Name: Fluorescencyjne obrazowanie żywych komórek pełnego wegetatywnego cyklu komórkowego wolno rosnącej bakterii społecznej Myxococcus xanthus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Poznaj metodę fluorescencyjnego obrazowania żywych komórek bakterii Myxococcus xanthus w celu badania podziału komórkowego i segregacji chromosomów. Technika umożliwia obserwację przez ponad 24 godziny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Niemiecką Radę ds. Badań Naukowych (DFG) w ramach Transregio 174 "Czasoprzestrzenna dynamika komórek bakteryjnych" oraz Towarzystwo Maxa Plancka.

1. Przygotowanie i wzrost szczepów M. xanthus
Uwaga: Zobacz Tabelę 1 i Tabelę 2.
<ol>
	<li>Przygotuj 1% bulion casitone (CTT) pożywkę wzrostową 1% (w/v) trawienie trzustkowe kazeiny (np. Bacto casitone), 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM KH2PO4 pH 7,6, 8 mM MgSO422, uzupełnione kanamycyną (50 μg/ml) lub oksytetracykliną (10 μg/ml). Dodaj gentamycynę (10 μg/ml) do wszystkich pożywek, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia innymi bakteriami, ponieważ komórki M. xanthus są na nią naturalnie odporne.</li>
	<li>Zaszczepić 5 ml 1% CTT zawierającego odpowiedni antybiotyk (antybiotyki) pojedynczą świeżo wyhodowaną kolonią typu dzikiego (WT) DK1622 23, SA4420 (ΔmglA)24, SA4797 (ΔmglA, ΔpomX/PpomZ mCherry-pomX)16, SA8241 (ΔmglA, ftsZ+/PnatftsZ-gfp), lub SA4749 (ΔmglA, parB+/ PnatparB-yfp) rano dnia 1.
	<ol>
		<li>Zawiesić pojedynczą kolonię M. xanthus w 500 μl 1% CTT uzupełnionego antybiotykami w sterylnej probówce i przenieść całą zawiesinę do 50 ml kolby Erlenmeyera zawierającej 5 ml 1% CTT. 
		UWAGA: Użyć kolby Erlenmeyera o 10-krotnie większej objętości niż kultura, aby zagwarantować wystarczające napowietrzenie i optymalny wzrost.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodować komórki przez osiem pokoleń (około 40 - 48 godzin z czasem generacji 4 - 6 godzin) w temperaturze 32 °C, wytrząsając z prędkością 220 obr./min, w ciemności. Utrzymuj komórki w fazie wzrostu wykładniczego (OD550 <1.2) i zapobiegaj ich osiągnięciu fazy stacjonarnej. W razie potrzeby rozcieńczyć komórki w świeżej pożywce 1% CTT zawierającej odpowiedni antybiotyk (antybiotyki) do OD550 0,1 - 0,2, 
	UWAGA: Optymalna wartość OD550 dla mikroskopii jednokomórkowej wynosi 0,5 - 0,7. Przy tym OD550 na obrazie znajduje się wystarczająca liczba komórek, aby umożliwić kwantyfikację, a także analizę statystyczną parametrów komórkowych.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek mikroskopowych
Uwaga: Komórki, które mają być oglądane pod mikroskopem, są umieszczane na szkiełku nakrywkowym mikroskopu, a następnie przykrywane podkładką agarozową zawierającą składniki odżywcze. Szkiełko nakrywkowe jest przyklejone do plastikowej lub metalowej ramy, aby zapewnić mechaniczne podparcie. Przygotowując się do badania mikroskopowego, należy wcześniej przygotować dużą podkładkę z 1% agarozy/TPM/0,2% CTT, jak opisano w krokach 2.1 - 2.3. Prosimy również o zapoznanie się z tabelą materiałów, aby zapoznać się z konkretnymi użytymi tutaj produktami.
<ol>
	<li>Przygotować 500 ml buforu TPM (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM KH2PO4 pH 7,6, 8 mMMgSO4) i sterylizować w autoklawie lub filtrze za pomocą filtra butelkowego. 
	UWAGA: Sterylny bufor może być przechowywany przez kilka miesięcy w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować 1% roztwór do mikroskopii agarozowej zawierający 0,2% CTT (zmieszać 1 g agarozy z 80 ml buforu TPM i 20 ml 1% pożywki CTT). Podgrzej w kuchence mikrofalowej, aż agaroza się stopi. 
	UWAGA: 0,2% CTT jest wystarczające, aby umożliwić komórkom wzrost i zapobiec głodowi. Wyższe stężenia CTT w podłożu mikroskopowym spowodują wysoką fluorescencję tła.</li>
	<li>Napełnij szalkę Petriego stopioną agarozą do grubości 0,5 cm (w przypadku kwadratowej szalki Petriego o wymiarach 11,5 cm x 11,5 cm wymagane jest około 60 ml stopionej agarozy) i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej. 
	UWAGA: Podkładka agarozowa może być przechowywana w temperaturze 4 °C w wilgotnym środowisku do 2 dni.
	<ol>
		<li>Przed użyciem podgrzej wkładkę 1% agarozy/TPM/0,2% CTT w temperaturze 32 °C przez co najmniej 15 minut. 
		UWAGA: Aby przygotować komórki do mikroskopii, wykonaj kroki 2.4 - 2.8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść sterylne szklane szkiełko nakrywkowe (60 mm x 22 mm, grubość: 0,7 mm) na plastikowej lub metalowej ramie z otworem pośrodku (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A); ta ramka służy jako mechaniczne podparcie dla cienkiego szkiełka nakrywkowego i pomaga zmniejszyć dryft podczas mikroskopii. Przymocuj szkiełko nakrywkowe do ramy za pomocą taśmy.
	<ol>
		<li>Aby przygotować ramkę, wytnij ramkę o wymiarach 75 mm × 25 mm z metalowej płytki o grubości 1 mm, a następnie wytnij otwór o odpowiedniej wielkości (20 mm × 30 mm w tym eksperymencie) pośrodku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 10 - 20 μl wykładniczo rosnących komórek M. xanthus na szkiełko nakrywkowe.</li>
	<li>Dodaj fluorescencyjne mikrosfery 0,5 μm jako markery odniesienia do komórek, aby uprościć śledzenie komórek lub białek w nagraniach poklatkowych.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć mikrosfery w stosunku 1:100 w buforze TPM i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do kilku miesięcy. Przed użyciem dokładnie wstrząsnąć i dodać do komórek 5 - 10 μl rozcieńczonych mikrosfer. 
		UWAGA: Tutaj użyto mikrosfer, które są fluorescencyjne we wszystkich popularnych niebieskich, zielonych, żółtych i czerwonych kanałach fluorescencyjnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytnij małą podkładkę o rozmiarze zbliżonym do szkiełka nakrywkowego dużej, wstępnie podgrzanej podkładki 1% agarozy/TPM/0,2% CTT i umieść ją na wierzchu komórek (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). Umieść szkiełko nakrywkowe na podkładce agarozowej 1% agarozy/TPM/0,2% CTT, aby zapobiec parowaniu i utrzymać komórki w wilgotnym środowisku. 
	UWAGA: Samo szkiełko nakrywkowe zapobiegnie znacznemu parowaniu przez co najmniej 2 godziny. W przypadku dłuższych nagrań poklatkowych, podkładkę 1% agarozy/TPM/0,2% CTT i szkiełko nakrywkowe należy uszczelnić folią parafinową, aby zapobiec parowaniu.</li>
	<li>Inkubować próbkę mikroskopową w temperaturze 32 °C przez 15-20 minut, aby komórki mogły przyczepić się do dna podkładki agarozowej. Następnie rozpocznij nagrania z mikroskopii poklatkowej.</li>
</ol>
3. Konfiguracja mikroskopu i akwizycja poklatkowa
Uwaga: Opisany tutaj protokół został opracowany dla odwróconego mikroskopu szerokokątnego z autofokusem, obiektywu 100X/1.30 NA oil PH3, zmotoryzowanego stolika X, Y, kamery sCMOS, źródła światła, filtrów dla białek zielono-fluorescencyjnych, czerwonych lub żółto-fluorescencyjnych oraz komory inkubacyjnej o kontrolowanej temperaturze. Komora ta chroni komórki przed światłem i utrzymuje stałą temperaturę.
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem mikroskopii podgrzać komorę inkubacyjną i mikroskop do temperatury 32 °C przez ~1 - 2 godziny. 
	UWAGA: W zależności od konfiguracji mikroskopu nagrzewanie może potrwać dłużej. Wstępne podgrzewanie jest niezbędne do zmniejszenia dryftu i stabilizuje system sterowania autofokusem.</li>
	<li>Włącz mikroskop i uruchom oprogramowanie sterujące mikroskopem. Wybierz odpowiedni obiektyw oraz odpowiednie lustra i filtry, aby uzyskać obrazy kontrastu fazowego, a także obrazy białek zielono-fluorescencyjnych, czerwonych lub żółtych fluorescencyjnych. 
	UWAGA: Mikroskop jest zwykle dostarczany z preferowanym oprogramowaniem do sterowania mikroskopem i akwizycji obrazu. W tym przypadku wykorzystano dostępne na rynku oprogramowanie (patrz tabela materiałów) do sterowania mikroskopem i akwizycji obrazu.</li>
	<li>Dodać kroplę wysokiej jakości olejku immersyjnego na soczewkę obiektywu i na dno próbki wstępnie inkubowanej w temperaturze 32 °C. Umieścić obiektyw w najniższym możliwym położeniu Z, aby uniknąć uszkodzenia soczewki obiektywu, gdy próbka jest umieszczana na stoliku mikroskopu. Umieść metalową ramkę z próbką na stoliku mikroskopu i "stroną z otworem" w kierunku obiektywu. Bezpiecznie zamocuj próbkę w uchwycie stolika.</li>
	<li>Skoncentruj się na komórkach, przesuwając stolik w kierunku Z bliżej celu. Przesuwaj stolik wolniej, gdy olej spadnie na dolną stronę próbki, a soczewka obiektywu zetknie się. Przesuwaj stół montażowy w kierunku X/Y, aż w obszarze widzenia będzie widocznych wiele pojedynczych komórek, gdy komórki znajdują się w płaszczyźnie ogniskowej. Upewnij się, że w obszarze view znajduje się co najmniej jedna mikrosfera fluorescencyjna, aby później wyrównać uzyskane obrazy. 
