Name: Cytometria przepływowa sterowana bazą danych do oceny dojrzewania komórek szpiku kostnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
Description: Poznaj cytometrię przepływową sterowaną bazą danych do oceny dojrzewania komórek szpiku kostnego. Ta metoda zwiększa dokładność diagnostyczną zespołów mielodysplastycznych poprzez redukcję subiektywności analizy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Przeciwciała użyte w tym badaniu zostały dostarczone przez BD Biosciences. Autorzy chcieliby podziękować swojej koleżance, dr Pascale Flandrin-Gresta z Wydziału Biologii Molekularnej, laboratorium hematologicznego Szpitala Uniwersyteckiego Saint-Etienne we Francji, która dostarczyła wiedzę specjalistyczną w celu interpretacji danych NGS dla drugiego przypadku MDS. Autorzy są wdzięczni hematologom klinicystom za zainteresowanie i zaangażowanie w to badanie, a także pacjentom i zdrowym dawcom za zgodę na udział w tym badaniu. Autorzy pragną również podziękować Fundacji "Les Amis de Rémi" za wsparcie finansowe publikacji.

<ol><li>Orfao, A., Ortuño, F., de Santiago, M., Lopez, A., San Miguel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotyping+of+Acute+Leukemias+and+Myelodysplastic+Syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Immunophenotyping of Acute Leukemias and Myelodysplastic Syndromes.</a> Cytometry Part A. 58, 62-71 (2004).</li>
<li>Porwit, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24919805">Revisiting guidelines for integration of flow cytometry results in the WHO classification of Myelodysplastic Syndromes - proposal from the International/European LeukemiaNet Working Group for Flow Cytometry in MDS (IMDSFlow).</a> Leukemia. 28 (9), 1793-1798 (2014).</li>
<li>Westers, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+flow+cytometry+in+the+diagnostic+work-up+of+myelodysplastic+syndromes+in+a+multicenter+approach%3A+Report+from+the+Dutch+Working+Party+on+Flow+Cytometry+in+MDS%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Research%22%5BJournal%5D)">Implementation of flow cytometry in the diagnostic work-up of myelodysplastic syndromes in a multicenter approach: Report from the Dutch Working Party on Flow Cytometry in MDS.</a> Leukemia Research. 36, 422-430 (2012).</li>
<li>Meehan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AutoGate%3A+automating+analysis+of+flow+cytometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Immunologic+Research%22%5BJournal%5D)">AutoGate: automating analysis of flow cytometry data.</a> Immunologic Research. 58, 218-223 (2014).</li>
<li>Greenberg, P. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21233243">NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: myelodysplastic syndromes.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 9, 30-56 (2011).</li>
<li>Greenberg, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+Syndromes%2C+Version+2.2017%2C+Clinical+Practice+Guidelines+in+Oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Comprehensive+Cancer+Network%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic Syndromes, Version 2.2017, Clinical Practice Guidelines in Oncology.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 15, (2017).</li>
<li><a target="_blank" href="https://www.amazon.com/Classification-Tumours-Haematopoietic-Lymphoid-Tissues/dp/928324494X">WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Revised 4th Edition</a>. Swerdlow, S. H., et al. (2), IARC Press. Lyon, France. 86-128 (2017).</li>
<li>https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html">https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html</a> (2018).</li>
<li><a target="_blank" href="NULL">Composition of EuroFlow panels and technical information on reagents Version 1.5</a>. , (2017).</li>
<li><a target="_blank" href="NULL">EuroFlow Standard Operating Procedure (SOP) for sample preparation and staining Version 1.2.1</a>. , (2015).</li>
<li>Kalina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EuroFlow+standardization+of+flow+cytometer+instrument+settings+and+immunophenotyping+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols.</a> Leukemia. 26, 1986-2010 (2012).</li>
<li>http;//www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-flow-cytometry/reagents/antibodies-and-dyes/recombinant-antibodies.aspx. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http;//www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-flow-cytometry/reagents/antibodies-and-dyes/recombinant-antibodies.aspx">http;//www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-flow-cytometry/reagents/antibodies-and-dyes/recombinant-antibodies.aspx</a> (2018).</li>
<li>van Dongen, J. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EuroFlow+antibody+panels+for+standardized+n-dimensional+flow+cytometric+immunophenotyping+of+normal%2C+reactive+and+malignant+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes.</a> Leukemia. 26, 1908-1975 (2012).</li>
<li>Matarraz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+the+Diagnosis+and+Classification+of+Monocytic-Lineage+Leukemias+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+B+%28Clinical+Cytometry%29%22%5BJournal%5D)">Introduction to the Diagnosis and Classification of Monocytic-Lineage Leukemias by Flow Cytometry.</a> Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 92 (3), 218-227 (2015).</li>
<li>Westers, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotypic+analysis+of+erythroid+dysplasia+in+myelodysplastic+syndromes.+A+report+from+the+IMDSFlow+working+group%29%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Immunophenotypic analysis of erythroid dysplasia in myelodysplastic syndromes. A report from the IMDSFlow working group).</a> Haematologica. 102, 308-319 (2017).</li>
<li>Shen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+immunophenotypic+findings+in+chronic+myelomonocytic+leukemia+and+its+utility+in+monitoring+treatment+response%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry immunophenotypic findings in chronic myelomonocytic leukemia and its utility in monitoring treatment response.</a> European Journal of Haematology. 95, 168-176 (2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych. Zakład Cytometrii Przepływowej, Laboratorium Hematologii Szpitala Uniwersyteckiego w Saint-Etienne jest członkiem Konsorcjum EuroFlow.

