Name: Długoterminowe śledzenie in vivo dynamiki komórek zapalnych w poczwarkach Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-14T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Poznaj metodę długoterminowego obrazowania in vivo procesu gojenia ran i odpowiedzi zapalnej w poczwarkach Drosophila. Technika ta umożliwia śledzenie migracji hemocytów i badanie mechanizmów wrodzonej odporności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować członkom laboratoriów Martin, Nobes, Richardson i Wood za pomocną dyskusję. Dziękujemy również Wolfson Bioimaging Facility (University of Bristol, Wielka Brytania), Bloomington Stock Centre (University of Indiana, USA) oraz Vienna Drosophila Resource Centre (dla stad Drosophila) i Flybase (za aktualną adnotację genu Drosophila). Praca ta została wsparta grantem MRC Project Grant dla P.M. i W.W. (MR/J002577/1), stypendium Wellcome Trust Senior Fellowship dla W.W. oraz Wellcome Trust Investigator Award dla P.M..

Ten protokół składa się z czterech głównych etapów: (1) Przygotowanie stad Drosophila i inscenizacja poczwarek Drosophila, (2) Rozwarstwienie i montaż poczwarki, (3) Ranienie poczwarki, (4) Obrazowanie konfokalne in vivo w czasie poklatkowym.
1. Przygotowanie stad Drosophila i inscenizacja poczwarek
<ol>
	<li>Zaopatrzyć się w odpowiednie stada Drosophila (patrz Wprowadzenie i Spis materiałów).</li>
	<li>Zbieraj młode, zdrowe dorosłe muchy o odpowiednim genotypie.
	<ol>
		<li>Wybierz dorosłe muchy, używając podkładek z dwutlenkiem węgla, aby na krótko znieczulić muchy i cienkiego pędzla, aby przenieść muchy o odpowiednim genotypie lub płci do fiolki do pobrania.</li>
		<li>Dodać 20 dziewiczych samic i 20 samców do każdej fiolki zawierającej standardowe podłoże pokarmowe dla much (mieszanina mąki kukurydzianej, melasy i agaru, patrz tabela materiałów) uzupełnioną drożdżami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu uzyskania optymalnego pokolenia poczwarek, dorosłe muchy powinny codziennie podawać nowy pokarm w świeżych fiolkach, utrzymując wszystkie fiolki w temperaturze 25 °C. 
	Uwaga: Jeśli system Gal4-UAS 31 jest używany do sterowania ekspresją genów specyficzną dla linii, wszystkie kroki powinny być wykonywane w temperaturze 25 °C lub wyższej, ponieważ system Gal4-UAS jest wrażliwy na temperaturę.</li>
	<li>Na 18 godzin przed planowaną sesją obrazowania należy pobrać co najmniej 10 nowo utworzonych białych poczwarek (<silna klasa="xfig">Ryc. 1A) z fiolek (tj. 0 godzin po utworzeniu poczwarki, APF) za pomocą kleszczy lub cienkiego pędzla, aby usunąć poczwarki z wewnętrznej powierzchni fiolki i ostrożnie przenieść poczwarki na bok czystej, pustej plastikowej fiolki. 
	Uwaga: Wędrujące larwy w 3. stadium wypełzają w górę z pożywki pokarmowej, aby przejść przepoczwarzenie; Nowo powstałe białe poczwarki są łatwe do zidentyfikowania, ponieważ mają przetchlinki przednie i są nieruchome (w przeciwieństwie do larw w 3.stadium). Naskórek przekształca się w "puparium" (obudowę poczwarki), która początkowo jest miękka i biała17. Należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić poczwarek, ponieważ może to prowadzić nie tylko do niepożądanej reakcji zapalnej wywołanej urazem, ale także do znacznego opóźnienia rozwoju.</li>
	<li>Starzeć wybrane poczwarki do odpowiedniego stadium rozwojowego (18 h APF da optymalne wyniki) w fiolce w temperaturze 25 °C. 
	Uwaga: W miarę rozwoju poczwarek obudowa poczwarki będzie stawać się coraz ciemniejsza i bardziej krucha.</li>
	<li>Przygotuj inne odczynniki do następnego kroku z wyprzedzeniem. Aby zrobić klej heptanowy, połącz zwiniętą taśmę dwustronną o długości 20 cm z 20 ml heptanu w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml, uszczelnij folią parafinową i rozbujaj przez noc w temperaturze pokojowej na stole.</li>
</ol>
2. Przygotowanie i rozbiór poczwarek Drosophila 
<ol>
	<li>Przenieś poczwarki Drosophila na kawałek dwustronnej taśmy klejącej zamontowanej na szkiełku podstawowym. Ustaw poczwarki tak, aby strona brzuszna była mocno przyklejona do taśmy, a strona grzbietowa była skierowana do góry (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). 
	Uwaga: Przednia część poczwarki będzie możliwa do zidentyfikowania na podstawie dwóch przetchlinków wystających z przedniego końca koperty poczwarki.</li>
	<li>Ostrożnie usuń poczwarki z ich ochronnej osłony poczwarki pod mikroskopem preparacyjnym w jasnym polu za pomocą kleszczy i mikronożyczek (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B-D).
	<ol>
		<li>Początkowo wykonaj nacięcie w najbardziej przedniej części poczwarki za pomocą kleszczy (<silna klasa="xfig">Ryc. 1B). Upewnij się, że poczwarka w tym obszarze jest pusta i pozbawiona tkanki poczwarki, ponieważ poczwarki skurczą się w obrębie koperty we wczesnym rozwoju poczwarki.</li>
		<li>Po tym początkowym nacięciu ostrożnie rozerwij lub rozetnij obudowę poczwarki w kierunku od przodu do tyłu za pomocą kleszczy lub mikronożyczek (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C), aż poczwarka będzie całkowicie wolna od brązowej, nieprzezroczystej, kruchej osłonki (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1D). 
		Uwaga: Poczwarki na tym etapie są bardzo delikatne i należy zachować ostrożność, aby nie przebić powierzchni poczwarki; Nakłucie jest oczywiste, ponieważ hemolimfa szybko wycieka z miejsca nakłucia. Poczwarki z nakłuciami, nawet małe, należy wyrzucić.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamontuj poczwarki w naczyniu ze szklanym dnem za pomocą kleju heptanowego.
	<ol>
		<li>Za pomocą końcówki pipety o pojemności 20 ml umieścić 10 ml kropli wstępnie przygotowanego kleju heptanowego (patrz sekcja 1.6 powyżej) w linii na naczyniu ze szklanym dnem.</li>
		<li>Pozostaw klej do wyschnięcia na 5 sekund, a następnie ostrożnie przenieś wypreparowane poczwarki na klej heptanowy za pomocą kleszczy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E).</li>
		<li>Dla ułatwienia zranienia i obrazowania, ustaw poczwarki w rzędzie; sugeruje się około 5 poczwarek, ale więcej będzie można opanować z doświadczeniem. 
		Uwaga: Stosowanie kleju heptanowego jest zalecane w przypadku korzystania z pionowych systemów obrazowania, ale nie jest konieczne w przypadku korzystania z systemu odwróconego. Jeśli klej tworzy aberracje optyczne podczas obrazowania, poczwarki można zamiast tego umieścić bezpośrednio na szkle nakrywkowym – naturalne przyleganie między tkanką poczwarki a szkłem będzie w większości przypadków wystarczające do stabilnego obrazowania, o ile zachowa się ostrożność podczas przesuwania czaszy obrazowania między mikroskopami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby uzyskać najlepsze wyniki, zamontuj poczwarki tak, aby skrzydło było płasko na szkle nakrywkowym, a większość powierzchni skrzydła miała bezpośredni kontakt ze szkłem nakrywkowym (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1F). Zwiń poczwarki za pomocą kleszczy, aby zmienić ich położenie, aby upewnić się, że skrzydło jest prawidłowo zamontowane.</li>
	<li>Aby zapobiec odwodnieniu próbki w okresie obrazowania, dodaj kawałek chłonnej bibuły filtracyjnej nasączonej wodą destylowaną na bok naczynia ze szklanym dnem pod koniec montażu, uważając, aby nie naruszyć poczwarki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1E). Przykryj naczynie pokrywką. 
	Uwaga: Poczwarki są teraz gotowe do zranienia i obrazowania.</li>
</ol>
3. Laserowe ranienie skrzydeł poczwarki Drosophila 
<ol>
	<li>Przenieść naczynie ze szklanym dnem zawierające zamontowane poczwarki do mikroskopu szerokokątnego wyposażonego w przestrajalny system ablacji laserowej.
	<ol>
		<li>Użyj impulsowego lasera ablacyjnego chłodzonego powietrzem UV, pompowanego azotem, dostrojonego do 435 nm – szczegóły w Tabeli Materiałów11; dokładna długość fali światła używanego do oświetlenia jest wybierana przez użytkownika za pomocą odpowiedniego ogniwa barwnikowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Korzystając z optyki jasnego pola, dostosuj elementy sterujące stolika mikroskopu, aby zlokalizować skrzydło poczwarki pierwszej poczwarki, która ma zostać zraniona (<silna klasa="xfig">Rysunek 1F).</li>
	<li>Aby uzyskać optymalne wyniki, należy używać soczewek obiektywowych z olejkiem 40X lub 63X zarówno do obrazowania, jak i do ablacji laserowej; upewnij się, że użyty płyn immersyjny (olej lub glicerol) jest spójny między systemami ablacji i obrazowania. Ustaw mikroskop tak, aby ustawił ostrość na płaszczyźnie nabłonka skrzydła poczwarki najbliżej szkiełka nakrywkowego (tj. ustaw ostrość na obszarze nabłonka, który ma zostać zraniony) za pomocą pokrętła precyzyjnego ustawiania ostrości.</li>
	<li>Korzystając z regulacji stolika mikroskopu, ustaw skrzydło poczwarki tak, aby obszar, który ma zostać zraniony, był bezpośrednio wyrównany ze znanym obszarem docelowym lasera ablacyjnego.</li>
	<li>Użyj szkiełka tłumiącego gęstość energii zamontowanego na mikroskopie, aby ręcznie wyregulować poziom mocy światła ablacyjnego. 
	Uwaga: Suwak tłumika ma ograniczniki kliknięcia i liniatury, które identyfikują względny poziom tłumienia i umożliwiają korzystanie z powtarzalnych ustawień.</li>
	<li>Korzystając z zewnętrznego ręcznego spustu, aktywuj laser ablacyjny za pomocą jednego krótkiego kliknięcia spustu, aby wykonać ranę. Sprawdź, czy w miejscu ablacji nie pojawił się przejściowy pęcherzyk powietrza, ponieważ zwykle towarzyszy mu zranienie. Sprawdź, czy zranienie wywołane laserem powiodło się, używając odpowiednich filtrów fluorescencyjnych do wizualizacji nabłonka poczwarki. 
	Uwaga: Uważaj, aby uniknąć przypadkowego narażenia na wiązki laserowe, ponieważ odbicia wiązki mogą spowodować poważne uszkodzenie oczu lub skóry.</li>
	<li>Jeśli zranienie się nie powiedzie, zmień płaszczyznę ogniskowej (przesuwając ostrość mikroskopu nieco powyżej lub poniżej bieżącego poziomu ogniskowej) i powtórz pojedyncze kliknięcie spustu ablacji. Alternatywnie, stopniowo zwiększaj moc lasera za pomocą suwaka tłumika, aż do uzyskania pożądanego rozmiaru rany.</li>
	<li>Aby zmienić częstotliwość powtarzania impulsów lasera ablacyjnego, użyj pokrętła Częstotliwość powtarzania na tylnym panelu sterowania (które zmienia częstotliwość od mniej niż 1 impulsu/s do 60 Hz). Aby uzyskać optymalne nawijanie, ustaw częstotliwość powtarzania impulsów na 40 Hz.</li>
	<li>Aby wygenerować rany o różnych rozmiarach, użyj suwaka tłumika gęstości energii, aby ręcznie dostosować poziom mocy światła ablacyjnego.</li>
	<li>Powstrzymaj się od ranienia wszystkich dosiadanych poczwarek i używaj tych nieablowanych poczwarek jako niezranionych kontrol</li>.
	<li>Aby uzyskać spójne wyniki, należy regularnie ustawiać system ablacji (korzystając z odpowiedniej instrukcji obsługi). Wyczyść również i napełnij komórkę rezonatora barwnika, która kontroluje długość fali wyjściowej lasera.</li>
</ol>
4. Obrazowanie konfokalne in vivo w czasie poklatkowym
<ol>
	<li>Szybko przenieś naczynie ze szklanym dnem do odpowiedniego mikroskopu w celu wykonania zdjęć poklatkowych. 
	Uwaga: Aby uzyskać optymalne wyniki, należy użyć wysokiej jakości mikroskopu konfokalnego lub z wirującym dyskiem, wyposażonego w czułe detektory, które mogą wykrywać zarówno fluorofory GFP, jak i mCherry.</li>
	<li>Aby zobrazować całe skrzydło poczwarki, użyj soczewki obiektywu o małym powiększeniu (np. 20X) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Aby zobrazować gojenie się ran i towarzyszącą im reakcję zapalną z wysoką rozdzielczością przestrzenną, należy użyć soczewek obiektywowych 40X (NA 1.3) lub 63X (NA 1.4) (patrz reprezentatywne zdjęcia w <silna klasa="xfig">Rysunek 2B-D).</li>
	<li>Otwórz odpowiednie oprogramowanie do przechwytywania obrazu skojarzone z mikroskopem.</li>
	<li>Korzystając z oprogramowania do przechwytywania obrazu, włącz odpowiednie lasery, np. lasery 488 nm i 561 nm, aby uwidocznić odpowiednio fluorofory GFP i mCherry (klikając odpowiednie pola) i dostosuj moc lasera oraz ustawienia wzmocnienia/przesunięcia, aby uzyskać wystarczający sygnał fluorescencyjny, unikając nasycenia pikseli; użyj najniższej możliwej mocy lasera (w zakresie 5 - 20%), aby zminimalizować fotowybielanie i fototoksyczność.</li>
	<li>Aby uchwycić zarówno naprawczy nabłonek, jak i rekrutację komórek zapalnych, ustaw mikroskop tak, aby rejestrował stos z za pomocą pokręteł precyzyjnej regulacji ostrości na panelu sterowania; Aby uzyskać optymalne wyniki, ustaw oprogramowanie (za pomocą ręcznych kliknięć przycisków) tak, aby rejestrowało plasterki Z przez skrzydło poczwarki (minimum co 3 mm), od góry uszkodzonego nabłonka do przestrzeni zewnątrzkomórkowej poniżej (zawierającej migrujące hemocyty), aby uzyskać duży stos Z (w zakresie 50 - 100 mm).</li>
	<li>W przypadku obrazowania poklatkowego rejestruj stosy z w regularnych odstępach czasu (minimum co 30 s) przez co najmniej 1 godzinę po zranieniu. 
	Uwaga: Dokładny odstęp czasu między wybranymi stosami z stanowi kompromis między uchwyceniem szybko zmieniającej się dynamiki komórek a uniknięciem fotowybielania próbek.</li>
	<li>Aby jednocześnie obrazować wiele poczwarek (w tym nieuszkodzone grupy kontrolne bez ablacji), należy użyć zmotoryzowanego stolika (dołączonego do mikroskopu) i funkcji akwizycji wielopozycyjnej dostępnej w oprogramowaniu do obrazowania. Ręcznie ustaw pozycję każdej pojedynczej poczwarki w oprogramowaniu za pomocą pokręteł regulacji pozycji sceny, a następnie ręcznie ustaw odpowiednie limity stosu z (góra i dół) dla każdej pojedynczej poczwarki.</li>
	<li>Wizualizuj obrazy poklatkowe podczas przechwytywania obrazu lub później za pomocą specjalistycznego oprogramowania do analizy obrazu (takiego jak ImageJ32) za pomocą projekcji z-stack lub renderowania 3D. Na przykład, aby śledzić ruchy poszczególnych hemocytów (jak w <silna klasa="xfig">Rysunek 2C' i D'), śledź jądra hemocytów za pomocą ogólnodostępnych wtyczek ImageJ "TrackMate" lub "Manual Tracking" (metody opublikowane w 33,34).</li>
	<li>Użyj fotokonwertowalnych sond (takich jak Kaede30) do selektywnej fotokonwersji i oznaczania podzbioru komórek nabłonkowych lub odpornościowych podczas obrazowania.
	<ol>
		<li>Otwórz odpowiednie moduły w oprogramowaniu do obrazowania, aby przeprowadzić fotokonwersję (np. FRAP, odzysk fluorescencji po module fotowybielania) i aktywuj laser 405 nm (klikając odpowiednie pole oprogramowania)35.</li>
		<li>Wybierz komórki, które mają zostać fotokonwertowane w oprogramowaniu FRAP za pomocą narzędzia do zaznaczania kwadratowego, okrągłego lub odręcznego. W oprogramowaniu FRAP ustaw przebieg czasowy fotokonwersji (wybielania) na pojedynczą iterację/klatkę i ustaw laser 405 nm na 20% mocy lasera. Ręcznie kliknij Rozpocznij eksperyment, aby przeprowadzić fotokonwersję.</li>