	UWAGA: W optymalnych warunkach powinna zostać osiągnięta gęstość komórek 15 - 30 komórek na region widzenia (2,048 x 2,048 piksela lub 133,1 x 133,1 μm).</li>
	<li>Otwórz kreatora Akwizycji wielowymiarowej w oprogramowaniu sterującym mikroskopem, aby skonfigurować eksperyment poklatkowy, który umożliwia mikroskopowi rejestrowanie obrazów na wielu długościach fal i pozycjach stolika, jeśli jest to wymagane.
	<ol>
		<li>W zakładce Main aktywuj Timelapse i Multiple Wavelengths. Dodatkowe zakładki pojawią się po lewej stronie okna.</li>
		<li>Kliknij kartę Zapisywanie i wybierz Katalog, aby wybrać pusty folder na dysku twardym komputera, aby zapisać pozyskane obrazy. Aktywuj nazwę podstawową przyrostu, jeśli plik istnieje, aby upewnić się, że kolejne zestawy danych nie zastępują wcześniejszych. Następnie nadaj eksperymentowi nazwę z datą i nazwą szczepu lub tytułem eksperymentu.</li>
		<li>Kliknij zakładkę Timelapse, aby dostosować parametry time-lapse. Ustaw Czas trwania na 24 godziny i ustaw Interwał czasu na 20 minut. Liczba punktów czasowych zmieni się automatycznie. 
		UWAGA: Optymalny przedział czasowy zależy od eksperymentu i funkcji komórkowej, która ma być analizowana. Częste pozyskiwanie obrazu może powodować fotowybielanie. W związku z tym należy empirycznie znaleźć kompromis między rozdzielczością czasową a fotowybielaniem. Przy czasie podwajania wynoszącym 4 - 6 godzin można łatwo uzyskać obrazy w odstępach 5 minut (lub nawet w mniejszych odstępach czasu, jeśli jest to pożądane) w celu mikroskopii z kontrastem fazowym. Jeśli pożądana jest mikroskopia fluorescencyjna w czasie 24 godzin, obrazy powinny być rejestrowane w odstępie około 15 - 30 minut.</li>
		<li>Kliknij zakładkę Długości fal. Wybierz liczbę długości fal, które mają być uzyskiwane dla każdego obrazu w każdym punkcie czasowym, zmieniając liczbę. 
		UWAGA: Dla każdej długości fali pojawi się nowa zakładka po lewej stronie kreatora "Akwizycja wielowymiarowa", a długości fal zostaną uzyskane w kolejności od góry do dołu. Dla każdej długości fali ustawienia akwizycji można modyfikować osobno.</li>
		<li>Kliknij pierwszą kartę długości fali od góry. Wybierz opcję Kontrast fazowy z listy rozwijanej Iluminacja. Wybierz 100 ms dla opcji Ekspozycja i wybierz opcję Every Time Point (Każdy punkt czasowy) z listy rozwijanej Acquire (Pobierz). Wyłącz opcję Automatyczne naświetlanie, wybierając opcję Nigdy z listy rozwijanej.</li>
		<li>Powtórz krok 3.5.5 dla każdej długości fali, która ma być uzyskana w każdym punkcie czasowym. Dla opisanej tutaj konfiguracji eksperymentalnej i białek znakowanych fluorescencyjnie należy użyć następujących parametrów dla ekspozycji: 250 ms dla białek fuzyjnych mCherry, 200 ms dla białek fuzyjnych YFP i 1,000 ms dla białek fuzyjnych GFP. 
		UWAGA: Optymalne ustawienia oświetlenia dla każdego szczepu i białka fluorescencyjnego należy określić z wyprzedzeniem, zmieniając intensywność lampy i czas akwizycji obrazu dla każdej długości fali. Zbyt długi czas akwizycji obrazu zwiększy efekt fototoksyczny i ostatecznie doprowadzi do zatrzymania wzrostu i śmierci komórki. W związku z tym należy osiągnąć kompromis między jakością obrazu a żywotnością komórek.</li>
		<li>Pobieraj obrazy z wielu pozycji etapu, aby zwiększyć liczbę komórek zarejestrowanych w tym samym eksperymencie.
		<ol>
			<li>Aby uzyskać obrazy z wielu pozycji stołu montażowego, aktywuj opcję Wiele pozycji stołu montażowego na karcie Główna. Następnie kliknij kartę Scena i kliknij przycisk Na żywo, aby spojrzeć na pole widzenia.</li>
			<li>Przesuwaj stolik w kierunku X/Y, aż obszar zainteresowania (ROI) znajdzie się w polu view. Zapisz współrzędne X i Y, klikając "+" w zakładce Etap. Ponownie przesuń stolik w kierunku X/Y, aż zostanie znaleziony nowy zwrot z inwestycji, a następnie ponownie zapisz współrzędne, klikając przycisk "+". Kontynuuj, aż zostanie zapisana żądana liczba regionów. 
			UWAGA: W przypadku akwizycji obrazu fluorescencyjnego upewnij się, że obszary zainteresowania (ROI) nie znajdują się zbyt blisko siebie, aby zminimalizować fototoksyczność.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprawdź jeszcze raz, czy komórki są ostre, klikając różne zapisane pozycje X i Y, a następnie uruchom sprzętowy autofokus, klikając AFC hold, aby utrzymać zapisaną pozycję Z na stałym poziomie w trakcie eksperymentu.</li>
	<li>Rozpocznij nagrania poklatkowe w oprogramowaniu sterującym mikroskopem, klikając przycisk Acquire (Akwizycja) w kreatorze Multi-Dimensional Acquisition (Akwizycja wielowymiarowa). 
	UWAGA: Dla każdej uzyskanej długości fali pojawi się jedno okno i pojawi się dodatkowe okno, które pokazuje liczbę uzyskanych punktów czasowych i czas do następnej akwizycji obrazu.</li>
	<li>Sprawdź, czy komórki są nadal ostre po pierwszych kilku punktach czasowych w nagraniach poklatkowych, aby zmaksymalizować jakość obrazów i w razie potrzeby ponownie ustawić ostrość.</li>
</ol>
4. Generowanie filmów poklatkowych i wyrównanie obrazu
Uwaga: Dostępnych jest kilka komercyjnych i darmowych pakietów oprogramowania do akwizycji i analizy obrazów. Korzystamy z dostępnego na rynku oprogramowania (patrz tabela materiałów) z wieloma preinstalowanymi wtyczkami i dodatkowymi narzędziami.
<ol>
	<li>Zapisz poszczególne obrazy z nagrań poklatkowych na komputerze z zainstalowanym oprogramowaniem do analizy/przetwarzania obrazu.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie i otwórz obrazy jako stos, klikając Przejrzyj dane wielowymiarowe | Wybierz punkt menu Plik podstawowy | Wybierz pozycję Katalog. Otwórz folder z danymi wielowymiarowymi. Sprawdź zestaw danych i kliknij przycisk Widok; Zestaw danych będzie wyświetlany jako pojedyncze obrazy od pierwszego punktu czasu do końca. Aktywuj długość fali (w celu utworzenia stosu), zaznacz wszystkie obrazy, które powinny znaleźć się w stosie i kliknij Załaduj obraz(y). Powtórz ten krok dla wszystkich długości fal i zapisz ukończone stosy.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Otwórz wszystkie obrazy wymagane do filmu za pomocą punktu menu Plik | otwarty. 
	UWAGA: Zaleca się otwieranie obrazów za pomocą jednej uzyskanej długości fali na raz, aby nie spowalniać komputera, jeśli moc obliczeniowa jest ograniczona. Jeśli pewne części nagrań poklatkowych, np. początek, koniec lub kilka punktów czasowych zostaną pominięte, można to dostosować w ukończonym filmie.</li>
	<li>Aktywuj stos obrazów, który musi zostać skorygowany pod kątem dryfu. Otwórz narzędzie do wyrównywania za pomocą aplikacji | Automatyczne wyrównywanie.... Zaznacz opcję Stos jako źródło obrazów i pierwszą płaszczyznę/punkt czasowy jako płaszczyznę odniesienia. Zaznacz stos za pomocą przycisku Stos źródłowy i kliknij przycisk Zastosuj. 
	UWAGA: Automatyczne wyrównanie zajmie trochę czasu i mocy obliczeniowej, ale jest dobrym sposobem na skorygowanie dużych stosów pod kątem dryfu konfiguracji mikroskopu. To automatyczne wyrównanie działa dobrze, jeśli uwzględnione są mikrosfery, ale może również działać bez nich.</li>
	<li>Zapisz wyrównany stos.</li>
	<li>Użyj ROIs. 
	UWAGA: Fluorescencyjna mikroskopia poklatkowa z łatwością tworzy duże zestawy plików danych, które zajmują dużo mocy obliczeniowej i spowalniają dalsze przetwarzanie tych filmów. Dlatego zdecydowanie zalecamy zidentyfikowanie ROI i odizolowanie komórek do pracy z mniejszymi plikami.
	<ol>
		<li>Wybierz narzędzie Region prostokątny. Utwórz ROI wokół interesujących komórek, ręcznie rysując ROI na obrazie kontrastu fazowego. Upewnij się, że interesujące komórki są widoczne i ostre przez cały czas trwania filmu poklatkowego.</li>
		<li>Otwórz film poklatkowy drugiej długości fali tego samego zestawu danych. Aby przenieść ROI z obrazów kontrastu fazowego na obrazy fluorescencyjne drugiej długości fali, użyj narzędzia Transferuj regiony za pomocą opcji Regiony | Regiony transferowe. Wybierz zestaw danych kontrastu fazowego jako obraz źródłowy, a drugi zestaw danych długości fali jako obraz docelowy. Wybierz Wszystkie regiony i naciśnij OK.</li>
		<li>Powtórz krok 4.6.2 dla każdej długości fali uzyskanej dla tego samego zestawu danych.</li>
		<li>Wybierz ROI i zduplikuj go jako stos za pomocą punktu menu Edytuj | Duplikat | Stos... lub naciśnij Shift + Ctrl + D. Następnie zapisz zduplikowany stos za pomocą punktu menu Plik | Zapisz w tym samym folderze, w którym znajdują się oryginalne dane.</li>
		<li>Powtórz krok 4.6.4 dla każdego zwrotu z inwestycji dla każdej długości fali uzyskanej dla tego samego zestawu danych</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby wygenerować film w formatach MOV lub AVI, otwórz funkcję Make Movie za pomocą Stack | Zrób film. Wybierz nagrania poklatkowe za pomocą przycisku Stos źródłowy. Wybierz format wyjściowy, liczbę klatek na sekundę, liczbę klatek i kliknij przycisk Zapisz.</li>
</ol>

