, że wysokość tych dwóch punktów jest prawie taka sama w kierunku grzbietowo-brzusznym (wszelkie błędy powinny wynosić < 0,05 mm). Upewnij się również, że czaszka jest wypoziomowana w kierunku przyśrodkowo-bocznym w ten sam sposób26.</li>
	<li>W przypadku operacji jednostronnej zamontuj domową 2-kanałową miedzianą elektrodę mikrodrutową w obrotowym uchwycie elektrody na stereotaktycznej ramie operacyjnej.</li>
	<li>Najpierw umieść elektrodę pionowo nad punktem bregma i ustaw ją jako oryginalne miejsce. Użyj stereotaktycznej ramy operacyjnej z wyświetlaczem cyfrowym, aby wskazać pozycję przednio-tylną (AP), przyśrodkowo-boczną (ML) i grzbietowo-brzuszną (DV). 
	UWAGA: Aby zapobiec wygięciu elektrody, nie dotykaj końcówki elektrody czaszki podczas operacji.</li>
	<li>Delikatnie przesuń elektrodę do właściwej pozycji (Rysunek 1A, AP-2.1/ML ± 1.0 dla DG i AP-3.8/ML ± 3.0 dla PP), odpowiednio)27 nad czaszką bez dotykania. Po zidentyfikowaniu żądanego miejsca wprowadzenia elektrody, użyj grzbietowo-brzusznej regulacji stereotaktycznej, aby podnieść uchwyt elektrod i zaznacz pozycję czarnym markerem. 
	UWAGA: Dokładna lokalizacja w odniesieniu do współrzędnych stereotaktycznych może się różnić w zależności od wysiłku, wagi i płci myszy. Dorosłe myszy tej samej płci powinny być używane, aby zminimalizować wszelkie różnice w lokalizacji. Jeśli to możliwe, należy wykorzystać przedoperacyjne skany anatomiczne w celu zidentyfikowania lokalizacji na podstawie indywidualnego obiektu27.</li>
	<li>Użyj ręcznej wiertarki wspomaganej mikromanipulatorem (rozmiar zadziorów = 0,5 mm), aby precyzyjnie wykonać otwory na zadziory w zaznaczonym miejscu. Przed wierceniem wysterylizuj końcówkę zadziorów 70% etanolem. Przesuń mini wiertło w górę przez czaszkę wzdłuż osi Z 0,8 - 1,0 mm bez zmiany jego położenia X-Y. Użyj sterylnej bawełny, aby zatamować krwawienie podczas operacji. 
	UWAGA: Aby uniknąć nadmiernego wiercenia i nadmiernego wytwarzania ciepła podczas wiercenia, upewnij się, że prędkość wiercenia wynosi 15 000 - 18 000 obrotów na minutę (RPM) i często wyjmuj wiertło z otworu w zadziorach co 8 - 10 s.</li>
	<li>Kontynuuj wiercenie, aż opona twarda zostanie odsłonięta. Użyj wygiętej igły, aby usunąć wszelkie skrawki kości, które powstają podczas wiercenia i wykonaj otwór w oponie twardej, nie uszkadzając leżącej pod spodem miękkiej tkanki mózgowej. 
	UWAGA: Aby uniknąć uszkodzenia tkanki mózgowej, wygiętą igłę można również zastąpić cienkimi kleszczami.</li>
	<li>Aby potwierdzić, że otwory na zadziory zostały prawidłowo wykonane w żądanej pozycji, zmniejsz wysokość elektrody poprzez regulację ramy chirurgicznej stereotaktycznej i upewnij się, że elektroda może być płynnie wprowadzana przez otwór zadziorów bez dotykania jakichkolwiek przeszkód. Jeśli tak, powoli wprowadzić elektrody na głębokość 1,8 mm w przypadku DG (lub 3,0 mm w przypadku PP) od powierzchni czaszki znajdującej się w przyśrodkowej PP do DG (PP-DG). 
	UWAGA: Podczas procesu implantacji elektrody należy zetrzeć płyn mózgowo-rdzeniowy lub wypływy krwi z otworów w zadziorach sterylną bawełną.</li>
	<li>Po włożeniu elektrody mikrodrutowej do otworu czaszki, przytrzymaj ją na miejscu za pomocą odpowiedniego cementu dentystycznego za pomocą małej szpatułki. Gdy cement zgęstnieje, uformuj go wokół włożonej elektrody i, aby utworzyć ładną, gładką nasadkę. Oczyścić i zdezynfekować brzegi rany.</li>
	<li>Odłącz elektrodę od uchwytu elektrody. Wyjmij mysz z ramki stereotaktycznej i umieść ją z powrotem w ciepłej klatce. 
	UWAGA: Po operacji należy poczekać z powrotem zwierząt do klatek, aż w pełni wyzdrowieją ze znieczulenia z wystarczającą świadomością.</li>
	<li>Pozwól myszy poruszać się swobodnie i pozwól jej dojść do siebie przez 2 dni w klatce. Następnie podłącz elektrodę wszczepioną w mózg myszy do programowalnego stymulatora za pomocą przewodów. Skonfiguruj interfejs oprogramowania zgodnie z opisem w Rysunek 2. Ustaw parametry HFS jako 6 serii po 6 ciągów po 6 impulsów przy 400 Hz (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B, 100 ms między ciągami, 20 s między seriami)28. Ustaw intensywność stymulacji na 200 μA.</li>
	<li>Dostarczaj HFS przez żądany okres czasu zgodnie z ustawieniami. Dostarczaj stymulację 2x dziennie o 8:00 i o 20:00</li>.
	<li>W przypadku grupy kontrolnej wszczepia się elektrody myszom i nie wykonuje stymulacji.</li>
	<li>W przypadku barwienia c-fos należy ostro stymulować myszy eksperymentalne (2 razy dziennie). W celu znakowania BrdU podziel myszy eksperymentalne na grupę ostrej stymulacji (stosowaną 2 razy dziennie) i grupę przewlekłej stymulacji (stosowaną 10 razy w ciągu 5 dni, 2 razy dziennie). W trakcie stymulacji upewnij się, że mysz nie śpi. Pamiętaj, aby upewnić się, że przewody nie są skręcone. 
	UWAGA: W ostatnim dniu zabiegu myszy w grupie ostrej stymulacji były stymulowane jednocześnie.</li>
	<li>Po zakończeniu stymulacji ostrożnie odłącz sworzeń elektrody od uchwytu elektrody i złącza systemu nagrywającego.</li>
</ol>
3. Barwienie immunofluorescencyjne i znakowanie bromodeoksyurydyny29