		<li>Wyjdź z modułu FRAP (kliknij Zamknij) i wróć do oryginalnego ekranu obrazowania w oprogramowaniu; użyj laserów 488 nm i 561 nm, aby zobrazować zachowanie komórek fotokonwertowanych i niefotokonwertowanych, konfigurując stos z i nagrywanie poklatkowe, jak powyżej. 
		Uwaga: Fotokonwertowane sondy pozostają stabilne przez wiele godzin po początkowej fotokonwersji, umożliwiając śledzenie zachowania fotokonwertowanych komórek w czasie (przez co najmniej 5 godzin). Na przykład, komórki zapalne w ranie mogą być selektywnie fotokonwertowane (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2F) i ich zachowanie obserwowane w miarę ustępowania z miejsca urazu (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2G i H).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Eming, S. A., Wynn, T. A., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+metabolism+in+tissue+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inflammation and metabolism in tissue repair and regeneration.</a> Science. 356 (6342), 1026-1030 (2017).</li>
<li>Crusz, S. M., Balkwill, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+cancer%3A+advances+and+new+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Inflammation and cancer: advances and new agents.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 12 (10), 584-596 (2015).</li>
<li>Martin, P., Nunan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+repair+in+acute+and+chronic+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of repair in acute and chronic wound healing.</a> British Journal of Dermatology. 173 (2), 370-378 (2015).</li>
<li>Razzell, W., Wood, W., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swatting+flies%3A+modelling+wound+healing+and+inflammation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+and+Mechanism%22%5BJournal%5D)">Swatting flies: modelling wound healing and inflammation in Drosophila.</a> Disease Model and Mechanism. 4 (5), 569-574 (2011).</li>
<li>Wood, W., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Functions+in+Tissue+Patterning+and+Disease%3A+New+Insights+from+the+Fly%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Cell%22%5BJournal%5D)">Macrophage Functions in Tissue Patterning and Disease: New Insights from the Fly.</a> Development Cell. 40 (3), 221-233 (2017).</li>
<li>Mohr, S. E., Smith, J. A., Shamu, C. E., Neumüller, R. A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+screening+comes+of+age%3A+improved+techniques+and+complementary+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">RNAi screening comes of age: improved techniques and complementary approaches.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (9), 591-600 (2014).</li>
<li>Muñoz-Soriano, V., López-Domenech, S., Paricio, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+mammalian+wound-healing+researchers+may+wish+to+turn+to+Drosophila+as+a+model%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Why mammalian wound-healing researchers may wish to turn to Drosophila as a model.</a> Experimental Dermatology. 23 (8), 538-542 (2014).</li>
<li>Weavers, H., Wood, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+a+Buzz+about+Macrophages%3A+The+Fly+as+an+In+Vivo+Model+for+Studying+Immune+Cell+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Creating a Buzz about Macrophages: The Fly as an In Vivo Model for Studying Immune Cell Behavior.</a> Developmental Cell. 38 (2), 129-132 (2016).</li>
<li>Stramer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+wound+inflammation+in+Drosophila+embryos+reveals+key+roles+for+small+GTPases+during+in+vivo+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration.</a> Journal of Cell Biology. 168 (4), 567-573 (2005).</li>
<li>Wood, W., Faria, C., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mechanisms+regulate+hemocyte+chemotaxis+during+development+and+wound+healing+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biolog%22%5BJournal%5D)">Distinct mechanisms regulate hemocyte chemotaxis during development and wound healing in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Cell Biolog. 173 (3), 405-416 (2006).</li>
<li>Razzell, W., Evans, I. R., Martin, P., Wood, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+flashes+orchestrate+the+wound+inflammatory+response+through+DUOX+activation+and+hydrogen+peroxide+release%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium flashes orchestrate the wound inflammatory response through DUOX activation and hydrogen peroxide release.</a> Current Biology. 23 (5), 424-429 (2013).</li>
<li>Weavers, H., Evans, I. R., Martin, P., Wood, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corpse+Engulfment+Generates+a+Molecular+Memory+that+Primes+the+Macrophage+Inflammatory+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Corpse Engulfment Generates a Molecular Memory that Primes the Macrophage Inflammatory Response.</a> Cell. , (2016).</li>
<li>Stramer, B., Winfield, M., Shaw, T., Millard, T. H., Woolner, S., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+induction+following+wounding+of+wild-type+versus+macrophage-deficient+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Gene induction following wounding of wild-type versus macrophage-deficient Drosophila embryos.</a> EMBO Reports. 9 (5), 465-471 (2008).</li>
<li>Matsubayashi, Y., Coulson-Gilmer, C., Millard, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis-dependent+coordination+of+multiple+actin+regulators+is+required+for+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Bioliogy%22%5BJournal%5D)">Endocytosis-dependent coordination of multiple actin regulators is required for wound healing.</a> Journal of Cell Bioliogy. 210 (3), 419-433 (2015).</li>
<li>Evans, I. R., Rodrigues, F. S. L. M., Armitage, E. L., Wood, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Draper%2FCED-1+Mediates+an+Ancient+Damage+Response+to+Control+Inflammatory+Blood+Cell+Migration+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Draper/CED-1 Mediates an Ancient Damage Response to Control Inflammatory Blood Cell Migration In Vivo.</a> Current Biology. 25 (12), 1606-1612 (2015).</li>
<li>Zanet, J., Stramer, B., Millard, T., Martin, P., Payre, F., Plaza, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fascin+is+required+for+blood+cell+migration+during+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fascin is required for blood cell migration during Drosophila embryogenesis.</a> Development. 136 (15), 2557-2565 (2009).</li>
<li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6802923">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66, 57-80 (1981).</li>
<li>Ninov, N., Martín-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+epidermal+morphogenesis+during+the+development+of+the+adult+abdominal+epidermis+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3074-3080 (2007).</li>
<li>Gho, M., Bellaïche, Y., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+Drosophila+microchaete+lineage%3A+a+novel+intrinsically+asymmetric+cell+division+generates+a+glial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell.</a> Development. 126 (16), 3573-3584 (1999).</li>
<li>Puah, W. C., Wasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+muscles+in+Drosophila+metamorphosis%3A+Towards+high-throughput+gene+identification+and+function+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis.</a> Methods. 96, 103-117 (2016).</li>
<li>Berh, D., Scherzinger, A., Otto, N., Jiang, X., Klämbt, C., Risse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+non-invasive+heartbeat+quantification+of+Drosophila+pupae%5BTitle%5D)+AND+%22Computers+in+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Automatic non-invasive heartbeat quantification of Drosophila pupae.</a> Computers in Biology and Medicine. 93, 189-199 (2018).</li>
<li>Sander, M., Squarr, A. J., Risse, B., Jiang, X., Bogdan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+pupal+macrophages--a+versatile+tool+for+combined+ex+vivo+and+in+vivo+imaging+of+actin+dynamics+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila pupal macrophages--a versatile tool for combined ex vivo and in vivo imaging of actin dynamics at high resolution.</a> European Journal of Cell Biology. 92 (10-11), 349-354 (2013).</li>
<li>Weavers, H., Liepe, J., Sim, A., Wood, W., Martin, P., Stumpf, M. P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+Analysis+of+the+Dynamic+Inflammatory+Response+to+Tissue+Damage+Reveals+Spatiotemporal+Properties+of+the+Wound+Attractant+Gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient.</a> Current Biology. 26 (15), 1975-1989 (2016).</li>
<li>Fristrom, D., Wilcox, M., Fristrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+PS+integrins%2C+laminin+A+and+F-actin+during+key+stages+in+Drosophila+wing+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The distribution of PS integrins, laminin A and F-actin during key stages in Drosophila wing development.</a> Development. 117 (2), (1993).</li>
<li>Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C. M., Rørth, P., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PDGF%2FVEGF+receptor+controls+blood+cell+survival+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Cell%22%5BJournal%5D)">The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila.</a> Development Cell. 7 (1), 73-84 (2004).</li>
<li>Berg, H. Random Walks in Biology. , Princeton University Press. Available from:
 <a target="_blank" href="http://press.princeton.edu/titles/112.html">http://press.princeton.edu/titles/112.html</a> (1993).</li>
<li>Diehl, H., Ihlefield, H., Schwegler, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDiehl%2C+H+%22Physik+fur+Biologen%22">Physik fur Biologen</a>. , Springer-Verlag. (1991).</li>
<li>Stewart, P. S., McFeters, G. A., Huang, C. T. Biofilm control by antimicrobial agents. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStewart%2C+PS+%22Biofilms+II+Process+Analysis+and+Application%22">Biofilms II Process Analysis and Application</a>. , 373-405 (2000).</li>
<li>Milo, R., Phillips, R. Cell Biology by the Numbers. , Garland Science. Available from:
 <a target="_blank" href="https://books.google.com/books?id=9NPRCgAAQBAJ&pgis=1">https://books.google.com/books?id=9NPRCgAAQBAJ&pgis=1</a> (2015).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proceeding of National Academy of Science U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Cordelières, F. Manual tracking. National Institutes of Health. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/Manual%20Tracking%20plugin.pdf">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/Manual%20Tracking%20plugin.pdf</a> (2015).</li>
<li>Tinevez, J. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate%3A+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li>
<li>Grueber, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134 (1), 55-64 (2007).</li>
<li>Wood, W., Faria, C., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mechanisms+regulate+hemocyte+chemotaxis+during+development+and+wound+healing+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct mechanisms regulate hemocyte chemotaxis during development and wound healing in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Cell Biology. 173 (3), 405-416 (2006).</li>
<li>Wood, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+recapitulates+morphogenesis+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Wound healing recapitulates morphogenesis in Drosophila embryos.</a> Nature Cell Biology. 4 (11), 907-912 (2002).</li>
<li>Franz, A., Wood, W., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+Body+Cells+Are+Motile+and+Actively+Migrate+to+Wounds+to+Drive+Repair+and+Prevent+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Developmetal+Cell%22%5BJournal%5D)">Fat Body Cells Are Motile and Actively Migrate to Wounds to Drive Repair and Prevent Infection.</a> Developmetal Cell. 44 (4), 460-470 (2018).</li>
<li>del Valle Rodríguez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila.</a> Nature Methods. 9 (1), 47-55 (2012).</li>
<li>Losick, V. P., Fox, D. T., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyploidization+and+Cell+Fusion+Contribute+to+Wound+Healing+in+the+Adult+Drosophila+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Polyploidization and Cell Fusion Contribute to Wound Healing in the Adult Drosophila Epithelium.</a> Current Biology. 23 (22), 2224-2232 (2013).</li>
<li>Babcock, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+blood+cells+function+as+a+surveillance+system+for+damaged+tissue+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Circulating blood cells function as a surveillance system for damaged tissue in Drosophila larvae.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 105 (29), 10017-10022 (2008).</li>
<li>Galko, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+Genetic+Analysis+of+Wound+Healing+in+Drosophila+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular and Genetic Analysis of Wound Healing in Drosophila Larvae.</a> PLoS Biology. 2 (8), e239(2004).</li>
<li>Brock, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+Profilin+during+wound+closure+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of Profilin during wound closure in Drosophila larvae.</a> Journal of Cell Science. 125 (23), (2013).</li>
<li>Wu, Y., Brock, A. R., Wang, Y., Fujitani, K., Ueda, R., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+blood-borne+PDGF%2FVEGF-like+ligand+initiates+wound-induced+epidermal+cell+migration+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A blood-borne PDGF/VEGF-like ligand initiates wound-induced epidermal cell migration in Drosophila larvae.</a> Current Biology. 19 (17), 1473-1477 (2009).</li>
<li>Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Drosophila+Larvae+to+Study+Epidermal+Wound+Closure+and+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Using Drosophila Larvae to Study Epidermal Wound Closure and Inflammation.</a> Methods in Molecular Biology. 1037, 449-461 (2013).</li>
<li>Kakanj, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+and+TOR+signal+in+parallel+through+FOXO+and+S6K+to+promote+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Insulin and TOR signal in parallel through FOXO and S6K to promote epithelial wound healing.</a> Nature Communications. 7, 12972(2016).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych konfliktów interesów.