<ol><li>Shapiro, L., McAdams, H. H., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+and+how+bacteria+localize+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Why and how bacteria localize proteins.</a> Science. 326 (5957), 1225-1228 (2009).</li>
<li>Treuner-Lange, A., Søgaard-Andersen, L. <a target="_blank" href="http://jcb.rupress.org/content/206/1/7">Regulation of cell polarity in bacteria.</a> J Cell Biol. 206 (1), 7-17 (2014).</li>
<li>Laloux, G., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+PopZ+localization+through+cell+cycle-coupled+multimerization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of PopZ localization through cell cycle-coupled multimerization.</a> J Cell Biol. 201, 827-841 (2013).</li>
<li>Rudner, D. Z., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+subcellular+localization+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Perspect.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein subcellular localization in bacteria.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2 (4), 000307(2010).</li>
<li>Badrinarayanan, A., Le, T. B. K., Laub, M. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26566111">Bacterial chromosome organization and segregation.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 31 (1), 171-199 (2015).</li>
<li>Munoz-Dorado, J., Marcos-Torres, F. J., Garcia-Bravo, E., Moraleda-Munoz, A., Perez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myxobacteria%3A+Moving%2C+Killing%2C+Feeding%2C+and+Surviving+Together%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Myxobacteria: Moving, Killing, Feeding, and Surviving Together.</a> Front Microbiol. 7, 781(2016).</li>
<li>Berleman, J. E., Kirby, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+hunting+strategy+of+a+bacterial+wolfpack%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Deciphering the hunting strategy of a bacterial wolfpack.</a> FEMS Microbiol Rev. 33 (5), 942-957 (2009).</li>
<li>Konovalova, A., Petters, T., Søgaard-Andersen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+biology+of+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Extracellular biology of Myxococcus xanthus.</a> FEMS Microbiol. Rev. 34, 89-106 (2010).</li>
<li>Nudleman, E., Wall, D., Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+transfer+of+bacterial+outer+membrane+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell transfer of bacterial outer membrane lipoproteins.</a> Science. 309, 125-127 (2005).</li>
<li>Vassallo, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+polymorphic+toxins+delivered+by+outer+membrane+exchange+discriminate+kin+in+myxobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Infectious polymorphic toxins delivered by outer membrane exchange discriminate kin in myxobacteria.</a> eLife. 6, 29397(2017).</li>
<li>Vassallo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+rejuvenation+and+social+behaviors+promoted+by+LPS+exchange+in+myxobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Cell rejuvenation and social behaviors promoted by LPS exchange in myxobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (22), 2939-2946 (2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+polysaccharides+mediate+pilus+retraction+during+social+motility+of+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Extracellular polysaccharides mediate pilus retraction during social motility of Myxococcus xanthus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 5443-5448 (2003).</li>
<li>Kim, S. K., Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+alignment+required+in+differentiation+of+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell alignment required in differentiation of Myxococcus xanthus.</a> Science. 249, 926-928 (1990).</li>
<li>Lobedanz, S., Søgaard-Andersen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+C-signal%2C+a+contact+dependent+morphogen+coordinating+multiple+developmental+responses+in+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Identification of the C-signal, a contact dependent morphogen coordinating multiple developmental responses in Myxococcus xanthus.</a> Genes Dev. 17, 2151-2161 (2003).</li>
<li>Schumacher, D., Søgaard-Andersen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cell+polarity+in+motility+and+cell+division+in+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of cell polarity in motility and cell division in Myxococcus xanthus.</a> Annu Rev Microbiol. 71 (1), 61-78 (2017).</li>
<li>Schumacher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PomXYZ+proteins+self-organize+on+the+bacterial+nucleoid+to+stimulate+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The PomXYZ proteins self-organize on the bacterial nucleoid to stimulate cell division.</a> Dev Cell. 41 (3), 299-314 (2017).</li>
<li>Treuner-Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PomZ%2C+a+ParA-like+protein%2C+regulates+Z-ring+formation+and+cell+division+in+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">PomZ, a ParA-like protein, regulates Z-ring formation and cell division in Myxococcus xanthus.</a> Mol Microbiol. 87 (2), 235-253 (2013).</li>
<li>Iniesta, A. A., Garcia-Heras, F., Abellon-Ruiz, J., Gallego-Garcia, A., Elias-Arnanz, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22923595">Two systems for conditional gene expression in Myxococcus xanthus inducible by isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside or vanillate.</a> J Bacteriol. 194 (21), 5875-5885 (2012).</li>
<li>Harms, A., Treuner-Lange, A., Schumacher, D., Søgaard-Andersen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+of+chromosome+and+replisome+dynamics+in+Myxococcus+xanthus.+reveals+a+novel+chromosome+arrangement%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Tracking of chromosome and replisome dynamics in Myxococcus xanthus. reveals a novel chromosome arrangement.</a> PLoS Genet. 9 (9), 1003802(2013).</li>
<li>Iniesta, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ParABS+system+in+chromosome+partitioning+in+the+bacterium+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">ParABS system in chromosome partitioning in the bacterium Myxococcus xanthus.</a> PLoS One. 9 (1), 86897(2014).</li>
<li>Lin, L., Osorio Valeriano, M., Harms, A., Søgaard-Andersen, L., Thanbichler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bactofilin-mediated+organization+of+the+ParABS+chromosome+segregation+system+in+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Bactofilin-mediated organization of the ParABS chromosome segregation system in Myxococcus xanthus.</a> Nat Commun. 8 (1), 1817(2017).</li>
<li>Hodgkin, J., Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+stimulation+of+movement+in+nonmotile+mutants+of+Myxococcus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell stimulation of movement in nonmotile mutants of Myxococcus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (7), 2938-2942 (1977).</li>
<li>Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+gliding+is+correlated+with+the+presence+of+pili+in+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Social gliding is correlated with the presence of pili in Myxococcus xanthus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 76 (11), 5952-5956 (1979).</li>
<li>Miertzschke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+the+Ras-like+G+protein+MglA+and+its+cognate+GAP+MglB+and+implications+for+bacterial+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of the Ras-like G protein MglA and its cognate GAP MglB and implications for bacterial polarity.</a> EMBO J. 30 (20), 4185-4197 (2011).</li>
<li>Hodgkin, J., Kaiser, D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00270004">Genetics of gliding motility in Myxococcus xanthus. (Myxobacterales): Two gene systems control movement.</a> Mol Gen Genet. 171, 177-191 (1979).</li>
<li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+and+experimental+analysis+of+proteins+of+two-component+systems+in+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics and experimental analysis of proteins of two-component systems in Myxococcus xanthus.</a> J Bacteriol. 190 (2), 613-624 (2008).</li>
<li>Bi, E. F., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsZ+ring+structure+associated+with+division+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli.</a> Nature. 354 (6349), 161-164 (1991).</li>
<li>Lutkenhaus, J., Pichoff, S., Du, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cytokinesis%3A+From+Z+ring+to+divisome%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Bacterial cytokinesis: From Z ring to divisome.</a> Cytoskeleton. 69 (10), 778-790 (2012).</li>
<li>McLoon, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MglC%2C+a+Paralog+of+Myxococcus+xanthus+GTPase-Activating+Protein+MglB%2C+Plays+a+Divergent+Role+in+Motility+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">MglC, a Paralog of Myxococcus xanthus GTPase-Activating Protein MglB, Plays a Divergent Role in Motility Regulation.</a> J Bacteriol. 198 (3), 510-520 (2015).</li>
<li>Gomez-Santos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+set+of+integrative+plasmid+vectors+for+copper-inducible+gene+expression+in+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive set of integrative plasmid vectors for copper-inducible gene expression in Myxococcus xanthus.</a> Appl Environ Microbiol. 78 (8), 2515-2521 (2012).</li>
<li>Treuner-Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small+G-protein+MglA+connects+to+the+MreB+actin+cytoskeleton+at+bacterial+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The small G-protein MglA connects to the MreB actin cytoskeleton at bacterial focal adhesions.</a> J Cell Biol. 210 (2), 243-256 (2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Fluorescencyjne obrazowanie żywych komórek stało się potężnym narzędziem do badania czasoprzestrzennej dynamiki komórek bakteryjnych. Poklatkowa mikroskopia fluorescencyjna ruchliwych i wolno rosnących bakterii, takich jak M. xanthus, była jednak wyzwaniem i była wykonywana tylko przez krótki czas. W tym miejscu przedstawiamy łatwą w użyciu i solidną metodę obrazowania żywych komórek M. xanthus za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej. Ta metoda pozwala użytkownikowi śledzić komórki i znakowane fluorescencyjnie białka przez kilka rund cyklu komórkowego z rozdzielczością pojedynczej komórki.
Istnieje kilka warunków wstępnych, które wpływają na powodzenie obrazowania żywych komórek wolno rosnących komórek M. xanthus , w tym: 1) solidna powierzchnia do przyczepiania komórek; 2) dostępność składników odżywczych i tlenu; 3) stała wilgotność i temperatura; oraz 4) optymalizacja warunków eksperymentalnych, takich jak czas ekspozycji i częstotliwość pozyskiwania obrazu.
W naszym eksperymentalnym zestawie używamy grubych płatków agarozowych uzupełnionych składnikami odżywczymi. Używanie grubych płatków agarozowych w przeciwieństwie do urządzeń mikroprzepływowych do śledzenia pojedynczych komórek ma pewne podstawowe zalety, ale także pewne wady. Po pierwsze, podkładka agarozowa nie tylko zapewnia powierzchnię do przyczepiania się i ruchu komórek M. xanthus, ale także wystarczającą ilość składników odżywczych do wzrostu przez co najmniej 24 godziny. Po drugie, analizy snap shot powszechnie stosowane do badania wewnątrzkomórkowej lokalizacji białek znakowanych fluorescencyjnie przeprowadzono wcześniej na tym samym typie płatków agarozowych 16,17,29. W związku z tym dane z analiz typu snap shot mogą być bezpośrednio porównywane z danymi uzyskanymi za pomocą opisanej tutaj metody. Po trzecie, płatki agarozowe można łatwo modyfikować i uzupełniać antybiotykami lub innymi suplementami, takimi jakCuSO4 i wanilinian, które są powszechnie stosowane do indukcji ekspresji genów18,30. Wreszcie, ponieważ komórki mogą tworzyć mikrokolonie w trakcie eksperymentu, ta konfiguracja pozwala również na badanie wpływu bezpośrednich interakcji komórka-komórka na konkretny analizowany parametr. Ten aspekt jest szczególnie ważny w przypadku M. xanthus, ponieważ bakteria ta wykazuje kilka interakcji zależnych od kontaktu. Główną wadą tej metody jest to, że warunki eksperymentu są ustawione na czas trwania eksperymentu. Z kolei urządzenia mikroprzepływowe na ogół pozwalają na zmianę warunków doświadczalnych w trakcie eksperymentu poprzez dodanie na przykład antybiotyków31.
Dostępne są darmowe pakiety oprogramowania (np. MicrobeJ, Oufti) do automatycznej analizy wzrostu pojedynczych komórek i lokalizacji białek w poszczególnych komórkach. Jednak oprogramowanie to doskonale nadaje się tylko do analizy pojedynczych komórek lub małych grup komórek. W związku z tym wyzwaniem pozostaje automatyczna analiza danych generowanych dla opisywanych tu nagrań 24 h.
Podsumowując, opisaliśmy łatwy w użyciu i powtarzalny protokół do wykonywania obrazowania żywych komórek z wolno rosnącymi bakteriami M. xanthus . Pokazujemy, że proste płatki agarozowe uzupełnione składnikami odżywczymi są wystarczające do podtrzymania wzrostu przez co najmniej 24 godziny i pozwalają na obserwację i analizę lokalizacji i wzrostu białek z rozdzielczością pojedynczej komórki przez kilka pokoleń.

