Szczurzy model rozległej demielinizacji kory mózgowej indukowanej przez domózgowe wstrzyknięcie cytokin prozapalnych
21 września 2021
Przedstawiony tutaj protokół pozwala na reprodukcję rozległej demielinizacji istoty szarej obu półkul korowych u dorosłych samców szczurów Dark Agouti. Metoda polega na domózgowym wszczepieniu cewnika, subklinicznej immunizacji przeciwko glikoproteinie mielinowych oligodendrocytów oraz domózgowej iniekcji prozapalnej mieszaniny cytokin przez wszczepiony cewnik.
Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie rozległej demielinizacji kory mózgowej obu półkul mózgowych w modelu szczurzym przy użyciu subklinicznej immunizacji przeciwko glikoproteinie oligodendrocytów mielinowych, a następnie interesującego wstrzyknięcia cytokin do mózgu przez wszczepiony cewnik. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w zapalnych chorobach demielinizacyjnych mózgu, takich jak stwardnienie rozsiane. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona generować demielinizację istoty szarej wywołaną stanem zapalnym w korze obu półkul mózgowych bez prowadzenia do powstania czopów istoty białej.
Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku lepszego zrozumienia mechanizmów demielinizacji kory mózgowej, która jest obserwowana głównie w postępujących typach stwardnienia rozsianego. Aby rozpocząć tę procedurę, zmontuj cewnik i nasadkę cewnika z wlotem. Następnie przytnij cewnik na długość dwóch milimetrów za pomocą skalpela.
Następnie ogol głowę znieczulonego szczura między uszami za pomocą golarki elektrycznej. Umieść szczura w ramie stereotaktycznej i zabezpiecz jego głowę za pomocą nauszników i płytki gryzowej. Upewnij się, że głowa jest pozioma i sprawdź jej stabilność, naciskając na nią palcem lub kleszczami.
Następnie nałóż nawilżające krople do oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas zabiegu, zakryj oczy nieprzezroczystym materiałem, aby zapobiec chirurgicznej ekspozycji na światło. Następnie oczyść ogolone miejsce, naprzemiennie stosując 70% etanolu i 10% kompleks jodowidonu. Aby wszczepić cewnik, wykonaj podłużne nacięcie o długości około dwóch centymetrów wzdłuż linii środkowej.
Następnie użyj zacisków buldoga, aby przytrzymać skórę na boki. Usuń krew za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką. Następnie usuń okostną, wyczyść tkankę aplikatorem z bawełnianą końcówką, odsłoń czaszkę i pozostaw do wyschnięcia na około minutę.
Następnie zidentyfikuj anatomiczne punkty orientacyjne, lambda, bregma i szew przyśrodkowy. Gdy wiertło jest zainstalowane na ramie stereotaktycznej, umieść końcówkę wiertła na bregmie jako punkt początkowy. Przesuń dwa milimetry do tyłu od bregmy i 2,4 milimetra w bok do szwu przyśrodkowego.
Następnie wywierć otwór o średnicy 0,5 milimetra na cewnik w tej pozycji. Wywierć trzy dodatkowe otwory o średnicy 1.3 milimetra na kotwiące w odległości kilku milimetrów od pierwszego otworu. Usuń pył kostny przez irygację około jednym do dwóch mililitrów sterylnego PBS i oczyść czaszkę.
Następnie dokręć kotwiące o dwa do trzech pełnych obrotów. Wprowadzić cewnik o długości dwóch milimetrów przez pierwszy otwór prostopadły do powierzchni czaszki. Trzymając cewnik, nałóż niewielką ilość cementu dentystycznego i pozwól mu spolimeryzować po krótkiej ekspozycji na światło do utwardzania zębów, aby ustabilizować cewnik
.Następnie nałóż więcej cementu dentystycznego wokół cewnika, zakotwicz i zestal cement dentystyczny za pomocą światła do utwardzania zębów przez około 15 do 30 sekund, upewnij się, że cement stwardniał. Po implantacji należy zamknąć skórę szwami wchłanialnymi z przodu i z tyłu cewnika. Następnie należy wstrzyknąć mieszaninę antidotum podskórnie.