Ostra reakcja zapalna na uszkodzenie tkanek jest złożonym i wysoce dynamicznym procesem, który jest niezbędny do zorganizowania naprawy uszkodzonych tkanek, w tym usunięcia martwiczych szczątków i walki z infekcją. Aby w pełni zrozumieć i rozwikłać podstawowe aspekty tej reakcji, kluczowe jest przeprowadzenie badań in vivo na trójwymiarowych żywych próbkach, aby można było dokładnie śledzić zachowanie i interakcje różnych zaangażowanych linii komórkowych w czasie. Analiza dynamiki tych komórek w czasie rzeczywistym pozwala na bardziej szczegółową charakterystykę zmutowanych fenotypów niż statyczne pojedyncze punkty czasowe z ustalonych próbek przy użyciu klasycznych technik immunohistochemicznych. Tradycyjnie, większość badań obrazowania na żywo z wykorzystaniem genetycznie wykonalnego modelu Drosophila wykorzystywała embrionalne stadium rozwoju muszki owocowej ze względu na jej przezroczystość optyczną i bezruch w porównaniu z późniejszymi stadiami rozwojowymi 4,5. Jednak ostatnio nasza grupa i inni opracowali poczwarkę Drosophila jako nowatorski model do wykonywania wysokiej rozdzielczości i długoterminowego obrazowania naprawy ran i stanów zapalnych jednocześnie in vivo 8,22,23. To pojawiające się podejście oferuje ekscytujący długoterminowy potencjał do rozwikłania podstawowych aspektów zachowania komórek zapalnych i może być dalej dostosowywany do badania dynamicznego zachowania innych linii komórkowych (takich jak adipocyty Drosophila 38) po uszkodzeniu tkanki.
Podczas przygotowania i obrazowania zranionych poczwarek Drosophila istnieje szereg krytycznych czynników, które będą decydować o jakości opisanych powyżej wyników obrazowania. Prawdopodobnie najtrudniejszym etapem opisanego protokołu jest staranne rozebranie i precyzyjne ułożenie poczwarek przed zranieniem i obrazowaniem. Poczwarki na tym etapie rozwoju są niezwykle delikatne i nawet niewielkie przypadkowe uszkodzenie poczwarek na etapach przygotowania znacznie pogorszy eksperyment; Wszelkie poczwarki, które mogły doznać niezamierzonego uszkodzenia, muszą zostać odrzucone z eksperymentu, ponieważ uszkodzenie to może aktywować ich własną reakcję zapalną, co może prowadzić do bardziej rozległych (lub nawet ogólnoustrojowych) skutków dla zachowania komórek zapalnych w innych częściach poczwarki. Ze względu na ciągły rozwój poczwarek wykorzystywanych w tych eksperymentach (które przechodzą znaczne przegrupowania tkanek w celu przygotowania tkanek do dorosłości), czasami poczwarki poruszają się w trakcie obrazowania. Zwijanie poczwarki jest jednak bardziej prawdopodobne, jeśli poczwarki nie zostały prawidłowo zamontowane na najbardziej płaskiej powierzchni skrzydła (lub innej tkanki, która ma być zobrazowana) w bezpośrednim kontakcie ze szkłem nakrywkowym; Użycie kleju heptanowego do stabilizacji poczwarek na szkle nakrywkowym powinno zminimalizować ten niepożądany ruch. Z tego powodu należy również zachować szczególną ostrożność, aby nie wytrącić poczwarek z ich starannie wyrównanych pozycji podczas przenoszenia próbek między mikroskopami; Idealnie byłoby, gdyby laser do zraniania był podłączony do tego samego mikroskopu, aby można go było wykorzystać do późniejszego obrazowania poklatkowego i konwersji zdjęć.
Oprócz biegłości w rozwarstwianiu poczwarki i etapach montażu, dokładny genotyp użytych poczwarek Drosophila będzie miał znaczący wpływ na jakość generowanych danych obrazowych. Na przykład liczba kopii sterownika Gal4 i konstrukcji UAS (np. UAS-GFP lub UAS-Kaede) w obrębie pojedynczego genotypu poczwarki określi stosunek sygnału do szumu podczas późniejszego obrazowania. Zgodnie z ogólną zasadą, im więcej kopii konstruktu Gal4 lub UAS, tym większy jest całkowity poziom białka fluorescencyjnego (np. GFP lub Kaede) w tkance. Optymalny poziom białka fluorescencyjnego będzie jednak stanowił staranną równowagę między zwiększeniem fluorescencji tkanek na tyle, aby umożliwić obrazowanie o wysokiej jakości (umożliwiając użycie niższych mocy lasera, zmniejszenie fotowybielania i obrazowania w dłuższych okresach czasu), ale bez powodowania toksyczności komórkowej wywołanej fluoroforem; optymalna liczba konstruktów Gal4 i UAS w każdym eksperymencie będzie się różnić w zależności od konkretnych użytych sterowników i fluoroforów. Należy zachować ostrożność, aby wychowywać poczwarki w temperaturze 25 °C (lub wyższej, do 29 °C), ponieważ system Gal4-UAS jest wrażliwy na temperaturę i będzie nieskuteczny w niższych temperaturach31. W celu osiągnięcia dodatkowych poziomów kontroli nad tkanką lub specyficznością czasową ekspresji sterowanej przez Gal4, represor systemu Gal4-UAS Gal80 może być również włączony do genotypupoczwarki 39. Gal80 może być używany do tłumienia aktywności Gal4 w określonej tkance (przy użyciu specyficznego tkankowo Gal80) lub w określonym czasie (przy użyciu wrażliwego na temperaturę Gal80). System Gal4-UAS może być dalej łączony z innymi niezależnymi układami binarnymi (takimi jak systemy LexA-lexAop i QF-QUAS) w celu wytworzenia Drosophila, która ma wiele konstruktów (np. fluoroforów, linii RNAi lub innych konstruktów genetycznych) wyrażanych jednocześnie w szeregu różnych tkanek39.
Zastosowanie nowego modelu poczwarki Drosophila ma wiele zalet w porównaniu z bardziej tradycyjnym podejściem do zarodków. W porównaniu z obrazowaniem krótkoterminowym (do 3 godzin) dostępnym w zarodkach w stadium 15 (etap, na którym przeprowadza się większość badań nad zranieniem zarodka), poczwarki można obrazować w znacznie dłuższych okresach czasu (zasadniczo do dorosłości po 96 godzinach rozwoju poczwarki). Co więcej, znacznie większa liczba hemocytów (wrodzonych komórek odpornościowych Drosophila ) jest obecna w tkankach poczwarki (i dostępna do obrazowania) w porównaniu z bardziej ograniczoną liczbą obecną w zarodku, co pozwoliło nam zebrać znacznie więcej danych obrazowych na temat zachowania hemocytów przy użyciu tej samej całkowitej liczby próbek. Co najważniejsze, to z kolei umożliwiło nam zastosowanie bardziej wyrafinowanego modelowania matematycznego do analizy zachowania hemocytów i wyodrębnienia nowych cech atraktantów ran i odpowiedzi zapalnej, które w przeciwnym razie pozostałyby eksperymentalnieniedostępne. Kolejną zaletą modelu poczwarki jest to, że knockdown genów za pośrednictwem RNAi jest znacznie bardziej wydajny niż we wcześniejszych stadiach embrionalnych, co pozwala na lepszą analizę inaktywacji genów w zależności od tkanki lub czasu przy użyciu systemów binarnych, takich jak system Gal4-UAS39. Skuteczność RNAi na tym etapie otwiera zatem potencjał do przeprowadzania badań przesiewowych RNAi na dużą skalę (lub nawet bezstronnych w całym genomie) w celu poszukiwania nowych graczy zaangażowanych w gojenie ran lub zachowanie komórek zapalnych.
Jednak poczwarki Drosophila z pewnością nie mogą być wykorzystywane do badania fenotypów wynikających z mutacji genetycznych, które są śmiertelne dla zarodka; Badania funkcjonalne i obrazowanie w czasie rzeczywistym genów, które są niezbędne dla rozwoju embrionalnego, muszą być zatem nadal przeprowadzane na zarodkach, chyba że knockdown genu za pośrednictwem RNAi w sposób specyficzny dla czasu lub tkanki pozwala na rozwój aż do stadium poczwarki. Zarodek pozostaje również modelem z wyboru do badania i obrazowania na żywo pewnych cech zachowania komórek odpornościowych, w tym rozwojowego rozpraszania komórek odpornościowych od ich pochodzenia, kontaktowego hamowania lokomocji i fagocytozy apoptotycznych zwłok powstałych podczas rozwojowego rzeźbienia tkanek 5,8, których nie zaobserwowano jeszcze w modelach poczwarkowych. Chociaż badania na larwach i osobnikach dorosłych Drosophila dostarczyły ważnych informacji na temat mechanizmów leżących u podstaw gojenia się ran i stanu zapalnego 40,41,42,43,44, badania obrazowania na żywo na tych etapach okazały się trudne ze względu na z natury mobilny charakter próbek. Podczas gdy larwy mogą być znieczulane, aby umożliwić krótkie okresy obrazowania na żywo, ze względu na tymczasowy charakter znieczulenia, można zobaczyć tylko krótkie migawki z naprawy rany na żywo lub reakcji zapalnej45. W niedawnym badaniu opracowano ulepszony protokół, który umożliwia długoterminowe obrazowanie gojenia się ran larwalnych46, chociaż przygotowanie i obrazowanie nadal pozostają znacznie trudniejsze niż w przypadku zarodków lub poczwarek. W dłuższej perspektywie przewidujemy, że wykorzystując najbardziej odpowiedni etap rozwojowy do odpowiedzi na każde konkretne pytanie, badania we wszystkich czterech różnych stadiach Drosophila - od zarodków, przez okres larwalny i poczwarki, aż do dorosłości (każdy z własnymi unikalnymi zaletami i ograniczeniami) - dostarczą uzupełniających informacji na temat molekularnego i komórkowego mechanizmu napędzającego gojenie się ran i stan zapalny.
W przyszłości ten protokół leczenia ran i długoterminowego obrazowania poczwarek Drosophila może być łatwo dostosowany do badania szeregu zjawisk związanych ze stanem zapalnym i ma daleko idący potencjał w odkrywaniu nowych cech odpowiedzi zapalnej na rany. Połączenie długoterminowego obrazowania wraz z zastosowaniem fotokonwertowalnych fluoroforów (takich jak Kaede) ma ogromne znaczenie dla zrozumienia dynamiki zachowania wrodzonych komórek odpornościowych, a w szczególności znacznie mniej zrozumiałej fazy ustępowania odpowiedzi zapalnej rany. Poprzez specyficzne znakowanie pojedynczych lub subpopulacji komórek odpornościowych (takich jak te zrekrutowane do rany), możliwe będzie przeanalizowanie, w jaki sposób ekspozycja na jeden sygnał środowiskowy (taki jak zwłoki lub uraz) wpływa na późniejszą reakcję komórki odpornościowej na późniejszą wskazówkę. Zachowanie zapalne hemocytów Drosophila może być zmienione przez wcześniejsze doświadczenia - na przykład są one przygotowane do reagowania na uszkodzenie tkanek przez wcześniejszą fagocytozę apoptotycznych zwłok podczasrozwoju12 , ale dopiero okaże się, czy inne sygnały środowiskowe wywołują podobne zdarzenia pobudzające. Chociaż dotychczasowe badania ran poczwarek koncentrowały się na wrodzonej reakcji zapalnej, model skrzydeł poczwarki stanowi również idealną okazję zarówno do zobrazowania na żywo, jak i przeanalizowania mechanizmów leżących u podstaw naprawy ran nabłonkowych. Co więcej, ta metoda obrazowania poczwarek może być również zaadaptowana do badania dynamicznego zachowania innych linii komórkowych w odpowiedzi na uszkodzenie tkanek38, zarówno w samym skrzydle poczwarki, jak i w innych łatwo dostępnych tkankach poczwarki (takich jak oczy, nogi lub klatka piersiowa). Wreszcie, łącząc podatność genetyczną Drosophila z łatwością długoterminowego obrazowania poczwarek, można odkryć nowe regulatory naprawy nabłonka lub stanu zapalnego dzięki zastosowaniu bezstronnych podejść do knock-down obejmujących cały genom.

