Fluorescencyjne obrazowanie żywych komórek pełnego wegetatywnego cyklu komórkowego wolno rosnącej bakterii społecznej Myxococcus xanthus

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórek bakteryjnych, takie jak to, w jaki sposób komórki replikują swoje DNA, jak rosną i jak się dzielą. Główną zaletą tej techniki jest to, że żywe komórki bakteryjne mogą być monitorowane pod mikroskopem przez co najmniej 24 godziny, a technika ta nie wymaga specjalnego sprzętu. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd we wzrost i podział Myxococcus xanthus, można ją również łatwo zastosować do innych wolno rosnących bakterii.

Na początek ponownie zawiesić pojedynczą kolonię M.xanthus w 500 mikrolitrach 1% CTT, uzupełnionych antybiotykami, w sterylnej probówce i przenieść całą zawiesinę do 50-mililitrowej kolby Erlenmeyera zawierającej pięć mililitrów 1% CTT. Przygotuj 1% roztwór mikroskopii agarozowej zawierający 0,2% CTT, mieszając jeden gram agarozy z 80 mililitrami buforu TPM i 20 mililitrami pożywki 1% CTT. Roztwór podgrzewać w kuchence mikrofalowej, aż agaroza się stopi.

Napełnij szalkę Petriego około 60 mililitrami stopionej agarozy i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej. Podgrzej wacik z agarozą w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez co najmniej 15 minut przed użyciem. Następnie umieść sterylne szklane szkiełko nakrywkowe na plastikowej lub metalowej ramie z otworem pośrodku, a następnie użyj taśmy, aby przymocować szkiełko nakrywkowe do ramy.

Dodaj 10 do 20 mikrolitrów wykładniczo rosnących komórek M.xanthus na szkiełko nakrywkowe. Aby dodać mikrosfery fluorescencyjne jako markery odniesienia komórek, użyj bufora TPM, aby rozcieńczyć mikrosfery do 1:100. Dokładnie wstrząśnij zawiesiną kulek i dodaj do komórek od pięciu do 10 mikrolitrów.

Z dużej, wstępnie podgrzanej 1% waciczki agarozowej wytnij małą podkładkę mniej więcej wielkości szkiełka nakrywkowego i umieść ją na wierzchu komórek. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu podkładki, aby zapobiec parowaniu i utrzymać komórki w wilgotnym środowisku. Inkubować próbkę mikroskopową w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez 15 do 20 minut, aby komórki mogły przyczepić się do dna podkładki agarozowej przed zapisami z mikroskopii poklatkowej.

Aby przeprowadzić mikroskopię poklatkową, włącz mikroskop i uruchom oprogramowanie sterujące mikroskopem. Wybierz właściwy obiektyw i właściwe lustra oraz filtruj, aby uzyskać obrazy kontrastu fazowego, a także obrazy białek zielono-fluorescencyjnych, czerwonych lub żółtych fluorescencyjnych. Dodać kroplę wysokiej jakości olejku immersyjnego na soczewkę obiektywu i na dno próbki wstępnie inkubowanej w temperaturze 32 stopni Celsjusza.

Stroną z otworem skierowaną w stronę obiektywu umieść metalową ramkę z próbką na stoliku mikroskopu, a następnie bezpiecznie przymocuj próbkę w uchwycie stolika. Skoncentruj się na komórkach, przesuwając stolik w kierunku Z bliżej celu. Gdy olej na obiektywie i próbce zetkną się, przesuń stolik w kierunku X/Y.

Przełącz się na oprogramowanie Metamorph i otwórz narzędzie Acquire. Wybierz Kontrast fazowy z listy rozwijanej Ustawienia i ustaw czas ekspozycji na 100 milisekund. Kliknij opcję Pokaż na żywo, przenieś komórkę na płaszczyznę ogniskowej i przesuwaj stół montażowy w kierunku X/Y, aż w polu widzenia będzie widocznych wiele pojedynczych komórek.

Upewnij się, że co najmniej jedna mikrosfera fluorescencyjna znajduje się w obszarze view, aby później wyrównać uzyskane obrazy. Następnie otwórz kreatora akwizycji wielowymiarowej w oprogramowaniu sterującym mikroskopem, aby skonfigurować eksperyment poklatkowy, który w razie potrzeby umożliwia mikroskopowi uzyskanie obrazów na wielu długościach fal i pozycjach stolika. Na karcie Główny aktywuj tryb poklatkowy i wiele długości fal.

Dodatkowe zakładki pojawią się po lewej stronie okna. Kliknij kartę Zapisywanie i wybierz Katalog, aby wybrać pusty folder na dysku twardym komputera, aby zapisać pozyskane obrazy, a następnie aktywuj opcję Zwiększ nazwę podstawową, jeśli plik istnieje, aby upewnić się, że kolejne zestawy danych nie zastąpią wcześniejszych. Nadaj eksperymentowi nazwę z datą i nazwą szczepu lub tytułem eksperymentu.

Kliknij zakładkę poklatkową, aby dostosować parametry poklatkowe, a następnie ustaw interwał czasu na 20 minut i ustaw czas trwania na 24 godziny. Liczba punktów czasowych zmieni się automatycznie. Teraz kliknij kartę Długości fal.

Wybierz liczbę długości fal, które mają być rejestrowane dla każdego obrazu w każdym punkcie czasowym, zmieniając liczbę. Wybierz opcję Zezwalaj na oddzielną sprzętową pozycję zapamiętywanego AF dla każdej długości fali. Kliknij kartę Pierwsza długość fali od góry.