Komórki bakteryjne są przestrzennie wysoce zorganizowane, a wiele białek lokalizuje się asymetrycznie w przedziałach komórkowych1,2,3,4. Ta lokalizacja jest często bardzo dynamiczna i zmienia się w czasie w odpowiedzi na sygnały cyklu komórkowego lub sygnały zewnętrzne. Podobnie, chromosom bakteryjny jest przestrzennie wysoce zorganizowany, a poszczególne loci są umieszczane w określonych lokalizacjach subkomórkowych przed i w trakcie procesu segregacji5. Ta dynamiczna organizacja przestrzenna jest ważna dla wzrostu, podziału, regulacji cyklu komórkowego, różnicowania, ruchliwości, transdukcji sygnału, a także organizacji i segregacji chromosomów; W związku z tym wpływa zasadniczo na wszystkie aspekty funkcjonowania bakterii.
Czasoprzestrzenna dynamika tych procesów komórkowych jest analizowana w różnych gatunkach bakterii, przy czym Escherichia coli, Bacillus subtilis, Vibrio cholerae i Caulobacter crescentus służą jako ważne organizmy modelowe. Jednak te cztery gatunki obejmują tylko niewielkie spektrum ogromnej różnorodności bakteryjnej i, co może nie być zaskakujące, biorąc pod uwagę duży dystans filogenetyczny między tymi gatunkami, organizacja komórkowa i mechanizmy polaryzacji są różne u tych bakterii. Rodzi to potrzebę zbadania dodatkowych gatunków bakterii, aby móc ostatecznie wyodrębnić ogólne zasady leżące u podstaw czasoprzestrzennej dynamiki komórek bakteryjnych.
Gram-ujemny delta-proteobacterium M. xanthus jest organizmem modelowym w badaniu zachowań społecznych i współpracy u bakterii6. M. xanthus jest ścisłą tlenowcem i w obecności składników odżywczych tworzy kolonie, w których komórki rozprzestrzeniają się na zewnątrz w wysoce skoordynowany, rojowy sposób i żerują na innych mikroorganizmach7. W odpowiedzi na głód składników odżywczych komórki inicjują program rozwojowy, który powoduje powstanie owocników, które składają się z tysięcy komórek, a wewnątrz których ruchliwe komórki w kształcie pręcików różnicują się w sferyczne diploidalne zarodniki8. Oba rodzaje zachowań, tj. rój i tworzenie owocników, są wykonywane tylko przez komórki, które są umieszczone na twardej powierzchni. Co więcej, w obu warunkach odżywczych komórki angażują się w procesy, które obejmują bezpośrednie kontakty komórka-komórka, w tym wymianę lipoprotein błony zewnętrznej, które mogą stymulować ruchliwość lub funkcjonować jako toksyny w biorcy9,10, wymiana LPS11, stymulacja ruchliwości przez egzopolisacharydy na sąsiednich komórkach12oraz sygnalizacja międzykomórkowa za pomocą białka sygnalizacyjnego zakotwiczonego powierzchniowo w komórce13,14.
Ostatnio M. xanthus stał się również organizmem modelowym do badania mechanizmów leżących u podstaw ruchliwości i jej regulacji15, podział komórek16,17,18, oraz organizacja chromosomów19,20,21. Krytyczne etapy cyklu komórkowego M. xanthus zostały szczegółowo przeanalizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu obrazów snap-shot lub krótkich nagrań poklatkowych na szczepach zawierających odpowiednie białka znakowane fluorescencyjnie16,17,18,19,20. Idealnie byłoby, gdyby wiele komórek było obserwowanych z rozdzielczością pojedynczej komórki za pomocą fluorescencyjnego obrazowania żywych komórek przez co najmniej jeden pełny cykl komórkowy, aby uzyskać wiarygodne dane ilościowe dotyczące parametrów cyklu komórkowego. Jest to jednak wyzwanie w przypadku M. xanthus ze względu na jego stosunkowo długi czas wytwarzania wynoszący 4 - 6 godzin w standardowych warunkach laboratoryjnych oraz ze względu na fotowybielanie fluoroforów i fototoksyczność podczas akwizycji obrazu.
Tutaj opisujemy protokół obserwacji komórek M. xanthus z rozdzielczością pojedynczej komórki poprzez fluorescencyjne obrazowanie żywych komórek przez co najmniej 24 godziny i obejmujące kilka cykli komórkowych. Co ważne, podczas całego protokołu komórki są utrzymywane na podkładce agarowej i w bliskim kontakcie, co pozwala na czynności zależne od kontaktu, niezbędne dla społecznego stylu życia M. xanthus. Protokół pozwala również użytkownikom monitorować kształt, rozmiar, podziały i sondy fluorescencyjne w wysokiej rozdzielczości czasowej i z rozdzielczością pojedynczej komórki, a tym samym umożliwia ilościowe określanie zmienności między komórkami i korelacji zdarzeń cyklu komórkowego.