Efektywna i skuteczna reakcja zapalna jest kluczowa dla każdego organizmu, aby zwalczać infekcje, usuwać zanieczyszczenia i organizować naprawę uszkodzonych tkanek1. Chociaż ta reakcja jest nieuniknionym skutkiem większości uszkodzeń tkanek, stan zapalny wymaga ścisłej regulacji, ponieważ niewłaściwa reakcja zapalna została powiązana z wieloma różnymi chorobami ludzkimi (w tym przewlekłymi, niegojącymi się ranami, nadmiernymi bliznami i predyspozycjami do raka)1,2,3. Biorąc pod uwagę to znaczenie kliniczne, kluczowe jest uzyskanie bardziej szczegółowego zrozumienia mechanizmów molekularnych i komórkowych napędzających odpowiedź zapalną w celu opracowania nowych wskaźników prognostycznych i strategii leczenia szeregu przewlekłych stanów zapalnych, które mogą chronić naprawiające się tkanki przed długotrwałym i niepotrzebnym stanem zapalnym.
W ostatnich latach Drosophila stała się dobrze znanym i wartościowym systemem modelowym do analizy podstawowych cech reakcji zapalnej zachowanej od owadów do człowieka4,5. Obecnie Drosophila oferuje znacznie większą podatność genetyczną niż jest to obecnie możliwe w innych modelach eksperymentalnych (takich jak myszy czy danio pręgowany), umożliwiając precyzyjną czasoprzestrzenną manipulację genetyczną in vivo (w celu inaktywacji lub nadmiernej ekspresji dowolnego genu w określonych typach komórek w określonym punkcie rozwojowym) oraz łatwość badań przesiewowych całego genomu6,7. Tradycyjnie, większość badań obrazowych gojenia się ran i stanów zapalnych u Drosophila przeprowadza się w stadiach embrionalnych, ponieważ zarodki są nieruchome (w przeciwieństwie do larw Drosophila lub dorosłych) i optycznie przezroczyste, co umożliwia niezrównanie wysoką rozdzielczość obrazowania in vivo8. Pozwoliło to naukowcom na wizualizację szybkiej i solidnej rekrutacji wrodzonych komórek odpornościowych (hemocytów) Drosophila do miejsca rany w odpowiedzi na mechaniczne lub wywołane laserem uszkodzenie nabłonka embrionalnego9,10,11,12,13,14. Łącząc te badania obrazowania na żywo z manipulacją genetyczną, badania na zarodkach Drosophila odkryły wiele ważnych białek komórek odpornościowych, które kontrolują zachowanie komórek zapalnych in vivo. Na przykład, homolog CED-1 Draper (białko zawierające domenę ITAM) został zidentyfikowany jako ważny "receptor uszkodzenia", który pośredniczy w rekrutacji komórek odpornościowych Drosophila w sposób zależny odH2O2do miejsc uszkodzenia15. Poziomy Drapera w komórkach odpornościowych są z kolei regulowane przez indukowaną wapniem sygnalizację JNK i podwyższone poniżej apoptotycznego wychwytu zwłok12. Ruchliwość hemocytów wymaga ponadto złożonych zmian cytoszkieletu w celu skoordynowania ukierunkowanej migracji w kierunku rany, a to zależy od aktywności regulatorów cytoszkieletu, takich jak białko wiązania aktyny Fascin16 i małe GTPazy z rodziny Rho Rac i Rho9.
Drosophila to holometaboliczny owad, który przechodzi przez dodatkowe stadia larwalne i poczwarkowe po embriogenezie, zanim osiągnie dorosłość17. Poczwarka Drosophila została opracowana jako dodatkowy model do nieinwazyjnego obrazowania na żywo różnych dynamicznych zdarzeń komórkowych, w tym rozwojowej migracji komórek18, cell division19, cell growth20 i skurczu mięśni21. Niedawno został uznany za nowatorski model, w którym można badać dynamikę gojenia się ran i stanów zapalnych in vivo22,23.
Podobnie jak w stadium embrionalnym, poczwarki Drosophila są nieruchome i optycznie przezroczyste, po dokładnym rozebraniu z ich nieprzezroczystych obudów poczwarek18. Wykorzystując tę przezroczystość optyczną, można śledzić zachowanie in vivo wrodzonych komórek odpornościowych (hemocytów) w odpowiedzi na uszkodzenia tkanek w poczwarkach Drosophila, takich jak skrzydło poczwarki22. Skrzydło poczwarki występuje jako prosta dwuwarstwowa struktura, składająca się z dwóch dużych płaskich arkuszy nabłonka, które są połączone na obwodzie skrzydła; Przestrzeń zewnątrzkomórkowa między tymi dwiema warstwami nabłonka jest wypełniona hemolimfą (krwią owadów) i dużą liczbą ruchliwych hemocytów24. Podobnie jak w zarodkach, mechaniczne lub laserowe uszkodzenie nabłonka skrzydła wyzwala szybką rekrutację hemocytów do miejsca urazu23. Jednak to stadium poczwarki oferuje pewne wyraźne zalety w obrazowaniu w porównaniu z wcześniejszymi stadiami embrionalnymi. Uszkodzone poczwarki można obrazować w znacznie dłuższych okresach czasu (przez co najmniej 5 godzin), dostępna jest większa powierzchnia tkanki do eksperymentalnych zaburzeń (takich jak generowanie wielu ran) i na tym etapie obecna jest znacznie większa liczba hemocytów (co zapewnia więcej trajektorii komórek z większych odległości w celu poprawy mocy statystycznej podczas analizy matematycznej). Co więcej, skuteczność inaktywacji genów za pośrednictwem RNAi ulega znacznej poprawie w stadiach poczwarki, co pozwala na "strącenie" wielu genów w tkance lub w sposób specyficzny w czasie w porównaniu z bardziej tradycyjnym podejściem do zarodków z pełną mutacją.
Aby śledzić dynamikę reepitelializacji ran i towarzyszącej jej reakcji zapalnej w tym nowym modelu poczwarki, należy oznaczyć dwie różne populacje komórek: nabłonek poczwarki i wrodzone komórki odpornościowe (hemocyty Drosophila). Dostępnych jest wiele różnych markerów (Tabela materiałów) do oznaczania tych dwóch różnych populacji komórek - wybór markera zależy od konkretnego procesu, który ma być badany. Aby oznaczyć nabłonek poczwarki, linie Drosophila zawierające albo wszechobecnie wyrażaną E-kadherynę znakowaną GFP (która oznacza połączenia przylegające) są rutynowo wykorzystywane do wskazywania pozycji marginesów komórkowych, lub alternatywnie, znakowaną GFP domenę wiążącą aktynę Moesin (która oznacza cytoszkielet aktynowy) do wizualizacji kurczliwego pierścienia aktynowego na krawędzi rany i wypukłości krawędzi natarcia. Aby oznaczyć hemocyty Drosophila, stosuje się specyficzny dla hemocytów srp-Gal425 w celu sterowania ekspresją jądrowego RFP (do śledzenia jądra), cytoplazmatycznego GFP lub Moesin znakowanego GFP (do oznaczania cytoplazmy lub cytoszkieletu aktynowego, odpowiednio) lub fotokonwertowalnego fluoroforu (takiego jak Kaede). W rzeczywistości często korzystne jest stosowanie wielu markerów komórek odpornościowych w połączeniu, aby umożliwić jednoczesną analizę ruchu jądra i morfologii komórki (patrz Reprezentatywne wyniki). Ponieważ jednak protokół ten obejmuje użycie poczwarek Drosophila, można wykorzystać tylko kombinacje markerów genetycznych, które są żywotne do połowy stadium poczwarki. Również embrionalne stada letalne nie będą odpowiednie. Jest mało prawdopodobne, aby stanowiło to problem w przypadku obrazowania poczwarek kontrolnych (lub typu dzikiego), ale ważne jest, aby rozważyć, kiedy geny mają zostać powalone lub nadmiernie wyrażone, aby ocenić ich wpływ na zamknięcie rany lub stan zapalny. W przypadku wczesnej śmiertelności spowodowanej knockdownem genu (lub nadekspresją), konstrukt Gal80ts może być użyty do wywołania knockdownu napędzanego przez Gal4 w późniejszym etapie rozwoju (patrz Dyskusja).
W naszych ostatnich badaniach, przejście do fazy poczwarki umożliwiło nam zebranie wystarczającej ilości danych o trajektorii komórek odpornościowych do analizy zachowań zapalnych przy użyciu zaawansowanego modelowania matematycznego, co z kolei pozwoliło nam wydedukować nowe szczegóły sygnałów atraktantu zapalnego rany23. Na przykład podejście to ujawniło, że chemoatraktant na ranę rozprzestrzenia się powoli w tkance objętej stanem zapalnym z prędkością 200 μm2/min, czyli znacznie wolniej niż wcześniej sugerowane małe cząsteczki kandydujące, takie jak ATP lubH2O2, które według doniesień dyfuzyjny26,27,28,29; Te małe cząsteczki "uszkadzające" mogą zamiast tego działać jako sygnały permisywne. Co więcej, śledząc długoterminowe zachowanie wrodzonych komórek odpornościowych, gdy ustępują one z początkowej rany i są wystawione na działanie drugiej (wytworzonej w różnych punktach czasowych po pierwszej), odkryliśmy tymczasowy okres "odczulania", podczas którego komórki odpornościowe są ślepe na kolejne urazy23. Wykorzystując długoterminowy potencjał obrazowania modelu poczwarki, wraz z wykonalnością genetyczną Drosophila, można śledzić zachowanie określonych populacji komórek odpornościowych (takich jak tylko te komórki odpornościowe zrekrutowane do miejsca rany) w odpowiedzi na kolejne zniewagi, używając fotokonwertowalnego fluoroforu30, który może być wyrażany wyłącznie w linii komórek odpornościowych23.
Tutaj opisujemy protokół do wizualizacji dynamiki gojenia się ran i związanej z tym reakcji zapalnej w wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej przy użyciu żywych poczwarek Drosophila. Zapewniamy szczegółową metodologię obejmującą etapy wymagane do wstępnego przygotowania poczwarki (sekcja i montaż) oraz późniejsze zranienie za pośrednictwem lasera i obrazowanie poklatkowe. Opisujemy również zastosowanie fotokonwertowalnych fluoroforów, aby umożliwić znakowanie określonych podzbiorów komórek odpornościowych in vivo. W dłuższej perspektywie przewidujemy, że ten nowy model poczwarki Drosophila otworzy ekscytujące możliwości analizy złożonej dynamiki sygnalizacji leżącej u podstaw odpowiedzi zapalnej na uszkodzenie tkanek. Stosując bardziej wyrafinowane analizy statystyczne, można odkryć cechy odpowiedzi, które w przeciwnym razie pozostałyby eksperymentalnie niedostępne, podczas gdy zwiększona wydajność RNAi może nadawać się do zastosowania badań przesiewowych całego genomu w komórkach odpornościowych in vivo w celu identyfikacji nowych graczy regulujących zachowanie komórek odpornościowych.

