Cytometria przepływowa sterowana bazą danych do oceny dojrzewania komórek szpiku kostnego
November 3rd, 2018
Diagnoza MDS jest trudna ze względu na brak kryteriów morfologicznych lub cytogenetyki bez informacji. MFC może pomóc udoskonalić proces diagnostyczny MDS. Aby analiza MFC stała się przydatna w praktyce klinicznej, musi opierać się na parametrach o wystarczającej swoistości i czułości, a dane powinny być powtarzalne dla różnych operatorów.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w diagnostyce chorób szpikowych, takich jak zespoły mielodysplazji lub inne choroby hematologiczne, które rozwijają się wraz z nieprawidłowościami dojrzewania w liniach komórek szpikowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że zmniejsza ona subiektywność badacza w tej analizie i interpretacji. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat tego, które parametry są najbardziej dyskryminujące dla mielodysplazji.
Pozwala to na ilościowe określenie różnic w stosunku do normalnych populacji komórek szpikowych. Procedurę zademonstruje Tiphanie Picot, adiunkt z naszego laboratorium. Rozpocznij od zmieszania 600 mikrolitrów pierwotnej próbki komórek z 10 mililitrami buforu płuczącego w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów do dwóch wirowań i 10 mililitrów świeżego buforu do płukania na pranie.
Po drugim przemyciu ponownie zawiesić osad w 400 mikrolitrach świeżego buforu do przemywania i przenieść 350 mikrolitrów zawiesiny komórek do pięciomililitrowej probówki FACS z polipropylenu, zawierającej cały panel przeciwciał szkieletowych. Po dokładnym wymieszaniu komórek, odpipetować równe objętości roztworu przeciwciała komórkowego do trzech nowych probówek polipropylenowych i w razie potrzeby doprowadzić końcową objętość w każdej probówce do 200 mikrolitrów ze świeżym buforem do mycia. Następnie dodać odpowiednią objętość przeciwciał przeciwko markerom powierzchniowym komórki, które są przedmiotem zainteresowania, mieszając, w celu 30-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej, chronionej przed światłem.
Pod koniec inkubacji dodać dwa mililitry roztworu lizującego z mieszaniem, na 10-minutową inkubację w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Zebrać zlizowane komórki przez odwirowanie i wyrzucić wszystkie oprócz ostatnich 50 mikrolitrów supernatantu do każdej probówki, nie naruszając osadu. Ponownie zawiesić granulki w pozostałym supernatancie, delikatnie mieszając, i dodać dwa mililitry świeżego buforu płuczącego do każdej próbki.
Po drugim przemyciu wyrzucić supernatant, pozostawiając około 50 mikrolitrów pozostałej objętości w każdej probówce, nie naruszając osadu. Ponownie zawiesić granulat w 200 mikrolitrach PBS z mieszaniem, w celu natychmiastowej analizy. Aby odczytać próbki na cytometrze przepływowym, najpierw otwórz nowy eksperyment w oprogramowaniu cytometru przepływowego i zmień nazwę eksperymentu zgodnie z nazwą, typem próbki i datą.
Utwórz nową próbkę dla trzech probówek i określ przeciwciała użyte w każdej probówce w układzie eksperymentu. Otwórz ustawienia cytometru i wybierz ustawienia aplikacji, aby zastosować wartości uzyskane w konfiguracji miesięcznej. Otwórz nowy globalny arkusz roboczy i utwórz odpowiednie wykresy kropkowe do bramkowania komórek singletowych, a także dla populacji granulocytów, monocytów, blastów i limfocytów.
Utwórz nowy arkusz globalny dla formantów wynagrodzeń. Następnie należy pozyskać 500 000 zdarzeń z każdej lampy, ze średnią szybkością akwizycji, eksportując dane jako pliki fcs 3.0 po ich walidacji technicznej. Przed rozpoczęciem nowej analizy należy pobrać pliki cyt zawierające normalne dane szpiku kostnego dla neutrofili, monocytów i jądrzastych linii czerwonych oraz pliki analizy w formacie inp.
