Długoterminowe śledzenie in vivo dynamiki komórek zapalnych w poczwarkach Drosophila
14 czerwca 2018
Tutaj prezentujemy protokół do obrazowania ran na żywo i związanej z tym reakcji zapalnej w wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej in vivo. Metoda ta wykorzystuje stadium poczwarki rozwoju Drosophila, aby umożliwić długoterminowe obrazowanie i śledzenie określonych populacji komórek w czasie i jest kompatybilna z wydajną inaktywacją genów za pośrednictwem RNAi.
Wykorzystując długoterminowy potencjał obrazowania tego nowego modelu poczwarki wraz z wykonalnością genetyczną Drosophila, metoda ta może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie gojenia się ran i odporności wrodzonej. Stadium poczwarki oferuje pewne wyraźne zalety obrazowania na żywo w porównaniu z bardziej tradycyjnymi modelami gojenia się ran Drosophila. Na przykład poczwarki mogą być obrazowane w znacznie dłuższych okresach czasu, większa powierzchnia tkanki jest dostępna do eksperymentalnej manipulacji, a na tym etapie występuje więcej hemocytów.
Ponadto skuteczność inaktywacji genów za pośrednictwem RNAi ulega znacznej poprawie w tych stadiach poczwarki, co pozwala na zniszczenie wielu genów w sposób specyficzny dla tkanki lub czasu. Aby skonfigurować kolekcję poczwarek, ustaw fiolki z 20 dziewiczymi samicami i 20 samcami. Następnie 18 godzin przed sesją obrazowania zbierz z fiolek co najmniej 10 nowo utworzonych białych poczwarek wstępnych.
Aby zebrać poczwarkę, użyj kleszczy lub cienkiego pędzla, aby usunąć ją z wewnętrznej powierzchni fiolki i ostrożnie przenieś na bok nowej fiolki na muchy. Po tym, jak poczwarki rozwiną się do pożądanego punktu czasowego, przenieś je na kawałek dwustronnej taśmy klejącej zamontowanej na szklanym szkiełku. Teraz pod mikroskopem preparacyjnym w jasnym polu ostrożnie usuń poczwarki z ich osłonek.
Ustaw poczwarki tak, aby ich brzuszne boki były mocno przyklejone do taśmy. Wykonaj pierwsze nacięcie w najbardziej wysuniętym do przodu obszarze poczwarki za pomocą kleszczy. Upewnij się, że poczwarka w tym obszarze jest pusta i pozbawiona tkanki poczwarki, ponieważ poczwarki skurczą się w obrębie koperty we wczesnym rozwoju poczwarki.
Następnie ostrożnie rozerwij lub rozetnij obudowę poczwarki w kierunku od przodu do tyłu za pomocą kleszczy lub mikronożyczek, aż poczwarka będzie całkowicie wolna od brązowej, nieprzezroczystej, kruchej osłonki. Uważaj, te poczwarki są bardzo delikatne. Teraz ważne jest, aby kleszcze i mikronożyczki nie przebijały powierzchni poczwarki na tym etapie.
Staraj się unikać dotykania samej poczwarki podczas usuwania otaczającej obudowy. Teraz zamontuj nieuszkodzone poczwarki w naczyniu ze szklanym dnem za pomocą kleju heptanowego. Najpierw nałóż linię przygotowanego kleju heptanowego z podwielokrotności 10 mikrolitrów.
Następnie, po pięciu sekundach suszenia, użyj kleszczy, aby ostrożnie przenieść wypreparowane poczwarki na klej. Podczas nauki ustaw w szeregu do pięciu poczwarek. Więcej można przygotować dzięki zdobytemu doświadczeniu.