<table><tbody><tr><td>Drosophila stocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>wszędobylska E-kadheryna z GFP; Ubi-p63E-shg.GFP; (chrII)</td><td>Kyoto Stock Center, DGRC</td><td>#109007</td><td>Sekwencje promotorowe Ubi-p63E napędzają ekspresję Drosophila E-kadheryny (shotgun) oznaczonej na końcu C-końcowym GFP.</td></tr><tr><td>wszechobecny E-kadheryna z oznaczeniem GFP; Ubi-p63E-shg.GFP (III)</td><td>Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)</td><td>#58742</td><td>Sekwencje promotorowe Ubi-p63E napędzają ekspresję Drosophila E-kadheryny (shotgun) oznaczonej na końcu C-końcowym GFP.</td></tr><tr><td>wszechobecny Moesin P{sGMCA}3.1</td><td>Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)</td><td>#59023</td><td>Wszechobecny ekspresjonowany promotor/wzmacniacz sqh napędza ekspresję fragmentu Moesin (który zawiera sekwencje wiążące aktynę) oznaczonego GFPS65T.</td></tr><tr><td>sterownik specyficzny dla hemocytu serpent-Gal4 ; srp-Gal4; </td><td>Wygenerowane przez Katja Bruckner</td><td>Wygenerowane przez Katja Bruckner</td><td>Ekspresja Scer \ GAL4 połączonego z ogonem polyA jest pod kontrolą 2 sekwencji genomowych z góry węża Drosophila. Nr ref.: Br&uuml; ckner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., R&oslash; rth, P., Perrimon, N. Receptor PDGF/VEGF kontroluje przeżycie komórek krwi u Drosophila. Komórka deweloperska. 7 (1), 73&ndash; 84, doi: 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004).</td></tr><tr><td>UAS-nuclearRFP w1118; P{UAS-RedStinger}6</td><td>Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)</td><td>#8545 lub #8547</td><td>Sekwencje regulacyjne UAS napędzają ekspresję formy RFP DsRed.T4, która jest oznaczona na końcu C-końcowym sygnałem lokalizacji jądrowej</td></tr><tr><td>UAS-cytoplasmicGFP ;; P{UAS-GFP. S65T}</td><td>Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)</td><td>Dostępnych jest wiele stad (np. #1522)</td><td>Ekspresja wersji S65T GFP za pomocą sekwencji regulacyjnych UAS; wariant S65T wykazuje zwiększoną jasność.</td></tr><tr><td>UAS-photoconvertibleKaede w1118;; P{UAS-Kaede.A}3</td><td>Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)</td><td>#26161</td><td>Białko Kaede po syntezie emituje jasnozieloną fluorescencję, ale po naświetlaniu UV zmienia się efektywnie w jasną, stabilną czerwoną fluorescencję.</td></tr><tr><td> dynia spaghetti z oznaczeniem GFP w1118;; P{sqh-GFP.RLC}</td><td>Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)</td><td>#57145</td><td>Region kodowania sqh, który jest oznaczony na końcu C-końcowym znacznikiem T:Avic\GFPS65T, jest wyrażany pod kontrolą naturalnego promotora sqh.</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Składniki na podłoża pokarmowe dla much</td><td></td><td></td><td>Podłoża pokarmowe dla much są wytwarzane zgodnie ze standardowymi procedurami (patrz Greenspan, R. 1997. Pchanie much: teoria i praktyka genetyki Drosophila. Cold Spring Harbor Press. 1-191 str.)</td></tr><tr><td>kukurydza</td><td>Wild Oats, Bristol, Wielka Brytania (lub równoważny dostawca)</td><td>Skontaktuj się z dostawcą bezpośrednia</td><td>organiczna</td></tr><tr><td>mąka sojowa</td><td>Wild Oats, Bristol, Wielka Brytania (lub równoważny dostawca)</td><td>Skontaktuj się z dostawcą bezpośredni</td><td></td></tr> organiczny <tr><td>ekstrakt słodowy</td><td>Wild Oats, Bristol, Wielka Brytania (lub równoważny dostawca)</td><td>Skontaktuj się z dostawcą bezpośrednia</td><td></td></tr><tr><td>organiczna melasa</td><td>Wild Oats, Bristol, Wielka Brytania (lub równoważny dostawca)</td><td>Kontakt dostawca bezpośrednio</td><td>organiczny</td></tr><tr><td>agar Difco</td><td>BD Biosciences, Fisher Scientific</td><td>DF0142-15-2</td><td>Do przygotowania pokarmu dla much</td></tr><tr><td>Kwas propionowy</td><td>Sigma</td><td>402907</td><td>Do przygotowania pokarmu dla much</td></tr><tr><td>Nipagen</td><td>Sigma</td><td>79721</td><td>Do przygotowania pokarmu dla much</td></tr><tr><td>Suszone drożdże piekarskie</td><td>Redstar, Dutscher Scientific, Wielka Brytania LTD</td><td>Redstar, Dutscher Scientific, Wielka Brytania LTD</td><td>Do przygotowania pokarmu dla much</td></tr><tr><td>Nazwa<</td><td>strong>Company<</td><td>strong>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Przygotowanie i montaż próbki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td>Do przygotowania kleju heptanowego</td></tr><tr><td>Drobny sobol Pędzel</td><td>Daler-Rowney (lub odpowiednik)</td><td>#0 lub 1</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fisher Scientific (lub Fine Science Tools)</td><td>NC9404145</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>Naczynia ze szklanym dnem do obrazowania</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td>Sugerujemy użycie szalek Petriego o średnicy 35 mm, z co najmniej 10-milimetrową szklanką Microwell, 0,085-0,13 mm, niepowlekaną. Szalki z większymi mikrostudzienkami umożliwią montowanie i obrazowanie coraz większej liczby poczwarek w jednym eksperymencie.</td></tr><tr><td>Heptane</td><td>Sigma</td><td>51730-5ML</td><td>Do przygotowania kleju heptanowego</td></tr><tr><td>Dwustronna taśma klejąca (np. Scotch)</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG263</td><td>Do przygotowania kleju heptan</td></tr><tr><td>50ml tubka (do kleju heptanowego)</td><td>Probówki Falcon firmy Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Do przygotowania kleju heptan</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Agar Scientific</td><td>AGL4244</td><td>Do preparacji poczwarek Drosophila pupae</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy preparacyjny z jasnym polem</td><td>Leica (lub odpowiednikiem)</td><td>M50</td><td>Do sekcji poczwarek Drosophila</td></tr><tr><td>Nożyczki</td> badawcze <td>John Weiss International</td><td>103123</td><td>Miniature (proste)</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td> Numer katalogowy</td><td>Uwagi</strong</td></tr><tr><td>>Laserowa ablacja i obrazowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser ablacyjny nitogenowy</td><td>Spectra-Physics (lub odpowiednik Andor)</td><td>Model VSL-337ND-S</td><td>W przypadku zranień należy go podłączyć do systemu obrazowania szerokokątnego</td></tr><tr><td>Wielolaserowy konfokalny laserowy mikroskop skaningowy (CLSM)</td><td>Leica (lub odpowiednik)</td><td>TCS AOBS SP8 lub SP5-II podłączony do mikroskopu odwróconej epifluorescencji Leica DMi8 (lub jego odpowiednika)</td><td>Idealnie wyposażony w zmotoryzowany stolik do skanowania wielomiejscowego i "mozaikowego" oraz " hybrydowy" Detektory GaAsP (które oferują znacznie większą czułość i wzmocnienie słabego sygnału)</td></tr><tr>Usługi obrazowania życia <td>w komorze środowiskowej</td><td>(lub równoważne)</td><td>"System kontroli temperatury mikroskopu"</td><td>Dołączony do mikroskopu konfokalnego do kontroli temperatury podczas obrazowania</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny</td><td>><silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</silny></td><td><silny> Komentarze</td></tr><tr><td>Image Analysis Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FRAP Moduł oprogramowania</td><td>Leica (lub odpowiednik)</td><td>CLSM Moduł oprogramowania FRAP</td><td>Do wykonywania fotokonwersji fotokonwertowalnych fluoroforów, takich jak Kaede</td></tr><tr><td>ImageJ (oprogramowanie do analizy obrazu)</td><td>National Institutes of Health (NIH)</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td>Schneider, C.A., Rasband, WS, Eliceiri, KW "NIH Image to ImageJ: 25 lat analizy obrazu". Metody natury 9, 671-675, 2012.</td></tr><tr><td>Wtyczka ImageJ "Ręczne śledzenie"</td><td>National Institutes of Health (NIH)</td><td>https://imagej.net/Manual_Tracking</td><td></td></tr><tr><td>Wtyczka ImageJ "TrackMate"</td><td>ImageJ, NIH</td><td>https://imagej.net/TrackMate</td><td>Tinevez, JY.; Perry, N. & Schindelin, J. i in. (2016), "TrackMate: Otwarta i rozszerzalna platforma do śledzenia pojedynczych cząstek.", Metody 115: 80-90, PMID 27713081</td></tr><tr><td>Volocity (wysokowydajne oprogramowanie do obrazowania 3D)</td><td>Perkin Elmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>Do analizy obrazu</td></tr><tr><td>IMARIS (oprogramowanie do analizy obrazu)</td><td>Bitplane</td><td>IMARIS dla biologów komórkowych</td><td>Do analizy obrazu</td></tr></tbody></table>