<ol>
	<li>W przypadku barwienia c-fos i Notch1, około 3 godziny po ostatniej stymulacji HF-DBS, znieczulij myszy, wstrzykując pentobarbital (20 - 50 mg / kg, IP) w celu uzyskania chirurgicznej płaszczyzny znieczulenia.</li>
	<li>W przypadku znakowania BrdU, około 12 godzin po ostatniej stymulacji HF-DBS, należy podać 6 wstrzyknięć BrdU kontrolnej i stymulowanym myszom w odstępach 2-godzinnych (50 mg / kg w 0,9% soli fizjologicznej, IP). 36 godzin po ostatnim wstrzyknięciu znieczulić myszy, wstrzykując pentobarbital (20 - 50 mg / kg, IP) w celu uzyskania płaszczyzny operacyjnej.</li>
	<li>Wykonaj nacięcia za pomocą skalpela przez klatkę piersiową, aby odsłonić serce, a następnie przełóż igłę perfuzyjną o rozmiarze 22 do lewej komory. Wykonaj małe nacięcie w prawym przedsionku. Perfuzja przezsercowa z 50 ml zimnej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie 50 ml zimnego 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS (pH 7,4). 
	UWAGA: Przełącz PBS na PFA, gdy krew myszy in vivo zostanie wymieniona, a płyn będzie czysty. Dobrą perfuzję można ocenić na podstawie oczyszczenia wątroby. Perfuzję należy przerwać po zaobserwowaniu drżeń fiksacji30.</li>
	<li>Odetnij głowę myszy nożyczkami okulistycznymi, wykonaj nacięcie na skórze i odsłoń czaszkę. Za pomocą kleszczy lekko odetnij czaszkę i ostrożnie wypreparuj cały mózg myszy. Po utrwaleniu mózgu w 4% paraformaldehydzie przez dodatkowe 2 dni i przeniesieniu go do 30% roztworu sacharozy w temperaturze 4 °C na noc.</li>
	<li>Za pomocą kriostatu pokrój mózgi na 20-μm odcinki koronalne. Przenieś i zamontuj sekcje na szkiełku za pomocą szczotki i przechowuj je w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: Zwierzęta z nieprawidłowym przemieszczeniem elektrod lub nadmiernymi uszkodzeniami mechanicznymi zostaną wykluczone z dalszej analizy.</li>
	<li>Przenieść szkiełka do normalnego PBS (0,1 M, pH 7,4) niezawierającego utrwalacza. Umyj plastry PBS przez 3 - 4x przez 5 minut każdy, aby usunąć nadmiar utrwalacza. W przypadku grupy znakowanej BrdU inkubować skrawki w 2-N HCl przez 30 minut w temperaturze 37 °C i przepłukać je w 0,1-M buforze boranowym (pH 8,4; 10 min). Następnie myj plastry 2x przez 5 min w PBS. 
	UWAGA: Następnie przeprowadza się barwienie immunologiczne.</li>
	<li>Plastry traktować przez inkubację w roztworze blokującym (1 % normalna surowica kozia, 3 % albuminy surowicy bydlęcej <BSA> , 0,5 % Triton X-100 i 0,02 % azydek sodu w 1 x PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Inkubować plastry z przeciwciałem poliklonalnym anty-c-fos (1:500; królik), przeciwciałem anty-Notch1 (1:50; koza) lub przeciwciałem anty-BrdU (1:800; szczur) w roztworze blokującym w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Umyj plastry 3x w PBS, a następnie inkubuj je z anty-króliczym przeciwciałem anty-króliczym Alexa Fluor 568 sprzężonym (1:500), Alexa Fluor 488 sprzężonym z kozim, (1:1,000) lub Alexa Fluor 488-sprzężonym z przeciwciałem anty-szczurzym (1:500) przez 1 godzinę w RT.</li>
	<li>Próbki przemyć 3x w PBS (za każdym razem 10 min). Przykryj wycinki mózgu znakowane immunologicznie za pomocą odczynnika montażowego zapobiegającego blaknięciu zawierającego DAPI. Pozostaw plastry do wyschnięcia na powietrzu i przechowuj je w temperaturze 4 °C przed światłem.</li>
	<li>Uzyskuj obrazy obszarów hipokampa ze stymulowanej i niestymulowanej strony mózgu za pomocą wielokanałowego (sekwencyjnego) skaningowego mikroskopu konfokalnego o wysokiej rozdzielczości. Ustaw parametry obrazowania spójnie między grupą kontrolną i eksperymentalną.</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie mozaikowe przy użyciu obiektywu o dużym powiększeniu (obiektyw powietrzny 20X, NA 0,45), aby uzyskać ciągłe obrazy 3D (XYZ) sąsiednich pól widzenia za pomocą zmotoryzowanego stolika i użyj odpowiedniego oprogramowania do zszycia ich ze sobą w celu uzyskania dużych obrazów kompozytowych. 
	UWAGA: Funkcje kafelkowania obejmują opcje prawdziwego łączenia i wygładzania, co zapewnia lepsze płynne obrazy. Obrazy kompozytowe można szybko i łatwo przygotować za pomocą funkcji łączenia, aby utworzyć obraz na dużym obszarze.</li>
	<li>W przypadku barwienia c-fos i Notch1 należy przeprowadzić dodatnią analizę ilościową jąder gęstości immunofluorescencyjnej21 zszytych obrazów. Losowo wybierz 3 obszary w podregionach DG rostralnego, grzbietowego i brzusznego hipokampa i zmierz gęstość immunofluorescencyjną w sposób podwójnie ślepej próby za pomocą oprogramowania Image J (http://rsb.info.nih.gov/ij/)31.</li>
	<li>W przypadku etykietowania BrdU przeanalizuj warstwy wokół punktu wiercenia przez grzbietowy hipokamp (-1,7 mm do -2,7 mm w stosunku do bregmy) w sposób podwójnie ślepej.</li>
	<li>Policz tylko neurony BrdU-dodatnie w DG. Do zliczania należy włączyć komórki leżące w obrębie 2 średnic komórek ziarnistości. 
	UWAGA: W tym przypadku liczenie odbywało się za pomocą obiektywu pneumatycznego 40X. Losowo policzono od 3 do 5 sekcji na zwierzę, a liczby zostały uśrednione i wyrażone jako średnie na DG19.</li>
</ol>

