Egzogenne podawanie agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami do neuronów pierwotnych jako potężny model komórkowy tworzenia włókienek

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie alfa-synukleiny, takie jak wyjaśnienie mechanizmu rozprzestrzeniania się agregacji i toksyczności alfa-synukleiny in vivo. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga ona czasochłonnego oczyszczania fibryli wstępnie uformowanych alfa-synukleiny. Procedurę zademonstruje Lucia Rota, doktorantka z COLA Lab.

Aby rozpocząć procedurę, należy przygotować bufor homogenizacyjny i przechowywać go na lodzie. Następnie homogenizuj świeżą lub zamrożoną tkankę w objętości od 1 do 10 lodowatego buforu homogenizacyjnego za pomocą homogenizatora teflonowego z tłuczkiem o 10 do 15 pociągnięciach. Następnie przenieś cały początkowy homogenat do probówki mikrowirówkowej i odwiruj w temperaturze 1000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu usunięcia jąder i nieuszkodzonych komórek z powstałego osadu.

Następnie wyrzuć wynikowy osad. Następnie przenieś supernatant do czystej probówki do mikrowirówki i odwiruj go w temperaturze 10 000 razy G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza za pomocą wirówki z chłodzeniem w celu uzyskania drugiego supernatantu i osadu. Następnie przenieś ten supernatant do butelki z poliwęglanu i odwiruj go w temperaturze 100 000 razy G przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza za pomocą ultrawirówki i wirnika o stałym kącie nachylenia.

Zawiesić surowy granulat P100 z 500 mikrolitrami buforu homogenizacyjnego. Przenieś surowy osad P100 do czystej probówki do mikrowirówki i odwiruj przy 10 000 razy G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wirówce z chłodzeniem. Po 20 minutach wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić P100 ze 100 mikrolitrami buforu homogenizacyjnego.

Następnie poddaj próbkę sonikacji przez dwie sekundy na lodzie i przechowuj ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby wykonać Western Blot, należy odlać gradientowy żel poliakrylamidowy o stężeniu od czterech do 20% tris-glicyny na pionowym aparacie do elektroforezy. Rozpuść jeden mikrogram frakcji alfa-synukleiny związanych z mikrosomami w denaturującym buforze próbki i załaduj go na żel.

Do innego dołka załaduj pięć mikrolitrów markera wzorcowego białka. Uruchom żel pod napięciem 100 V w buforze działającym tris-glicyny SDS, aż marker białkowy dotrze do końca żelu. Następnie przenieś białka do membrany nitrocelulozowej za pomocą zasadowego buforu węglanowego.

Próbkę należy przechowywać przez noc w chłodni ze stałą mocą ustawioną na 200 miliamperów. Następnego dnia zablokuj membranę PBS-T z 5% beztłuszczowym mlekiem w proszku na wytrząsarce orbitalnej przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie krótko przepłucz membranę PBS-T.

Inkubować błonę z przeciwciałem SIN-1 w temperaturze od jednego do 5 000 lub przeciwciałem alfa-synukleiny P-Ser129 w temperaturze od jednego do 5 000 w 2,5% beztłuszczowym mleku w proszku w PBS-T przez noc w chłodni lub lodówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza na wytrząsarce orbitalnej. Następnego dnia myj membranę przez 10 minut w temperaturze pokojowej za pomocą PBS-T na wytrząsarce orbitalnej. Inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP przeciwko myszom lub królikom w ilości od jednego do 3 000 w 2,5% beztłuszczowym mleku w proszku w PBS-T przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej.

Następnie myj membranę przez 10 minut w temperaturze pokojowej za pomocą PBS-T na wytrząsarce orbitalnej trzy razy. Uzyskaj sygnał za pomocą zwykłego zestawu chemiluminescencyjnego. Aby leczyć neurony, należy wyciągnąć związane z mikrosomami agregaty alfa-synukleiny uzyskane z rdzenia kręgowego trzech różnych chorych myszy transgenicznych, aby uzyskać roztwór o stężeniu jednego mikrograma na mikrolitr rozcieńczony oryginalnym buforem homogenizacyjnym.

Następnie usuń jedną trzecią pożywki i delikatnie zastąp ją świeżą pożywką neuronową. Dodaj jeden mikrogram połączonych agregatów alfa-s związanych z mikrosomami do pożywki komórkowej. Zwróć neurony w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Dodać jedną trzecią świeżej pożywki do próbki, nie wymieniając pożywki raz na trzy dni przez jeden tydzień. Po tygodniu leczenia należy usunąć jedną trzecią pożywki i delikatnie zastąpić ją świeżą pożywką zawierającą 2% witaminy B27, gentamycynę 10 mikrogramów na mililitr i dwumilimolową glutaminę. Powtarzaj co trzy dni przez tydzień przed utrwaleniem komórek.

Aby przeprowadzić immunofluorescencję, w chemicznym okapie oparowym utrwalić neurony za pomocą 2% paraformaldehydu i PBS w 5% roztworze sacharozy przez 15 minut w temperaturze pokojowej bez wstrząsania. Po 15 minutach usuń roztwór utrwalający i krótko przemyj neurony trzykrotnie PBS. Następnie przepuszczaj neurony za pomocą 0,3% niejonowej surfaktyny w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Następnie krótko umyj neurony trzykrotnie PBS. Inkubuj neurony z 3% FBS i PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej, aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania. Następnie inkubuj neurony z odpowiednim przeciwciałem pierwszorzędowym rozpuszczonym w 3% FBS i PBS przez noc w chłodni lub lodówce przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na wytrząsarce orbitalnej.

Następnego dnia usuń roztwór przeciwciała i krótko przemyj komórki trzykrotnie PBS. Następnie inkubuj neurony z odpowiednim fluorescencyjnym przeciwciałem wtórnym rozpuszczonym w 3% FBS i PBS przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności na wytrząsarce orbitalnej. Usunąć roztwór przeciwciał i krótko przemyć PBS trzy razy.

Następnie barwić neurony roztworem DAPI przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności na wytrząsarce orbitalnej. Po 15 minutach usunąć roztwór przeciwciała i krótko przemyć PBS trzy razy. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełku za pomocą środka montażowego zapobiegającego blaknięciu.

W tym badaniu podanie jednego mikrograma połączonych agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami od chorych myszy transgenicznych A53T do pożywki hodowlanej neuronów korowych lub hipokampowych indukuje zależne od czasu tworzenie inkluzji alfa-synukleiny, dodatnich dla specyficznych dla agregatu przeciwciał alfa-synukleinowych. Po dwóch dniach leczenia agregaty te pojawiają się jako małe, rozproszone punkty, które staną się bardziej obfite w późniejszych punktach czasowych. Po dwóch tygodniach inkluzje alfa-synukleiny przypominają długie i dojrzałe struktury przypominające koraliki, silnie rozsiane po kulturach neuronalnych zgodnie ze wzorcem neurytów i częściowo kolokalizujące się z markerami presynaptycznymi i neurytowymi.

Podejmując tę procedurę, należy pamiętać o dostosowaniu stosunku mikrogramów agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami do gęstości posianych neuronów oraz o wyizolowaniu agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami z tkanki bogatej w inkluzje alfa-synukleiny. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oczyszczać agregaty alfa-synukleiny związane z mikrosomami od chorych myszy transgenicznych, które mają być stosowane jako leczenie pierwotnych neuronów w celu wywołania tworzenia inkluzji alfa-synukleiny.