długoterminowe śledzenie in vivo dynamiki komórek zapalnych w poczwarkach drosophila

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Podczas szybkiej reakcji zapalnej na uszkodzenie tkanki, komórki wrodzonego układu odpornościowego są szybko rekrutowane do miejsca urazu. Po dotarciu do rany wrodzone komórki odpornościowe pełnią szereg podstawowych funkcji, takich jak zwalczanie infekcji, usuwanie martwiczych szczątków i stymulowanie odkładania się macierzy. Aby w pełni zrozumieć różnorodne zdarzenia sygnalizacyjne, które regulują tę odpowiedź immunologiczną, kluczowe jest obserwowanie złożonych zachowań (i interakcji, które zachodzą między) wieloma liniami komórkowymi in vivo i w czasie rzeczywistym, z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną. Przezroczystość optyczna i podatność genetyczna zarodków Drosophila sprawiły, że Drosophila stała się nieocenionym modelem do obrazowania na żywo i analizowania podstawowych aspektów zachowania komórek zapalnych, w tym mechanizmów dyspersji rozwojowej, usuwania apoptotycznych zwłok i/lub patogenów mikrobiologicznych oraz rekrutacji do ran. Jednak nowsze prace wykazały, że zastosowanie znacznie późniejszego etapu cyklu życiowego Drosophila – poczwarki Drosophila – oferuje szereg wyraźnych korzyści, w tym lepszą wydajność RNAi, dłuższe okresy obrazowania i znacznie większą liczbę komórek odpornościowych. W tym miejscu opisujemy protokół obrazowania gojenia się ran i związanej z tym odpowiedzi zapalnej w wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej u żywych poczwarek Drosophila. Aby śledzić dynamikę zarówno reepitelializacji, jak i stanu zapalnego, używamy szeregu specyficznych markerów fluorescencyjnych in vivo zarówno dla nabłonka, jak i wrodzonych komórek odpornościowych. Wykazujemy również skuteczność fotokonwertowalnych fluoroforów, takich jak Kaede, w podążaniu za określonymi podzbiorami komórek odpornościowych, w celu śledzenia ich zachowania podczas migracji do miejsca uszkodzenia i ustępowania z niego.