Zwiń poczwarki za pomocą kleszczy, aby zamontować poczwarki tak, aby skrzydło przylegało płasko do szkła nakrywkowego, a większość powierzchni skrzydła miała bezpośredni kontakt ze szkłem nakrywkowym. Na koniec, aby zapobiec odwodnieniu, dodaj kawałek chłonnej bibuły filtracyjnej nasączonej wodą destylowaną na bok naczynia ze szklanym dnem. Następnie przykryj naczynie i przystąp do procedury ranienia indukowanego laserem.
Przenieś zamontowane poczwarki do mikroskopu szerokokątnego wyposażonego w przestrajalny system ablacji laserowej. Dostosuj chłodzony powietrzem laser ablacyjny z pulsacyjnym promieniowaniem UV pompowanym azotem do żądanej długości fali za pomocą odpowiedniego ogniwa barwnikowego. Aby uzyskać optymalne nawijanie, ustaw częstotliwość powtarzania impulsów na 40 herców.
Teraz, używając 40-krotnych lub 63-krotnych obiektywów i jasnego pola, dostosuj elementy sterujące sceną mikroskopu, aby zlokalizować skrzydło poczwarki pierwszej poczwarki, która ma zostać zraniona. Skoncentruj się na płaszczyźnie nabłonka skrzydła poczwarki znajdującej się najbliżej szkiełka nakrywkowego. Dopasuj obszar, który ma zostać zraniony, do znanego obszaru docelowego lasera ablacyjnego.
W tym celu należy skorzystać ze znacznika krzyża nitkowego w okularze mikroskopu. Następnie wyreguluj moc lasera, regulując suwak tłumika gęstości energii w mikroskopie. Skorzystaj z ograniczników kliknięcia, aby ustawienie było powtarzalne.
Teraz, aby zrobić ranę, aktywuj laser ablacyjny za pomocą szybkiego kliknięcia ręcznego sterowania. Następnie sprawdź, czy w miejscu ablacji nie pojawił się przejściowy pęcherzyk powietrza, co jest normalne w przypadku zranienia. Jeśli zranienie się nie powiedzie, spróbuj zmienić płaszczyznę ogniskowej.
Alternatywnie stopniowo zwiększaj moc lasera za pomocą suwaka tłumika, aż do uzyskania pożądanych rozmiarów ran. Po zranieniu brzegów skrzydeł poczwarki szybko przenieś naczynie ze szklanym dnem do odpowiedniego mikroskopu w celu wykonania obrazowania poklatkowego. Następnie otwórz odpowiednie oprogramowanie do przechwytywania obrazu.
W oprogramowaniu włącz odpowiednie lasery i dostosuj ich moc oraz wzmocnienie/przesunięcie, aby uzyskać wystarczającą ilość sygnału fluorescencyjnego bez nasycenia pikseli. Ogólnie rzecz biorąc, najniższa możliwa moc lasera w zakresie od pięciu do 20% najlepiej sprawdza się w celu zminimalizowania fotowybielania. Skoncentruj się na całym skrzydle poczwarki w małym powiększeniu lub skup się na ranie w dużym powiększeniu, aby zbadać gojenie się rany.
Aby uchwycić zarówno nabłonek naprawczy, jak i rekrutację komórek zapalnych, najpierw ustaw mikroskop tak, aby rejestrował stos z za pomocą precyzyjnej regulacji ostrości na panelu sterowania. Skanuj od zranionego nabłonka do przestrzeni zewnątrzkomórkowej poniżej zawierającej migrujące hemocyty. Następnie ustaw oprogramowanie tak, aby rejestrowało plasterki z przez skrzydło poczwarki co trzy mikrony lub w jeszcze ciaśniejszych odstępach czasu.
W przypadku obrazowania poklatkowego nagrywaj stosy z co najmniej co 30 sekund przez co najmniej jedną godzinę. W przypadku korzystania z konwertowalnych sond fotograficznych do selektywnej konwersji zdjęć i oznaczania podzbioru komórek podczas obrazowania, otwórz odpowiednie moduły w oprogramowaniu do obrazowania, aby przeprowadzić konwersję zdjęć i aktywować laser 405 nanometrów. Następnie wybierz komórki, które mają zostać przekonwertowane na zdjęcia w oprogramowaniu FRAP za pomocą narzędzia do zaznaczania.