Jakość aspiratu BM może mieć wpływ na końcowe wyniki. Hemodylucja aspiratu BM może zniekształcić rozmieszczenie komórek na różnych etapach dojrzewania z powodu braku komórek progenitorowych lub prekursorowych. Prawdopodobnie zastosowanie metody lizy masowej może pomóc w normalizacji aspiratów BM do hemodylucji w analizach cytometrii przepływowej. Ponadto krytycznymi etapami oceny dysplazji szpikowej BM za pomocą cytometrii przepływowej są przetwarzanie i barwienie próbki, gromadzenie danych i interpretacja<sup class="xre...

Wobec braku markerów fenotypowych specyficznych dla zmian dysplastycznych występujących w komórkach szpikowych podczas inicjacji i progresji MDS, w ostatnich latach zaproponowano nowe podejście oparte na ocenie szlaków dojrzewania (zmieniona ekspresja antygenów szpikowych podczas produkcji dojrzałych komórek szpikowych) lub nieprawidłowego rozmieszczenia różnych typów komórek w przedziałach komórek szpiku kostnego (BM)1,2.
Ten artykuł przedstawia nową metodę standaryzacji stosowania MFC w celu wykrywania zmian dysplastycznych w przedziałach komórek szpikowych BM związanych z zespołami mielodysplastycznymi (MDS) lub innymi chorobami hematologicznymi szpiku. Badanie to pokazuje również użyteczność wykorzystania baz danych dojrzewania do analizy danych MFC.
Standaryzacja procedury przygotowania próbek, pozyskiwania danych i analizy za pomocą baz danych pozwoliłaby na identyfikację najistotniejszych nieprawidłowości fenotypowych związanych ze zmianami dysplastycznymi w komórkach szpikowych BM. W związku z tym statystycznie wybrane podzbiory oparte na dobrze oznaczonych i dobrze rozpoznanych formatach (diagramy automatycznego separatora populacji (APS), histogramy i wykresy punktowe) są niezbędne do opracowania strategii analizy, którą można wykorzystać w kolejnych rundach analizy. Odkrycie silnych nieprawidłowości fenotypowych w MDS ułatwiłoby diagnozę w przypadkach z lub bez minimalnej dysplazji morfologicznej i bez nieprawidłowości cytogenetycznych. Identyfikacja parametrów dyskryminacyjnych pozwalających na zmniejszenie paneli immunofenotypowych może uprościć obecne wyniki2, umożliwiając ich zastosowanie w klinicznych laboratoriach patologicznych.
Ta metoda ogranicza subiektywne interpretacje danych cytometrycznych, jak to zostało zasygnalizowane w diagnozie MDS3. Ten krok jest warunkiem wstępnym do opracowania zautomatyzowanych narzędzi do przetwarzania i analizowania danych przepływu4.
