Inwazyjna metoda aktywacji zakrętu zębatego myszy poprzez stymulację o wysokiej częstotliwości

Ogólnym celem tego eksperymentu jest obserwacja wpływu stymulacji o wysokiej częstotliwości na aktywność neuronalną w neurogenezie. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące wyrównanych komórkowych i molekularnych mechanizmów głębokiej stymulacji mózgu o wysokiej częstotliwości, takich jak indukcja aktywności neuronów i neurogeneza w hipokampie. Zaletą tej techniki jest to, że pokazuje ona potężny wpływ TBS o wysokiej częstotliwości na aktywność neuronów i neurogenezę w dorosłym mózgu.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w wpływ TBS o wysokiej częstotliwości na zakręt zębaty myszy, można ją również zastosować do innych systemów, takich jak zwoje podstawy i regiony podwzgórza w przypadku zaburzeń mózgu w klinice. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść znieczuloną mysz na ramce stereotaktycznej. Dopasuj opaski na uszy do głowy i delikatnie je zaciśnij, aby podeprzeć wyśrodkowaną głowę.

Chwyć skórę od przodu do uszu i usuń około jednego centymetra kwadratowego nad czaszką. Następnie usuń mięsień i inne przyczepy leżące nad czaszką za pomocą bawełnianego wacika, aby odsłonić powierzchnię czaszki. Następnie nałóż roztwór nadtlenku wodoru, aby wysuszyć czaszkę w celu zidentyfikowania linii szwów strzałkowych i lambda.

Następnie zidentyfikuj bregmę i lambdę. Punkt bregma zostanie użyty jako oryginalny punkt do ustawienia pozycji jądra. Następnie wypoziomuj czaszkę w płaszczyźnie poziomej za pomocą tych dwóch punktów.

Upewnij się, że wysokości tych dwóch punktów są prawie takie same w grzbietowej płaszczyźnie brzusznej. Ponadto upewnij się, że czaszka jest wypoziomowana w przyśrodkowej płaszczyźnie bocznej. Następnie zamontuj domową dwukanałową miedzianą elektrodę mikrodrutową w obrotowym uchwycie elektrody na stereotaktycznej ramie operacyjnej.

Umieść elektrodę bezpośrednio nad bregmą i ustaw ją jako oryginalne miejsce. Następnie delikatnie przesuń elektrodę do właściwej pozycji nad czaszką, nie dotykając jej. Użyj cyfrowego wyświetlacza na stereotaktycznej ramie operacyjnej, aby wskazać przednią tylną, przyśrodkową pozycję boczną i grzbietowo-brzuszną.

Po zidentyfikowaniu żądanego miejsca wprowadzenia elektrody należy oznaczyć tę pozycję czarnym markerem. Następnie użyj grzbietowo-brzusznej regulacji stereotaktycznej, aby podnieść uchwyt elektrody. Następnie wysterylizuj wiertło 70% etanolem.

Użyj ręcznej wiertarki wspomaganej mikromanipulatorem, wykonaj otwór na zadziory dokładnie w zaznaczonym miejscu. Użyj sterylnego bawełnianego wacika, aby zatamować krwawienie podczas operacji. Kontynuuj wiercenie, aż opona twarda zostanie odsłonięta.

Użyj wygiętej igły, aby usunąć wszelkie skrawki kości, które powstają podczas wiercenia, i wykonaj otwór w oponie twardej, nie uszkadzając leżącej pod spodem miękkiej tkanki mózgowej. Aby potwierdzić, że otwór na zadziory jest prawidłowo wykonany w żądanej pozycji, opuść elektrodę, aby upewnić się, że płynnie przechodzi przez otwór zadziorów, nie dotykając żadnej przeszkody. Jeśli nie zostanie wykryty żaden opór, powoli włóż elektrodę na docelową głębokość od powierzchni czaszki.

Następnie nałóż cement dentystyczny za pomocą małej szpatułki, aby utrzymać elektrodę na miejscu. Gdy cement zgęstnieje, uformuj go wokół włożonej elektrody i innych kostnych, aby utworzyć ładną, gładką nasadkę. Następnie odłącz elektrodę od uchwytu elektrody.

Wyjmij mysz z ramki stereotaktycznej i umieść ją z powrotem w ciepłej klatce. Pozwól myszy poruszać się swobodnie i pozwól jej dojść do siebie przez dwa dni w klatce. Aby dostarczyć stymulację, podłącz wszczepioną elektrodę do programowalnego stymulatora za pomocą przewodów.

Skonfiguruj interfejs oprogramowania. Następnie ustaw parametry HFS jako sześć serii po sześć ciągów po sześć impulsów przy 400 Hz i intensywności stymulacji 200 miliamperów. Dostarczaj HFS przez żądany okres czasu, zgodnie z ustawieniami.