<table><tbody><tr><td>DMI6000B z AFC</td><td>Leica microsystems</td><td>11888945</td><td>Automatyczny odwrócony mikroskop fluorescencyjny szerokokątny z adaptacyjną kontrolą ostrości</td></tr><tr><td>Uniwersalna rama montażowa</td><td>11532338 Leica microsystems</td><td></td><td>Uchwyt stolika dla różnych rozmiarów próbek&nbsp;</td></tr><tr><td>Olej HCX PL FLUOTAR 100x/1.30 PH3</td><td>Leica microsystems</td><td>11506197</td><td>Obiektyw z kontrastem fazowym</td></tr><tr><td>Kamera Orca Flash 4.0</td><td>Hamamatsu</td><td>11532952</td><td>4,0 megapikselowa kamera sCMOS do akwizycji zdjęć</td></tr><tr><td>Zestaw filtrów TXR ET, k</td><td>Leica microsystems</td><td>11504170</td><td>Zestaw filtrów fluorescencyjnych, Ex: 560/40 Em: 645/75</td></tr><tr><td>Zestaw filtrów L5 ET, k</td><td>Leica microsystems</td><td>11504166</td><td>Zestaw filtrów fluorescencyjnych, Ex: 480/40 Em: 527/30</td></tr><tr><td>Zestaw filtrów YFP ET, k</td> Zestaw filtrów fluorescencyjnych <td>Leica microsystems</td><td>11504165</td><td>, Ex: 500/20 Em: 535/30</td></tr><tr><td>ProScan III&nbsp;</td><td>Wcześniejszy</td><td>H117N1, V31XYZEF, PS3J100</td><td>Sterownik automatyki mikroskopu z interaktywnym centrum sterowania</td></tr><tr><td>Źródło światła EL 6000</td><td>Leica microsystems</td><td>11504115</td><td>Zewnętrzne fluorescencyjne źródło światła</td></tr><tr><td>Inkubator BLX Black</td><td>Pecon</td><td>11532830</td><td>komora inkubacyjna otaczająca mikroskop</td></tr><tr><td>Tempcontrol 37-2 cyfrowe</td><td>11521719</td><td></td> <td>mikrosystemów LeicaAutomatyczna kontrola temperatury w komorze inkubacyjnej</td></tr><tr><td>Siarczan gentmycyny</td><td>Carl Roth</td><td>0233.4</td><td>Gentamycyna</td></tr><tr><td>Oksytetracylina dihydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>201-212-8</td><td>Oxytetracyklina</td></tr><tr><td>Siarczan kanamycyny</td><td>Carl Roth</td><td>T832.3</td><td>Kanamycin</td></tr><tr><td>Filtropur BT25 0,2 filtr butelkowy</td><td>Sarstedt</td><td>831,822,101</td><td>Filtr butelkowy do sterylizacji </td></tr><tr><td>Deckgl&auml; ser</td><td>VWR</td><td>630-1592</td><td>Szkiełko nakrywkowe szklane (60 x 22 mm, grubość: 0,7 mm)</td></tr><tr><td>Seakem LE agaroza</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td>Agaroza do szkiełek mikroskopowych</td></tr><tr><td>Leica Metamorph AF</td><td>Leica microsystems</td><td>11640901</td><td>Oprogramowanie sterujące mikroskopem i oprogramowanie do analizy obrazu</td></tr><tr><td>Tetraspeck Microsperes, 0,5 i mikro; </td><td>m ThermoFisher</td><td>T7281</td><td>Mikrosfery fluorescencyjne</td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Greiner Bio-one</td><td>688102</td><td>120 mm x 120 mm x 17 mm kwadratowa szalka Petriego do płatków agarozy</td></tr><tr><td>BD Bacto Casitone</td><td>Becton Dickinson</td><td>225930</td><td>Casitone</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>VWR</td><td>291-1213</td><td>Parafilm</td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)-aminometan</td><td>Carl Roth</td><td>AE15.2</td><td>Tris</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>Carl Roth</td><td>P027.2</td><td>Siarczan magnezu</td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu p.d.</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td>Diwodorofosforan potasu</td></tr> <tr><td>< mocny>1% Pożywka CTT: < / silna> 1 % (w/v) BD Bacto&; casitone, 10 mM Tris-HCl ph 8,0, 1 mM bufor fosforanu potasu pH 7,6, 8 mM MgSO4</td><td></td><td></td><td>Pożywka uprawowa dla M.xanthus</td></tr><tr><td>TPM bufor: 10 mM Tris-HCl ph 8,0, 1 mM bufor fosforanu potasu pH 7,6, 8 mM MgSO4</td><td></td><td></td><td>Bufor do przygotowania szkiełek mikroskopowych dla M.xanthus</td></tr></tbody></table>

fluorescencyjne obrazowanie żywych komórek pełnego wegetatywnego cyklu komórkowego wolno rosnącej bakterii społecznej myxococcus xanthus

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescencyjne obrazowanie żywych komórek bakteryjnych jest kluczową metodą w analizie przestrzennej i czasowej dynamiki białek i chromosomów leżących u podstaw wydarzeń centralnego cyklu komórkowego. Jednak obrazowanie tych cząsteczek w wolno rosnących bakteriach stanowi wyzwanie ze względu na fotowybielanie fluoroforów i fototoksyczność podczas akwizycji obrazu. W tym miejscu opisujemy prosty protokół pozwalający obejść te ograniczenia w przypadku Myxococcus xanthus (którego czas generacji wynosi 4 - 6 godzin). W tym celu komórki M. xanthus są hodowane na grubej, zawierającej składniki odżywcze podkładce agarowej w wilgotnym środowisku o kontrolowanej temperaturze. W tych warunkach określamy czas podwojenia poszczególnych komórek, śledząc wzrost pojedynczych komórek. Co więcej, kluczowe procesy komórkowe, takie jak segregacja chromosomów i podział komórek, można obrazować za pomocą fluorescencyjnego obrazowania żywych komórek komórek zawierających odpowiednie znakowane fluorescencyjnie białka markerowe, takie jak ParB-YFP, FtsZ-GFP i mCherry-PomX w wielu cyklach komórkowych. Następnie pozyskane obrazy są przetwarzane w celu wygenerowania montaży i/lub filmów.