<ol><li>Perlmutter, J. S., Mink, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+brain+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Deep brain stimulation.</a> Annual Review of Neuroscience. 29, 229-257 (2006).</li>
<li>Lozano, A. M., Lipsman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+and+regulating+dysfunctional+circuits+using+deep+brain+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Probing and regulating dysfunctional circuits using deep brain stimulation.</a> Neuron. 77 (3), 406-424 (2013).</li>
<li>Kohl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+brain+stimulation+for+treatment-refractory+obsessive+compulsive+disorder%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Deep brain stimulation for treatment-refractory obsessive compulsive disorder: a systematic review.</a> BMC Psychiatry. 14, 214(2014).</li>
<li>Schlaepfer, T. E., Bewernick, B. H., Kayser, S., Madler, B., Coenen, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+effects+of+deep+brain+stimulation+for+treatment-resistant+major+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Rapid effects of deep brain stimulation for treatment-resistant major depression.</a> Biological Psychiatry. 73 (12), 1204-1212 (2013).</li>
<li>Fisher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+of+the+anterior+nucleus+of+thalamus+for+treatment+of+refractory+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy.</a> Epilepsia. 51 (5), 899-908 (2010).</li>
<li>Greenberg, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+brain+stimulation+of+the+ventral+internal+capsule%2Fventral+striatum+for+obsessive-compulsive+disorder%3A+worldwide+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Deep brain stimulation of the ventral internal capsule/ventral striatum for obsessive-compulsive disorder: worldwide experience.</a> Molecular Psychiatry. 15 (1), 64-79 (2010).</li>
<li>Kalia, S. K., Sankar, T., Lozano, A. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23817213">Deep brain stimulation for Parkinson's disease and other movement disorders.</a> Current Opinion in Neurology. 26 (4), 374-380 (2013).</li>
<li>Garcia, L., D'Alessandro, G., Bioulac, B., Hammond, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15808356">High-frequency stimulation in Parkinson's disease: more or less.</a> Trends in Neurosciences. 28 (4), 209-216 (2005).</li>
<li>Guercio, L. A., Schmidt, H. D., Pierce, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+brain+stimulation+of+the+nucleus+accumbens+shell+attenuates+cue-induced+reinstatement+of+both+cocaine+and+sucrose+seeking+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Deep brain stimulation of the nucleus accumbens shell attenuates cue-induced reinstatement of both cocaine and sucrose seeking in rats.</a> Behavioural Brain Research. 281, 125-130 (2015).</li>
<li>Bossert, J. M., Marchant, N. J., Calu, D. J., Shaham, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reinstatement+model+of+drug+relapse%3A+recent+neurobiological+findings%2C+emerging+research+topics%2C+and+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berlin%29%22%5BJournal%5D)">The reinstatement model of drug relapse: recent neurobiological findings, emerging research topics, and translational research.</a> Psychopharmacology (Berlin). 229 (3), 453-476 (2013).</li>
<li>Grubert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropsychological+safety+of+nucleus+accumbens+deep+brain+stimulation+for+major+depression%3A+effects+of+12-month+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+World+Journal+of+Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Neuropsychological safety of nucleus accumbens deep brain stimulation for major depression: effects of 12-month stimulation.</a> The World Journal of Biological Psychiatry. 12 (7), 516-527 (2011).</li>
<li>Lyons, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+brain+stimulation%3A+current+and+future+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clinic+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Deep brain stimulation: current and future clinical applications.</a> Mayo Clinic Proceedings. 86 (7), 662-672 (2011).</li>
<li>McIntyre, C. C., Hahn, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+perspectives+on+the+mechanisms+of+deep+brain+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Network perspectives on the mechanisms of deep brain stimulation.</a> Neurobiology of Disease. 38 (3), 329-337 (2010).</li>
<li>Kringelbach, M. L., Green, A. L., Owen, S. L., Schweder, P. M., Aziz, T. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sing+the+mind+electric+-+principles+of+deep+brain+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sing the mind electric - principles of deep brain stimulation.</a> European Journal of Neuroscience. 32 (7), 1070-1079 (2010).</li>
<li>Toda, H., Hamani, C., Fawcett, A. P., Hutchison, W. D., Lozano, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+adult+rodent+hippocampal+neurogenesis+by+deep+brain+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">The regulation of adult rodent hippocampal neurogenesis by deep brain stimulation.</a> Journal of Neurosurgery. 108 (1), 132-138 (2008).</li>
<li>Selvakumar, T., Alavian, K. N., Tierney, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+changes+in+the+rat+hippocampus+after+deep+brain+stimulation+of+the+anterior+thalamic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression changes in the rat hippocampus after deep brain stimulation of the anterior thalamic nucleus.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52457(2015).</li>
<li>Hattiangady, B., Shetty, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+decreased+hippocampal+neurogenesis+in+chronic+temporal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Implications of decreased hippocampal neurogenesis in chronic temporal lobe epilepsy.</a> Epilepsia. 49, Suppl 5 26-41 (2008).</li>
<li>Hattiangady, B., Rao, M. S., Shetty, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+temporal+lobe+epilepsy+is+associated+with+severely+declined+dentate+neurogenesis+in+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Chronic temporal lobe epilepsy is associated with severely declined dentate neurogenesis in the adult hippocampus.</a> Neurobiology of Disease. 17 (3), 473-490 (2004).</li>
<li>Madsen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+neurogenesis+in+a+model+of+electroconvulsive+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Increased neurogenesis in a model of electroconvulsive therapy.</a> Biological Psychiatry. 47 (12), 1043-1049 (2000).</li>
<li>Feldman, L. A., Shapiro, M. L., Nalbantoglu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+rapidly+acquired+and+persistent+spatial+memory+task+that+induces+immediate+early+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+and+Brain+Functions%22%5BJournal%5D)">A novel, rapidly acquired and persistent spatial memory task that induces immediate early gene expression.</a> Behavioral and Brain Functions. 6, 35(2010).</li>
<li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch1+deficiency+in+postnatal+neural+progenitor+cells+in+the+dentate+gyrus+leads+to+emotional+and+cognitive+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Notch1 deficiency in postnatal neural progenitor cells in the dentate gyrus leads to emotional and cognitive impairment.</a> The FASEB Journal. 31 (10), 4347-4358 (2017).</li>
<li>Alberi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-induced+Notch+signaling+in+neurons+requires+Arc%2FArg3.1+and+is+essential+for+synaptic+plasticity+in+hippocampal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-induced Notch signaling in neurons requires Arc/Arg3.1 and is essential for synaptic plasticity in hippocampal networks.</a> Neuron. 69 (3), 437-444 (2011).</li>
<li>Halpern, C. H., Attiah, M. A., Tekriwal, A., Baltuch, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+step-wise+approach+to+deep+brain+stimulation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochirurgica.%28Wien%29%22%5BJournal%5D)">A step-wise approach to deep brain stimulation in mice.</a> Acta Neurochirurgica.(Wien). 156 (8), 1515-1521 (2014).</li>
<li>Batra, V., Guerin, G. F., Goeders, N. E., Wilden, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+General+method+for+evaluating+deep+brain+stimulation+effects+on+intravenous+methamphetamine+self-administration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A General method for evaluating deep brain stimulation effects on intravenous methamphetamine self-administration.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53266(2016).</li>
<li>Fluri, F., Bieber, M., Volkmann, J., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrode+guided+implantation+of+electrodes+into+the+subthalamic+nucleus+of+rats+for+long-term+deep+brain+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microelectrode guided implantation of electrodes into the subthalamic nucleus of rats for long-term deep brain stimulation.</a> Journal of Visualized Experiments. (104), e53066(2015).</li>
<li>Resendez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cortical%2C+subcortical+and+deep+brain+neural+circuit+dynamics+during+naturalistic+mammalian+behavior+with+head-mounted+microscopes+and+chronically+implanted+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses.</a> Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. <a target="_blank" href="https://www.amazon.com/Mouse-Brain-Stereotaxic-Coordinates-Third/dp/0123694604">The mouse brain in stereotaxic coordinates.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, 3rd edition. 28 (03), 6(2007).</li>
<li>McHugh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dentate+gyrus+NMDA+receptors+mediate+rapid+pattern+separation+in+the+hippocampal+network%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dentate gyrus NMDA receptors mediate rapid pattern separation in the hippocampal network.</a> Science. 317 (5834), 94-99 (2007).</li>
<li>Gonzalez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medial+prefrontal+cortex+is+a+crucial+node+of+a+rapid+learning+system+that+retrieves+recent+and+remote+memories%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Medial prefrontal cortex is a crucial node of a rapid learning system that retrieves recent and remote memories.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 103, 19-25 (2013).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Tse, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuromuscular+junction%3A+measuring+synapse+size%2C+fragmentation+and+changes+in+synaptic+protein+density+using+confocal+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The neuromuscular junction: measuring synapse size, fragmentation and changes in synaptic protein density using confocal fluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), e52220(2014).</li>
<li>Pizzolato, G., Mandat, T. <a target="_blank" href="https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnint.2012.00002/full">Deep brain stimulation for movement disorders.</a> Frontiers in Integrative Neuroscience. 6, 2(2012).</li>
<li>Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+recent+trends+and+further+promising+directions+in+functional+neurosurgery%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochirurgica+Supplement%22%5BJournal%5D)">Some recent trends and further promising directions in functional neurosurgery.</a> Acta Neurochirurgica Supplement. 117 (117), 87-92 (2013).</li>
<li>Laxton, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+trial+of+deep+brain+stimulation+of+memory+circuits+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">A phase I trial of deep brain stimulation of memory circuits in Alzheimer's disease.</a> Annals of Neurology. 68 (4), 521-534 (2010).</li>
<li>Min, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+brain+stimulation+induces+BOLD+activation+in+motor+and+non-motor+networks%3A+an+fMRI+comparison+study+of+STN+and+EN%2FGPi+DBS+in+large+animals%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Deep brain stimulation induces BOLD activation in motor and non-motor networks: an fMRI comparison study of STN and EN/GPi DBS in large animals.</a> NeuroImage. 63 (3), 1408-1420 (2012).</li>
<li>Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKukurba%2C+KR+%22RNA+sequencing+and+analysis%22">RNA sequencing and analysis</a>. 2015 (11), Cold Spring Harbor Protocols. 951-969 (2015).</li>
<li>Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+era+for+functional+labeling+of+neurons%3A+activity-dependent+promoters+have+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8, 37(2014).</li>
<li>Liu, J., Solway, K., Messing, R. O., Sharp, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+neurogenesis+in+the+dentate+gyrus+after+transient+global+ischemia+in+gerbils%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Increased neurogenesis in the dentate gyrus after transient global ischemia in gerbils.</a> Journal of Neuroscience. 18 (19), 7768-7778 (1998).</li>
<li>Kuhn, H. G., Dickinson-Anson, H., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+dentate+gyrus+of+the+adult+rat%3A+age-related+decrease+of+neuronal+progenitor+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation.</a> Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do zadeklarowania.