Następnie zapisz dane na pulpicie. W celu zapisania dojrzewania neutrofili w bazie danych, należy najpierw otworzyć oprogramowanie Infinicyt, a następnie otworzyć plik cyt odpowiadający danym dojrzewania neutrofili. Narysuj szlak dojrzewania na wykresie APS i zapisz szlak dojrzewania neutrofili w bazie danych.
Otwórz plik fcs dla dojrzewania linii neutrofili, która ma być analizowana. Prześlij plik inp dojrzewania neutrofili z zakładki profile. Analiza dla tej linii jest podzielona na trzy etapy.
Zacznij od wyboru CD34-dodatnich, zaangażowanych w neutrofile blastów. W tym celu należy użyć przecięcia siedmiu bramek, aby umożliwić wybór zdarzeń CD34 dodatnich, CD117 dodatnich, niskich HLAD, CD10 ujemnych, CD13 dodatnich, CD11 b-ujemnych. Kontynuować analizę z wyborem prekursorów neutrofili CD117 dodatnich i CD34 ujemnych.
Kontynuuj analizę, wybierając bardziej dojrzałe komórki neutrofilowe. Następnie pokaż analizę monocytowych komórek liniowych. Narysuj ścieżkę dojrzewania na wykresie APS.
Sprawdź, czy strzałka wskazująca poczucie dojrzewania jest zorientowana od niedojrzałych komórek monocytowych, CD14 ujemnych, IREM2 ujemnych, do dojrzałych monocytów, CD14 dodatnich, IREM2 dodatnich. Zapisz ścieżkę dojrzewania dla linii monocytowej w bazie danych. Otwórz plik fcs dla dojrzewania linii monocytowej, która musi zostać przeanalizowana.
Prześlij profil do analizy pochodzenia monocytów. Aby zidentyfikować komórki linii monocytowej, użyj przecięcia czterech bramek, które umożliwiają wybór zdarzeń CD64 dodatnich wysokich, CD117 dodatnich, CD117 ujemnych, HLADR. Przypisz te zdarzenia do zakładki monocytów w drzewie hierarchii populacji.
Otwórz plik cyt NRC, który ma być zapisany w bazie danych NRC. Narysuj ścieżkę dojrzewania na wykresie APS i zapisz ścieżkę dojrzewania jądrzastych krwinek czerwonych w bazie danych. Otwórz plik fcs, który ma zostać przeanalizowany.
Prześlij z profili szablon analizy dla jądrzastych krwinek czerwonych. Analiza dla tej linii jest podzielona na dwa etapy. Począwszy od wyboru CD34 dodatniego, erytroidalne wybuchy.
Tutaj użyj przecięcia siedmiu bramek, aby umożliwić wybór zdarzeń CD34 dodatnich, CD117 dodatnich, niskich HLAD, CD105 dodatnich, CD33 ujemnych, CD36 dodatnich, CD71 dodatnich. Przypisz te zdarzenia do zakładki NRC w hierarchii populacji. Usuń z widoczności wybuchy popełnione przez erytroidy CD34 dodatnie.
Aby zidentyfikować bardziej dojrzałe komórki erytroidalne, użyj przecięcia czterech bramek, które umożliwiają rozróżnienie CD45 ujemnego i CD45 dodatniego dołka, niskiego rozproszenia bocznego, dodatniego CD36 wysokiego i CD71 dodatniego haju. Następnie usuń CD36 z niskimi płytkami krwi po stronie zarodkowanej i przypisz tę populację do zakładki NRC. Aby ocenić dojrzewanie szpiku w przedziale szpiku kostnego, otwórz plik cyt odpowiadający interesującej linii z przypadku, który ma być oceniany.
