1: Histotypiczna kultura tkankowa

Histotypiczna hodowla tkankowa pozwala na hodowlę komórek w trzech wymiarach, tworząc w ten sposób morfologie tkanek in vitro, które ściśle naśladują realistyczne funkcje tkanek, które można wykorzystać jako żywotne konstrukty do naprawy tkanek. Kultury te są zazwyczaj trójwymiarowymi strukturami składającymi się z pojedynczego typu komórek hodowanych w dużej gęstości. Trójwymiarowa struktura, znana również jako rusztowanie, naśladuje naturalną macierz zewnątrzkomórkową. W zależności od użytego typu komórki, rusztowania mogą być zaprojektowane do konkretnego zastosowania i zazwyczaj działają jako szablon dla tkanki biomimetycznej. Ten film wprowadzi podstawy histotypowych kultur tkankowych, procedurę izolacji komórek oraz wytwarzanie i celularyzację porowatego rusztowania z jedwabiu w celu naśladowania tkanki sercowej.

Wszystkie tkanki składają się z dwóch podstawowych elementów, macierzy zewnątrzkomórkowej i komórek specyficznych tkankowo, które ją zamieszkują. Macierz zewnątrzkomórkowa to sieć białek strukturalnych, które tworzą trójwymiarowe środowisko, w którym mogą zajmować się komórki, a komórki w niej zawarte mają za zadanie podsumować natywne procesy fizjologiczne tkanki. Obecnie powszechną techniką stosowaną do modelowania tkanek jest dwuwymiarowa hodowla tkankowa, w której komórki są dozowane na płaskie podłoże i pozostawiane do utworzenia cienkiej warstwy. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta nie jest wiarygodna w utrzymywaniu fenotypu in vivo, funkcji specyficznych dla narządu oraz interakcji kontekstowych między komórkami lub komórkami-substratami. Histotypiczna hodowla tkankowa łagodzi te ograniczenia, zapewniając rusztowanie 3D, na którym mogą rosnąć komórki, co skutkuje gęstą siecią komórek, która bardziej naśladuje natywne morfologie komórek i ułatwia rozwój realistycznych sieci międzykomórkowych i szlaków komunikacyjnych. Różnorodne sieci polimerowe 3D, w tym hydrożele i elektroprzędzone maty jedwabne, oferują wygodne sposoby hodowli komórek specyficznych tkankowo w trzech wymiarach. Aby zaludnić te rusztowania, komórki muszą zostać odizolowane. Komórki pierwotne użyte w tym filmie są zbierane z żywej tkanki, która jest mielona, a następnie trawiona w roztworze enzymu w celu oddzielenia komórek docelowych od macierzy zewnątrzkomórkowej. Po wyizolowaniu komórek stosuje się dwie techniki zasiewania rusztowań. Technika kropelkowa polega na pipetowaniu roztworu komórek na rusztowanie z powolną i stałą szybkością. Druga, czyli technika zawieszenia komórek, polega na zanurzeniu rusztowania w zawiesinie komórki. Często rusztowanie i zawiesina są wstrząsane, aby pobudzić migrację komórek do macierzy. Obie techniki prowadzą do powstania bioinżynieryjnych konstruktów o dużej gęstości komórek. Poniższe procedury będą obejmowały izolację komórek serca i technikę zawieszania komórek w celu stworzenia rusztowania specyficznego dla komórek serca, ponieważ zachowa ono natywną morfologię tkanki serca.

Aby rozpocząć proces izolowania komórek od tkanki dawcy, zacznij od upewnienia się, że obszar roboczy i narzędzia preparacyjne są wysterylizowane. Następnie umieść sterylną serwetę na powierzchni roboczej w szafie bezpieczeństwa biologicznego. Umieść sterylne narzędzia chirurgiczne na serwecie, nie dotykając ich, a następnie otwórz sterylne ostrze skalpela numer 20. Po eutanazji próbki należy wysterylizować obszar operacyjny gazikiem nasączonym betadyną. Gdy będzie gotowy, zabezpiecz próbkę i rozpocznij zabieg chirurgiczny w celu wyizolowania interesującej tkanki. W tym przypadku będzie to serce. Po wycięciu umieść tkankę na lodzie na szalce Petriego zawierającej glukozę PBS. Usuń resztki krwi lub tkanki łącznej, a następnie przenieś tkankę na szalkę Petriego ze świeżą glukozą PBS. Następnie, za pomocą sterylnych mikronożyczek i kleszczy, ostrożnie zmiel próbki tkanek na około 1 milimetrowe kawałki. Za pomocą pipety przenieś kawałki i bufor do stożkowej probówki. Następnie usuń wszystkie oprócz 10 mililitrów buforu. Dodaj 7 mililitrów roztworu kolagenazy, a następnie potrząsaj mieszaniną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 7 minut. Następnie delikatnie odpipetuj 10 razy, aby rozbić kawałki tkanki. Poczekaj, aż kawałki osiądą, a następnie zaessaj płyn i wyrzuć go. Następnie powtórz trawienie i delikatnie pipetuj roztwór, aby rozbić kawałki tkanki. Po osiadaniu kawałków odciągnij supernatant i zbierz go do osobnej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Następnie dodaj 10 mililitrów roztworu STOP do każdej stożkowej probówki zawierającej supernatant, aby zatrzymać trawienie.