Technika HF-DBS jest szeroko stosowana jako potężne narzędzie w leczeniu wielu zaburzeń neurologicznych od lat 90. Jak dotąd, przełomowa praca HF-DBS dotyczy leczenia choroby Parkinsona i drżenia samoistnego, co przyciągnęło dużą uwagę i zainteresowanie zarówno w środowisku klinicznym, jak i naukowym. Wiele grup prowadzi różnego rodzaju badania nad HF-DBS nad zastosowaniem terapeutycznym HF-DBS w niektórych zaburzeniach neurologicznych i psychiatrycznych32,33. Ni...

HF-DBS to neurochirurgiczna technologia stymulacji elektrycznej mózgu, rozwijana od 1870 roku1. Pod koniec lat osiemdziesiątych HFS został po raz pierwszy użyty jako potencjalna interwencja terapeutyczna w chorobie Parkinsona i innych zaburzeniach ruchowych2. W ciągu ostatnich kilku dekad HF-DBS jest coraz szerzej stosowany w leczeniu chorób mózgu, które są obecnie nieuleczalne tradycyjną strategią terapeutyczną. W szczególności, ze względu na poprawę dokładności elektrody HFS, wysoce skuteczne wyniki i minimalne skutki uboczne, liczba zaburzeń mózgu leczonych za pomocą HF-DBS znacznie wzrosła w ciągu ostatnich dziesięcioleci3,4,5. Na przykład HF-DBS został zatwierdzony przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) do leczenia choroby Parkinsona (PD), otępienia typu Alzheimera, drżenia samoistnego i innych rodzajów zaburzeń ruchowych2,6,7. U pacjentów z chorobą Parkinsona lek dopaminergiczny jest zmniejszony do 50% podczas HF-DBS8. Oprócz skutecznego leczenia zaburzeń ruchowych, HF-DBS wykazał również swoje potężne działanie w leczeniu chorób psychicznych w klinice, a także w zakresie wspomagania funkcji poznawczych2,9,10,11. Należy zauważyć, że badania nad HFS w leczeniu innych zaburzeń psychicznych są na różnych etapach, oferując pacjentom wiele nadziei12.
Chociaż wiele badań wykazało, że ogniskowy HFS ma zarówno miejscowe, jak i odległe efekty w całym mózgu13, neurologiczne i molekularne mechanizmy tych efektów pozostają nieuchwytne2,14. W klinice terapeutyczny HF-DBS jest zwykle stosowany w sposób długotrwały w leczeniu choroby Parkinsona i przewlekłego bólu itp. Pojawia się wiele opinii wyjaśniających poprawę wynikającą z leczenia HF-DBS, wśród których jedną jest możliwość, że prąd HFS moduluje aktywność sieci neuronalnej, prawdopodobnie przez powtarzającą się depolaryzację aksonów w pobliżu wszczepionej elektrody HFS. Lub HF-DBS może zmienić szybkość rozładowania neuronów wyjściowych i projektowanych celów. Ponadto HF-DBS może prowadzić do długotrwałych zmian synaptycznych, w tym długotrwałego nasilenia (LTP) i długotrwałej depresji (LTD), co może przyczynić się do poprawy objawowej. Jak dotąd nadal nie jest jasne, czy HFS wpływa na kluczowe zdarzenia molekularne, które regulują procesy komórkowe, takie jak neurogeneza dorosłych in vivo. Kilka linii badań wykazało, że HFS u gryzoni może naśladować podobne reakcje neuronalne klinicznie stosowanych DBS15,16. Aby zrozumieć mechanizmy komórkowe leżące u podstaw HF-DBS, w tym badaniu najpierw opracowaliśmy metodologię HFS in vivo u myszy w sposób ostry (jeden dzień) lub przewlekły (pięć dni). Po drugie, opracowaliśmy metodologię analizy aktywacji, aby określić zmianę aktywności neuronalnej i neurogenezy po dostarczeniu HF-DBS.
Biorąc pod uwagę, że produkcja neuronalna z nerwowych komórek macierzystych jest obfita podczas rozwoju embrionalnego, ale trwa przez całe dorosłe życie, strefa subziarnista hipokampa jest jednym z głównych obszarów, gdzie zachodzi neurogeneza. Na proces neurogenezy wpływa wiele czynników fizjologicznych i patologicznych. W niektórych przypadkach padaczkowych neurogeneza hipokampa jest znacznie zmniejszona17,18. Ponadto pojedyncza terapia elektrowstrząsowa może znacznie zwiększyć produkcję neuronów w zakręcie zębatym19. Obserwacje te sugerują, że aktywność elektrofizjologiczna odgrywa kluczową rolę w regulacji neurogenezy dorosłych i plastyczności synaptycznej w neuronach hipokampa. Dlatego, aby jeszcze bardziej zademonstrować wpływ HF-DBS na aktywność neuronalną i neurogenezę, najpierw przeprowadzamy test barwienia immunologicznego natychmiastowego wczesnego genu (IEG) c-fos, który jest dobrze znanym markerem krótkotrwałej aktywności neuronalnej wynikającej z doświadczenia20. Sygnalizacja Notch1 jest również wykrywana w celu monitorowania aktywacji sygnalizacji po dostarczeniu HFS21,22. Co więcej, wykrywamy również produkcję neuronalną za pomocą analizy znakowania BrdU po indukcji HF-DBS na różne sposoby, chociaż barwienie BrdU może być również markerem glehaju.
W obecnym badaniu, dwie metodologie HFS są dostosowane do bezpośredniego i pośredniego celu aktywacji DG hipokampa. Elektroda jest wszczepiana bezpośrednio do DG lub wszczepiana do przyśrodkowej ścieżki perforacji (PP), która wysyła projekcje w celu aktywacji neuronów DG. Do indukcji HF-DBS prezentowany jest programowalny stymulator do ciągłej stymulacji za pomocą elektrody stałej na głowie myszy. Aby określić wpływ HFS na aktywację neuronów i neurogenezę, wykrywamy ekspresję c-fos i Notch1 za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego oraz liczbę dodatnich neuronów włączonych do BrdU w regionie hipokampa DG, odpowiednio, po leczeniu HFS. W szczególności porównano wpływ HF-DBS na neurogenezę w DG między ostrą i przewlekłą stymulacją lub odpowiednio między bezpośrednim i pośrednim sposobem stymulacji.