M. xanthus to wolno rosnąca bakteria poruszająca się po powierzchniach stałych. Aby przetestować nasz układ eksperymentalny, przeprowadziliśmy eksperyment time-lapse z wykorzystaniem ruchomych komórek DK1622 WT. Obrazy w kontraście fazowym pozyskiwano w odstępach 5 min przez 24 h (Rysunek 2A, B). Większość komórek układała się w grupy. Zgodnie z oczekiwaniami, komórki wykazywały ruchliwość i przemieszczały się głównie w grupach. Zaobserwowaliśmy ponadto, że komórki sporadycznie zmieniały kierunek ruchu. Wyniki te sugerują, że komórki WT w badanych warunkach zachowują się prawidłowo pod względem ruchliwości. Jednak nawet przy rejestracji komórek co 5 min, identyfikacja pojedynczych komórek jest trudna. Co więcej, ze względu na ruchliwość komórek, wiele z nich opuszcza lub wchodzi w pole widzenia, co utrudnia śledzenie komórek przez dłuższe okresy.
Aby śledzić te same komórki M. xanthus przez kilka cykli komórkowych za pomocą obrazowania żywych komórek, w poszczególnych szczepach można usunąć gen mglA, który jest niezbędny do ruchu25. Zapobiega to przemieszczaniu się komórek poza pole widzenia podczas protokołu obrazowania. Delecje w ramce odczytu generuje się zgodnie z opisem Shi et al.26
Zgodnie z oczekiwaniami, w obrazowaniu żywych komórek w kontraście fazowym z zastosowaniem nieruchomych komórek ΔmglA (Rycina 3), komórki nie wykazywały aktywnego ruchu. Byliśmy w stanie śledzić wzrost i podział poszczególnych komórek podczas formowania się mikrokolonii. Na podstawie nagrań time-lapse, w których obrazy pozyskiwano w odstępach 5 min przez 24 h, możliwe było ilościowe określenie czasu między podziałami (czasu między dwoma zdarzeniami podziału komórki) z rozdzielczością pojedynczej komórki. Komórki mutanta ΔmglA charakteryzowały się czasem między podziałami wynoszącym 235 ± 50 min (n = 97 komórek). Przy wartości około 4 h, czas między podziałami jest zbliżony do czasu podwojenia mierzonego w kulturach zawiesinowych dla komórek WT. Stanowi to dowód na to, że komórki M. xanthus rosną optymalnie w tych warunkach eksperymentalnych.
Aby zbadać, czy nasza konfiguracja umożliwia normalny wzrost komórek przy jednoczesnym śledzeniu białek znakowanych YFP przez dłuższe okresy, przeprowadzono obrazowanie fluorescencyjne w trybie time-lapse z użyciem komórek M. xanthus wykazujących ekspresję białka z tagiem YFP. W tym celu śledzono ParB-YFP jako marker miejsca inicjacji replikacji (ori). ParB jest komponentem systemu ParABS w M. xanthus i wiąże się z sekwencjami parS znajdującymi się w pobliżu ori; dzięki temu można śledzić duplikację miejsca inicjacji oraz segregację chromosomów19,20,21. Przy akwizycji obrazów (kontrast fazowy i fluorescencja, czas akwizycji 200 ms w kanale YFP) co 20 min, komórki rosły, dzieliły się i wykazywały wzrost nawet po 24 h (Rysunek 4A). Na początku zapisów w większości komórek ParB-YFP tworzył dwa skupiska w regionach subpolarnych (Rysunek 4A). Krótko przed lub po podziale komórki, subpolarny skupiszek ParB-YFP przy starym biegunie komórki ulegał duplikacji. Jeden z dwóch skupisków pozostawał przy starym biegunie komórki, natomiast druga kopia przemieszczała się do nowego bieguna komórki, osiągając ostateczną pozycję subpolarną po około 40 - 60 min (Rysunek 4A, B). Obserwacje te są zgodne z wcześniejszymi danymi uzyskanymi z krótkich zapisów time-lapse z wykorzystaniem cienkich podkładek agarowych19. Wyciągamy wniosek, że ta konfiguracja eksperymentalna umożliwia wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej time-lapse do śledzenia segregacji chromosomów przez kilka cykli komórkowych w wolno rosnących komórkach M. xanthus, bez zaburzania wzrostu komórek lub mechanizmu segregacji chromosomów.
W podobnym eksperymencie dążyliśmy do śledzenia markerów podziału komórkowego za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej. Podobnie jak prawie wszystkie inne bakterie, M. xanthus wymaga do podziału komórkowego białka FtsZ, bakteryjnej GTPazy podobnej do tubuliny16,17,18. FtsZ tworzy w połowie komórki strukturę pierścieniową, tzw. pierścień Z, który pomaga w rekrutacji wszystkich pozostałych białek niezbędnych do podziału komórki27,28. U M. xanthus formowanie pierścionia Z oraz jego pozycjonowanie w połowie komórki jest stymulowane przez trzy białka PomXYZ16,17. Te trzy białka tworzą kompleks związany z chromosomem, który przemieszcza się przez nukleoid z miejsca podziału komórki w komórce „matce” do środka nukleoidu w dwóch komórkach potomnych. Środek nukleoidu pokrywa się z połową komórki przed segregacją chromosomów i to tutaj kompleks PomXYZ rekrutuje FtsZ oraz stymuluje formowanie pierścionia Z.
W tym etapie monitorowaliśmy najpierw nieruchome komórki wykazujące ekspresję ftsZ-gfp. Ponieważ FtsZ-GFP wykazuje ogólnie słabszy sygnał fluorescencyjny niż ParB-YFP, zwiększyliśmy czas ekspozycji w kanale GFP 5-krotnie, do 1 s. Zgodnie z oczekiwaniami, silna akumulacja FtsZ-GFP była obserwowana wyłącznie w środkowej części komórki, a lokalizacja ta wyznaczała miejsce zwężenia podczas podziału komórki (Rycina 5A). W dłuższych komórkach FtsZ-GFP tworzyło głównie skupisko w centrum komórki. Zaobserwowano również, że intensywność tego skupiska wzrastała w czasie. Po podziale komórki stwierdzono, że FtsZ-GFP ponownie zakumulowało się w środkowej części dwóch komórek potomnych po około 2 h (Rycina 5B). Jest to zgodne z wynikami analizy statycznej, według której około 50% komórek w populacji wykazuje lokalizację FtsZ w środkowej części komórki16,17.
W drugim eksperymencie przez 24 h obserwowano nieruchome komórki ΔmglA wykazujące ekspresję mCherry-pomX. Jako element systemu PomXYZ, PomX pomaga kierować formowaniem i pozycjonowaniem pierścienia Z, stymulując tym samym podział komórki w jej centrum16. Sygnał fluorescencji mCherry-PomX jest silny, co pozwala na zastosowanie czasu ekspozycji w kanale fluorescencyjnym wynoszącego 250 ms. Co istotne, wszystkie komórki zwiększyły swoje rozmiary i w trakcie eksperymentu przeszły proces podziału, tworząc po 24 h mikrokolonie (Rycyna 6A). Jak raportowano wcześniej16, niemal wszystkie komórki zawierały skupisko mCherry-PomX. Większość z nich lokalizowała się w centrum komórki, a skupiska znajdujące się poza centrum przemieszczały się do niego w trakcie trwania eksperymentu. Podczas podziałów komórkowych skupiska mCherry-PomX ulegały rozdzieleniu, tak że każda komórka potomna otrzymała jedno skupisko. W przeciwieństwie do FtsZ-GFP, mCherry-PomX lokalizowało się w centrum komórki przez 80–90% cyklu komórkowego i osiągało tę pozycję wkrótce po podziale komórki (Rycyna 6B).
<img alt="Schemat układu mikroskopowego, komórki między podkładkami z agarozy, szkiełka nakrywkowe, obiektyw 100x, widok z góry i z boku." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57860/57860fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat układu eksperymentalnego stosowanego w niniejszym badaniu. (A) Metalowa lub plastikowa ramka służy jako podparcie dla próbki. Szkiełko nakrywkowe jest przymocowane do metalowej ramki taśmą w celu ograniczenia ruchu próbki. (B) Widok z boku układu próbki eksperymentalnej. Komórki są osadzone na szkiełku nakrywowym pokazanym w (A). Podkładka z agarozy, która dostarcza komórkom substancji odżywczych i wilgoci, jest umieszczona na komórkach. Podkładka z agarozy jest przykryta dodatkowym szkiełkiem nakrywowym w celu ograniczenia parowania. W celu uzyskania wysokiej jakości obrazów stosowany jest obiektyw fazowo-kontrastowy 100X z imersją olejową. <a href="/files/ftp_upload/57860/57860fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii time-lapse pokazujące podział komórek bakteryjnych w czasie wyrażonym w minutach i godzinach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57860/57860fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Mikroskopia kontrastowa w trybie time-lapse komórek WT M. xanthus. Komórki obserwowano przez 24 h, a obrazy rejestrowano co 5 min. (A) Przedstawiono reprezentatywne obrazy tego samego pola widzenia co 5 min. Kolorowe strzałki wskazują kierunek ruchu poszczególnych komórek. Ten sam kolor oznacza tę samą komórkę w czasie. Liczby wskazują czas w minutach. Pasek skali: 5 µm. (B) Przedstawiono obrazy tego samego pola widzenia co godzinę. Należy zauważyć, że pokazano to samo pole widzenia, ale ze względu na ruch komórek, stale wchodzą one w pole widzenia i z niego wychodzą. Liczby wskazują czas w godzinach. Pasek skali: 5 µm. PH: kontrast fazowy. <a href="/files/ftp_upload/57860/57860fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Podział komórek ΔmglA w czasie; wykres z 24 klatkami obrazów mikroskopowych przedstawiający etapy wzrostu bakterii." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57860/57860fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Mikroskopia pokontrastowa time-lapse nieruchomych komórek M. xanthus.Obserwowano komórki ΔmglA przez 24 h. Obrazy pozyskiwano co 5 min; przedstawiono reprezentatywne obrazy z każdej godziny. Wybrane przewężenia podczas podziału komórek zaznaczono pomarańczowymi strzałkami. Liczby oznaczają czas w godzinach. PH: kontrast fazowy. <a href="/files/ftp_upload/57860/57860fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia poklatkowa podziału komórek bakteryjnych, szczep ΔmglA parB-yfp, nałożenie obrazu w kontraście fazowym i YFP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57860/57860fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rycina 4Mikroskopia fluorescencyjna time-lapse białka ParB-YFP w komórkach nieruchomych M. xanthus komórki. Komórki szczepu ΔmglA mutantekspresja parB-yfp w obecności natywnego parB (SA4749; ΔmglA; parB+/PnatparB-yfp) obserwowano przez 24 h za pomocą mikroskopii kontrastowej i fluorescencyjnej. (A) Obrazy pozyskiwano co 20 min; przedstawiono reprezentatywne obrazy z każdej godziny aż do 10 h, wraz z obrazami tych samych komórek po 24 h. Obrazy zaprezentowano w kontraście fazowym (PH) oraz jako nałożenie kontrastu fazowego i sygnału YFP. Wybrane podziały komórkowe zaznaczono pomarańczowymi strzałkami. Białe i zielone strzałki wskazują zdarzenia duplikacji klastrów ParB-YFP, przy czym zielone strzałki oznaczają klastry translokujące. Liczby oznaczają czas w godzinach. Pasek skali: 5 µm. (B) Obrazy pozyskano zgodnie z procedurą opisaną w (A) lecz przedstawiono je w wyższej rozdzielczości czasowej. Liczby oznaczają czas w minutach. Strzałki są zgodne z (A). Pasek skali: 5 µm. <a href="/files/ftp_upload/57860/57860fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia poklatkowa dynamiki ΔmglA ftsZ+ PftsZ-gfp w komórkach bakteryjnych, nałożenie obrazu w kontraście fazowym i fluorescencyjnym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57860/57860fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Fluorescencyjna mikroskopia poklatkowa FtsZ-GFP w nieruchomych komórkach M. xanthus. Komórki mutanta ΔmglA ekspresującego ftsZ-gfp w obecności natywnego ftsZ (SA8241; ΔmglA; ftsZ+/PnatftsZ-gfp) były obserwowane przez 24 h za pomocą mikroskopii w kontraście fazowym i fluorescencyjnej. (A) Obrazy były pozyskiwane co 20 min; przedstawiono reprezentatywne obrazy co godzinę do 10 h, wraz z tymi samymi komórkami po 24 h. Obrazy pokazano w kontraście fazowym (PH) oraz jako nałożenie sygnału kontrastu fazowego i GFP. Wybrane podziały komórkowe zaznaczono pomarańczowymi strzałkami. Białe strzałki wskazują skupiska FtsZ-GFP w środku komórki. Liczby oznaczają czas w godzinach. Pasek skali: 5 µm. (B) Obrazy były pozyskiwane w ten sam sposób co w (A), ale przedstawiono je w wyższej rozdzielczości czasowej. Liczby oznaczają czas w minutach. Zielone i białe strzałki zaznaczają skupiska FtsZ-GFP odpowiednio w lewej i prawej komórce. Pomarańczowe strzałki wskazują podziały komórkowe. Pasek skali: 5 µm. <a href="/files/ftp_upload/57860/57860fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia time-lapse mutanta ΔmglA z mCherry-pomX; badanie dynamiki lokalizacji białka." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57860/57860fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Fluorescencyjna mikroskopia time-lapse mCherry-PomX w nieruchomych komórkach M. xanthus. Nieruchome komórki ΔpomX akumulujące mCherry-PomX (SA4797; ΔmglA; ΔpomX/PpomZ mCherry-pomX) były obserwowane przez 24 h za pomocą mikroskopii kontrastowej i fluorescencyjnej co 20 min. (A) Przedstawiono reprezentatywne obrazy co godzinę do 10 h, wraz z tymi samymi komórkami po 24 h. Obrazy pokazano w kontraście fazowym (PH) oraz jako nałożenie kontrastu fazowego i sygnału mCherry. Wybrane podziały komórkowe zaznaczono pomarańczowymi strzałkami. Białe i zielone strzałki wskazują klastry mCherry-PomX odpowiednio przed i po zdarzeniach rozszczepienia. Liczby oznaczają czas w godzinach. Pasek skali: 5 µm. (B) Obrazy zostały pozyskane w taki sam sposób jak w (A) i są przedstawione w wyższej rozdzielczości czasowej. Strzałki są analogiczne do tych w (A). Pasek skali: 5 µm. <a href="/files/ftp_upload/57860/57860fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Szczep bakteryjny</td>
			<td>Istotny genotyp1</td>
			<td>Bibliografia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DK1622</td>
			<td>Typ dziki</td>
			<td>23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SA4420</td>
			<td>ΔmglA</td>
			<td>24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SA4749</td>
			<td>ΔmglA; parB+/attB::PnatparB-yfp (pAH7)</td>
			<td>Niniejsze badanie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SA4797</td>
			<td>ΔmglA; ΔpomX/ attB::PpomZ mCherry-pomX (pAH53)</td>
			<td>16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SA8241</td>
			<td>ΔmglA;ftsZ+/ mxan18-19::PnatftsZ-gfp (pDS150)</td>
			<td>Niniejsze badanie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Plazmidy w nawiasach zawierają wskazane fuzje genowe i zostały zintegrowane w zaznaczonych miejscach w genomie. 
			Plazmidy zintegrowane w attB miejsce lub mxan18-19 region międzygenowy był wyrażany z 
			ich natywny promotor (Pnat) lub natywny promotor pomZ (PpomZ).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Lista szczepów bakteryjnych użytych w niniejszym badaniu.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plazmidy</td>
			<td>Istotne charakterystyki</td>
			<td>Bibliografia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAH7</td>
			<td>Pnat parB-yfp;Mx8 attP; TetR</td>
			<td>19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAH53</td>
			<td>PpomZ mCherry-pomX; Mx8 attP ; KmR</td>
			<td>16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDS150 1</td>
			<td>Pnat ftsZ-gfp ; mxan18-19 ; TetR</td>
			<td>Niniejsze badanie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMR3691</td>
			<td>Plazmid do indukowalnej wanilanianem ekspresji genów</td>
			<td>18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pKA51</td>
			<td>Pnat ftsZ-gfp ; Mx8 attP; TetR</td>
			<td>17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">1 pDS150: pDS150 jest pochodną pKA51, w której Mx8 attP miejsce zostało zastąpione przez mxan18-19 region międzygenowy 
			W tym celu mxan18-19 region międzygenowy został namnożony z pMR3691 przy użyciu starterów Mxan18-19 fwd BsdRI 
			(GCGATCATTGCGCGCCAGACGATAACAGGC) oraz Mxan18-19 rev BlpI 
			(GCGGCTGAGCCCGCGCCGACAACCGCAACC) i sklonowano do wektora pKA51.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Lista plazmidów użytych w niniejszym badaniu.