MDS to heterogeniczna grupa zaburzeń klonalnych hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC), w których mutacje spliceosomów współpracują ze specyficznymi modyfikatorami epigenetycznymi, aby uzyskać fenotyp MDS. Obecnie wiadomo, że wraz z mutacjami HSC w patofizjologii MDS zaangażowane są inne mechanizmy, takie jak nieprawidłowy stan zapalny o podłożu immunologicznym i interakcje między złośliwymi HSC a mikrośrodowiskiem zrębu BM. Mechanizmy te pozostają jednak słabo poznane. Duża heterogeniczność kliniczna i biologiczna MDS sprawia, że diagnoza i dobór optymalnej terapii jest wyzwaniem. W ciągu ostatniej dekady liczne badania wykazały, że MFC jest często bardziej czuły w wykrywaniu dysplazji2 niż morfologii, ale ograniczenia techniczne i ekonomiczne sprawiają, że technika ta jest trudna do standaryzacji, a wyniki często zależą od doświadczenia tłumacza3. Ponadto nie jest jasne, w jaki sposób MFC może przechylić szalę w kierunku MDS w przypadkach z lub bez minimalnej dysplazji morfologicznej i przy braku anomalii cytogenetycznych, lub w przypadkach granicznych, takich jak hipokomórkowy MDS, z niską liczbą blastów, z innych nieklonalnych zaburzeń BM, takich jak niewydolność szpiku kostnego (tj. niedokrwistość aplastyczna). Trudno jest również odróżnić graniczne przypadki MDS z nadmiarem blastów z ostrej białaczki szpikowej (AML). Z tych wszystkich powodów wytyczne kliniczne nie uwzględniają badania MFC w ostatecznej diagnozie MDS. W 2011 roku amerykańska National Comprehensive Cancer Network (NCCN) zaleciła MFC do oszacowania odsetka komórek CD34 +, wykrywania napadowych nocnych klonów hemoglobinurii oraz obecności cytotoksycznych klonów komórek T w hipokomórkowym MDS5. Te dwie ostatnie sytuacje również wiążą się z celem terapeutycznym, ponieważ dane kliniczne wykazały dobrą odpowiedź tych pacjentów na terapię immunosupresyjną6. Wytyczne NCCN z 2017 r., powołując się na zalecenia Międzynarodowej Grupy Roboczej (IWG), wymieniły nieprawidłowe wykrywanie immunofenotypowania przez MFC wśród współkryteriów diagnozy MDS, ale bez żadnych specyfikacji6. Ponadto niedawno opublikowana klasyfikacja WHO stanowi, że same wyniki MFC nie są wystarczające do ustalenia pierwotnego rozpoznania MDS w przypadku braku rozstrzygających danych morfologicznych i/lub cytogenetycznych7. Jednak MFC może być stosowany jako dodatkowy test pokazujący rozregulowanie wzorców dojrzewania komórek szpikowych i określający ilościowo "odległość od normy" dla pacjenta w określonym momencie przebiegu choroby.
Ta metoda ma zastosowanie w laboratoriach klinicznych zainteresowanych oceną dysplazji w komórkach szpikowych BM za pomocą immunofenotypowania MFC, w celu doprecyzowania diagnozy w MDS lub innych zaburzeniach szpikowych z nieprawidłowościami dysplastycznymi.