<table><tbody><tr><td>Stereotaktyczny instrument do stereotaktycznego mózgu</td><td>Stoelting</td><td>51730D</td><td>Stereotaktyczne wszczepienie wewnątrzczaszkowe dla myszy</td></tr><tr><td>Stymulator</td><td>Systemy AM</td><td>Model 3800</td><td>MultiStim 8-kanałowy programowalny stymulator</td></tr><tr><td>Wiertarka dentystyczna</td><td>Saeshin Precision Co., Ltd</td><td>STRONG 90</td><td>Do wiercenia i krainiotomii&nbsp;</td></tr><tr><td>Frez</td><td>Meisinger</td><td>HM1 005#</td><td>Do wiercenia i krainiotomii&nbsp;</td></tr><tr><td>Digidata 1550 Digitizer</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>AXON 1550</td><td>Akwizycja danych w wysokiej rozdzielczości</td></tr><tr><td>Cryotome</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Thermo Cryotome FSE</td><td>Cięcie zamrożonych odcinków próbek</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Olympus</td><td>FV-1200</td><td>Japonia, z obiektywem 20x (NA 0,45)</td></tr> <tr><td>Narzędzia do chirurgii myszy</td> FST.14084-08,11254-20,16109-14 <td></td><td></td><td>Nożyczki, kleszcze, obcinacz do kości, uchwyty itp.</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodu</td><td>R& Systemy D</td><td>4579</td><td>20-50mg/kg do iniekcji dożylnych</td></tr><tr><td>Penicylina G&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td>75 000 U do iniekcji domięśniowej</td></tr><tr><td>Karprofen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML1713</td><td>5-10 mg / kg, do wstrzyknięcia s.c.</td></tr><tr><td>4% paraformaldehydu (PFA)</td><td>Beijing Solarbio Sci-Tech Co.&nbsp;</td><td>P1110</td><td>roztwór do pończoch do utrwalania tkanek</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10010023</td><td>pH7,4, 500 ml w pończochach</td></tr><tr><td>Związek Tissue-Tek OCT</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>Preparat rozpuszczalnych w wodzie glikoli i żywic</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-BrdU</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>Rozcieńczenia: 1/800</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-c-fos</td><td>Abcam</td><td>ab209794</td><td>Rozcieńczenia: 1/500</td></tr><tr><td>Kozia IgG Anty-Królicza (Alexa Fluor 568)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11036</td><td>Rozcieńczenia: 1/500</td></tr><tr><td>IgG przeciw szczurom osła (Alexa Fluor 488)</td> <td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-546-150</td><td>Rozcieńczenia: 1/500</td></tr><tr><td>Podłoże mocujące zapobiegające blaknięciu z DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Barwienie przeciwdziałające przeciwciałem DAPI</td></tr><tr><td>anty-Notch1 (C-20)</td> <td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-6014</td><td>Rozcieńczenia: 1/50</td></tr><tr><td>IgG przeciw kozom osła (Alexa Fluor 488)</td> <td>Abcam</td><td>ab150073</td><td>Rozcieńczenia: 1/1000</td></tr></tbody></table>

inwazyjna metoda aktywacji zakrętu zębatego myszy poprzez stymulację o wysokiej częstotliwości