Następnie należy podać 2,5% enrofloksacynę we wstrzyknięciu podskórnym w celu profilaktycznego leczenia antybiotykami. Umieść zwierzę z powrotem w zmodyfikowanej klatce i trzymaj je pod obserwacją przez jedną do trzech godzin z zastosowaniem światła podczerwonego, aby uniknąć hipotermii. Powtórz leczenie enrofloksacyną i podawaj karprofen w ilości jednego miligrama na mililitr podskórnie w celu złagodzenia bólu przez wstrzyknięcie następnego dnia po operacji.
Aby przygotować mieszaninę uodparniającą, podłącz dwie 10-mililitrowe szklane strzykawki z dolną końcówką zamka do krótkich ramion trójdrożnego kranu i zamknij trzeci wylot długim ramieniem. Następnie należy odpipetować razem jeden mililitr IFA i 50 mikrogramów rMOG. I dostosuj mieszaninę do końcowej objętości dwóch mililitrów za pomocą sterylnego PBS.
Umieścić rozcieńczoną mieszaninę IFA i rMOG w otwartej strzykawce, a następnie delikatnie włożyć tłok, utrzymując luźny nacisk na przeciwległy tłok. Emulgować inokulum, przesuwając je z jednej strzykawki do drugiej, popychając tłoki do przodu i do tyłu, aż stanie się białe i lepkie. Następnie przymocuj strzykawkę z dolnym zamkiem o pojemności jednego mililitra do otwartego krótkiego ramienia trójdrożnego kranu i napełnij go inokulum.
Rozprowadzić całe inokulum do strzykawek o pojemności jednego mililitra i trzymać je na lodzie do momentu wstrzyknięcia. Następnie wstrzyknąć 200 mikrolitrów mieszaniny IFA i rMOG podskórnie u podstawy ogona pod tymczasowym znieczuleniem izofluranem za pomocą igły o rozmiarze 21. W przypadku wstrzyknięcia cytokin domózgowych należy dostosować długość kaniuli łącznika do dwóch milimetrów.
Napełnij strzykawkę o pojemności jednego mililitra mieszaniną cytokin. Następnie podłączyć strzykawkę do kaniuli łącznika. Następnie napełnij kaniulę mieszaniną cytokin, unikając tworzenia pęcherzyków.
Następnie zamontuj strzykawkę na programowalnej pompie strzykawkowej i zaprogramuj ją tak, aby wstrzykiwała z szybkością 0,2 mikrolitra na minutę. Uruchom pompę i utrzymuj ją w ruchu, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza na końcu kaniuli. Następnie zdejmij nasadkę cewnika wraz z wlotem.
Włóż kaniulę łącznika do cewnika, przykręć ją i dokręć. Następnie należy odczekać, aż wstrzyknięcie będzie kontynuowane przez 10 minut przed zatrzymaniem pompy. Pozostaw kaniulę wewnątrz cewnika na 20 minut, aby wstrzyknięta objętość mogła się całkowicie rozproszyć.
Następnie odkręć kaniulę złącza i powoli ją wyjmij, aby uniknąć efektu podciśnienia. Ponownie załóż nasadkę cewnika z wlotem i przykręć ją. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie po znieczuleniu w klatce.
Demielinizację kory mózgowej można ocenić w różnych punktach czasowych po wstrzyknięciu cytokin za pomocą histochemii immunologicznej dla PLP. Rycina 6A pokazuje nienaruszoną immunoreaktywność PLP w dniu 15 u uodpornionego zwierzęcia kontrolnego, które otrzymało tylko sterylny PBS przez wszczepiony cewnik. Już pierwszego dnia po wstrzyknięciu cytokin można było wykryć demielinizację u zwierząt MOG prime.