Następnie ustaw przebieg czasowy konwersji zdjęcia na pojedynczą klatkę iteracji i ustaw laser 405 nm na 20% mocy lasera. Następnie kliknij Rozpocznij eksperyment, aby przeprowadzić konwersję zdjęć. Po zakończeniu wyjdź z modułu FRAP i wróć do oryginalnego ekranu obrazowania.
Tam dostrój lasery do używanych fluoroforów i zobrazuj komórki przekonwertowane na światło i nieprzekonwertowane za pomocą nagrań poklatkowych. Zranione skrzydła poczwarek Drosophila po 18 godzinach od powstania poczwarki zobrazowano za pomocą konfokalnej mikroskopii poklatkowej. Wywołane laserem uszkodzenie nabłonka skrzydła poczwarki stymulowało szybką migrację wrodzonych komórek odpornościowych Drosophila zwanych hemocytami do miejsca rany.
Hemocyty oznaczono zarówno markerem jądrowym, jak i markerem cytoplazmatycznym lub cytoszkieletowym, aby umożliwić odpowiednio śledzenie i wgląd w ich morfologię. Śledzenie trajektorii jądrowych hemocytów pokazuje złożoną czasoprzestrzenną dynamikę odpowiedzi zapalnej. W ciągu 30 minut od zranienia hemocyty znajdujące się najbliżej miejsca urazu rozpoczęły ukierunkowaną migrację w kierunku rany.
W końcu hemocyty znajdujące się coraz dalej od urazu zaczynają migrować w kierunku rany. Wykorzystując fotokonwertowalny fluorofor Kaede, subpopulacje tych hemocytów skrzydeł wędrownych zostały selektywnie oznakowane. Metoda ta została wykorzystana do wykazania, że hemocyty zrekrutowane do początkowej rany są tymczasowo znieczulone na drugą ranę powstałą 90 minut później.
Znakując E-kadherynę w przylegających do komórek połączeniach GFP, brzeg rany jest łatwo identyfikowalny, co pozwala na analizę dynamiki gojenia się ran. Większość ran zaczyna ponownie nabłonkować w ciągu godziny od urazu. Krawędź rany przesuwa się do wewnątrz, a rany ostatecznie goją się w ciągu trzech godzin.
Po opanowaniu tej techniki wiele poczwarek można przygotować do obrazowania na żywo w ciągu zaledwie 10 minut, ale podczas próby tej procedury należy pamiętać, że po wypreparowaniu z ich poczwarki poczwarki są niezwykle podatne na uszkodzenia i odwodnienie. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się odpornością wrodzoną do współpracy z biologami obliczeniowymi i zastosowania bardziej wyrafinowanego modelowania matematycznego w celu zbadania zachowania sygnałów atraktantu ran, które są odpowiedzialne za rekrutację komórek zapalnych. A nawet bardziej niedawno, alternatywne typy komórek zostały również oznaczone, aby śledzić ich reakcję na uraz wywołany laserem, co ujawniło, że komórki adipocytów, komórki tłuszczowe Drosophila, również reagują na rany w tym systemie.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół do obrazowania na żywo naprawy ran i reakcji zapalnej u poczwarek Drosophila. Metoda ta umożliwia długotrwałą obserwację i śledzenie określonych populacji komórek, co poprawia badania nad gojeniem ran i wrodzoną odpornością.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Immunologia
Tło
- Drosophila oferuje genetyczną dostępność do badania procesów biologicznych.
- Stadium poczwarki umożliwia dłuższą obserwację w porównaniu z tradycyjnymi modelami.
- Obecność hemocytów jest większa w stadium poczwarki, ułatwiając badania nad odpowiedzią immunologiczną.