<table><tbody><tr><td>Cytometr przepływowy BD FACSCanto II</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>SN:</td><td>3-laserowy V33896301336, konfiguracja 4-2-2, Szczegóły filtrów i luster: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf</td></tr><tr><td>Wirówka Awel C48-R</td><td>AWEL Industries, FR</td><td>SN: 910120016; Model nr: 320002001</td><td>wirówki wolnoobrotowe; pojemność 60 probówek FACS</td></tr><tr><td>Pipety 10 i mikro; L oraz 200&mikro; L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pasteura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówki Falcon rurka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>polipropylenowa do myszy FACS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human HLA-DR</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>655874</td><td>klon L243 Mysz BALB/c IgG2a, &kappa; Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm)</td></tr><tr><td>Mysz Anti-Human CD45</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td></td><td>560777 klon myszy HI30 IgG1, &kappa; Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm)</td></tr><tr><td>Mysz Anti-Human CD16</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>656146</td><td>klon CLB/fcGran1 Mysz BALB/c IgG2a, &kappa; Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)</td></tr><tr><td>Mysz Anti-Human CD13</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>347406</td><td>klon L138 Mysz BALB/c X C57BL/6 IgG1, &kappa; Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)</td></tr><tr><td>Mysz Anti-Human CD34</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>347222</td><td>klon 8G12 Mysz BALB/c IgG1, &kappa; Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm)</td></tr><tr><td>Mysz Anti-Human CD117</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>339217</td><td>klon 104D2 Mysz BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm)</td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka CD11b</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>333143</td><td>klon myszy D12 BALB/c IgG2a, &kappa; D12, fluorochrom APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm</td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka CD10</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>646783</td><td>klon HI10A Mysz BALB/c IgG1, &kappa; Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)</td></tr><tr><td>Mysz Anti-Human CD35</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>555452</td><td>klon E11 Mysz IgG1, &kappa; Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)</td></tr><tr><td>Mysz Anti-Human CD64</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>644385</td><td>klon 10.1 Mysz BALB/c IgG1, &kappa; Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)</td></tr><tr><td>Mysz Anti-Human CD300e</td><td>Immunostep</td><td>IREM2A-T100</td> klon <td>UP-H2 Mysz BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)</td></tr><tr><td>Mysz Anti-Human CD14</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>641394</td><td>klon MoP9 Mysz BALB/c IgG2b, &kappa; Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)</td></tr><tr><td>Mysz Anti-Human CD36</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>656151</td><td>klon CLB-IVC7 Mysz IgG1, &kappa; Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)</td></tr><tr><td>Mysz Anti-Human CD105</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>560839</td><td>klon 266 Mysz BALB/c IgG1, &kappa; Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)</td></tr><tr><td>Mysz Anti-Human CD33</td><td></td><td>345800</td><td>klon P67.6 Mysz BALB/c IgG1, &kappa; Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)</td></tr><tr><td>Mysz Anti-Human CD71</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>655408</td><td>klon M-A712 Mysz BALB/c IgG2a, &kappa; Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)</td></tr><tr><td>Roztwór do lizy 10x Koncentrat (IVD)</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>FACSFlow Scover Fluid</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva CS& Koraliki T IVD</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>656046</td><td></td></tr><tr><td>TĘCZOWE CZĄSTKI KALIBRACYJNE, 8 PIKÓW</td><td>Cytognos, Salamanka, Hiszpania</td><td>SPH-RCP-30-5A</td><td>dużo EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01</td></tr><tr><td>Cząstki kompensacyjne Multicolor CompBeads(CE/IVD)</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Diva w wersjach 6.1.2 i 6.1.3</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tabletki soli fizjologicznej buforowane fosforanami</td><td>R& D Systems, Minneapolis, USA</td><td>5564</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej&nbsp;( BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, Francja</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu 99%</td><td>Sigma-Aldrich, Francja</td><td>199931</td><td></td></tr><tr><td>Wersja oprogramowania Infinicyt 1.8.0.e</td><td>Cytognos, Salamanka, Hiszpania</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cytometria przepływowa sterowana bazą danych do oceny dojrzewania komórek szpiku kostnego

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

Grupa robocza zainicjowana w ramach Francuskiego Towarzystwa Cytometrii (AFC) została opracowana w celu harmonizacji zastosowania wieloparametrowej cytometrii przepływowej (MFC) w diagnostyce chorób szpikowych we Francji. Przedstawiony tu protokół został uzgodniony i był stosowany w okresie od września 2013 r. do listopada 2015 r. w sześciu francuskich laboratoriach diagnostycznych (Szpitale Uniwersyteckie w Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nicei i Lille oraz Institut Paoli-Calmettes w Marsylii) i pozwolił na standaryzację przygotowania próbek szpiku kostnego i pozyskiwania danych. Opracowano trzy bazy danych dojrzewania dla linii neutrofilowych, monocytowych i erytroidalnych ze szpikiem kostnym od "zdrowych" dawców (osób bez objawów choroby układu krwiotwórczego). Solidna metoda analizy dla każdej linii szpikowej powinna być stosowana do rutynowego stosowania diagnostycznego. Nowe przypadki mogą być analizowane w ten sam sposób i porównywane ze zwykłymi bazami danych. W ten sposób można zidentyfikować ilościowe i jakościowe nieprawidłowości fenotypowe, a te powyżej 2SD w porównaniu z danymi z prawidłowych próbek szpiku kostnego należy uznać za wskazujące na patologię. Głównym ograniczeniem jest większa zmienność pomiędzy danymi uzyskanymi za pomocą przeciwciał monoklonalnych uzyskanych metodami opartymi na technologiach hybrydoma i obecnie stosowanych w diagnostyce klinicznej. Ustawienie kryteriów technicznej walidacji uzyskanych danych może pomóc w poprawie użyteczności MFC na potrzeby diagnostyki MDS. Ustalenie tych kryteriów wymaga analizy w oparciu o bazę danych. Istotną zaletą tej metody jest zmniejszenie subiektywizmu badaczy w analizie danych.