Chociaż tylko w bliskim sąsiedztwie obszaru cewnikowania. Immunoreaktywność PLP pozostaje nienaruszona w korze przeciwległej jeden dzień po wstrzyknięciu cytokin. W trzecim dniu można było zaobserwować stopniowy wzrost utraty reaktywności immunologicznej PLP, która rozprzestrzenia się w korze ipsilateralnej.
Kontralateralna demienizacja korowa może być również wykryta w trzecim dniu, ale jest raczej ograniczona do obszaru pod kotwiącymi. Między dziewiątym a piętnastym dniem demielinizacja wpływa na duże części kory mózgowej obu półkul. Demielinizacja kory mózgowej utrzymuje się do 30 dni po wstrzyknięciu cytokin w obu półkulach z tylko częściową remielinizacją.
Rycina 6J przedstawia ilościowe określenie utraty PLP w istocie szarej kory mózgowej po wstrzyknięciu cytokin domózgowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować demielinizację istoty szarej za pomocą subklinicznej immunizacji przeciwko białkom mieliny, a następnie domózgowego wstrzykiwania cytokin przez wszczepiony cewnik. Ten model zwierzęcy może pomóc naukowcom w badaniu postępujących typów stwardnienia rozsianego, warstwowa demielinizacja istoty szarej to cały znak.
Wszczepiony cewnik umożliwia wiele rund demielinizacji lub międzymózgowego dostarczania potencjalnych leków terapeutycznych poddawanych badaniom przedklinicznym bez powodowania urazu wywołanego wstrzyknięciem.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół indukcji rozległej demielinizacji istoty szarej w korze obu półkul mózgu u dorosłych samców szczurów szczepu Dark Agouti. Metoda obejmuje subkliniczną immunizację przeciwko glikoproteinie mieliny oligodendrocytów oraz dokomorowe wstrzyknięcie cytokin, co ma na celu poszerzenie wiedzy na temat zapalnych chorób demielinizacyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- demyelinizacja
- choroby zapalne
Wstęp
- Obecne metodologie nie oferują sposobu na wywołanie demielinizacji korowej bez powodowania uszkodzeń istoty białej.
- Niniejszy protokół dostarcza informacji na temat mechanizmów demielinizacji korowej istotnych w chorobach takich jak stwardnienie rozsiane.
- Ma on na celu lepsze zrozumienie progresji choroby w zapalnych zaburzeniach demielinizacyjnych.
Cel badania
- W celu wywołania indukowanej stanem zapalnym demielinizacji istoty szarej w kontrolowanym modelu szczurzym.
- W celu zbadania mechanizmów zaangażowanych w demielinizację kory mózgu, w szczególności w przebiegu postępującej stwardnienia rozsianego.
- W celu opracowania wiarygodnej metody eksperymentalnej, która pozwala uniknąć powikłań związanych z uszkodzeniami istoty białej.
Zastosowane metody
- Wewnątrzczaszkowa implantacja cewnika do celowanych iniekcji.
- Jako model biologiczny wykorzystano dorosłe samce szczurów linii Dark Agouti, koncentrując się na uszkodzeniach związanych z demielinizacją.
- Subkliniczna immunizacja przeciwko glikoproteinie mieliny oligodendrocytów, a następnie wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie cytokin.
- Metoda obejmuje określone kroki chirurgiczne i harmonogram czasowy w celu zapewnienia prawidłowej implantacji i przebiegu leczenia.
Główne wyniki
- Indukcję demielinizacji potwierdzono za pomocą immunohistochemii w kierunku PLP, co wykazało wczesne zmiany korowe.
- Bezpośrednie skutki wstrzyknięcia cytokin doprowadziły do wykrywalnej demielinizacji krótko po zabiegu.
- Metoda ta podkreśliła potencjał do badania mechanizmów demielinizacji kory mózgowej bez zakłóceń wynikających ze zmian w istocie białej.