Niniejszy protokół opisuje przygotowanie poczwarek Drosophila do obrazowania live time-lapse procesu gojenia ran i stanu zapalnego in vivo. Dzięki zastosowaniu tej metody możliwe powinno być z łatwością generowanie wielu filmów o wysokiej rozdzielczości przedstawiających zamykanie się ran w poczwarce oraz rekrutację komórek zapalnych, a także obrazowanie poczwarek przez długie okresy (co najmniej 5 h) po zranieniu bez istotnego fotobielenia.
Ogólny schemat przygotowania poczwarki Drosophila 
Rysunek 1 przedstawia optymalną metodę przygotowania poczwarek Drosophila do obrazowania in vivo. Białe „przypoczwarki” Drosophila są zbierane w czasie „0 h” po utworzeniu puparium (APF), gdy pełzające larwy przestają się poruszać i przyjmują stereotypowy kształt poczwarki z widocznymi na najbardziej przednim końcu wywiniętymi przydatkami oddechowymi (przetchlinkami) (Rysunek 1A). Białe przypoczwarki 0 h APF pozostawia się do rozwoju przez 18 h w temperaturze 25 °C, do czasu, aż puparium stanie się brązowe (Rysunek 1B), a następnie poddaje się wiwisekcji za pomocą precyzyjnej pęsety i/lub mikronoareczek (Rysunek 1C, w celu usunięcia ochronnej łupiny poczwarki), aby odsłonić znajdującą się wewnątrz optycznie przeźroczystą poczwarkę (Rysunek 1D). Po wiwisekcji skrzydła poczwarki będą widoczne po bokach klatki piersiowej poczwarki (obrysowane na niebiesko, Rysunek 1C-D). Na tym etapie łatwo można rozpoznać również inne części ciała poczwarki, w tym oczy, odnóża i odwłok (oznaczone na Rysunku 1D). Odnóża nadają się również do badań nad zapaleniem ran i mogą zostać uszkodzone przy użyciu tej samej metody laserowej opisanej powyżej. Wiele poczwarek 18 h APF można zamontować jednocześnie w szalce do obrazowania (Rysunek 1E, używając kleju heptanowego i nasączonego wodą papieru filtrowanego, aby zminimalizować odwodnienie), tak aby najpłasksza część skrzydła (obrysowana na niebiesko) stykała się z szkiełkiem podstawowym (Rysunek 1F); jest to szczególnie korzystne, jeśli mikroskop do obrazowania jest wyposażony w zmotoryzowany stolik, co pozwala na zarejestrowanie kilku poczwarek podczas jednej sesji obrazowania. Wszelkie poczwarki, które zostały uszkodzone podczas wiwisekcji lub montażu, należy odrzucić (np. poczwarka znajdująca się trzecia w kolejności, strzałka na Rysunku 1E). Inne części ciała (np. oczy i odnóża, obrysowane na różowo) mogą również stykać się ze szkiełkiem podstawowym i są dostępne do wywołania ran oraz późniejszego obrazowania (Rysunek 1F). W eksperymentach badających pojedyncze rany, uszkodzenia wywołane laserem najlepiej nanosić centralnie na skrzydle (gwiazdka, Rysunek 1F), choć w przypadku badania wielu ran można stosować inne lokalizacje.
Sterylne zranienie aktywuje silną odpowiedź zapalną w skrzydle poczwarki Drosophila 
Aby śledzić proces gojenia ran oraz towarzyszącą mu odpowiedź zapalną in vivo, obrazowano zranione skrzydła poczwarek Drosophila w 18h APF, wykorzystując konfokalną mikroskopię time-lapse (Ryc. 2A-H). Na tym etapie rozwoju poczwarki nabłonek skrzydła stanowi proste, płaskie arkusze komórek (oznaczone tutaj za pomocą E-kadheryny z tagiem GFP w celu wyznaczenia granic poszczególnych komórek, krawędź skrzydła obrysowana na Ryc. 2A). Nawet w nieuszkodzonych skrzydłach (małe powiększenie, Ryc. 2A i 2A') w hemolimfie (krwi owadziej) zajmującej przestrzenie międzykomórkowe znajduje się duża liczba migrujących odpornościowych komórek wrodzonych (hemocytów, oznaczonych za pomocą cytoplazmatycznego GFP w kolorze zielonym oraz jądrowego RFP w kolorze magenta, sterowanych przez srp-Gal4) (Ryc. 2A i 2A'). Uszkodzenie nabłonka skrzydła poczwarki wywołane laserem (krawędź rany obrysowana na biało, Ryc. 2B-D) stymuluje szybką migrację hemocytów do miejsca zranienia (Ryc. 2B-D oraz jądra komórek odpornościowych na Ryc. 2B'-D'). Oznaczenie hemocytów zarówno markerem jądrowym (np. jądrowym RFP „red-stinger”), jak i markerem cytoplazmatycznym lub cytoszkieletowym (np. cytoplazmatycznym GFP lub moezyną z tagiem GFP) jest szczególnie korzystne, ponieważ pozwala na jednoczesne śledzenie jąder hemocytów (do zautomatyzowanej analizy zachowania hemocytów, np. prędkości i kierunkowości migracji) oraz wizualizację morfologii hemocytów. To drugie jest istotne, ponieważ pozwala ustalić, czy hemocyty fagocytują nekrotyczne szczątki (Ryc. 2C, wstawka) na krawędzi rany (lub drobnoustroje w przypadku infekcji)12,23, a także umożliwia obserwację ich aktywności protrusyjnej, gdy wysuwają cienkie filopodia lub lamelipodia na krawędzi prowadzącej podczas migracji w stronę rany lub od niej.
Proste śledzenie trajektorii jąder hemocytów przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu32 (Tabela materiałów) wykazuje złożoną dynamikę czasowo-przestrzenną odpowiedzi zapalnej, podobną do tej zgłaszanej wcześniej dla zranionych embrionów9,36 (wielokolorowe ścieżki, Rysunek 2C' oraz D'). Już w ciągu 30 min od zranienia hemocyty znajdujące się najbliżej miejsca uszkodzenia rozpoczynają ukierunkowaną migrację w stronę rany (Rysunek 2C'). Jednak wraz z upływem czasu po urazie, hemocyty znajdujące się progresywnie dalej od miejsca uszkodzenia również zaczynają ukierunkowaną migrację w stronę rany (Rysunek 2D'). W ten sposób obserwuje się „falę” reaktywności komórek odpornościowych rozprzestrzeniającą się na zewnątrz od brzegu rany, co w naszej ocenie odzwierciedla dyfuzję chemoatraktanta rany z miejsca urazu. Ta czasowo-przestrzenna dynamika komórek odpornościowych stanowiła użyteczny punkt wyjścia dla naszego niedawnego badania, w którym zastosowano zaawansowane modelowanie matematyczne (analizę „wnioskowania bayesowskiego”), aby wywnioskować nowe właściwości sygnału atraktanta rany (szczegółowe metody opublikowano w23). Poprzez kalibrację naszych modeli obliczeniowych (które wiązały gradient atraktanta rany z preferencją kierunkową hemocytów) w celu dopasowania ich do obserwowanych trajektorii odpornościowych in vivo, można było wyodrębnić szczegółową charakterystykę atraktanta rany z danych trajektorii hemocytów (taką jak szybkość dyfuzji sygnału, jego źródło oraz czas trwania produkcji sygnału)23.
Ponadto, poprzez indukowanie ekspresji fotokonwertowalnego fluoroforu Kaede w linii komórkowej układu odpornościowego przy użyciu srp-Gal4 (zielony, Rycina 2E) udało nam się również selektywnie oznakować subpopulację tych migrujących hemocytów skrzydła (takich jak te rekrutowane do miejsca zranienia; E, przed fotokonwersją indukowaną promieniowaniem UV i F, po fotokonwersji). Następnie możemy śledzić zachowanie tych hemocytów w czasie (magenta, Rysunek 2G-H) w miarę jak oddalają się od miejsca rany (strzałki, Rysunek 2G i H) i porównać, czym różnią się ich zachowania od zachowań komórek niepoddanych fotokonwersji, które nie docierają do miejsca uszkodzenia. Wykorzystaliśmy to in vivo technika znakowania służąca do wykazania, że hemocyty zrekrutowane do pierwotnej rany są tymczasowo desensytyzowane na drugą ranę powstałą 90 minut później23choć ta technika różnicowego znakowania może w przyszłości znaleźć wiele innych cennych zastosowań (patrz: Dyskusja).
Stosując to podejście, możemy jednocześnie śledzić dynamikę czasoprzestrzenną gojenia rany lub „reepitelizacji” (Rysunek 2B-D). W tym przypadku powszechnie ekspresowana E-kadheryna z tagiem GFP znakuje komórkowe połączenia przylegające w całym nabłonku skrzydła, co pozwala na śledzenie kształtów poszczególnych komórek nabłonkowych w czasie. Brzeg rany jest łatwo identyfikowalny jako granica między nienaruszoną, znakowaną GFP nabłonkiem a nieznakowanymi szczątkami (biała przerywana linia, Rysunek 2B-D). W większości przypadków reepitelizacja rany rozpoczyna się w ciągu 1 h od urazu, a brzeg rany przesuwa się do wewnątrz (Rysunek 2D); rany tej wielkości zazwyczaj goją się w ciągu 2 - 3 h od urazu23. Zamknięcie rany zarówno w embrionach, jak i poczwarkach jest napędzane przez kurczliwy kabel aktynomyzinowy wraz z bogatymi w aktynę filopodiami krawędzi prowadzącej23,37; dynamikę tę cytoszkieletu można bezpośrednio wizualizować podczas gojenia rany, używając odpowiednich reporterów in vivo, takich jak Spaghetti squash (regulatorowy lekki łańcuch miozyny) z tagiem GFP lub wiążąca aktynę Moezyna z tagiem GFP23. Jednak w przypadku niektórych szczególnie dużych ran kabel aktynomyzinowy i filopodia krawędzi prowadzącej nie utrzymują się – rany te stają się „przewlekłe” i nigdy nie ulegają całkowitej reepitelizacji23, nawet po znacznie dłuższych okresach (ponad 24 h) obrazowania in vivo. Co ciekawe, odpowiedź zapalna związana z tymi niegojącymi się ranami różni się wyraźnie od tej związanej z typowymi ranami ostrymi23, co sugeruje, że nieprawidłowe zachowanie komórek odpornościowych mogłoby być użytecznym markerem prognostycznym w klinice. W przyszłości dalsza analiza in vivo ran przewlekłych z wykorzystaniem długoterminowego obrazowania (ponad 24 h) w modelu poczwarkowym może dostarczyć ważnych informacji mechanistycznych na temat tego wyniszczającego stanu.
<img alt="Proces sekcji puparium owada, etapy od przed do po sekcji, poczwarki ustawione do obrazowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57871/57871fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przygotowanie poczwarki Drosophila do wywołania ran i obrazowania na żywo. (A) Białe przedpoczwarki Drosophila zebrane w 0 h APF, z końcem przednim wskazanym przez wywinięte przydatki oddechowe (przetchlinki). (B) Po hodowli białych przedpoczwarek 0h APF przez 18 h w 25 °C puparium przybiera brązowy kolor. Sekcję osłonki poczwarkowej należy rozpocząć od najbardziej przedniego regionu (strzałka), wskazanego przez wywinięte przetchlinki, ponieważ w tym obszarze nie znajduje się właściwa poczwarka; do usunięcia ochronnej osłonki poczwarkowej należy użyć precyzyjnej pęsety i/lub mikronożyczek (C). Skrzydła poczwarki będą widoczne po bokach klatki piersiowej poczwarki (niebieskie obrysy). (D) Osłonka poczwarkowa całkowicie usunięta z poczwarki 18h APF; tutaj poczwarka została obrócona o 90°, aby pokazać bok, a skrzydło do obrazowania zostało obrysowane na niebiesko. (E-F) Pięć poczwarek 18h APF zamocowanych na szkiełku nakrywkowym w naczyniu do obrazowania za pomocą kleju heptanowego, z namoczonym wodą papierem filtracyjnym w celu zminimalizowania odwodnienia (E). Poczwarkę znajdującą się trzecią w kolejności (strzałka) należy odrzucić, ponieważ doszło do uszkodzenia podczas przygotowania. Poczwarki są montowane tak, aby najpłaską część skrzydła (obrysowaną na niebiesko) stykała się ze szkiełkiem nakrywkowym (F), a rany indukowane laserem są generowane centralnie w skrzydle (gwiazdka, F), choć można użyć innych lokalizacji, jeśli badane są wielokrotne rany. Obraz w punkcie (D) zaadaptowany za zgodą Weavers et al., 201623. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57871/57871fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Time-lapse migracji komórek w procesie gojenia rany u Drosophila; mikroskopia fluorescencyjna; śledzenie GFP/RFP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57871/57871fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Dynamiczna analiza in vivo odpowiedzi zapalnej na uszkodzenie tkanki. Poczwarki wyjęte z ochronnych pochewek i zamocowane na szkiełku nakrywkowym (A) zostają poddane zranieniu, a następnie obrazowane za pomocą konfokalnej mikroskopii time-lapse (B-H). Widok przy niskim powiększeniu nieuszkodzonego skrzydła poczwarki (A, krawędź skrzydła obrysowana na biało), zawierający liczne migrujące hemocyty (A'). Indukowane laserowo uszkodzenie nabłonka skrzydła poczwarki (B-D, granice komórek znakowane za pomocą GFP-tagowanej E-kadheryny Drosophila; krawędź rany obrysowana na biało) aktywuje szybką odpowiedź zapalną z migracją wielu hemocytów (srp-Gal4 napędzająca ekspresję jądrowego RFP, magenta i cytoplazmatycznego GFP, zielony) w kierunku miejsca rany (B-D; reprezentatywne klatki z filmu time-lapse, w którym każda klatka jest projekcją 25 warstw o grubości 3 μm każda). Ręczne śledzenie trajektorii hemocytów (wielokolorowe ścieżki, C' i D') wskazuje na złożoną dynamikę czasowo-przestrzenną odpowiedzi zapalnej, podobną do tej opisanej dla uszkodzonych embrionów. Hemocyty fagocytują również nekrotyczne szczątki komórkowe w miejscu rany (grot strzałki, C oraz wstawka). Ekspresja fotokonwertowalnego fluoroforu Kaede w linii komórek odpornościowych (zielony, E, przy użyciu srp-Gal4) umożliwia różnicowe znakowanie hemocytów zrekrutowanych do rany (strzałka, E) (magenta, F) i śledzenie ich w czasie, gdy oddalają się z miejsca urazu (strzałki, G i H). Wykorzystano następujące genotypy poczwarek: (A-D) w1118;ubi-DE-cad-GFP, srp-Gal4&gt;UAS-GFP(II); UAS-nRFP(III) oraz (E-H) w1118;srp-Gal4(II); UAS-Kaede(III). Obrazy zaadaptowane za zgodą Weavers et al., 201623. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57871/57871fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Tutaj prezentujemy protokół do obrazowania ran na żywo i związanej z tym reakcji zapalnej w wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej in vivo. Metoda ta wykorzystuje stadium poczwarki rozwoju Drosophila, aby umożliwić długoterminowe obrazowanie i śledzenie określonych populacji komórek w czasie i jest kompatybilna z wydajną inaktywacją genów za pośrednictwem RNAi.

Długoterminowe śledzenie in vivo dynamiki komórek zapalnych w poczwarkach Drosophila