W badaniu uwzględniono 54 próbki BM pobrane do antykoagulanta K-EDTA. Dane MFC analizowano bez dostępu do informacji o pacjentach. Badanie retrospektywne wykazało, że próbki BM pochodziły od 7 zdrowych dawców (5 mężczyzn i 2 kobiet w medianie wieku 47,4 [35-48]), 11 osób bez dowodów na chorobę krwiotwórczą (8 mężczyzn i 3 kobiet w medianie wieku 57,9 [35-72]) oraz 36 przypadków z różnymi stanami patologicznymi: 1 przypadek anemii i niskiego poziomu kreatyniny, 3 przypadki anemii i wysokie...

Diagnoza MDS jest trudna ze względu na brak kryteriów morfologicznych lub cytogenetyki bez informacji. MFC może pomóc udoskonalić proces diagnostyczny MDS. Aby analiza MFC stała się przydatna w praktyce klinicznej, musi opierać się na parametrach o wystarczającej swoistości i czułości, a dane powinny być powtarzalne dla różnych operatorów.

Cytometria przepływowa sterowana bazą danych do oceny dojrzewania komórek szpiku kostnego

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w diagnostyce chorób szpikowych, takich jak zespoły mielodysplazji lub inne choroby hematologiczne, które rozwijają się wraz z nieprawidłowościami dojrzewania w liniach komórek szpikowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że zmniejsza ona subiektywność badacza w tej analizie i interpretacji. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat tego, które parametry są najbardziej dyskryminujące dla mielodysplazji.Pozwala to na ilościowe określenie różnic w stosunku do normalnych populacji komórek szpikowych. Procedurę zademonstruje Tiphanie Picot, adiunkt z naszego laboratorium. Rozpocznij od zmieszania 600 mikrolitrów pierwotnej próbki komórek z 10 mililitrami buforu płuczącego w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów do dwóch wirowań i 10 mililitrów świeżego buforu do płukania na pranie.Po drugim przemyciu ponownie zawiesić osad w 400 mikrolitrach świeżego buforu do przemywania i przenieść 350 mikrolitrów zawiesiny komórek do pięciomililitrowej probówki FACS z polipropylenu, zawierającej cały panel przeciwciał szkieletowych. Po dokładnym wymieszaniu komórek, odpipetować równe objętości roztworu przeciwciała komórkowego do trzech nowych probówek polipropylenowych i w razie potrzeby doprowadzić końcową objętość w każdej probówce do 200 mikrolitrów ze świeżym buforem do mycia. Następnie dodać odpowiednią objętość przeciwciał przeciwko markerom powierzchniowym komórki, które są przedmiotem zainteresowania, mieszając, w celu 30-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej, chronionej przed światłem.Pod koniec inkubacji dodać dwa mililitry roztworu lizującego z mieszaniem, na 10-minutową inkubację w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Zebrać zlizowane komórki przez odwirowanie i wyrzucić wszystkie oprócz ostatnich 50 mikrolitrów supernatantu do każdej probówki, nie naruszając osadu. Ponownie zawiesić granulki w pozostałym supernatancie, delikatnie mieszając, i dodać dwa mililitry świeżego buforu płuczącego do każdej próbki.Po drugim przemyciu wyrzucić supernatant, pozostawiając około 50 mikrolitrów pozostałej objętości w każdej probówce, nie naruszając osadu. Ponownie zawiesić granulat w 200 mikrolitrach PBS z mieszaniem, w celu natychmiastowej analizy. Aby odczytać próbki na cytometrze przepływowym, najpierw otwórz nowy eksperyment w oprogramowaniu cytometru przepływowego