W grupie kontrolnej wszczepia się elektrody myszom bez dostarczania żadnej stymulacji. W przypadku barwienia CFAS stymuluj myszy eksperymentalne dwa razy przez jeden dzień. W przypadku znakowania BrdU należy zastosować odpowiednie stymulacje zarówno do grupy stymulacji ostrej, jak i do grupy stymulacji przewlekłej.

W trakcie stymulacji upewnij się, że mysz nie śpi. Pamiętaj, aby upewnić się, że przewody nie są skręcone. Po zakończeniu stymulacji ostrożnie odłącz kołek elektrody od uchwytu elektrody w złączu systemu nagrywającego.

W przypadku CFAS i jednego wycięcia jednego barwienia, około trzech godzin po ostatnim HFDBS, znieczulij myszy, wstrzykując pentobarbital w celu uzyskania chirurgicznej płaszczyzny znieczulenia. W przypadku znakowania BrdU, około 12 godzin po ostatniej stymulacji HFDBS, należy podać sześć wstrzyknięć BrdU kontrolnym i stymulowanym myszom w odstępach dwugodzinnych. 36 godzin po ostatnim wstrzyknięciu głęboko znieczulij myszy pentobarbitalem i przezsercowo obficie go podaj 50 mililitrami zimnego PBS, a następnie 50 mililitrami zimnego 4% paraformaldehydu.

Usuń jego głowę i wykonaj nacięcie na skórze, aby odsłonić umiejętność. Za pomocą kleszczy lekko odetnij czaszkę i ostrożnie usuń cały mózg. Następnie, po naprawieniu, mózg składa się z 4% paraformaldehydu przez dodatkowe dwa dni i przenosi go do 30% roztworu sacharozy w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Za pomocą kriostatu pokrój mózg na 20-mikronowe odcinki koronalne. Przenieś i zamontuj sekcje do szkiełka za pomocą szczotki i przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnie przenieś szkiełka do normalnego PBS nie zawierającego utrwalacza.

Umyj skrawki PBS trzy do czterech razy przez pięć minut każda, aby usunąć nadmiar utrwalacza. W przypadku grupy znakowanej BrdU inkubować skrawki w dwóch molowych HCL przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i przepłukać je w 0,1-molowym buforze boranowym. Po 10 minutach umyj sekcje dwa razy w PBS przez pięć minut za każdym razem.

Następnie inkubować skrawki w roztworze blokującym przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie inkubować skrawki z przeciwciałem poliklonalnym anty-CFAS, przeciwciałem anty-notch one lub przeciwciałem anty-BrdU w roztworze blokującym w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Czy skrawki były trzy razy w PBS przez 10 minut za każdym razem, a następnie inkubować je z sprzężonym anty-rabidem Alexa Fluor 568, skoniugowanym anty-kozim Alexa Fluor 488 lub sprzężonym anty-szczurzym przeciwciałem drugorzędowym Alexa Fluor 488 przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.

Czy sekcje były trzy razy w PBS po 10 minut za każdym razem. Następnie przykryj znakowane immunologicznie skrawki mózgu za pomocą pożywki montażowej odczynnika zapobiegającego blaknięciu zawierającej DAPI. Pozostaw sekcje do wyschnięcia na powietrzu i przechowuj je przed światłem w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Pokazano tutaj eksperymentalny paradygmat leczenia HFS w generowaniu neuronów proliferacyjnych znakowanych BrdU w DG. Zwierzęta podzielono na grupę ostrą i przewlekłą, aby otrzymać różne wzorce stymulacji. Następnie zwierzętom w obu grupach wstrzyknięto BrdU w szóstym dniu. Ósmego dnia zwierzęta zostały znieczulone i obficie przygotowane do wykonania sekcji kriostatu.

Oto obrazy barwienia immunofluorescencyjnego BrdU po HFDBS w DG. Analiza ilościowa produkcji neuronalnej wykazała, że ostra stymulacja w DG nie może wzmocnić neurogenezy. Podczas gdy przewlekła stymulacja w DG znacznie regulowała neurogenezę. W porównaniu z grupą kontrolną, liczba komórek znakujących BrdU znacznie wzrosła w grupie przewlekłej, zarówno w półkuli ipsilateralnej, jak i przeciwległej.

Są to obrazy barwienia immunofluorescencyjnego BrdU po HFDBS w subregionie PP. Analiza ilościowa produkcji neuronalnej wykazała, że ani ostra, ani przewlekła stymulacja w PP nie może znacząco wzmocnić neurogenezy. Liczba komórek znakujących BrdU była stosunkowo stabilna z leczeniem HFS lub bez niego.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o prawidłowym zlokalizowaniu elektrody i pomyślnym dostarczeniu stymulacji. Po opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się neurobiologią, zajmującym się stymulacją wysokiej częstotliwości, zapisanymi w modelach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak dostarczać stymulację o wysokiej częstotliwości do głębokiego jądra mózgu.