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

Wykorzystując długoterminowy potencjał obrazowania tego nowego modelu poczwarki wraz z wykonalnością genetyczną Drosophila, metoda ta może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie gojenia się ran i odporności wrodzonej. Stadium poczwarki oferuje pewne wyraźne zalety obrazowania na żywo w porównaniu z bardziej tradycyjnymi modelami gojenia się ran Drosophila. Na przykład poczwarki mogą być obrazowane w znacznie dłuższych okresach czasu, większa powierzchnia tkanki jest dostępna do eksperymentalnej manipulacji, a na tym etapie występuje więcej hemocytów.Ponadto skuteczność inaktywacji genów za pośrednictwem RNAi ulega znacznej poprawie w tych stadiach poczwarki, co pozwala na zniszczenie wielu genów w sposób specyficzny dla tkanki lub czasu. Aby skonfigurować kolekcję poczwarek, ustaw fiolki z 20 dziewiczymi samicami i 20 samcami. Następnie 18 godzin przed sesją obrazowania zbierz z fiolek co najmniej 10 nowo utworzonych białych poczwarek wstępnych.Aby zebrać poczwarkę, użyj kleszczy lub cienkiego pędzla, aby usunąć ją z wewnętrznej powierzchni fiolki i ostrożnie przenieś na bok nowej fiolki na muchy. Po tym, jak poczwarki rozwiną się do pożądanego punktu czasowego, przenieś je na kawałek dwustronnej taśmy klejącej zamontowanej na szklanym szkiełku. Teraz pod mikroskopem preparacyjnym w jasnym polu ostrożnie usuń poczwarki z ich osłonek.Ustaw poczwarki tak, aby ich brzuszne boki były mocno przyklejone do taśmy. Wykonaj pierwsze nacięcie w najbardziej wysuniętym do przodu obszarze poczwarki za pomocą kleszczy. Upewnij się, że poczwarka w tym obszarze jest pusta i pozbawiona tkanki poczwarki, ponieważ poczwarki skurczą się w obrębie koperty we wczesnym rozwoju poczwarki.Następnie ostrożnie rozerwij lub rozetnij obudowę poczwarki w kierunku od przodu do tyłu za pomocą kleszczy lub mikronożyczek, aż poczwarka będzie całkowicie wolna od brązowej, nieprzezroczystej, kruchej osłonki. Uważaj, te poczwarki są bardzo delikatne. Teraz ważne jest, aby kleszcze i mikronożyczki nie przebijały powierzchni poczwarki na tym etapie.Staraj się unikać dotykania samej poczwarki podczas usuwania otaczającej obudowy. Teraz zamontuj nieuszkodzone poczwarki w naczyniu ze szklanym dnem za pomocą kleju heptanowego. Najpierw nałóż linię przygotowanego kleju heptanowego z podwielokrotności 10 mikrolitrów.Następnie, po pięciu sekundach suszenia, użyj kleszczy, aby ostrożnie przenieść wypreparowane poczwarki na klej. Podczas nauki ustaw w szeregu do pięciu poczwarek. Więcej można przygotować dzięki zdobytemu doświadczeniu.Zwiń poczwarki za pomocą kleszczy, aby zamontować poczwarki tak, aby skrzydło przylegało płasko do szkła nakrywkowego, a większość powierzchni skrzydła miała bezpośredni kontakt ze szkłem nakrywkowym. Na koniec, aby zapobiec odwodnieniu, dodaj kawałek chłonnej bibuły filtracyjnej nasączonej wodą destylowaną na bok naczynia ze szklanym dnem. Następnie przykryj naczynie i przystąp do procedury ranienia indukowanego laserem.Przenieś zamontowane poczwarki do mikroskopu szerokokątnego wyposażonego w przestrajalny system ablacji laserowej. Dostosuj chłodzony powietrzem laser ablacyjny z pulsacyjnym promieniowaniem UV pompowanym azotem do żądanej długości fali za pomocą odpowiedniego ogniwa barwnikowego. Aby uzyskać optymalne nawijanie, ustaw częstotliwość powtarzania impulsów na 40 herców.Teraz, używając 40-krotnych lub 63-krotnych obiektywów i jasnego pola, dostosuj elementy sterujące sceną mikroskopu, aby zlokalizować skrzydło poczwarki pierwszej poczwarki, która ma zostać zraniona. Skoncentruj się na płaszczyźnie nabłonka skrzydła poczwarki znajdującej się najbliżej szkiełka nakrywkowego. Dopasuj obszar, który ma zostać zraniony, do znanego obszaru docelowego lasera ablacyjnego.W tym celu należy skorzystać ze znacznika krzyża nitkowego w okularze mikroskopu. Następnie wyreguluj moc lasera, regulując suwak tłumika gęstości energii w mikroskopie. Skorzystaj z ograniczników kliknięcia, aby ustawienie było powtarzalne.Teraz, aby zrobić ranę, aktywuj laser ablacyjny za pomocą szybkiego kliknięcia ręcznego sterowania. Następnie sprawdź, czy w miejscu ablacji nie pojawił się przejściowy pęcherzyk powietrza, co jest normalne w przypadku zranienia. Jeśli zranienie się nie powiedzie, spróbuj zmienić płaszczyznę ogniskowej.Alternatywnie stopniowo zwiększaj moc lasera za pomocą suwaka tłumika, aż do uzyskania pożądanych rozmiarów ran. Po zranieniu brzegów skrzydeł poczwarki szybko przenieś naczynie ze szklanym dnem do odpowiedniego mikroskopu w celu wykonania obrazowania poklatkowego. Następnie otwórz odpowiednie oprogramowanie do przechwytywania obrazu.W oprogramowaniu włącz odpowiednie lasery i dostosuj ich moc oraz wzmocnienie/przesunięcie, aby uzyskać wystarczającą ilość sygnału fluorescencyjnego bez nasycenia pikseli. Ogólnie rzecz biorąc, najniższa możliwa moc lasera w zakresie od pięciu do 20% najlepiej sprawdza się w celu zminimalizowania fotowybielania. Skoncentruj się na całym skrzydle poczwarki w małym powiększeniu lub skup się na ranie w dużym powiększeniu, aby zbadać gojenie się rany.Aby uchwycić zarówno nabłonek naprawczy, jak i rekrutację komórek zapalnych, najpierw ustaw mikroskop tak, aby rejestrował stos z za pomocą precyzyjnej regulacji ostrości na panelu sterowania. Skanuj od zranionego nabłonka do przestrzeni zewnątrzkomórkowej poniżej zawierającej migrujące hemocyty. Następnie ustaw oprogramowanie tak, aby rejestrowało plasterki z przez skrzydło poczwarki co trzy mikrony lub w jeszcze ciaśniejszych odstępach czasu.W przypadku obrazowania poklatkowego nagrywaj stosy z co najmniej co 30 sekund przez co najmniej jedną godzinę. W przypadku korzystania z konwertowalnych sond fotograficznych do selektywnej konwersji zdjęć i oznaczania podzbioru komórek podczas obrazowania, otwórz odpowiednie moduły w oprogramowaniu do obrazowania, aby przeprowadzić konwersję zdjęć i aktywować laser 405 nanometrów. Następnie wybierz komórki, które mają zostać przekonwertowane na zdjęcia w oprogramowaniu FRAP za pomocą narzędzia do zaznaczania.Następnie ustaw przebieg czasowy konwersji zdjęcia na pojedynczą klatkę iteracji i ustaw laser 405 nm na 20% mocy lasera. Następnie kliknij Rozpocznij eksperyment, aby przeprowadzić konwersję zdjęć. Po zakończeniu wyjdź z modułu FRAP i wróć do oryginalnego ekranu obrazowania.Tam dostrój lasery do używanych fluoroforów i zobrazuj komórki przekonwertowane na światło i nieprzekonwertowane za pomocą nagrań poklatkowych. Zranione skrzydła poczwarek Drosophila po 18 godzinach od powstania poczwarki zobrazowano za pomocą konfokalnej mikroskopii poklatkowej. Wywołane laserem uszkodzenie nabłonka skrzydła poczwarki stymulowało szybką migrację wrodzonych komórek odpornościowych Drosophila zwanych hemocytami do miejsca rany.Hemocyty oznaczono zarówno markerem jądrowym, jak i markerem cytoplazmatycznym lub cytoszkieletowym, aby umożliwić odpowiednio śledzenie i wgląd w ich morfologię. Śledzenie trajektorii jądrowych hemocytów pokazuje złożoną czasoprzestrzenną dynamikę odpowiedzi zapalnej. W ciągu 30 minut od zranienia hemocyty znajdujące się najbliżej miejsca urazu rozpoczęły ukierunkowaną migrację w kierunku rany.W końcu hemocyty znajdujące się coraz dalej od urazu zaczynają migrować w kierunku rany. Wykorzystując fotokonwertowalny fluorofor Kaede, subpopulacje tych hemocytów skrzydeł wędrownych zostały selektywnie oznakowane. Metoda ta została wykorzystana do wykazania, że hemocyty zrekrutowane do początkowej rany są tymczasowo znieczulone na drugą ranę powstałą 90 minut później.Znakując E-kadherynę w przylegających do komórek połączeniach GFP, brzeg rany jest łatwo identyfikowalny, co pozwala na analizę dynamiki gojenia się ran. Większość ran zaczyna ponownie nabłonkować w ciągu godziny od urazu. Krawędź rany przesuwa się do wewnątrz, a rany ostatecznie goją się w ciągu trzech godzin.Po opanowaniu tej techniki wiele poczwarek można przygotować do obrazowania na żywo w ciągu zaledwie 10 minut, ale podczas próby tej procedury należy pamiętać, że po wypreparowaniu z ich poczwarki poczwarki są niezwykle podatne na uszkodzenia i odwodnienie. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się odpornością wrodzoną do współpracy z biologami obliczeniowymi i zastosowania bardziej wyrafinowanego modelowania matematycznego w celu zbadania zachowania sygnałów atraktantu ran, które są odpowiedzialne za rekrutację komórek zapalnych. A nawet bardziej niedawno, alternatywne typy komórek zostały również oznaczone, aby śledzić ich reakcję na uraz wywołany laserem, co ujawniło, że komórki adipocytów, komórki tłuszczowe Drosophila, również reagują na rany w tym systemie.

long-term-vivo-tracking-inflammatory-cell-dynamics-within-drosophila

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna działa poza limitami penetracji charakterystycznymi dla fluorescencyjnej mikroskopii sekcji tkanek. Technika ta opiera się na oświetleniu wieloprojekcyjnym oraz opisie transportu fotonów. Demonstrujemy wizualizację 3D całego organizmu in-vivo podczas morfogenezy wyobraźników skrzydeł wykazujących ekspresję GFP u Drosophila melanogaster.

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna do obrazowania in-vivo rozwijających się Drosophila

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Film demonstruje wykorzystanie fotokonwersji do badania dynamiki komórek zapalnych u poczwarek Drosophila. Zielone hemocyty są przyciągane do uszkodzonego nabłonka, po czym następuje dalsza migracja. Fotokonwersja przesuwa niektóre hemocyty z zielonego na czerwony, ułatwiając śledzenie ich ruchu.

Technika fotokonwersji do badania dynamiki komórek zapalnych w poczwarkach owadów

Ten artykuł demonstruje użycie szybkiego skaningowego mikroskopu konfokalnego do obrazowania zachowania komórek bezpośrednio przez poczwarkę. Pozostawiając nienaruszoną obudowę poczwarki, metoda ta umożliwia obserwację i pomiar dynamicznych procesów komórkowych na etapie rozwoju Drosophila, który jest trudny do bezpośredniego zbadania.

Obrazowanie przez poczwarkę Drosophila melanogaster

Ten protokół przedstawia skuteczną metodę obrazowania żywego nabłonka oka poczwarki Drosophila. Metoda ta kompensuje ruch tkanek i nierówną topologię, poprawia wizualizację granic komórek dzięki zastosowaniu wielu białek połączeniowych znakowanych GFP i wykorzystuje łatwe w montażu urządzenie do obrazowania.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila

Ten protokół opisuje szczegółową metodę długoterminowej hodowli ex vivo i obrazowania na żywo wyobrażonego dysku Drosophila. Pokazuje różnicowanie fotoreceptorów i rotację ommatidialną w ciągu 10 godzin obrazowania na żywo tarczy oka. Protokół jest prosty i nie wymaga kosztownej konfiguracji.

Długoterminowe obrazowanie na żywo dysku oka Drosophila

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół do wizualizacji, wykrywania, analizy i śledzenia endogennego transportu mRNA w żywej komorze jajowej Drosophila melanogaster za pomocą latarni molekularnych, mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem i oprogramowania do analizy open-source.

Wizualizacja i śledzenie endogennych mRNA w żywych komorach jajowych Drosophila melanogaster

Ten protokół jest przeznaczony do obrazowania i analizy dynamiki orientacji komórek i wzrostu tkanek w nabłonku brzusznym Drosophila, gdy muszka owocowa przechodzi metamorfozę. Opisana tutaj metodologia może być zastosowana do badania różnych etapów rozwojowych, tkanek i struktur subkomórkowych u Drosophila lub innych organizmów modelowych.

Obrazowanie i analiza orientacji tkanek i dynamiki wzrostu w rozwijającym się nabłonku Drosophila w stadiach poczwarkowych

Tutaj przedstawiono protokół długoterminowego obrazowania na żywo nogi Drosophila w fazie poczwarki, obejmujący całkowite usunięcie poczwarki. Protokół ten można również zastosować do innych tkanek.

Długoterminowe obrazowanie na żywo rozwoju nogi poczwarki Drosophila po usunięciu pupary

Poznaj metodę długoterminowego obrazowania in vivo procesu gojenia ran i odpowiedzi zapalnej w poczwarkach Drosophila. Technika ta umożliwia śledzenie migracji hemocytów i badanie mechanizmów wrodzonej odporności.

Długoterminowe śledzenie in vivo dynamiki komórek zapalnych w poczwarkach Drosophila

Przeglądaj więcej filmów