i zmień nazwę eksperymentu zgodnie z nazwą, typem próbki i datą.Utwórz nową próbkę dla trzech probówek i określ przeciwciała użyte w każdej probówce w układzie eksperymentu. Otwórz ustawienia cytometru i wybierz ustawienia aplikacji, aby zastosować wartości uzyskane w konfiguracji miesięcznej. Otwórz nowy globalny arkusz roboczy i utwórz odpowiednie wykresy kropkowe do bramkowania komórek singletowych, a także dla populacji granulocytów, monocytów, blastów i limfocytów.Utwórz nowy arkusz globalny dla formantów wynagrodzeń. Następnie należy pozyskać 500 000 zdarzeń z każdej lampy, ze średnią szybkością akwizycji, eksportując dane jako pliki fcs 3.0 po ich walidacji technicznej. Przed rozpoczęciem nowej analizy należy pobrać pliki cyt zawierające normalne dane szpiku kostnego dla neutrofili, monocytów i jądrzastych linii czerwonych oraz pliki analizy w formacie inp.Następnie zapisz dane na pulpicie. W celu zapisania dojrzewania neutrofili w bazie danych, należy najpierw otworzyć oprogramowanie Infinicyt, a następnie otworzyć plik cyt odpowiadający danym dojrzewania neutrofili. Narysuj szlak dojrzewania na wykresie APS i zapisz szlak dojrzewania neutrofili w bazie danych.Otwórz plik fcs dla dojrzewania linii neutrofili, która ma być analizowana. Prześlij plik inp dojrzewania neutrofili z zakładki profile. Analiza dla tej linii jest podzielona na trzy etapy.Zacznij od wyboru CD34-dodatnich, zaangażowanych w neutrofile blastów. W tym celu należy użyć przecięcia siedmiu bramek, aby umożliwić wybór zdarzeń CD34 dodatnich, CD117 dodatnich, niskich HLAD, CD10 ujemnych, CD13 dodatnich, CD11 b-ujemnych. Kontynuować analizę z wyborem prekursorów neutrofili CD117 dodatnich i CD34 ujemnych.Kontynuuj analizę, wybierając bardziej dojrzałe komórki neutrofilowe. Następnie pokaż analizę monocytowych komórek liniowych. Narysuj ścieżkę dojrzewania na wykresie APS.Sprawdź, czy strzałka wskazująca poczucie dojrzewania jest zorientowana od niedojrzałych komórek monocytowych, CD14 ujemnych, IREM2 ujemnych, do dojrzałych monocytów, CD14 dodatnich, IREM2 dodatnich. Zapisz ścieżkę dojrzewania dla linii monocytowej w bazie danych. Otwórz plik fcs dla dojrzewania linii monocytowej, która musi zostać przeanalizowana.Prześlij profil do analizy pochodzenia monocytów. Aby zidentyfikować komórki linii monocytowej, użyj przecięcia czterech bramek, które umożliwiają wybór zdarzeń CD64 dodatnich wysokich, CD117 dodatnich, CD117 ujemnych, HLADR. Przypisz te zdarzenia do zakładki monocytów w drzewie hierarchii populacji.Otwórz plik cyt NRC, który ma być zapisany w bazie danych NRC. Narysuj ścieżkę dojrzewania na wykresie APS i zapisz ścieżkę dojrzewania jądrzastych krwinek czerwonych w bazie danych. Otwórz plik fcs, który ma zostać przeanalizowany.Prześlij z profili szablon analizy dla jądrzastych krwinek czerwonych. Analiza dla tej linii jest podzielona na dwa etapy. Począwszy od wyboru CD34 dodatniego, erytroidalne wybuchy.Tutaj użyj przecięcia siedmiu bramek, aby umożliwić wybór zdarzeń CD34 dodatnich, CD117 dodatnich, niskich HLAD, CD105 dodatnich, CD33 ujemnych, CD36 dodatnich, CD71 dodatnich. Przypisz te zdarzenia do zakładki NRC w hierarchii populacji. Usuń z widoczności wybuchy popełnione przez erytroidy CD34 dodatnie.Aby zidentyfikować bardziej dojrzałe komórki erytroidalne, użyj przecięcia czterech bramek, które