Komórki bakteryjne są przestrzennie wysoce zorganizowane. Aby śledzić tę organizację w czasie w wolno rosnących komórkach Myxococcus xanthus, opracowano zestaw do fluorescencyjnego obrazowania żywych komórek z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną przez kilka pokoleń. Za pomocą tej metody można było określić czasoprzestrzenną dynamikę białek ważnych dla segregacji chromosomów i podziału komórek.

Fluorescencyjne obrazowanie żywych komórek pełnego wegetatywnego cyklu komórkowego wolno rosnącej bakterii społecznej Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórek bakteryjnych, takie jak to, w jaki sposób komórki replikują swoje DNA, jak rosną i jak się dzielą. Główną zaletą tej techniki jest to, że żywe komórki bakteryjne mogą być monitorowane pod mikroskopem przez co najmniej 24 godziny, a technika ta nie wymaga specjalnego sprzętu. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd we wzrost i podział Myxococcus xanthus, można ją również łatwo zastosować do innych wolno rosnących bakterii.Na początek ponownie zawiesić pojedynczą kolonię M.xanthus w 500 mikrolitrach 1% CTT, uzupełnionych antybiotykami, w sterylnej probówce i przenieść całą zawiesinę do 50-mililitrowej kolby Erlenmeyera zawierającej pięć mililitrów 1% CTT. Przygotuj 1% roztwór mikroskopii agarozowej zawierający 0,2% CTT, mieszając jeden gram agarozy z 80 mililitrami buforu TPM i 20 mililitrami pożywki 1% CTT. Roztwór podgrzewać w kuchence mikrofalowej, aż agaroza się stopi.Napełnij szalkę Petriego około 60 mililitrami stopionej agarozy i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej. Podgrzej wacik z agarozą w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez co najmniej 15 minut przed użyciem. Następnie umieść sterylne szklane szkiełko nakrywkowe na plastikowej lub metalowej ramie z otworem pośrodku, a następnie użyj taśmy, aby przymocować szkiełko nakrywkowe do ramy.Dodaj 10 do 20 mikrolitrów wykładniczo rosnących komórek M.xanthus na szkiełko nakrywkowe. Aby dodać mikrosfery fluorescencyjne jako markery odniesienia komórek, użyj bufora TPM, aby rozcieńczyć mikrosfery do 1:100. Dokładnie wstrząśnij zawiesiną kulek i dodaj do komórek od pięciu do 10 mikrolitrów.Z dużej, wstępnie podgrzanej 1% waciczki agarozowej wytnij małą podkładkę mniej więcej wielkości szkiełka nakrywkowego i umieść ją na wierzchu komórek. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu podkładki, aby zapobiec parowaniu i utrzymać komórki w wilgotnym środowisku. Inkubować próbkę mikroskopową w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez 15 do 20 minut, aby komórki mogły przyczepić się do dna podkładki agarozowej przed zapisami z mikroskopii poklatkowej.Aby przeprowadzić mikroskopię poklatkową, włącz mikroskop i uruchom oprogramowanie sterujące mikroskopem. Wybierz właściwy obiektyw i właściwe lustra oraz filtruj, aby uzyskać obrazy kontrastu fazowego, a także obrazy białek zielono-fluorescencyjnych, czerwonych lub żółtych fluorescencyjnych. Dodać kroplę wysokiej jakości olejku immersyjnego na soczewkę obiektywu i na dno próbki wstępnie inkubowanej w temperaturze 32 stopni Celsjusza.Stroną z otworem skierowaną w stronę obiektywu umieść metalową ramkę z próbką na stoliku mikroskopu, a następnie bezpiecznie przymocuj próbkę w uchwycie stolika. Skoncentruj się na komórkach, przesuwając stolik w kierunku Z bliżej celu. Gdy olej na obiektywie i próbce zetkną się, przesuń stolik w kierunku X/Y.Przełącz się na oprogramowanie Metamorph i otwórz narzędzie Acquire. Wybierz Kontrast fazowy z listy rozwijanej Ustawienia i ustaw czas ekspozycji na 100 milisekund. Kliknij opcję Pokaż na żywo, przenieś komórkę na płaszczyznę ogniskowej i przesuwaj stół montażowy w kierunku X/Y, aż w polu widzenia będzie widocznych wiele pojedynczych komórek.Upewnij się, że co najmniej jedna mikrosfera fluorescencyjna znajduje się w obszarze view, aby później wyrównać uzyskane obrazy. Następnie otwórz kreatora akwizycji wielowymiarowej w oprogramowaniu sterującym mikroskopem, aby skonfigurować eksperyment poklatkowy, który w razie potrzeby umożliwia mikroskopowi uzyskanie obrazów na wielu długościach fal i pozycjach stolika. Na karcie Główny aktywuj tryb poklatkowy i wiele długości fal.Dodatkowe zakładki pojawią się po lewej stronie okna. Kliknij kartę Zapisywanie i wybierz Katalog, aby wybrać pusty folder na dysku twardym komputera, aby zapisać pozyskane obrazy, a następnie aktywuj opcję Zwiększ nazwę podstawową, jeśli plik istnieje, aby upewnić się, że kolejne zestawy danych nie zastąpią wcześniejszych. Nadaj eksperymentowi nazwę z datą i nazwą szczepu lub tytułem eksperymentu.Kliknij zakładkę poklatkową, aby dostosować parametry poklatkowe, a następnie ustaw interwał czasu na 20 minut i ustaw czas trwania na 24 godziny. Liczba punktów czasowych zmieni się automatycznie. Teraz kliknij kartę Długości fal.Wybierz liczbę długości fal, które mają być rejestrowane dla każdego obrazu w każdym punkcie czasowym, zmieniając liczbę. Wybierz opcję Zezwalaj na oddzielną sprzętową pozycję zapamiętywanego AF dla każdej długości fali. Kliknij kartę Pierwsza długość fali od góry.Z listy rozwijanej Illumination (Iluminacja) wybierz opcję Phase Contrast (Kontrast fazowy). Wybierz 100 milisekund dla ekspozycji, a następnie z listy rozwijanej Pobierz wybierz opcję Every Time Point. Wyłącz opcję Automatyczne naświetlanie na liście rozwijanej, wybierając opcję Nigdy i wybierając opcję Każde pobranie z listy rozwijanej dla opcji Automatyczne ustawianie ostrości.Ustaw ekspozycję dla każdej długości fali, jak właśnie pokazano, używając następujących parametrów. Następnie, aby uzyskać obrazy z wielu pozycji stołu montażowego, na karcie Główny aktywuj opcję Wiele pozycji stołu montażowego. Kliknij kartę Scena i kliknij przycisk Na żywo, aby spojrzeć na pole widzenia.Przesuwaj stolik w kierunku X/Y, aż w polu widzenia znajdzie się zwrot akcji. Zapisz współrzędne X i Y na karcie Etap, klikając znak plus. Ponownie przesuń stół montażowy w kierunku X/Y, aż zostanie znaleziony nowy zwrot akcji, a następnie ponownie zapisz współrzędne, klikając znak plus.Kontynuuj, aż zostanie zapisana żądana liczba regionów. Sprawdź jeszcze raz, czy komórki są ostre, klikając różne zapisane pozycje X i Y, a następnie uruchom sprzętowy autofokus, klikając AFC hold, aby utrzymać zapisaną pozycję Z na stałym poziomie w trakcie eksperymentu. Rozpocznij nagrywanie poklatkowe w kreatorze akwizycji wielowymiarowej oprogramowania sterującego mikroskopem, klikając przycisk Acquire.Sprawdź, czy komórki są nadal ostre po pierwszych kilku punktach czasowych w nagraniach poklatkowych, aby zmaksymalizować jakość obrazów i w razie potrzeby ponownie ustawić ostrość. Aby wygenerować filmy poklatkowe i wykonać wyrównanie obrazu, uruchom oprogramowanie do analizy i przetwarzania obrazu. Otwórz obrazy jako stos, klikając opcję Przejrzyj dane wielowymiarowe, wybierz opcję Plik podstawowy, wybierz pozycję Katalog, a następnie otwórz folder z danymi wielowymiarowymi.Sprawdź zestaw danych i kliknij przycisk Wyświetl. Zestaw danych będzie wyświetlany jako pojedyncze obrazy od punktu czasu pierwszego do końca. Aktywuj długość fali do tworzenia stosu, a następnie wybierz wszystkie obrazy, które powinny znaleźć się w stosie i kliknij Załaduj obrazy.Powtórz ten krok dla wszystkich długości fal i zapisz ukończone stosy. Aktywuj stos obrazów, który musi zostać skorygowany pod kątem dryfu. Otwórz narzędzie do wyrównywania za pomocą Aplikacje, Automatyczne wyrównywanie.Zaznacz opcję Stos jako źródło obrazów i Pierwsza płaszczyzna/punkt czasowy jako płaszczyzna odniesienia, a następnie wybierz stos za pomocą przycisku Stos źródłowy i kliknij przycisk Zastosuj. Po zakończeniu automatycznego wyrównywania zapisz wyrównany stos. Aby wygenerować film w formatach MOV lub AVI, otwórz funkcję Make Movie za pomocą Stack, Make Movie.Wybierz nagrania poklatkowe za pomocą przycisku Stos źródłowy, a następnie wybierz format wyjściowy, liczbę klatek na sekundę, liczbę klatek i kliknij przycisk Zapisz. W tym eksperymencie poklatkowym z ruchliwymi komórkami DK1622 typu dzikiego, obrazy kontrastu fazowego były rejestrowane co pięć minut przez 24 godziny. Zgodnie z oczekiwaniami, komórki były ruchliwe i poruszały się głównie w grupach.W obrazowaniu żywych komórek z kontrastem fazowym z nieruchliwymi komórkami Delta-mgIA, wzrost i podział poszczególnych komórek obserwowano podczas tworzenia mikrokolonii. Gdy obrazy były rejestrowane co pięć minut przez 24 godziny, możliwe było ilościowe określenie czasu podziału wynoszącego 235 plus minus 50 minut w rozdzielczości pojedynczej komórki. Aby zbadać, czy komórki rosną normalnie podczas śledzenia białek znakowanych yfp przez długi czas, śledzono komórki M.xanthus wykazujące ekspresję ParB-YFP.ParB-YFP początkowo tworzył pojedynczy klaster w subpolarnym regionie komórki. Na krótko przed lub po podziale komórki klaster duplikował się, przy czym jedno skupisko pozostało na starym biegunie komórki, a drugie translokowało się na nowy biegun komórki. W tym eksperymencie nieruchliwe komórki wykazujące ekspresję FtsZ-gfp wykazały silną akumulację FtsZ-gfp w komórce środkowej, co dyktuje pozycję podziału komórki.FtsZ-gfp utworzył klaster w komórce środkowej, głównie w dłuższych komórkach. Dwie godziny po podziale komórki FtsZ-gfp zgromadził się w komórce środkowej w komórkach potomnych. Po opanowaniu tej techniki można rutynowo stosować na Myxococcus xanthus, a także na każdej innej wolno rosnącej bakterii.Podczas ustawiania tej procedury dla bakterii ważne jest, aby dostosować skład pożywki wzrostowej na płytce agarowej, aby spełnić specyficzne wymagania wzrostu tej bakterii. W przypadku każdej bakterii ważne jest określenie optymalnych warunków obrazowania, takich jak czas ekspozycji, natężenie światła i częstotliwość obrazowania, aby uniknąć fototoksyczności. Ponadto, w przypadku każdego białka znakowanego fluorescencyjnie, warunki obrazowania muszą być dostosowane, aby uniknąć fototoksyczności, a także fotowybielania.