Wnioski
- Niniejszy protokół umożliwia badanie procesów demielinizacji kory mózgowej in vivo.
- Wspiera on eksplorację podejść terapeutycznych w chorobach takich jak stwardnienie rozsiane.
- Wynikające z niego wnioski ułatwiają lepsze zrozumienie odpowiedzi zapalnych oraz progresji stanów neurodegeneracyjnych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia badanie demielinizacji istoty szarej indukowanej stanem zapalnym w modelu szczurzym, wypełniając istotną lukę w badaniach nad stwardnieniem rozsianym, w których patologia istoty szarej jest niedoreprezentowana. Dzięki unikaniu zmian w istocie białej, model ten stanowi bardziej specyficzną platformę do oceny mechanizmów demielinizacji korowej istotnych dla postępującego stwardnienia rozsianego. Podejście to wspiera przedkliniczną ocenę kandydatów terapeutycznych celujących w szlaki neurozapalne, przy jednoczesnym ograniczeniu czynników zakłócających wynikających z uszkodzeń istoty białej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie mechanizmów zapalnych prowadzących do demielinizacji kory w istocie szarej.
- Wartość operacyjna: Dostarcza powtarzalnego modelu do walidacji celów zaangażowanych w cytokinowe szlaki demielinizacji.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia uzyskanie mierzalnych wyników demielinizacji za pomocą immunohistochemii PLP w celu przesiewania związków.
- Wartość operacyjna: Zaimplantowany cewnik pozwala na wielokrotne podawanie dawek i ocenę podłużną bez konieczności ponownego urazu chirurgicznego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Modeluje demielinizację kory mózgowej obserwowaną w postaciach postępujących stwardnienia rozsianego, wspierając walidację celów terapeutycznych istotnych dla przebiegu choroby.
- Wartość operacyjna: Umożliwia wewnątrzmózgowe podawanie czynników terapeutycznych w celu oceny zaangażowania celu oraz skuteczności w istocie szarej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w continuum odkrywania leków, od walidacji celu po przedkliniczne testy skuteczności, w szczególności w programach skoncentrowanych na procesach neurozapalnych i demielinizacji.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących mechanizmów demielinizacji indukowanej cytokinami w szarej materii kory mózgowej.
- Przesiewowe badania (Screening): Umożliwia standaryzowane i powtarzalne podawanie związków za pomocą cewnika w celu oceny zależności dawka-odpowiedź.
- Analityka: Zapewnia ilościowe pomiary utraty PLP w celu porównania warunków i monitorowania postępu demielinizacji.
- Badania translacyjne: Modeluje patologię szarej materii istotną dla postaci postępującej stwardnienia rozsianego, wspierając walidację celów zgodnych z biomarkerami.
- Ponowne wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Platforma cewnikowa pozwala na wielokrotne interwencje, co zwiększa użyteczność w ramach kampanii przesiewowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez oddzielenie demielinizacji korowej od patologii istoty białej.
- Wartość operacyjna: Ustandaryzowane procedury chirurgiczne i iniekcyjne poprawiają powtarzalność wyników między laboratoriami.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), zapewniając pewność prognostyczną w zakresie modulacji celu w obrębie istoty szarej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację terapii OUN z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o modulację demielinizacji korowej.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w chirurgii stereotaktycznej i implantacji cewników u modeli gryzoni.
- Zależne od sterylnej infrastruktury chirurgicznej, cementu stomatologicznego oraz programowalnych pomp strzykawkowych do podawania cytokin.
- Konieczna jest standaryzacja między zespołami w celu zapewnienia spójnego rozmieszczenia cewników i dawkowania cytokin.
- Należy uwzględnić zmienność odpowiedzi immunologicznej pomiędzy szczepami szczurów oraz partiami cytokin.
- Ograniczone do przedklinicznego wglądu w mechanizmy; nie modeluje pełnej patofizjologii MS, w tym infiltracji komórek odpornościowych lub cykli rzutowo-remisyjnych.