Pozostaw widoczne tylko te zdarzenia przypisane do zakładki neutrofili w drzewie hierarchii populacji. Narysuj ścieżkę dojrzewania na wykresie APS i załaduj bazę danych odpowiadającą dojrzewaniu neutrofili w normalnym szpiku kostnym i porównaj dane. Jeśli dane są przynajmniej częściowo zgodne, oprogramowanie utworzy znormalizowany diagram różnic dojrzewania oraz pasmo parametrów, aby zobrazować różnice dojrzewania.
Aby porównać dojrzewanie monocytów w przedziale szpiku kostnego, dla nowego przypadku z danymi z normalnych szpików kostnych, w tym z bazy danych monocytów, otwórz plik cyt odpowiadający linii komórek monocytowych. Pozostaw widoczne tylko zdarzenia przypisane do zakładki monocyty w drzewie hierarchii populacji i narysuj ścieżkę dojrzewania na wykresie APS. Załaduj bazę danych odpowiadającą dojrzewaniu monocytów w prawidłowych szpikach kostnych i porównaj dane.
Aby porównać dojrzewanie jądrzastych krwinek czerwonych w przedziale szpiku kostnego, dla nowego przypadku, z danymi z normalnych szpików kostnych, zawartych w bazie danych NRC, otwórz plik cyt odpowiadający linii NRC. Pozostaw widoczne tylko te zdarzenia przypisane do zakładki NRC w drzewie hierarchii populacji. I narysuj ścieżkę dojrzewania na wykresie APS.
Załadować bazę danych odpowiadającą dojrzewaniu NRC w prawidłowym szpiku kostnym i porównać dane. Następnie, aby zobrazować znaczenie różnic między nowym plikiem a danymi zawartymi w bazie danych, kliknij znormalizowane różnice dojrzewania i powiększ. Należy pamiętać, że metody, które wykorzystują hierarchiczne algorytmy klasyfikacyjne w analizie danych cytometrii przepływowej, są wysoce subiektywne i z natury niedokładne, ponieważ nie uwzględniają nakładania się populacji komórek.
Ocena nowych przypadków cytopenii, podejrzewanej o MDS, w stosunku do baz danych prawidłowego dojrzewania szpiku, pozwala na identyfikację nieprawidłowo wyrażonych antygenów dojrzewania linii neutrofilów, monocytów i NRC, nawet w przypadkach bez nieprawidłowości cytologicznych lub cytogennych. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o uzyskaniu danych cytometrii przepływowej w ustandaryzowany sposób, w celu przeprowadzenia comiesięcznej konfiguracji cytometru, codziennych kontroli, rygorystycznego pipetowania przeciwciała przed użyciem oraz przestrzegania czasu barwienia. Zgodnie z tą procedurą, można zastosować inne metody, takie jak kompas, aby porównać różne grupy przypadków i odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak ostateczny typowy odcisk dla określonej grupy przypadków.
Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zainteresowanym badaniem wzorców dojrzewania komórek szpikowych, w przypadkach hematopoezy klonalnej o nieokreślonym potencjale, w celu zidentyfikowania końcowych typowych zmian wiarygodnie związanych z procesem dysplastycznym. Należy pamiętać, że aktualizacja bazy danych o zwiększoną liczbę danych od zdrowych dawców może poprawić wiarygodność analizy.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł omawia zastosowanie wieloparametrowej cytometrii przepływowej (MFC) w celu poprawy procesu diagnostycznego w przypadku zespołów mielodysplastycznych (MDS). Podkreśla znaczenie specyficzności i czułości w analizie MFC do zastosowań klinicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Hematologia
- Choroby mieloidalne
- Techniki diagnostyczne
Tło
- Diagnoza MDS jest trudna bez kryteriów morfologicznych.
- Nieinformacyjna cytogenetyka komplikuje proces diagnostyczny.
- MFC może potencjalnie udoskonalić proces diagnozy MDS.