An Invasive Method for the Activation of the Mouse Dentate Gyrus by High-frequency Stimulation

Elektryczna stymulacja wysokiej częstotliwości (HFS), wykorzystująca wszczepione elektrody skierowane do różnych obszarów mózgu, okazała się skuteczną metodą leczenia różnych zaburzeń neurologicznych i psychiatrycznych. HFS w głębokiej części mózgu, nazywany również głęboką stymulacją mózgu (DBS), staje się coraz ważniejszy w badaniach klinicznych. Niedawny postęp w dziedzinie chirurgii DBS O WYSOKIEJ CZĘSTOTLIWOŚCI (HF-DBS) zaczął rozprzestrzeniać możliwość wykorzystania tej inwazyjnej techniki na inne sytuacje, takie jak leczenie poważnych zaburzeń depresyjnych (MDD), zaburzeń obsesyjno-kompulsywnych (OCD) i tak dalej. 
Pomimo tych rosnących wskazań, mechanizmy leżące u podstaw korzystnych efektów HF-DBS pozostają enigmatyczne. Aby odpowiedzieć na to pytanie, jednym ze sposobów jest użycie wszczepionych elektrod, które w niewielkim stopniu aktywują rozproszone subpopulacje neuronów przez HFS. Doniesiono, że HFS w przednim jądrze wzgórza może być stosowany w leczeniu padaczki opornej na leczenie w klinice. Mechanizmy leżące u podstaw mogą być związane ze zwiększoną neurogenezą i zmienioną aktywnością neuronalną. Dlatego jesteśmy zainteresowani badaniem zmian fizjologicznych poprzez wykrywanie aktywności neuronalnej, a także neurogenezy w mysim zakręcie zębatym (DG) przed i po leczeniu HFS. 
W tym manuskrypcie opisujemy metodologie HFS do ukierunkowania aktywacji DG u myszy, bezpośrednio lub pośrednio oraz w sposób ostry lub przewlekły. Ponadto opisujemy szczegółowy protokół przygotowania wycinków mózgu do barwienia immunofluorescencyjnego c-fos i Notch1 w celu monitorowania aktywności neuronalnej i aktywacji sygnalizacji oraz znakowania bromodeoksyurydyny (BrdU) w celu określenia neurogenezy po indukcji HF-DBS. Aktywacja aktywności neuronalnej i neurogenezy po leczeniu HF-DBS dostarcza bezpośrednich dowodów neurobiologicznych i potencjalnych korzyści terapeutycznych. W szczególności metodologia ta może być modyfikowana i stosowana w celu ukierunkowania na inne zainteresowane obszary mózgu, takie jak zwoje podstawy i regiony podwzgórzowe w przypadku określonych zaburzeń mózgu w klinice.

Po stymulacji HF-DBS bezpośrednio w podregionie DG hipokampa lub w podregionie PP w celu pośredniej aktywacji DG poprzez wszczepione elektrody z wykorzystaniem korekt stereotaktycznych, gryzonie zostały zanestetyzowane pentobarbitalem, a próbki pobrano 3 h po ostatniej stymulacji HF-DBS do barwienia immunohistochemicznego na c-fos i Notch1. W przypadku barwienia BrdU, 36 h po ostatnim wstrzyknięciu BrdU, po 1 lub 5 dniach stymulacji HF-DBS, gryzonie zostały zanestetyzowa...

Ten protokół pokazuje, jak skonfigurować niezawodną metodę HFS u myszy. Neurony w zakręcie zębatym hipokampa są stymulowane elektrycznie przez HFS bezpośrednio i pośrednio in vivo. Aktywność neuronalną i sygnalizację molekularną bada się odpowiednio za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego c-fos i Notch1; Neurogenezę określa się ilościowo za pomocą testu znakowania bromodeoksyurydyny.

Inwazyjna metoda aktywacji zakrętu zębatego myszy poprzez stymulację o wysokiej częstotliwości