umożliwiają rozróżnienie CD45 ujemnego i CD45 dodatniego dołka, niskiego rozproszenia bocznego, dodatniego CD36 wysokiego i CD71 dodatniego haju. Następnie usuń CD36 z niskimi płytkami krwi po stronie zarodkowanej i przypisz tę populację do zakładki NRC. Aby ocenić dojrzewanie szpiku w przedziale szpiku kostnego, otwórz plik cyt odpowiadający interesującej linii z przypadku, który ma być oceniany.Pozostaw widoczne tylko te zdarzenia przypisane do zakładki neutrofili w drzewie hierarchii populacji. Narysuj ścieżkę dojrzewania na wykresie APS i załaduj bazę danych odpowiadającą dojrzewaniu neutrofili w normalnym szpiku kostnym i porównaj dane. Jeśli dane są przynajmniej częściowo zgodne, oprogramowanie utworzy znormalizowany diagram różnic dojrzewania oraz pasmo parametrów, aby zobrazować różnice dojrzewania.Aby porównać dojrzewanie monocytów w przedziale szpiku kostnego, dla nowego przypadku z danymi z normalnych szpików kostnych, w tym z bazy danych monocytów, otwórz plik cyt odpowiadający linii komórek monocytowych. Pozostaw widoczne tylko zdarzenia przypisane do zakładki monocyty w drzewie hierarchii populacji i narysuj ścieżkę dojrzewania na wykresie APS. Załaduj bazę danych odpowiadającą dojrzewaniu monocytów w prawidłowych szpikach kostnych i porównaj dane.Aby porównać dojrzewanie jądrzastych krwinek czerwonych w przedziale szpiku kostnego, dla nowego przypadku, z danymi z normalnych szpików kostnych, zawartych w bazie danych NRC, otwórz plik cyt odpowiadający linii NRC. Pozostaw widoczne tylko te zdarzenia przypisane do zakładki NRC w drzewie hierarchii populacji. I narysuj ścieżkę dojrzewania na wykresie APS.Załadować bazę danych odpowiadającą dojrzewaniu NRC w prawidłowym szpiku kostnym i porównać dane. Następnie, aby zobrazować znaczenie różnic między nowym plikiem a danymi zawartymi w bazie danych, kliknij znormalizowane różnice dojrzewania i powiększ. Należy pamiętać, że metody, które wykorzystują hierarchiczne algorytmy klasyfikacyjne w analizie danych cytometrii przepływowej, są wysoce subiektywne i z natury niedokładne, ponieważ nie uwzględniają nakładania się populacji komórek.Ocena nowych przypadków cytopenii, podejrzewanej o MDS, w stosunku do baz danych prawidłowego dojrzewania szpiku, pozwala na identyfikację nieprawidłowo wyrażonych antygenów dojrzewania linii neutrofilów, monocytów i NRC, nawet w przypadkach bez nieprawidłowości cytologicznych lub cytogennych. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o uzyskaniu danych cytometrii przepływowej w ustandaryzowany sposób, w celu przeprowadzenia comiesięcznej konfiguracji cytometru, codziennych kontroli, rygorystycznego pipetowania przeciwciała przed użyciem oraz przestrzegania czasu barwienia. Zgodnie z tą procedurą, można zastosować inne metody, takie jak kompas, aby porównać różne grupy przypadków i odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak ostateczny typowy odcisk dla określonej grupy przypadków.Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zainteresowanym badaniem wzorców dojrzewania komórek szpikowych, w przypadkach hematopoezy klonalnej o nieokreślonym potencjale, w celu zidentyfikowania końcowych typowych zmian wiarygodnie związanych z procesem dysplastycznym. Należy pamiętać, że aktualizacja bazy danych o zwiększoną liczbę danych od zdrowych dawców może poprawić wiarygodność analizy.