Z listy rozwijanej Illumination (Iluminacja) wybierz opcję Phase Contrast (Kontrast fazowy). Wybierz 100 milisekund dla ekspozycji, a następnie z listy rozwijanej Pobierz wybierz opcję Every Time Point. Wyłącz opcję Automatyczne naświetlanie na liście rozwijanej, wybierając opcję Nigdy i wybierając opcję Każde pobranie z listy rozwijanej dla opcji Automatyczne ustawianie ostrości.

Ustaw ekspozycję dla każdej długości fali, jak właśnie pokazano, używając następujących parametrów. Następnie, aby uzyskać obrazy z wielu pozycji stołu montażowego, na karcie Główny aktywuj opcję Wiele pozycji stołu montażowego. Kliknij kartę Scena i kliknij przycisk Na żywo, aby spojrzeć na pole widzenia.

Przesuwaj stolik w kierunku X/Y, aż w polu widzenia znajdzie się zwrot akcji. Zapisz współrzędne X i Y na karcie Etap, klikając znak plus. Ponownie przesuń stół montażowy w kierunku X/Y, aż zostanie znaleziony nowy zwrot akcji, a następnie ponownie zapisz współrzędne, klikając znak plus.

Kontynuuj, aż zostanie zapisana żądana liczba regionów. Sprawdź jeszcze raz, czy komórki są ostre, klikając różne zapisane pozycje X i Y, a następnie uruchom sprzętowy autofokus, klikając AFC hold, aby utrzymać zapisaną pozycję Z na stałym poziomie w trakcie eksperymentu. Rozpocznij nagrywanie poklatkowe w kreatorze akwizycji wielowymiarowej oprogramowania sterującego mikroskopem, klikając przycisk Acquire.

Sprawdź, czy komórki są nadal ostre po pierwszych kilku punktach czasowych w nagraniach poklatkowych, aby zmaksymalizować jakość obrazów i w razie potrzeby ponownie ustawić ostrość. Aby wygenerować filmy poklatkowe i wykonać wyrównanie obrazu, uruchom oprogramowanie do analizy i przetwarzania obrazu. Otwórz obrazy jako stos, klikając opcję Przejrzyj dane wielowymiarowe, wybierz opcję Plik podstawowy, wybierz pozycję Katalog, a następnie otwórz folder z danymi wielowymiarowymi.

Sprawdź zestaw danych i kliknij przycisk Wyświetl. Zestaw danych będzie wyświetlany jako pojedyncze obrazy od punktu czasu pierwszego do końca. Aktywuj długość fali do tworzenia stosu, a następnie wybierz wszystkie obrazy, które powinny znaleźć się w stosie i kliknij Załaduj obrazy.

Powtórz ten krok dla wszystkich długości fal i zapisz ukończone stosy. Aktywuj stos obrazów, który musi zostać skorygowany pod kątem dryfu. Otwórz narzędzie do wyrównywania za pomocą Aplikacje, Automatyczne wyrównywanie.

Zaznacz opcję Stos jako źródło obrazów i Pierwsza płaszczyzna/punkt czasowy jako płaszczyzna odniesienia, a następnie wybierz stos za pomocą przycisku Stos źródłowy i kliknij przycisk Zastosuj. Po zakończeniu automatycznego wyrównywania zapisz wyrównany stos. Aby wygenerować film w formatach MOV lub AVI, otwórz funkcję Make Movie za pomocą Stack, Make Movie.

Wybierz nagrania poklatkowe za pomocą przycisku Stos źródłowy, a następnie wybierz format wyjściowy, liczbę klatek na sekundę, liczbę klatek i kliknij przycisk Zapisz. W tym eksperymencie poklatkowym z ruchliwymi komórkami DK1622 typu dzikiego, obrazy kontrastu fazowego były rejestrowane co pięć minut przez 24 godziny. Zgodnie z oczekiwaniami, komórki były ruchliwe i poruszały się głównie w grupach.

W obrazowaniu żywych komórek z kontrastem fazowym z nieruchliwymi komórkami Delta-mgIA, wzrost i podział poszczególnych komórek obserwowano podczas tworzenia mikrokolonii. Gdy obrazy były rejestrowane co pięć minut przez 24 godziny, możliwe było ilościowe określenie czasu podziału wynoszącego 235 plus minus 50 minut w rozdzielczości pojedynczej komórki. Aby zbadać, czy komórki rosną normalnie podczas śledzenia białek znakowanych yfp przez długi czas, śledzono komórki M.xanthus wykazujące ekspresję ParB-YFP.

ParB-YFP początkowo tworzył pojedynczy klaster w subpolarnym regionie komórki. Na krótko przed lub po podziale komórki klaster duplikował się, przy czym jedno skupisko pozostało na starym biegunie komórki, a drugie translokowało się na nowy biegun komórki. W tym eksperymencie nieruchliwe komórki wykazujące ekspresję FtsZ-gfp wykazały silną akumulację FtsZ-gfp w komórce środkowej, co dyktuje pozycję podziału komórki.

FtsZ-gfp utworzył klaster w komórce środkowej, głównie w dłuższych komórkach. Dwie godziny po podziale komórki FtsZ-gfp zgromadził się w komórce środkowej w komórkach potomnych. Po opanowaniu tej techniki można rutynowo stosować na Myxococcus xanthus, a także na każdej innej wolno rosnącej bakterii.

Podczas ustawiania tej procedury dla bakterii ważne jest, aby dostosować skład pożywki wzrostowej na płytce agarowej, aby spełnić specyficzne wymagania wzrostu tej bakterii. W przypadku każdej bakterii ważne jest określenie optymalnych warunków obrazowania, takich jak czas ekspozycji, natężenie światła i częstotliwość obrazowania, aby uniknąć fototoksyczności. Ponadto, w przypadku każdego białka znakowanego fluorescencyjnie, warunki obrazowania muszą być dostosowane, aby uniknąć fototoksyczności, a także fotowybielania.