Electrical high-frequency stimulation (HFS), using implanted electrodes targeting various brain regions, has been proven as an effective treatment for ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest obserwacja wpływu stymulacji o wysokiej częstotliwości na aktywność neuronalną w neurogenezie. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące wyrównanych komórkowych i molekularnych mechanizmów głębokiej stymulacji mózgu o wysokiej częstotliwości, takich jak indukcja aktywności neuronów i neurogeneza w hipokampie. Zaletą tej techniki jest to, że pokazuje ona potężny wpływ TBS o wysokiej częstotliwości na aktywność neuronów i neurogenezę w dorosłym mózgu.Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w wpływ TBS o wysokiej częstotliwości na zakręt zębaty myszy, można ją również zastosować do innych systemów, takich jak zwoje podstawy i regiony podwzgórza w przypadku zaburzeń mózgu w klinice. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść znieczuloną mysz na ramce stereotaktycznej. Dopasuj opaski na uszy do głowy i delikatnie je zaciśnij, aby podeprzeć wyśrodkowaną głowę.Chwyć skórę od przodu do uszu i usuń około jednego centymetra kwadratowego nad czaszką. Następnie usuń mięsień i inne przyczepy leżące nad czaszką za pomocą bawełnianego wacika, aby odsłonić powierzchnię czaszki. Następnie nałóż roztwór nadtlenku wodoru, aby wysuszyć czaszkę w celu zidentyfikowania linii szwów strzałkowych i lambda.Następnie zidentyfikuj bregmę i lambdę. Punkt bregma zostanie użyty jako oryginalny punkt do ustawienia pozycji jądra. Następnie wypoziomuj czaszkę w płaszczyźnie poziomej za pomocą tych dwóch punktów.Upewnij się, że wysokości tych dwóch punktów są prawie takie same w grzbietowej płaszczyźnie brzusznej. Ponadto upewnij się, że czaszka jest wypoziomowana w przyśrodkowej płaszczyźnie bocznej. Następnie zamontuj domową dwukanałową miedzianą elektrodę mikrodrutową w obrotowym uchwycie elektrody na stereotaktycznej ramie operacyjnej.Umieść elektrodę bezpośrednio nad bregmą i ustaw ją jako oryginalne miejsce. Następnie delikatnie przesuń elektrodę do właściwej pozycji nad czaszką, nie dotykając jej. Użyj cyfrowego wyświetlacza na stereotaktycznej ramie operacyjnej, aby wskazać przednią tylną, przyśrodkową pozycję boczną i grzbietowo-brzuszną.Po zidentyfikowaniu żądanego miejsca wprowadzenia elektrody należy oznaczyć tę pozycję czarnym markerem. Następnie użyj grzbietowo-brzusznej regulacji stereotaktycznej, aby podnieść uchwyt elektrody. Następnie wysterylizuj wiertło 70% etanolem.Użyj ręcznej wiertarki wspomaganej mikromanipulatorem, wykonaj otwór na zadziory dokładnie w zaznaczonym miejscu. Użyj sterylnego bawełnianego wacika, aby zatamować krwawienie podczas operacji. Kontynuuj wiercenie, aż opona twarda zostanie odsłonięta.Użyj wygiętej igły, aby usunąć wszelkie skrawki kości, które powstają podczas wiercenia, i wykonaj otwór w oponie twardej, nie uszkadzając leżącej pod spodem miękkiej tkanki mózgowej. Aby potwierdzić, że otwór na zadziory jest prawidłowo wykonany w żądanej pozycji, opuść elektrodę, aby upewnić się, że płynnie przechodzi przez otwór zadziorów, nie dotykając żadnej przeszkody. Jeśli nie zostanie wykryty żaden opór, powoli włóż elektrodę na docelową głębokość od powierzchni czaszki.Następnie nałóż cement dentystyczny za pomocą małej szpatułki, aby utrzymać elektrodę na miejscu. Gdy cement zgęstnieje, uformuj go wokół włożonej elektrody i innych kostnych, aby utworzyć ładną, gładką nasadkę. Następnie odłącz elektrodę od uchwytu elektrody.Wyjmij mysz z ramki stereotaktycznej i umieść ją z powrotem w ciepłej klatce. Pozwól myszy poruszać się swobodnie i pozwól jej dojść do siebie przez dwa dni w klatce. Aby dostarczyć stymulację, podłącz wszczepioną elektrodę do programowalnego stymulatora za pomocą przewodów.Skonfiguruj interfejs oprogramowania. Następnie ustaw parametry HFS jako sześć serii po sześć ciągów po sześć impulsów przy 400 Hz i intensywności stymulacji 200 miliamperów. Dostarczaj HFS przez żądany okres czasu, zgodnie z ustawieniami.W grupie kontrolnej wszczepia się elektrody myszom bez dostarczania żadnej stymulacji. W przypadku barwienia CFAS stymuluj myszy eksperymentalne dwa razy przez jeden dzień. W przypadku znakowania BrdU należy zastosować odpowiednie stymulacje zarówno do grupy stymulacji ostrej, jak i do grupy stymulacji przewlekłej.W trakcie stymulacji upewnij się, że mysz nie śpi. Pamiętaj, aby upewnić się, że przewody nie są skręcone. Po zakończeniu stymulacji ostrożnie odłącz kołek elektrody od uchwytu elektrody w złączu systemu nagrywającego.W przypadku CFAS i jednego wycięcia jednego barwienia, około trzech godzin po ostatnim HFDBS, znieczulij myszy, wstrzykując pentobarbital w celu uzyskania chirurgicznej płaszczyzny znieczulenia. W przypadku znakowania BrdU, około 12 godzin po ostatniej stymulacji HFDBS, należy podać sześć wstrzyknięć BrdU kontrolnym i stymulowanym myszom w odstępach dwugodzinnych. 36 godzin po ostatnim wstrzyknięciu głęboko znieczulij myszy pentobarbitalem i przezsercowo obficie go podaj 50 mililitrami zimnego PBS, a następnie 50 mililitrami zimnego 4% paraformaldehydu.Usuń jego głowę i wykonaj nacięcie na skórze, aby odsłonić umiejętność. Za pomocą kleszczy lekko odetnij czaszkę i ostrożnie usuń cały mózg. Następnie, po naprawieniu, mózg składa się z 4% paraformaldehydu przez dodatkowe dwa dni i przenosi go do 30% roztworu sacharozy w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.Za pomocą kriostatu pokrój mózg na 20-mikronowe odcinki koronalne. Przenieś i zamontuj sekcje do szkiełka za pomocą szczotki i przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnie przenieś szkiełka do normalnego PBS nie zawierającego utrwalacza.Umyj skrawki PBS trzy do czterech razy przez pięć minut każda, aby usunąć nadmiar utrwalacza. W przypadku grupy znakowanej BrdU inkubować skrawki w dwóch molowych HCL przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i przepłukać je w 0,1-molowym buforze boranowym. Po 10 minutach umyj sekcje dwa razy w PBS przez pięć minut za każdym razem.Następnie inkubować skrawki w roztworze blokującym przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie inkubować skrawki z przeciwciałem poliklonalnym anty-CFAS, przeciwciałem anty-notch one lub przeciwciałem anty-BrdU w roztworze blokującym w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Czy skrawki były trzy razy w PBS przez 10 minut za każdym razem, a następnie inkubować je z sprzężonym anty-rabidem Alexa Fluor 568, skoniugowanym anty-kozim Alexa Fluor 488 lub sprzężonym anty-szczurzym przeciwciałem drugorzędowym Alexa Fluor 488 przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Czy sekcje były trzy razy w PBS po 10 minut za każdym razem. Następnie przykryj znakowane immunologicznie skrawki mózgu za pomocą pożywki montażowej odczynnika zapobiegającego blaknięciu zawierającej DAPI. Pozostaw sekcje do wyschnięcia na powietrzu i przechowuj je przed światłem w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Pokazano tutaj eksperymentalny paradygmat leczenia HFS w generowaniu neuronów proliferacyjnych znakowanych BrdU w DG. Zwierzęta podzielono na grupę ostrą i przewlekłą, aby otrzymać różne wzorce stymulacji. Następnie zwierzętom w obu grupach wstrzyknięto BrdU w szóstym dniu. Ósmego dnia zwierzęta zostały znieczulone i obficie przygotowane do wykonania sekcji kriostatu.Oto obrazy barwienia immunofluorescencyjnego BrdU po HFDBS w DG. Analiza ilościowa produkcji neuronalnej wykazała, że ostra stymulacja w DG nie może wzmocnić neurogenezy. Podczas gdy przewlekła stymulacja w DG znacznie regulowała neurogenezę. W porównaniu z grupą kontrolną, liczba komórek znakujących BrdU znacznie wzrosła w grupie przewlekłej, zarówno w półkuli ipsilateralnej, jak i przeciwległej.Są to obrazy barwienia immunofluorescencyjnego BrdU po HFDBS w subregionie PP. Analiza ilościowa produkcji neuronalnej wykazała, że ani ostra, ani przewlekła stymulacja w PP nie może znacząco wzmocnić neurogenezy. Liczba komórek znakujących BrdU była stosunkowo stabilna z leczeniem HFS lub bez niego.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o prawidłowym zlokalizowaniu elektrody i pomyślnym dostarczeniu stymulacji. Po opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się neurobiologią, zajmującym się stymulacją wysokiej częstotliwości, zapisanymi w modelach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak dostarczać stymulację o wysokiej częstotliwości do głębokiego jądra mózgu.