fluorescence-live-cell-imaging-complete-vegetative-cell-cycle-slow

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Aby zbadać zachowanie roju Myxococcus xanthus, opracowaliśmy protokół mikrokinematografii poklatkowej, który można modyfikować dla różnych analiz. Wykorzystuje on standardowe warunki hodowli dostosowane do mikroskopii i zapewnia powtarzalne wyniki dzięki zastosowaniu niedrogich, wielorazowych uszczelek silikonowych. Metodę tę wykorzystaliśmy do ilościowego określenia wielokomórkowego chemotaksy.

Nagrywanie zachowań wielokomórkowych w biofilmach Myxococcus xanthus przy użyciu mikrocynematografii poklatkowej

Niniejszy protokół przedstawia szczegółową procedurę monitorowania zachowania pojedynczych komórek różnych bakterii w czasie, z wykorzystaniem zautomatyzowanej fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej. Ponadto przedstawiamy wytyczne dotyczące analizy uzyskanych obrazów mikroskopowych.

Obrazowanie żywych komórek Bacillus subtilis i Streptococcus pneumoniae z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii poklatkowej

Drożdże szczapowe, Schizosaccharomyces pombe, stanowią dobry system modelowy do badania podstawowych procesów komórkowych. W niniejszej pracy opisujemy metodę ilościowej analizy żywych komórek drożdży szczapowych. W tym konkretnym doświadczeniu skupiamy się na organizacji genomu w obrębie jądra komórkowego, jednak metoda ta może być również wykorzystana do badania czynników cytozolowych.

Ilościowa analiza fluorescencyjna żywych komórek drożdży szczepowych przy użyciu mikroskopii

Źródło: Schumacher, D. i in. Obrazowanie żywymi komórkami fluorescencji pełnego cyklu komórkowego wegetatywnego powoli rosnącej bakterii społecznej Myxococcus xanthus. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje przygotowanie i obrazowanie Myxococcus xanthus, powoli rosnącej bakterii glebowej. Hodowla jest uprawiana w podłożu, nakładana na pokrywę fluorescencyjnych mikrosfer i nakładana na podgrzaną agarozę, aby wspierać nawodnienie i dopływ składników odżywczych. Takie rozwiązanie umożliwia...

Przygotowanie próbek Myxococcus xanthus do obrazowania żywymi komórkami

Źródło: Schumacher, D., i Sogaard-Andersen, L. Obrazowanie żywymi komórkowymi fluorescencji pełnego wegetatywnego cyklu komórkowego wolno rosnącej bakterii społecznej Myxococcus xanthus. J. Vis. Exp. (2018)Ten film demonstruje wykorzystanie obrazowania żywych komórek do śledzenia pochodzenia chromosomów oznaczonych fluorescencją podczas podziału komórek bakteryjnych. Rejestruje dynamikę segregacji chromosomów za pomocą mikroskopii poklatkowej fazowo-kontrastowej oraz fluorescencji.

Obrazowanie poklatkowe segregacji chromosomów u bakterii znakowanych fluorescencją

Mikroskopia poklatkowa markerów autofagii znakowanych fluorescencyjnie umożliwia monitorowanie dynamicznej odpowiedzi autofagii z wysoką rozdzielczością czasową. Korzystając ze specyficznych markerów autofagii i organelli w kombinacji 3 różnych kolorów, możemy śledzić wkład białka w tworzenie autofagosomów w solidnym kontekście przestrzennym i czasowym.

Obrazowanie na żywych komórkach wczesnych zdarzeń autofagii: omegasomy i nie tylko

Streptomyces charakteryzują się złożonym cyklem życiowym, który był eksperymentalnie trudny do zbadania za pomocą biologicznych metod komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykonywania fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej całego cyklu życia poprzez hodowlę Streptomyces venezuelae w urządzeniu mikroprzepływowym.

Fluorescencyjne obrazowanie poklatkowe całego cyklu życiowego S. venezuelae przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego

Zrozumienie funkcji podstawowych procesów zachodzących w bakteriach jest wyzwaniem. Mikroskopia fluorescencyjna z barwnikami specyficznymi dla celu może dostarczyć kluczowych informacji na temat wzrostu komórek drobnoustrojów i progresji cyklu komórkowego. W tym przypadku Agrobacterium tumefaciens jest używany jako bakteria modelowa w celu podkreślenia metod obrazowania żywych komórek w celu scharakteryzowania podstawowych procesów.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu obserwacji podstawowych procesów podczas wzrostu komórek drobnoustrojów

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku do badania dynamiki lokalizacji subkomórkowej białek i monitorowania zmian morfologicznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości u Bacillus subtilis i Staphylococcus aureus.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu zbadania lokalizacji białek subkomórkowych i zmian morfologii komórek u bakterii

Niezbędne barwniki fluorescencyjne są niezbędnymi narzędziami do analiz obrazowania żywych komórek w nowoczesnej biologii komórek grzybów. W artykule szczegółowo opisano zastosowanie znanych i mniej znanych barwników fluorescencyjnych do śledzenia dynamiki błony plazmatycznej, endo-/egzocytozy i morfogenezy ściany komórkowej u grzybów strzępkowych.

Zastosowanie selektywnych barwników fluorescencyjnych błonowych i ścian komórkowych do obrazowania żywych komórek grzybów strzępkowych

Obrazowanie komórek bakteryjnych to nowe podejście do biologii systemowej, skoncentrowane na definiowaniu statycznych i dynamicznych procesów, które dyktują funkcjonowanie dużych maszyn makromolekularnych. W tym przypadku integracja ilościowego obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej jest wykorzystywana do badania architektury i funkcji systemu wydzielania Legionella pneumophila typu IV.

Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila

Poznaj metodę fluorescencyjnego obrazowania żywych komórek bakterii Myxococcus xanthus w celu badania podziału komórkowego i segregacji chromosomów. Technika umożliwia obserwację przez ponad 24 godziny.

Fluorescencyjne obrazowanie żywych komórek pełnego wegetatywnego cyklu komórkowego wolno rosnącej bakterii społecznej Myxococcus xanthus (Wideo) | JoVE Journal

Fluorescencyjne obrazowanie żywych komórek pełnego wegetatywnego cyklu komórkowego wolno rosnącej bakterii społecznej Myxococcus xanthus

Przeglądaj więcej filmów