Teraz, gdy pierwotne komórki zostały wyizolowane, stwórzmy porowate rusztowanie z jedwabnej tkanki. Na początek wlej 30 mililitrów roztworu jedwabiu do formy. Następnie równomiernie rozsyp 60 gramów przesianego chlorku sodu na roztworze. Następnie pozostaw jedwab do niezakłóconej polimeryzacji w temperaturze pokojowej przez 48 godzin. Następnie umieść formę w piekarniku o temperaturze 60 stopni na 1 godzinę, aby zakończyć sieciowanie i odparować pozostały płyn. Po polimeryzacji zanurz formę w zlewce z wodą destylowaną na 48 godzin, aby wypłukać sól. Następnie zdejmij rusztowanie z formy i wytnij małe krążki za pomocą 5-milimetrowego stempla do biopsji. Przytnij krążki do wysokości 2 milimetrów, a na koniec usuń środki każdego elementu za pomocą 2-milimetrowego stempla do biopsji, aby utworzyć pierścień. Na koniec sterylizuj rusztowania w autoklawie w cyklu mokrym przez 20 minut.

Po przygotowaniu rusztowania rozpocznijmy proces wysiewu komórek. Najpierw umieść jedno sterylne rusztowanie na studzience w płytce 96-dołkowej. Następnie dodaj pożywkę do hodowli komórkowych, aby zanurzyć rusztowania i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli tkankowych, aby zrównoważyć je przez co najmniej 30 minut. Po inkubacji odessać nadmiar pożywki, a następnie dodać izolowaną zawiesinę komórek pierwotnych do rusztowań. Następnie włóż płytkę z powrotem do inkubatora i pozostaw na noc, aby komórki przyczepiły się do rusztowań. Następnego ranka ostrożnie odessać nieprzyłączone komórki i zastąpić 200 mikrolitrami świeżej pożywki do hodowli komórkowych na dołek. Powstałe rusztowanie jest porowatą konstrukcją o dużej gęstości komórek, gotową do użycia.

Teraz, gdy nauczyłeś się wykonywać histotypową hodowlę tkankową, przyjrzyjmy się niektórym praktycznym zastosowaniom tych materiałów. Histotypicowa hodowla tkankowa może tworzyć mikrośrodowiska komórkowe, które naśladują tkanki natywne, a w rezultacie są w stanie zapewnić odpowiedni model do badania zachowania komórkowego w odniesieniu do pojedynczego typu komórki. Na przykład włókno 3D w rusztowaniach, które dokładniej naśladuje niszę komórek macierzystych znalezioną in vivo, można obsiać pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi w celu zbadania sygnałów biologicznych i określenia ich wpływu na różnicowanie komórek macierzystych. Prace te mogą ostatecznie zapewnić lepsze zrozumienie różnicowania komórek macierzystych i mogą dostarczyć informacji na temat poprawy różnicowania i regeneracji komórek w zastosowaniach inżynierii tkankowej. Podobnie jak hodowle dynamiczne, kondycjonowanie mechaniczne może również wzmocnić rusztowanie tkankowe 3D, poddając je różnym obciążeniom mechanicznym, których naturalna tkanka może doświadczyć in vivo. Stosując obciążenia ściskające i dwuosiowe podczas wzrostu komórek, morfologia komórki i macierz zewnątrzkomórkowa są zmieniane, aby odzwierciedlić te obciążenia mechaniczne. W ten sposób powstaje wstępnie kondycjonowane, bioinżynieryjne rusztowanie tkankowe o strukturze komórkowej przypominającej tkankę natywną, dzięki czemu idealnie nadaje się do implantacji w obszarach, w których mogą występować podobne siły mechaniczne. Wreszcie, zmodyfikowane konstrukty tkankowe mogą być również wykorzystywane do zastępowania lub naprawy ubytków tkanek. Aby to osiągnąć, rusztowanie tkankowe musi być najpierw unaczynione, umożliwiając w ten sposób swobodny przepływ krwi przez konstrukt. Po unaczynieniu rusztowanie może zostać przeniesione i wszczepione w ubytek tkanki w celu zainicjowania naprawy. Udany przeszczep można później potwierdzić za pomocą histologii, która ujawnia, czy konstrukt tkankowy całkowicie naprawił uszkodzony obszar.

Właśnie obejrzałeś wprowadzenie Jowisza do histotypowej hodowli tkankowej. Powinieneś teraz zrozumieć, jak przygotowywane są proste struktury 3D, w jaki sposób komórki pierwotne są izolowane i umieszczane na rusztowaniu oraz jakie są różne zastosowania tych kultur w dziedzinie bioinżynierii. Dzięki za oglądanie.