an-invasive-method-for-activation-mouse-dentate-gyrus-high-frequency

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Selvakumar, T., et al., Analiza zmian ekspresji genów w hipokampie szczura po głębokiej stymulacji mózgu przedniego jądra wzgórza. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje procedurę wszczepiania elektrod do mózgu szczura w celu zastosowania głębokiej stymulacji mózgu (DBS), która moduluje aktywność neuronalną i poprawia komunikację z hipokampem, wspierając przeżycie neuronów i neurogenezę.

Wpływ głębokiej stymulacji mózgu na aktywność neuronalną hipokampa w modelu szczurzym

Źródło: Zhao, Z. i wsp. Inwazyjna metoda aktywacji zakrętu zębatego myszy poprzez stymulację o wysokiej częstotliwości. J. Vis. Exp. (2018)Ten film demonstruje protokół dostarczania głębokiej stymulacji mózgu o wysokiej częstotliwości do zakrętu zębatego hipokampa myszy, szczegółowo opisując jego wpływ na aktywację neuronów, plastyczność synaptyczną i neurogenezę.

Stymulacja o wysokiej częstotliwości w celu zwiększenia aktywacji neuronów i neurogenezy w zakręcie zębatym myszy

Ten film demonstruje protokół modulacji oscylacji theta w genetycznie zmodyfikowanym modelu myszy z światłoczułymi kanałami jonowymi w neuronach przegrody przyśrodkowej GABA-ergiczne. Dostarczając impulsy świetlne do hipokampa, protokół ma na celu synchronizację aktywności neuronalnej i generowanie oscylacji theta, które są rejestrowane jako lokalne potencjały pola.

Selektywna manipulacja oscylacjami theta w modelu mysim

Ten film pokazuje badanie aktywności neuronalnej w określonym regionie mózgu myszy, który przetwarza bodźce słuchowe. Technika polega na zastosowaniu hamującego blokera neurotransmisji i porównaniu odpowiedzi neuronalnych na bodźce słuchowe przed i po zastosowaniu leku do zlokalizowanego obszaru mózgu.

Badanie słuchowych reakcji neuronalnych u obudzonej myszy w obecności hamującego blokera neuroprzekaźników

Ten film demonstruje stereotaktyczne wszczepienie drutu elektrodowego i światłowodu w hipokampie modelu myszy.

Wszczepianie układu elektrod i światłowodu do hipokampa myszy

Transgeniczne i nokautujące mysie modele chorób neurologicznych są przydatne do badania roli genów w prawidłowej i nieprawidłowej neurofizjologii. W artykule opisano metodologie, które można wykorzystać do badania długotrwałego wzmocnienia, mechanizmu komórkowego, który może leżeć u podstaw uczenia się i pamięci, w transgenicznych i nokautujących, swobodnie zachowujących się mysich modelach neuropatologii.

Długotrwałe nasilenie synapsy zakrętu perforacyjnego i zębatego u swobodnie zachowujących się myszy

Badania wykazały, że katodowa przezczaszkowa stymulacja prądem stałym może powodować efekt tłumiący napady oporne na leki. W tym badaniu opracowano konfigurację eksperymentalną in vitro, w której oceniano stymulację prądem stałym i rejestrację wieloelektrodową aktywności podobnej do napadu w przygotowaniu wycinków mózgu myszy. Ocenie poddano parametry stymulacji prądem stałym.

Stymulacja prądem stałym i wieloelektrodowa rejestracja aktywności podobnej do napadów w przygotowaniu do wycinka mózgu myszy

Ten protokół opisuje rejestrację lokalnych potencjałów pola za pomocą wielozębowych liniowych sond krzemowych. Konwersja sygnałów za pomocą analizy gęstości źródła prądu pozwala na rekonstrukcję lokalnej aktywności elektrycznej w hipokampie myszy. Dzięki tej technice można badać ograniczone przestrzennie oscylacje mózgu u swobodnie poruszających się myszy.

Rejestrowanie przestrzennie ograniczonych oscylacji w hipokampie zachowujących się myszy

Tutaj opisujemy dwie nieinwazyjne metody chronicznego kontrolowania aktywności neuronalnej za pomocą chemogenetyki u myszy. Krople do oczu stosowano do codziennego dostarczania N-tlenku klozapiny (CNO). Opisano również dwie metody przedłużonego podawania CNO w wodzie pitnej. Te strategie przewlekłej kontroli neuronów wymagają minimalnej interwencji zmniejszającej stres zwierząt.

Nieinwazyjne strategie przewlekłej manipulacji aktywnością neuronalną kontrolowaną przez DREADD

Ten raport opisuje metody generowania modelu padaczki skroniowej na podstawie elektrycznego rozpalenia transgenicznych myszy VGAT-Cre. Rozpalone myszy VGAT-Cre mogą być przydatne w określaniu, co powoduje padaczkę i w badaniach przesiewowych nowych terapii.

Przygotowanie i wszczepienie elektrod dla elektrycznie zapalających myszy VGAT-Cre w celu wygenerowania modelu padaczki skroniowej

Proponuje się tani system zapisu elektroencefalograficznego w połączeniu z cewką o rozmiarach milimetrowych do napędzania przezczaszkowej stymulacji magnetycznej mózgu myszy in vivo. Korzystając z konwencjonalnych elektrod śrubowych z niestandardowym, elastycznym podłożem z matrycą wieloelektrodową, można przeprowadzić zapis w wielu miejscach z mózgu myszy w odpowiedzi na przezczaszkową stymulację magnetyczną.

Niedrogi elektroencefalograficzny system zapisu w połączeniu z cewką o rozmiarach milimetrowych do przezczaszkowej stymulacji mózgu myszy in vivo

Poznaj inwazyjną metodę aktywacji zakrętu zębatego myszy poprzez stymulację o wysokiej częstotliwości. Technika ta umożliwia badanie neurogenezy i aktywności neuronalnej w hipokampie z wykorzystaniem barwienia immunofluorescencyjnego.

Inwazyjna metoda aktywacji zakrętu zębatego myszy poprzez stymulację o wysokiej częstotliwości

Przeglądaj więcej filmów