- Powtarzalność danych między operatorami jest kluczowa.
Cel badania
- Ocenić skuteczność MFC w diagnozowaniu chorób mieloidalnych.
- Zidentyfikować najbardziej dyskryminacyjne parametry dla mielodysplazji.
- Zmniejszyć subiektywność w analizie i interpretacji.
Zastosowane metody
- Mieszanie pierwotnych próbek komórek z buforem do płukania.
- Przeprowadzanie wirowania w celu przygotowania próbki.
- Ilościowe określanie różnic w populacjach normalnych komórek mieloidalnych.
- Demonstrowanie procedury przez doktoranta.
Główne wyniki
- MFC zapewnia wgląd w różnice w populacjach komórek mieloidalnych.
- Technika zmniejsza subiektywność badacza.
- Pozwola na ilościową ocenę parametrów dyskryminacyjnych.
- Podkreślana jest powtarzalność danych dla użyteczności klinicznej.
Wnioski
- MFC może poprawić dokładność diagnozy MDS.
- Specyficzność i czułość są istotne dla zastosowań klinicznych.
- Wymagana jest dalsza walidacja dla szerokiego zastosowania klinicznego.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Standardized flow cytometry databases for myeloid maturation enable objective, quantitative assessment of hematologic dysplasia, reducing investigator subjectivity in diagnostic interpretation. This approach supports early detection of myelodysplastic syndromes by identifying phenotypic deviations from healthy donor baselines, enhancing diagnostic confidence in preclinical and translational hematology research. The method facilitates cross-laboratory reproducibility, a critical factor for biomarker validation and assay transfer in drug discovery pipelines targeting myeloid malignancies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of myeloid differentiation pathways through quantitative comparison of cell maturation profiles against established normal baselines.
- Operational Value: Reduces analytical variability in target validation studies by minimizing subjectivity in flow cytometric gating and interpretation.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by identifying early maturation defects in preclinical models of hematopoietic disorders.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a framework for assay standardization using lineage-specific maturation databases to ensure consistent phenotypic readouts across screening campaigns.
- Operational Value: Enables robust quantitative outputs for compound effect assessment on myeloid differentiation, supporting hit-to-lead progression.
- Assay Readiness: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream applications by establishing normalized maturation trajectories.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical stages by allowing direct comparison of experimental models to healthy human myeloid maturation benchmarks.
- Biomarker Alignment: Supports identification of lineage-specific phenotypic abnormalities that may serve as translational biomarkers in myeloid disease models.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven go/no-go decisions based on maturation deviation thresholds (e.g., 2SD from normal) in preclinical efficacy studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery workflow by providing standardized phenotypic readouts that inform target validation, assay development, and preclinical model qualification for myeloid-targeted therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of myeloid differentiation pathways through objective, database-referenced maturation analysis.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility by anchoring compound-induced phenotypic changes to established normal maturation baselines.
- Analytics: Generates quantitative maturation difference diagrams and parameter bands that allow statistical comparison of experimental conditions against healthy donor data.
- Translational Research: Connects in vitro or in vivo findings to human-relevant myeloid maturation standards, supporting preclinical-to-clinical translation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable analytical framework for consistent myeloid maturation assessment across multiple projects and sites.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in myeloid differentiation assessments.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of flow cytometry assays through standardized database-driven analysis.
- Strategic Value: Improves portfolio decision-making by enabling objective, quantitative evaluation of myeloid dysplasia risk in preclinical models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on myeloid maturation trajectories.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiparameter flow cytometry and hematologic marker panels for myeloid lineage identification.
- Depends on access to validated antibody panels and standardized instrument setup protocols for reproducible data acquisition.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation, staining, and acquisition protocols to ensure database comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the method to non-human model systems or alternative maturation markers.
- Limited by inter-laboratory variability in antibody performance, particularly those derived from hybridoma technologies, which may affect data harmonization.