database-guided-flow-cytometry-for-evaluation-bone-marrow-myeloid

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Podczas gdy infiltrujące makrofagi są stale rekrutowane do tkanek dorosłych z krążących prekursorów, makrofagi rezydentne zasiewają swoją tkankę podczas rozwoju, gdzie są utrzymywane bez dalszego wkładu ze strony przodków. Niedawno zidentyfikowano prekursorów rezydujących makrofagów. W tym miejscu przedstawiono metody genetycznego mapowania losów rezydentnych przodków makrofagów.

Identyfikacja przodków erytromieloidów i ich potomstwa w zarodku myszy za pomocą cytometrii przepływowej

Wykrywanie minimalnej lub mierzalnej choroby resztkowej (MRD) jest ważnym biomarkerem prognostycznym do udoskonalania oceny ryzyka i przewidywania nawrotu ostrej białaczki szpikowej (AML). Te kompleksowe wytyczne i zalecenia wraz z najlepszymi praktykami w zakresie spójnej i dokładnej identyfikacji i wykrywania MRD mogą pomóc w podejmowaniu skutecznych decyzji dotyczących leczenia AML.

Kompleksowy protokół pobierania i przetwarzania szpiku kostnego do pomiaru mierzalnej choroby resztkowej i białaczkowych komórek macierzystych w ostrej białaczce szpikowej

Przedstawiamy protokół wykrywania jednoczesnej ekspresji markerów komórek macierzystych białaczki na pierwotnych komórkach ostrej białaczki szpikowej za pomocą cytometrii przepływowej. Pokazujemy, jak określić ilościowo trzy populacje przodków i przypuszczalną populację LSC o rosnącym stopniu dojrzałości. Potwierdziliśmy obecność tych populacji w odpowiadających im ksenoprzeszczepach pochodzących od pacjentów.

Cytometria przepływowa w celu oceny komórek macierzystych białaczki w pierwotnej ostrej białaczce szpikowej i w ksenoprzeszczepach pobranych od pacjenta, w momencie diagnozy i obserwacji

Pokazujemy, jak zidentyfikować i wyizolować 6 podzbiorów komórek progenitorowych szpiku myszy za pomocą kombinacji sortowania magnetycznego i fluorescencyjnego (MACS i FACS). Protokół ten może być stosowany do testów hodowli in vitro (hodowle metylocelulozy lub płynów), eksperymentów z transferem adoptywnym in vivo oraz analiz RNA/białka.

Identyfikacja i izolacja oligopotencjalnych i zaangażowanych w linię przodków szpiku szpiku

Opisujemy tutaj prostą analizę heterogeniczności przedziału mysich komórek odpornościowych B w tkankach otrzewnej, śledziony i szpiku kostnego za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół można dostosować i rozszerzyć na inne tkanki myszy.

Charakterystyka cytometrii przepływowej rozwoju mysich komórek B

Tutaj opisujemy prosty protokół izolacji i barwienia mysich komórek szpiku kostnego do fenotypu hemopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych wraz z wspierającymi je niszowymi komórkami macierzystymi śródbłonka i mezenchymalnymi komórkami macierzystymi. Uwzględniono również metodę wzbogacania komórek zlokalizowanych w obszarach śródkostnych i centralnych szpiku kostnego.

Analiza cytometrii przepływowej mysich komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego oraz komórek niszowych zrębu

Prezentowana tutaj jest technika oparta na cytometrii przepływowej, która pozwala na jednoczesny pomiar liczby podziałów komórkowych, fenotypu komórek powierzchniowych i pokrewieństwa komórkowego. Właściwości te można testować statystycznie przy użyciu struktury opartej na permutacjach.

Jednoczesna ocena pokrewieństwa, liczby podziału i fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej dla hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych

Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół izolowania i charakteryzowania mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego z mysich modeli zespołów mielodysplastycznych i ostrej białaczki szpikowej. Technika ta identyfikuje zmiany w niekrwiotwórczej niszy szpiku kostnego, w tym w komórkach śródbłonka i mezenchymalnych komórek zrębu, wraz z postępem choroby.

Identyfikacja mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego w zespole mielodysplastycznym i ostrej białaczce szpikowej

Niniejszy protokół opisuje opłacalną metodę oczyszczania, namnażania i charakteryzowania wysoce jednorodnych mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego (BMSC) od myszy. Takie podejście ułatwia pozyskiwanie dużych ilości BMSC o wysokim potencjale proliferacji i różnicowania, wspierając modele mysie i posuwając naprzód badania przedkliniczne.

Oczyszczanie, ekspansja i fenotypowanie oparte na cytometrii przepływowej mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego pochodzenia mysiego

Jest to szybka i kompleksowa metoda immunofenotypowania mieloidalnych komórek supresorowych (MDSC) oraz wzbogacania populacji leukocytów Gr-1+ z śledziony mysiej. Metoda ta wykorzystuje cytometrię przepływową oraz sortowanie komórek AutoMACS w celu wyizolowania żywych leukocytów Gr-1+ przed sortowaniem MDSC metodą FACS do późniejszych analiz in vivo oraz in vitro.

Przygotowanie mieloidalnych komórek supresorowych (MDSC) od myszy naiwnych oraz myszy z nowotworem trzustki z wykorzystaniem cytometrii przepływowej i zautomatyzowanego magnetycznego sortowania komórek aktywowanych (AutoMACS)

Poznaj cytometrię przepływową sterowaną bazą danych do oceny dojrzewania komórek szpiku kostnego. Ta metoda zwiększa dokładność diagnostyczną zespołów mielodysplastycznych poprzez redukcję subiektywności analizy.

Cytometria przepływowa sterowana bazą danych do oceny dojrzewania komórek szpiku kostnego

Przeglądaj więcej filmów