- Inaktywacja genów za pośrednictwem RNAi jest bardziej efektywna w poczwarkach.
Cel badania
- Opracowanie protokołu do wysokiej rozdzielczości obrazowania gojenia ran.
- Zbadanie dynamiki migracji hemocytów podczas naprawy ran.
- Zgłębienie mechanizmów wrodzonej odporności u Drosophila.
Zastosowane metody
- Zbieranie i przygotowanie poczwarek Drosophila do obrazowania.
- Rannienie indukowanie laserem skrzydeł poczwarek do obserwacji w czasie rzeczywistym.
- Zdjęcia time-lapse, aby uchwycić reakcje komórkowe po urazie.
- Zastosowanie fotokonwertowalnych sond do oznakowywania określonych populacji komórek.
Główne wyniki
- Udane obrazowanie migracji hemocytów do miejsc ran.
- Zadokumentowanie skuteczności modelu poczwarki do badania naprawy ran.
- Identyfikacja kluczowych dynamiki komórkowych zaangażowanych w reakcję zapalną.
- Przedstawienie szczegółowego protokołu na przyszłe badania nad gojeniem ran.
Wnioski
- Stadium poczwarki Drosophila jest korzystne dla badań obrazowania na żywo.
- Ta metoda może znacząco przyczynić się do zrozumienia procesów gojenia ran.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tym protokole do eksploracji różnych czynników genetycznych w immunologii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-resolution, long-term imaging of inflammatory cell dynamics in a genetically tractable model, supporting mechanistic de-risking in target validation and assay development for innate immunity pathways. By capturing real-time hemocyte migration and wound healing dynamics, it provides quantitative, reproducible data that enhances predictive confidence in early discovery stages. The approach facilitates cross-functional collaboration between discovery biology and computational modeling teams to explore wound attractant signals and cellular behavior relevant to therapeutic intervention.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking innate immune cell recruitment and behavior in response to tissue damage.
- Operational Value: Supports functional target validation through visualization of hemocyte migration dynamics and response to genetic perturbations via RNAi.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by providing spatio-temporal data on inflammatory responses that inform target confidence and pathway relevance.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing standardized wound models with quantifiable immune cell recruitment.
- Operational Value: Addresses assay reproducibility through consistent laser-induced wounding and time-lapse imaging protocols across multiple pupae.
- Scalability: Enables preparation of multiple samples within 10 minutes post-mastery, supporting medium-throughput screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery observations to preclinical validation by modeling conserved inflammatory processes in a disease-relevant system.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive de-risking through detailed analysis of hemocyte trajectories and wound re-epithelialization dynamics.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker exploration via photo-convertible fluorophores like Kaede to track specific immune cell subsets over time.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing mechanistic insights that inform go/no-go decisions in early-stage programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling real-time observation of innate immune cell dynamics following tissue injury.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized wound generation and quantitative imaging of hemocyte recruitment and clearance.
- Analytics: Generates measurable outputs including migration trajectories, wound closure rates, and photo-conversion kinetics for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling immune cell behavior applicable to human wound healing and inflammation pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for longitudinal studies of genetic and pharmacological modifiers of inflammation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in inflammatory cell recruitment and resolution.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability through defined pupal preparation, wounding, and imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early biological de-risking of immunomodulatory targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative assessment of pathway activity and cellular response dynamics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila handling, microsurgery, and confocal microscopy for successful pupal dissection and mounting.
- Dependent on laser ablation systems and tunable UV lasers for precise, reproducible wound induction.
- Necessitates standardization across teams for consistent wound size, imaging intervals, and photo-conversion protocols.
- Involves adaptation considerations when extending to other cell types or genetic backgrounds beyond hemocytes and epithelium.
- Includes practical limitations such as pupal fragility post-dissection and dehydration risk, requiring careful handling and environmental controls.
